UNIVERSIDAD PERUANA UNION

Facultad de Ciencias de la SaludE.A.P. de Medicina Humana

Práctica de Laboratorio N° 11: Proteínas

Profesor:

Q. F. Pablo Padilla

Alumno:

Samuel Fernando Velasco Chacón2013

Introducción

En el presente informe de laboratorio el estudio fue centrado en el tema de reconocimiento de proteínas y por ende sus propiedades físicas y químicas; para ello hemos realizado un ensayo de laboratorio mediante el cual pudimos encontrar cada una de las diferentes formas de reconocer la presencia de las proteínas en una sustancia en este caso utilizamos la clara de huevo ya que está clara de huevo encontramos la albumina ya que esta a su vez es una proteína, para ello empleamos reacciones de solubilidad y de identificación de sus enlaces. En el presente informe se presenta los resultados de las reacciones y propiedades características de las proteínas. Las proteínas son las sustancias que están compuestas por la unión de dos aminoácidos o más y que forma la compleja estructura de los tejidos de los organismos vivientes tales como los músculos, la piel, las uñas, los cabellos, la sangre, leche, huevos, plumas, la sangre, etc. Ya que en ellas podemos encontrar una gran variedad de proteínas que cumplen una función de gran importancia caracterizándose por poseer un enlace peptídico.

Objetivos

El alumno:

Efectuará ensayos físicos y químicos característicos de una proteína.

Materiales y Métodos

Materiales:

Gradilla con tubos Vaso de 250 ml Fiola de 1000 ml Embudo Gasa y algodón Probeta Termómetro Pinzas para tubos Vaso de 600 ml

Reactivos:

o Albúmina de huevo.o Reactivo de Millón.o NaOH al 20%.o Solución de NaCl al 1% (suero).o Solución de Pb(CH3COO)2 al 10%.o Solución de CuSO4 al 1%.

o Ácido nítrico concentrado.o Agua destilada. o Solución de K4 [Fe(CN)6] al 10% . o Alcohol etílico comercial.o Solución de Ninhidrina al 0.1%.o Hidróxido de amonio [6M]. o Solución de AgNO3 al 1%.o Reactivo de Biuret.

Fundamento teórico:

Proteínas:Las proteínas son los materiales que desempeñan un mayor número de

funciones en las células de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura básica de los tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y, por otro, desempeñan funciones metabólicas y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales tóxicos o peligrosos, etc.). También son los elementos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código genético (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario.

Son macromoléculas orgánicas, constituidas principalmente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), etc.

Estos elementos químicos se unen para formar unidades estructurales llamados aminoácidos, a los cuales podríamos considerarlos como los "las bases de los edificios moleculares".

Se clasifican, de forma general, en Holo-proteínas y Hetero-proteínas según su conformación respectivamente sólo por aminoácidos o bien por aminoácidos más otras moléculas o elementos adicionales no aminoacídicos.

Los alimentos que consumimos nos proveen proteínas esenciales para el organismo. Pero tales proteínas no se absorben normalmente en su constitución normal sino que, luego de su desdoblamiento por hidrólisis o rotura del enlace, debido al proceso de digestión, atraviesan la pared intestinal en su forma desdoblada como aminoácidos y cadenas cortas de péptidos. Esas sustancias se incorporan inicialmente al torrente sanguíneo y, desde allí, son distribuidas hacia los tejidos que las necesitan para formar las proteínas, consumidas durante el ciclo vital.  

Los péptidos y el enlace peptídico:

Los péptidos están formados por la unión de varios aminoácidos mediante un enlace peptídico, enlace característico en las proteínas. Es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del que se encuentra a su lado, dando lugar al desprendimiento de una molécula de agua.

Así pues, para formar péptidos los aminoácidos se van enlazando y uniéndose entre sí formando cadenas de longitud y secuencia variable. Para denominar a estas cadenas se utilizan prefijos muy utilizados como:

Oligopéptidos.- si el Nº de aminoácidos es menor de 10. Dipéptidos.- si el Nº de aminoácidos es 2. Tripéptidos.- si el N º de aminoácidos es 3. Tetrapéptidos.- si el N º de aminoácidos es 4. Polipéptidos o cadenas polipeptídicas.- si el N º de aminoácidos es superior

de 10.

Estructura de las proteínas:

La organización de una proteína viene definida por cuatro tipos o niveles estructurales denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de las cuales informa de la disposición de la estructura definida en el espacio.

Estructura primaria:

La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos muestra qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se pueden formar. La función de una proteína depende de su secuencia y esta ligada la forma que ésta adopte.

Estructura Secundaria.

La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aminoácidos, a medida que se van uniendo progresivamente durante la síntesis de proteínas y debido a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable y definida. Existen dos tipos de estructura secundaria:

1. La a (alfa)-hélice

2. La conformación beta

Dicha estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un aminoácido y el -NH- del cuarto aminoácido que le sigue.

Estructura terciaria:

La estructura terciaria nos da detalles sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular.

En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por consiguiente la terciaria.

Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones tales como las de transporte, enzimáticas, hormonales, etc.

Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:

El puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre. Los puentes de hidrógeno. Los puentes eléctricos. Las interacciones hidrófobas. Estructura Cuaternaria

Esta estructura informa del tipo de unión, mediante enlaces débiles ( no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.

Propiedades de proteínas:

Desnaturalización:

Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha estructura manteniéndola unidad por un tipo de enlace. Todas las proteínas desnaturalizadas poseen la misma conformación, muy abierta y con una interacción excesiva con el disolvente, por lo que una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se convierte en insoluble en agua y precipita.La desnaturalización se puede producir por cambios de temperatura, tenemos como ejemplo el huevo cocido o frito, variaciones del pH. En algunos casos, si las condiciones se restablecen, una proteína desnaturalizada puede volver a su anterior plegamiento o conformación, proceso que se denomina re-naturalización.

Clasificación de las proteínas según su solubilidad:

Las proteínas fibrosas son insolubles en H2O. Las proteínas globulares generalmente son solubles en H2O o soluciones salinas débiles.

Las distintas solubilidades de las proteínas son de ayuda en ciertos casos en los que se les requiere, pero no son útiles para su clasificación.

Es posible formar sales de proteínas haciéndolas precipitar con sulfato de amonio saturado. Cuando la concentración de sulfato de amonio se reduce al 50%, algunas se disuelven mientras otras continúan precipitadas en el fondo de la solución.

Las globulinas se diferencian de la albúmina por su solubilidad como podemos observar en la siguiente tabla.

SOLUBILIDAD Albúmina Globulina

H2O sí

Soluciones salinas débiles sí sí

Soluciones salinas fuertes sí no

Sulfato de amonio al 50%

disuelve precipita

Actividades previas:

¿Qué se entiende por desnaturalización de proteínas? ¿qué pasa con la estructura de las proteínas cuando se desnaturalizan?

a. Desnaturalización de proteínas: Se presenta cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior tale como secundaria, terciaria y cuaternaria, quedando solamente la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional definida o fija.

La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión.

Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie.

Pérdida de las propiedades biológicas.

Cualquier elemento o factor que afecte la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá notablemente su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitarán la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces que la proteína se encuentra desnaturalizada.

b. La forma de una proteína se cambia sin alterar, manteniendo la estructura primaria, se dice que la proteína se ha desnaturalizado. Normalmente, existe una proteína nativa, o sea la proteína como la podemos encontrar en la célula. Al adicionarle un agente desnaturalizante, este hace que la proteína se desdoble y tome otra conformación denominada: espiral aleatoria, que corresponde a la forma desnaturalizada de la proteína. En algunos casos el proceso de desnaturalización es reversible. La desnaturalización involucra una alteración de la estructura secundaria y terciaria de la proteína; cualquier cambio que perturbe las fuerzas de dispersión, desnaturalizan la proteína.

Indique que sustancias se producen por la hidrolisis de una proteína. Proponga o busque el mecanismo de Hidrólisis.

La hidrólisis total de las proteínas da lugar a veinte aminoácidos, que son los llamados aminoácidos proteicos. Los aminoácidos son los monómeros de las proteínas, que a su vez son polímeros lineales de aminoácidos. En ocasiones, la hidrólisis de una proteína da lugar a aminoácidos con estructura diferente a la de estos veinte. Se trata, por lo general, de modificaciones pos-traduccionales,

Hidrólisis de las proteínasLa hidrolisis de las proteínas termina por fragmentarlas en a -aminoácidos. Existen 3 tipos de hidrolisis:

Hidrolisis ácida: Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con soluciones ácida fuertes (HCl y H2SO4). Este método destruye completamente el triptófano y parte de la serina y la treonina. Hidrolisis básica: Respeta los aminoácidos que se destruyen por la hidrolisis anterior, pero con gran facilidad, forma racematos. Normalmente se utiliza (NaOH e BaOH). Hidrolisis enzimática: Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es lenta y a menudo incompleta, sin embargo no se produce racemización y no se destruyen los aminoácidos; por lo tanto es muy específica.

¿Cuáles son los aminoácidos esenciales para el hombre y porque se le llamas así?

 Son aminoácidos esenciales aquellos que se requieren en la dieta ya que no se pueden biosintetizar. Los ocho aminoácidos esenciales son:

isoleucina leucina

lisina metionina

fenilalanina treonina

triptófano valina

Aunque la histidina es un aminoácido esencial para los niños, se cree que no lo es para los adultos. Todavía no es clara la clasificación de la histidina ni de la arginina; parece ser que ambos aminoácidos se pueden biosintetizar en cantidades más pequeñas que los demás aminoácidos no esenciales. Se debe anotar que los aminoácidos esenciales lo son únicamente respecto a la dieta y no en términos de su importancia en la estructura o función de las proteínas.

Procedimiento

1. ENSAYOS DE SOLUBILIDAD

A los 4 tubos de ensayo coloque aproximadamente 1 ml de clara de huevo (albúmina).

A cada tubo añádale respectivamente 5 ml de:

agua fría agua caliente solución de NaCl (suero) solución de NaOH al 20%

Resuma sus observaciones en la siguiente tabla:

Solvente Solubilidad Muy buena

Solubilidad Parcial

Insoluble Precipita

Agua fríaAgua calienteSolución de NaClSolución de NaOH al 20%

2. PREPARACION DE LA SOLUCION DE ALBUMINA

Vacíe en la fiola la clara de huevo sobrante de la primera parte. Añada aproximadamente 1/2 de litro de agua destilada, tape la fiola y agite fuertemente. Arme un equipo de filtración, utilizando como filtro una gasa medicinal con una capa de algodón en medio y filtre la solución preparada a un vaso grande.

3. ENSAYOS DE COLORACION

a. Reacción de Biuret: A 1 ml de la solución de albúmina añádale 1 ml de la solución de NaOH al

10% y añada gota a gota la solución de CuSO4 hasta observar cambios y la reacción posteriormente. La formación de una coloración violeta denota la presencia del enlace peptídico -CO-NH-, ya que los grupos imina -NH- del enlace peptídico forman un complejo de coordinación con el ion cúprico:

b. Reacción con Ninhidrina:

Coloque 3 ml de la solución de albúmina en un tubo de prueba y adiciónele 5 gotas de la solución de Ninhidrina al 1%. Caliente hasta el punto de ebullición y enfríe. Anote sus observaciones. La coloración azul con Ninhidrina la producen todos los aminoácidos, excepto la Prolina e la Hidroxiprolina que presenta una coloración amarilla al reaccionar.

Hidrato de Ninhidrina Violeta

c. Ensayo Xantoprotéico:

Vierta a un tubo de ensayo 2 ml de la solución de albúmina y agregue unas 5 gotas del ácido nítrico concentrado. Caliente a baño-maría por unos instantes. Posteriormente se debe dejar enfriar. Luego agregue unas cuantas gotas de hidróxido de amonio NH4OH [6M]. La aparición de una coloración amarilla, que posteriormente se torna de color naranja intenso con la adición del hidróxido de amonio denota la presencia de grupos fenilo, que se forman las Nitro-modificaciones amarillas. Anote sus observaciones.

d. Ensayo de Millón:

Coloque 2 ml de la solución de albúmina a un tubo de prueba y agregue 5 gotas del reactivo de Millón. Caliente a baño-maría hasta el punto de ebullición del mismo. La aparición del precipitado blanco, que se torna rojo posteriormente al pasar unos segundos, indica la presencia de los grupos fenólicos no sustituidos. Anote sus observaciones.

4. Ensayos de precipitación

Las proteínas por efecto de sales metálicas dan precipitados de proteinatos metálicos, formados por la parte ácida de las proteínas.

Las sales neutras hacen precipitar las proteínas debido al efecto de la desnaturalización y deshidratación. Las proteínas precipitadas de esta manera, pueden re-disolverse en el solvente original.

En tres tubos de ensayo limpios coloque 3 ml de solución de albúmina y agregue a cada uno respectivamente, 1 ml de:

solución de AgNO3 al 5% solución de CuSO4

solución de Pb (CH3COO)2

Anote sus observaciones.

5. Desnaturalización de proteínas

a. Efecto de calor:

Coloque 3 ml de la solución de albúmina a un tubo de ensayo y caliente en un vaso con agua y termómetro. Anote la temperatura a la que comenzó coagularse la albúmina.

b. Efecto de alcohol etílico:

A un tubo de ensayo con unos 3 ml de la solución de albúmina, agréguele 5 ml de alcohol etílico comercial. Anote sus observaciones.

Resultado y Discusión

1. Ensayos de solubilidad: Se colocó albumina en 4 tubos de ensayo diferentes y se les hizo

comprobar las solubilidad de 4 compuestos diferentes y se pueden observar las características de cada uno en la siguiente tablas.

Solvente Solubilidad Muy buena

Solubilidad Parcial

Insoluble Precipita

Agua fríaAgua calienteSolución de NaClSolución de NaOH al 20%

2. Preparación de las solución de Albumina

Al realizar el filtrado pudimos observar que no se filtró ya que estamos ante la presencia de un coloide, ya que su estructura tan grande no puede atravesar los poros del filtro además que hay que tener en cuenta su consistencia.

3. Ensayos de Coloración

a) Reacción de Biuret: En este experimento, inicialmente habíamos obtenidos una coloración rosada en la reacción el resultado de la mezcla nos dio color violeta, el cual en el que la teoría no mostraba, que nos indica la presencia del enlace peptídico común en las proteínas. El Biuret reconoce la presencia de este enlace y por eso decolora con un tiñe violeta.

b) Reacción con Ninhidrina: En la solución preparada con albúmina y Ninhidrina, se ha podido observar que la Ninhidrina produjo una coloración azul, demostrando que la hay presencia de los aminoácidos en esta proteína, detectados por la Ninhidrina.

c) Ensayo de Xantoprotéico: Cuando mezclamos las soluciones inicialmente nos dio una coloración naranja al final de la reacción pero, inicialmente obtuvimos una coloración amarilla, que se tornó color naranja intenso, demostrando que el ensayo de Xantoprotéico reconoce un aminoácido aromático y a los demás no obtienen esa reacción, y solo se da en un medio básico, por consiguiente pudimos observar que el hidróxido de Amonio es un confirmador de la reacción.

d) Ensayo de Millón: Después de colocar todas las soluciones en un tubo de prueba, vimos que se formó un precipitado blanco, que se tornó rojo, esto indica que en la solución está el grupo fenólicos no sustituidos y que cambio su color pero nos su estructura. El ensayo de Millón detecta al grupo benceno presente en la albumina.

4. Ensayos de Precipitación: En los tres tubos de ensayo se pudo observar las siguientes características de las reacciones.

solución de AgNO3 al 5%: La solución nos dio color blanco lechoso con la presencia de espuma y con precipitado blanco a su vez.

solución de CuSO4: Desnaturaliza a las proteínas. Formó una coloración celeste y a su vez se formó un precipitado en la solución de sulfato de cobre.

solución de Pb (CH3COO)2 – Pudimos observar que el acetato reconoce un grupo de azufre en los aminoácidos, obtuvimos también una coloración blanca oscura con la presencia de un precipitado del mismo color.

5. Desnaturalización de Proteínas

a. Temperatura de la reacción: La temperatura en la que comenzó a coagularse la albúmina fue de 86°C perdiendo la estructura normal de la albumina y obteniendo un color trasparente.

b. Efecto de alcohol etílico: Pudimos observar en la solución unas tiras de finitos hilos color blanco, esto se puedo obtener debido a que la

albúmina se ha desnaturalizado dentro de la solución.

Discusión Se desarrolló cada uno de los experimentos propuestos donde se pudo

comprobar cada una de las teorías planteadas en cuanto a que era el posible resultado de las reacciones desarrolladas en el laboratorio (Genaro 2003) en cuanto a las solubilidad de la albumina en agua fría esto debido a que al estar fría el agua no hay energía de donde se pueda sacar para generar la reacción en cambio en el agua caliente si hay dicha energía necesaria aunque su solubilidad sea parcial.

Como pudimos comprobar en el laboratorio la albumina no se puede filtrar o muy poco debido a que posee una carga molecular negativa a pesar de que su tamaño es relativamente escaso según (Kelley1994).

Su reacción con Biuret se realizó conforme a lo expuesto y se obtuvo los resultados esperados como lo son la coloración violeta formando un complejo debido al reconocimiento que hace la presencia del sulfato de cobre (Quesada Mora 2007).

La desnaturalización de proteínas se da a una temperatura de 70ºC sin embargo en la práctica de laboratorio hubo un disolución en agua lo que aumentó la cantidad de temperatura necesaria para esta reacción (Hernández 2007)

Conclusión

Al combinar y mezclar todas las soluciones propuestas, he aprendido que las proteínas constituyen una de las moléculas más importantes en el organismo ya que cumplen muchas funciones de gran utilidad para el funcionamiento de nuestro cuerpo en la vida diaria. Las proteínas están constituidas por aminoácidos por lo que a través de esta propiedad de las proteínas, por lo que se utilizaron métodos que se basan a su vez en el reconocimiento de los aminoácidos Al realizar las diferentes pruebas con la albúmina se pudo comprobar experimentalmente que este reactivo conocido como albumina es un tipo de proteína. En las reacciones donde se obtuvo precipitación fu como resultado de un cambio en el estado físico de la proteína, mientras que en la coagulación se ha producido un cambio en el estado físico y en la estructura química por eso este tipo de reacción es irreversible.

Aprendimos que hay ciertas reacciones teñidas que dan las proteínas y su color depende de los aminoácidos presentes en la molécula proteica. Las que contienen tirosina dan las reacciones Xantoproteica y de Millon.

Cuestionario

1. ¿Qué características presenta la solución acuosa de la clara de huevo?

Representa el 60% del peso del huevo. Está constituida principalmente por agua (90%) y un 10% de proteínas de alto valor biológico como la ovoalbúmina, ovo-globulina, ovo-mucina. Es una sustancia viscosa, transparente y se coagula a una temperatura de 65°C adquiriendo un color blanco, la presencia de las proteínas ya mencionada, son responsables de la espuma al montar las claras.

2. ¿Porque la solución preparada de la clara de huevo no se puede filtrar en el papel filtro?

El papel tiene poros muy pequeños, la característica del huevo es que es muy viscoso, debido a la presencia de enlaces peptídico además que la clara de huevo es un coloide, por tal motivo no se pueden separar por filtración, por lo tanto no se difunden a través de una membrana permeable o lo hacen con mucha lentitud siendo una característica de los coloides.

3. ¿Cuál es la proteína principal de la clara de huevo? La Ovoalbumina es la principal proteína presente en la clara de huevo y por

lo tanto la que posee mayor proporción en el huevo.

Ovomucina: hace al 2 % de la albumina proteica existente en el huevo. Ovoalbumina: más abundante del huevo y la más importante

Conalbumina: el 14 % de total de las proteínas de la clara de huevo

4. Cuando el ácido nítrico cae casualmente en la piel, ¿cuál de las reacciones efectuadas se produce?

El ácido nítrico al caer en la piel hidroliza las proteínas de la piel causándole quemaduras importante en la misma, el nitrato residual que queda como consecuencia de la reacción es quien da el color amarillo que tiñe la piel afectada, ya que la mayoría de nitratos acomplejados en compuestos orgánicos dan una coloración amarillenta.

5. De acuerdo a lo realizado en la práctica, explique lo que ocurre al cocinar un huevo.

Si ponemos a cocinar un huevo en agua hirviendo a una temperatura de 100ºC, lo primero que apreciamos es que en torno a la cáscara se van formando unas pequeñas burbujas. Éstas son causadas por el aire atrapado en el interior del huevo, que se va expandiendo y trata de salir a través de los poros de la cáscara.

Lo que sucede en el interior del huevo es que las fuerzas de atracción débiles que mantienen la estructura molecular de la ovoalbúmina de la clara son

bombardeadas por las moléculas de agua presentes alrededor de la solución, de manera que la estructura fluctúa y oscila. Al ir aumentando la temperatura, la energía de las moléculas de agua también aumenta proporcionalmente a la temperatura de la reacción y, en consecuencia, la energía de vibración interna de la cadena de albúmina se ve incrementada, generando la posterior desnaturalización y coagulación de esta proteína.

6. La clara de huevo o la leche se usan a menudo como antídotos en los envenenamientos con algunos metales pesados. como plomo, mercurio, bario, etc. ¿En qué fenómeno, de los que realizamos en la práctica, se basa esta aplicación?

Cuando se produce un envenenamiento, como método casero se le da leche o huevo como antídoto, debido a que las sales neutras hacen precipitar a las proteínas, esto ocurre por el efecto de desnaturalización y deshidratación. Las proteínas precipitadas pueden así disolverse y eliminar el veneno ingerido, quedando una barrera que impide el paso de microrganismos.

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