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Mécanismes de survenue des anomalies chromosomiques de structure

JM DUPONTLaboratoire de CytogénétiqueGroupe Hospitalier Cochin Saint Vincent de PaulUniversité Paris Descartes - Faculté de MédecineParis

Anomalies de structure Fréquence = 0,5% équilibrées 0,06% déséquilibrées

Anomalies de structure

Cassure double brin‣Pathologique

Fréquence = 0,5% équilibrées 0,06% déséquilibrées

Anomalies de structure

Cassure double brin‣Pathologique‣Physiologique

Fréquence = 0,5% équilibrées 0,06% déséquilibrées

CDB physiologiques

CDB physiologiques

• CDB méiotiques déclenchées par Spo11

• Première étape de la recombinaison méiotique

CDB physiologiques

• CDB méiotiques déclenchées par Spo11

• Première étape de la recombinaison méiotique

• CDB déclenché par le complexe RAG

• Recombinaison V(D)J

Cassures double-brin (CDB) pathologiques

• ≈ 10 CDB / j / cell

• Stress réplicatif

• O2- provenant du métabolisme oxydatif -> radicaux hydroxyl (≈ 100/h/cell)

• Radiations ionisantes

• rayons γ, rayons X (≈ 300 Millions/personne/heure)

• Erreur de processus enzymatiques normaux

• Défaut de la Topoisomérase II (pas de ligation), action du complexe RAG en dehors de la région V(D)J

• Stress mécanique

Redondance des mécanismes de réparation

R-S Mani & A M Chnnaiyan., Nature Rev Genetics 2010-11;819



Modification des extrêmités et ligation

«peu» fiableTout au long du cycle

Quelque soit l’état de l’extrêmitéGénère de la diversité par les

réarrangements formés



Remplacement de l’ADN cassé par une copie

Essentiellement S et G2Fidélité «parfaite»

Modification des extrêmités et ligation

«peu» fiableTout au long du cycle

Quelque soit l’état de l’extrêmitéGénère de la diversité par les

réarrangements formés

Réparation par recombinaison homologue

• Remplacement de la région lésée par une copie homologue

PJ Hastings et al., Nat Rev Genetics, 2009-10;551

Préparation des extrémités

Copie

Réparation


• Homologie de séquence

• > 97% sur 50 - 300 pb


EXO I + BLM (Bloom)



• > 97% sur 50 - 300 pb

• Stabilisation de l’ADN simple brin

• RPA, RAD52


EXO I + BLM (Bloom)

T Sugiyama et N Kantake, J Mpl Biol 2009-390;45



• > 97% sur 50 - 300 pb


• RPA, RAD52


EXO I + BLM (Bloom)

Réparation par recombinaison homologueT Sugiyama et N Kantake, J Mpl Biol 2009-390;45

RAD51 + BRCA2 + cohesines



• Formation d’un nucléofilament

• RAD51-ssDNA

• Formation d’une synapse -> Recherche d’homologie

ME Moynahan, M Jasin, Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11;196

ATP

Réparation par recombinaison homologue : recherche d’homologie

Y Savir and Tlusty T, Mol Cell, 2010-40;388

• Etirement de ssDNA par RAD51 dans le nucléofilament

• L’étirement est maximal entre les triplets

• Reconnaissance homologue + contrôle conformationnel (ATP independent)

• L’énergie nécessaire à la déformation de dsDNA (Edef) est fournie par l’appariement homologue (Epair)

• Homologie-> Edef < Epair-> haute probabilité d’appariement ->passage au triplet suivant

• Erreur -> Epair ➘ -> ➘ probabilité d’étirement et donc d’appariement -> dissociation de la synapse

Réparation par recombinaison homologueT Sugiyama et N Kantake, J Mpl Biol 2009-390;45

RAD51 + BRCA2 + cohesines

DSBRDouble Strand Break Repair

SDSASynthesis-Dependant strand

annealing



• Formation d’un nucléofilament

• Recherche d’homologie

• Etape clé = invasion du brin homologue (D-loop) : RAD51

Réparation par recombinaison homologue : Crossing over / Conversion génique


• Etape clé = invasion du brin homologue (D-loop)

• Résolution

• DSBR (Holliday junction)

• Crossing over

• Conversion génique


Endonucléase

Double Holliday Junction

Réparation par recombinaison homologue : Crossing over / Conversion génique



• Résolution

• DSBR (Holliday junction)

• Crossing over

• Conversion génique

• Migration


Double Holliday Junction

Hélicase + Topoisomérase




• Résolution

• DSBR

• SDSA (Synthesis Dependant Strand Annealing)

• Dissociation de l’invasion par une Hélicase (BLM = Bloom Syndrome Protein)


BLM : Bloom Syndrome Protein

Réparation par fusion des extrémités

± MRN(MRE11+RAD50+NBS1)

(Ku70+Ku80)

MR Lieber, Annu Rev Biochem, 2010-79;181

Réparation par fusion des extrémités• NHEJ : Non Homologous End Joining

• Nucléase, DNA polymérase, ligase


(Ku70+Ku80)




• Fixation du complexe Ku (Ku70+Ku80)

• Facilite la fixation des autres enzymes


(Ku70+Ku80)




• Fixation du complexe Ku (Ku70+Ku80)

• Facilite la fixation des autres enzymes

• Action itérative dans n’importe quel ordre et indépendamment sur les deux extrêmités -> modification pour permettre la ligation

• polymérases : Pol µ and λ

• nucléase: artemis:DNA-PKcs

• ligase


(Ku70+Ku80)



• Ligation finale

• DNA ligase IV ±XRCC4±XLF



• Ligation finale


• XRCC4 et XLF augmentent l’efficacité de DNA ligase IV sur des extrêmités non homologues



• Ligation finale



• «Cicatrice» au point de cassure



• Ligation finale




• Plusieurs résultats possibles pour un même point de cassure -> très flexible



• Ligation finale




• Plusieurs résultats possibles pour un même point de cassure -> très flexible

• Création de diversité ( réarrangement V(D)J)


Choix du mécanisme de réparation

M Shrivastav et al., Cell Res, 2008-18;134



• Compétition entre HR et NHEJ

• HR : S et G2

• NHEJ : Tout le cycle mais essentiellement G0 et G1



• Compétition entre HR et NHEJ

• HR : S et G2

• NHEJ : Tout le cycle mais essentiellement G0 et G1

• Eléments de régulation

• Partenaire disponible pour HR ++

• Régulation de la formation d’ADN simple brin par CDK (Cycline Dependant Kinases)

• Protéines participant au «choix» : DNA Protein kinase, BRCA1, ATM

Et si il n’y a pas de deuxième extrémité ?

Cassure télomérique


Et si il n’y a pas de deuxième extrémité ?

D Branzei et M Foiani, Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11;208

J Atkinson et P McGlynn, Nucleic Acids Res, 2009-37;3475

Arrêt de la fourche de réplication

Levée du blocage par changement de matrice (FoSTeS : Fork Stalling and Template Switching)

Break Induced Replication

•Réplication en dehors d’un site initiateur de réplication

•Fourche relativement processive mais fréquent changement de matrice

•Taux de mutation élevé

Les Anomalies chromosomiques résultent d’une réparation anormale !

W Gu et al., PathoGenetics, 2008-I:4

Anomalies récurrentes : NAHR 2 fois plus de délétions que de duplications !

M Sasaki et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11:182

Anomalies non récurrentes : NHEJ / BFB

• Organisation du génome dans le noyau Cassures

Machinerie de réparation

Intermédiaire de réparation

Translocation

K J Meaburn et al., Semin Cancer Biol 2007-17;80

Facteurs favorisants les anomalies de structure

• Organisation du génome dans le noyau

• Territoires chromosomiques

Facteurs favorisants les anomalies de structure

• Organisation du génome dans le noyau

• Territoires chromosomiques

• Juxtapositions de séquences éloignées


Breakage-first model

• Mobilité des fragments cassés


G1, RAD51- G2, RAD51+JA Aten et al., Science 2004-303;92

Contact-first modelK J Meaburn et al., Semin Cancer Biol

2007-17;80

• Association fonctionnelle de séquences éloignées


2007-17;80

T Cremer et al., Curr Opinion Cell Biol, 2006-18;307CS Osborne et al., Nature Genetics,

2004-36;1065

Kcnq1ot1 (chr7) hba (chr11)

hbb b1 (chr7) hbb b1 (chr7)

• Association fonctionnelle de séquences éloignées

• Corrélation entre volume de recouvrement et fréquence des translocations


2007-17;80

T Cremer et al., Curr Opinion Cell Biol, 2006-18;307

MR Branco and A Pombo, PLoS Biol, 2006-4;e138

CS Osborne et al., Nature Genetics, 2004-36;1065

Kcnq1ot1 (chr7) hba (chr11)

hbb b1 (chr7) hbb b1 (chr7)

Quid des anomalies complexes ?• Pelizaeus-Merzbacher

• Liée à l’X, gène PLP1Proteolipid Protein 1

• Non récurrente

P J Hastings et al., PLoS Genetics, 2009-5:e1000327

DuplicationDélétionTriplicationDiploïdie

Clonage des points de cassure

• Réarrangement complexe

• Zones tripliquées au sein de zones dupliquées

• Zones non dupliquées intercalées

• Microhomologies au points de cassure

J A Lee et al., Cell, 2007-131:1235

Erreurs de réplication : FoSTeS / MMBIR (Microhomology Mediated Break Induced Reparation)

P J Hastings et al., Nat Review Genetics, 2009-10:551

J A Lee et al., Cell, 2007-131:1235

Facteurs favorisant les remaniements



• Proximité des molécules d’ADN

• Fréquence des cassures double brin

• Erreurs de réparation



• Territoires chromosomiques : taille, contenu en gènes, recouvrement

• Zones de transcription (Transcription factories), différenciation cellulaire

• Chronologie de réplication

• Translocations majoritairement entre séquences se répliquant en même temps



E Gaffe, PLoS Genet, 2010-6;e1001011


Triplex DNA Hairpins Quadruplex DNA

Cruciform DNA Left-handed Z-DNA

L Visser et al, Hum Mol Genet 2009-18;3579




• Non-B DNA






• Non-B DNA

• Séquences répétées






• Non-B DNA

• Séquences répétées


I Voineagu et al., PNAS 2008-105;9936

Protection contre le stress réplicatif


• Régression de la fourche de réplication

• DNA supercoiling

• Hélicases et Translocases

• BLM, WRN (Werner syndrome) : suppriment les super tours

• FANCM : component of the Fanconi Anaemia core complex

• Protéines de recombinaison

• RecA / RAD51



Régression puis digestion de l’ADN double brin néo formé



Régression puis recombinaison pour passer la lésion

Régression puis digestion de l’ADN double brin néo formé

Cas de la t(11;22)(q23;q11)

• Palindromes en 11q 23 et 22q11

• ADN cruciforme

• Cassure double brin

• Réplication ? Autre ?

• Réparation par NHEJ

• Homologie qq nucléotides

• petite délétion au point de cassure





• Structure du génome favorise les erreurs de recombinaison

Erreurs de recombinaison : NAHR (Non Allelic Homologous Recombination)

J A Bailey and E E Eichler, Nat Review Genet, 2006-7:552

• Favorisées par la présence de séquences répétées : LCR (Low Copy Repeats) ou duplicons

• ≈ 13% du génome

• > 95 - 97% homologie

• 50 - 300 pb

Duplicons inter chromosomiques

Duplicons intra chromosomiques

Erreurs de recombinaison : NAHR (Non Allelic Homologous Recombination)

• Favorisées par la présence de séquences répétées : LCR (Low Copy Repeats) ou duplicons

• ≈ 13% du génome

• > 95 - 97% homologie

• 50 - 300 pb

• Hotspots recombinaison non allélique et recombinaison méiotique ont des positions semblables

M Sasaki et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11:182

Déterminants de la fréquence des NAHR


• Taille des duplicons

• Zone d’homologie divisée par deux (232 à 134 nucléotides) -> réduction par 20 de la fréquence de NAHR




• Structure locale du génome

• Palindrome, ADN non B, transposon…




• Structure locale du génome

• Palindrome, ADN non B, transposon…

• Contexte de survenue

• Pour un même LCR, fréquence de NAHR peu varier entre mitose et méiose

• Fréquence variable de NAHR pour certains loci en fonction du sexe

Mécanismes de protection contre les NAHR


• Inhibition des cassures au niveau des séquences répétées

• Homologie de séquence ≈ parfaite pour autoriser la recombinaison


M Sasaki et al., Nat Review Mol Cell Biol 2010-11;182



• Utilisation préférentielle de l’homologue


M Sasaki et al., Nat Review Mol Cell Biol 2010-11;182



• Utilisation préférentielle de l’homologue

• Contrôle de la qualité de l’homologie (RAD51 - ssDNA)





• Structure du génome favorise les erreurs de recombinaison

• Rôle du stress cellulaire

Stress cellulaire et défaut de recombinaison

ME Moynahan, M Jasin, Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11;196

ATP

Stress cellulaire et défaut de recombinaison

• Mutation des protéines de réparation,

• Stress cellulaire

• Réduction RAD51ME Moynahan, M Jasin, Nat Rev Mol Cell Biol, 2010-11;196

ATP

Le stress cellulaire peut entraîner un déficit en RAD51


• Mécanismes réplicatifs

• BIR : Homologie étendue (> 50 pb)

• MMBIR : Microhomologie de quelques nucléotides suffit


• Mécanismes réplicatifs

• BIR : Homologie étendue (> 50 pb)

• MMBIR : Microhomologie de quelques nucléotides suffit

• BIR nécessite RAD51 pour l’invasion du brin homologue

• MMBIR : mécanisme alternatif impliquant RAD52

T Sugiyama et N Kantake, J Mpl Biol 2009-390;45

MMBIRBIR


• En l’absence d’invasion d’un ADN double brin homologue :

• Réparation possible par Single-Strand Annealing (SSA) - RAD51 non nécessaire

• Résection 5‘ -> 3’ poursuivie

• Révélation de séquences homologues

• Appariement et résection des extrémités non appariées

• Ligation -> délétion entre les séquences répétées

• Mécanisme de délétion entre séquences AluPJ Hastings et al., Nat Rev Genetics, 2009-10;551

Le stress cellulaire peut entraîner un déficit en Cohésines

M Carratero et al. Curr Op Cell Biol, 2010

K Shintomi & T Hirano Chromosoma, 2010


• 2 rôles principaux

• Cohésion des chromatides soeurs

C H Haering, 2003

K Nasmyth, An Rev Genet, 2009


• 2 rôles principaux

• Cohésion des chromatides soeurs

• Organisation du génome / Contrôle transcriptionnel en association avec CTCF

E Nunez et al., Curr Op Genet Dev, 2009-19;424


S Covo et al., PLoS Genetic 2010-e1001006

• Mutation des protéines de réparation,

• Stress cellulaire

• Réduction RAD51

• Déficit en cohésines

• Favorisent la recombinaison entre chromatides soeurs

• Suppriment la recombinaison entre homologues

Conclusion

Anomalies complexes

Cas sure

Conclusion

HR

NHEJBIR

Anomalies complexes

Cicatrice au point de cassure

Cas sure

Restauration fidèle

Conclusion

HR

NHEJBIR

CompétitionProtéines régulatrices : BRCA1

Cycle cellulaire

Anomalies complexes


Cas sure


Conclusion

HR

NHEJBIR


Cycle cellulaire

Anomalies complexes


Cas sure


Position dans le noyau

Structure du génomeEnvironnement cellulaire

Conclusion

HR

NHEJBIR

NAHR


Anomalies récurrentesmais pas seulement (ALU, LINE …)

Cycle cellulaire

Anomalies complexes


LCR

Cas sure




Conclusion

HR

NHEJBIR

NAHR

FoSTeS / MMBIR


Anomalies récurrentesmais pas seulement (ALU, LINE …)

Cycle cellulaire

Stress cellulaire

Anomalies complexes

Anomalies complexes


LCR

Cas sure




Mais comment expliquer çà ??

Stephens, P. J. et al. Cell 144, 27-40 (2011).

Hypothèse d’un évènement catastrophique = chromothripsis

• Concernerait 2 à 3% des cancers

• jusqu’à 25% des cancers osseux

• Réparation par les mécanismes habituels (MMBIR / NHEJ)

• Très nombreux réarrangements créés en même temps

Accumulation d’anomalies ou chromothripsis ?

• Les cassures ne sont pas réparties aléatoirement

• Clustering sur un chromosome (ou une partie)

• Mais partenaires peuvent être distants

• Il n’y a pas de duplications, soit 1 copie, soit deux copies

Stephens, P. J. et al. Cell 144, 27-40 (2011).

Mécanisme ?

• Soit radiation ionisante / radicaux libres

• sur un chromosome en cours de condensation -> clustering des anomalies au niveau d’un bras, d’une bande…

• Soit un effet de l’attrition télomérique

• BFB pendant la cytokinèse

• Dans tous les cas remaniement en profondeur du génome

• En général mort cellulaire

• Sinon, très nombreux réarrangements entraînent

• déséquilibre d’expression génique (➘, fusion, ➚ (chromosomes minutes))

• avantage prolifératif et cancérisation

Le phénomène de chromthripsis peut-il expliquer des remaniements constitutionnels (très) complexes ?

• Réarrangements complexes

• localisés

• associent del / dup/ trp

• Pas de mosaicisme différent entre les différentes anomalies

Liu, P., et al. Cell 146, 889-903 (2011).

Mécanisme différent ?

• Eléments en faveur d’un mécanisme réplicatif type BIR

• Duplications /Triplications

• Microhomologies aux points de cassure

Liu, P., et al. Cell 146, 889-903 (2011).

Bibliographie

• A DNA Replication Mechanism for Generating Nonrecurrent Rearrangements Associated with Genomic Disorders. J A. Lee et al., Cell, 2007, 131:1235

• Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. M Shrivastav et al., Cell Resarch, 2008, 18:134

• Mechanisms of change in gene copy number. PJ Hastings et al, Nature review Genetics, 2009, 10:551

• The mechanism of double-strand DNA break repair by the Nonhomologous DNA end-joining pathway. MR Lieber, Annu Rev Biochem, 2010, 79:181

• Triggers for genomic rearrangements:insights into genomic, cellular and environmental influences.R-S Mani et al., Nature reviews Genetics, 2010, 11:819

• Mitotic homologous recombination maintains genomic stability and suppresses tumorigenesis. ME Moynahan et al., Nature reviews Molecular Cell Biology, 2010, 11:197

• Stephens, P. J., Greenman, C. D., Fu, B., Yang, F., et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell 144, 27-40 (2011).

mécanismes de survenue des anomalies chromosomiques de ... · levée du blocage par changement de...

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