LA CALPROTECTINA EN LA

ENFERMEDAD

INFLAMATORIA INTESTINAL.

BIOMARCADORES EN

CÁNCER DE COLON.

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL (EII)

• Grupo multisistémico de enfermedades orgánicas de etiología

desconocida que cursan con inflamación crónica del tracto

gastrointestinal. Ha de sospecharse en pacientes con episodios

crónicos o recurrentes de dolor abdominal y/o diarrea.

• La EII se expresa fenotípicamente como:

– Colitis Ulcerosa: Inflamación de la mucosa del colon, sin

granulomas en biopsia. 10.4/100000 habitantes (40 % mas alta al

norte de Europa). Mayor afectación en hombres.

– Enfermedad de Crohn: Inflamación parcheada que puede aparecer

en cualquier punto del tracto gastrointestinal. 5.6/100000

habitantes (80% mas frecuente al norte de Europa). Mayor

afectación en mujeres.

– Colitis Indeterminada: De difícil catalogación (~10%).

EII. COLITIS ULCEROSA (CU)

• EI crónica que afecta y se limita a la mucosa del colon.

• Cursa en forma de brotes impredecibles y periodos de remisión

de duración variable.

• Criterios Clínicos: Diarrea con sangre, fiebre en formas

extensas, dolor abdominal, síndrome rectal, pérdida de peso,

manifestaciones extraintestinales.

• Criterios Endoscópicos: Apariencia granular con pérdida del

patrón vascular, eritema difuso, microulceraciones, exudado y

hemorragias espontáneas al roce con el endoscopio.

• Criterios Histológicos: Infiltrado inflamatorio de linfocitos, células

plasmáticas y neutrófilos en las criptas (microabcesos crípticos).

Distorsión permanente de criptas y transitoria del número de

células caliciformes.

EII. CU. CLASIFICACIÓN DE MONTREAL (2006)

EII. ENFERMEDAD DE CROHN (EC)

• EI transmural y tendente a la fibrosis que afecta a cualquier

parte del tracto digestivo.

• Manifestaciones asociadas sistémicas y extraintestinales.

• Presencia de granulomas (50-70%). Desarrollo de fístulas y

estenosis.

• Brotes de actividad inflamatoria y periodos de remisión.

EII. EC. CLASIFICACIÓN DE MONTREAL (2006)

EII. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INFLAMATORIA

(AI)

• El seguimiento de la AI (en agudizaciones o periodos pre

cínicos) es imprescindible para el pronóstico y la decisión

terapeútica.

• No existe un único marcador para este fin:

– Marcadores Invasivos (“Gold Standard”): Endoscopia, estudio

histológico. Costosos e invasivos.

– Marcadores No Invasivos: Subrogados a la dinámica real del brote.

• El “marcador ideal” no existe:

– Específico.

– Refleje la AI “a tiempo real”.

– Fácilmente aplicable en la práctica clínica.

– Capacidad de identificar precozmente un brote y un aumento sutil

de la inflamación intestinal.

EII. EVALUACIÓN DE LA AI EN CU. ÍNDICE DE

TRUELOVE & VITTIS (1955)

EII. EVALUACIÓN DE LA AI EN EC. ÍNDICE DE BEST ET AL. (1976)

CONTEXTO CLÍNICO DE LA EII

EII. CALPROTECTINA. DEFINICIÓN

• Complejo molecular (S100 A8 CALGRANULIN A / S100 A9

CALGRANULIN B) que constituye el 45% de las proteínas

citosólicas de los Neutrófilos.

• Alta afinidad por el Ca2+ (EF-hand), lo que aumenta su

estabilidad.

EII. CALPROTECTINA. CARACTERÍSTICAS

• Marcador no invasivo presente en heces.

• Resistente a la actividad bacteriana intestinal y a la actividad

proteolítica.

• Estable a Tª ambiente (hasta 7 días).

• Su concentración aumenta con la migración de los Neutrófilos

hacia el lumen intestinal.

• Monitorización de la AI en EII.

• También aparece elevada en:

– Ingesta de AINES.

– Grandes sangrados.

– Procesos de malignidad. Cáncer de colon.

CALPROTECTINA. DESPISTAJE DE ENFERMEDAD

ORGÁNICA VS FUNCIONAL

CALPROTECTINA. DESPISTAJE DE ENFERMEDAD

ORGÁNICA VS FUNCIONAL

• [Cp-f]> Sujetos sanos y TFD [27, 29, 31, 32, 34–37, 48–66].

• Buena correlación con el Estándar de Plata, Leucocitos-

Indio111. [31].

• Similar diagnóstica en comparación con Lactoferrina en heces

[59, 62] y mejor que PCR, VSG, ANCA y ASCA.

• Sobreestimación del valor diagnóstico en ciertos estudios con

controles sanos vs enfermos. (Van Rheenen et al.)

• Menor especificidad/sensiblidad en estudios en población

pediátrica y en población adulta (Van Rheenen et al.)

• Difícil diferenciar a partir de Cp-f UC de EC [27, 29].

CALPROTECTINA. CORRELACIÓN CON ÍNDICE DE

ACTIVIDAD

CALPROTECTINA. CORRELACIÓN CON ÍNDICE DE

ACTIVIDAD

• Se han establecido 4 categorías de IA: inactiva, intermedia

moderada y elevada que correlacionan con los valores de Cp-f.

• Leucocitos, VSG y PCR tienen una S, E y correlación con los

síntomas muy disminuída [62, 75, 84–89].

• La endoscopia aun sigue siento el método de referencia para

determinar el IA en CU [90-92] y EC [93-102].

• La Cp-f es más poderosa que la PCR y los índices de actividad.

• Mejor correlación en localización colónica [49, 108, 109].

• El índice de Rachmilewitz [99], correlacionó mejor con la Cp-f

(R = 0.834), que con los IA clínicos (R = 0.672), la PCR (R =

0.503), y leucocitos en sangre (R = 0.461).

CALPROTECTINA. CORRELACIÓN CON

RESPUESTA AL TRATAMIENTO

CÁNCER DE COLON (CC)

• El cáncer colorrectal (CCR) es una de las 3 primeras causas de

mortalidad por cáncer en el mundo. Un millón de nuevos casos

por año y se reportan medio millón de fallecidos.

• Asociada a estilos de vida poco saludables.

• Carácter eminentemente esporádico (70%)

• Hombres: Próstata > Pulmón > CCR

• Mujeres: Mama > CCR

CC. MECANISMO

• Mecanismo de

acumulación de

mutaciones en

oncogenes, genes

supresores de

tumores y genes de

reparación del ADN.

• 5-10 años para el

desarrollo del CC.

Importancia de

detección en primeros

estadíos (mejora el

pronóstico).

CC. PRUEBAS DE CRIBADO

CC. DETECCIÓN DE SANGRE OCULTA EN HECES

(SOH)

• Detección de la Hemoglobina en heces por técnicas

convencionales y automatizadas:

– Guayaco y benzidina: Detectan actividad peroxidasa de la

hemoglobina. Muchos FP (carne roja) y FN (Vit C)

– HemoQuant: Detección de la hb y sus derivados porfirínicos. No

afectado por interferentes con actividad peroxidasa.

– ELISA: Reacción enzimática entre la solución de materia fecal y el

anticuerpo anti-hb marcado con una enzima.

– Aglutinación de partículas de látex: Reacción indirecta. Las

partículas de látex se aglutinan cuando el anticuerpo entra en

contacto con la hb.

– Técnicas inmunoquímicas: Anticuerpo monoclonal vs hb, con

actividad peroxidasa. Falsos positivos.

– Técnicas de inmunoluminiscencia: Luminol.

CC. DETECCIÓN RÁPIDA DE SOH

Sensibilidad Especificidad VPP VPN IK Fuerza de

concordancia

Hb-f Clearview FOB® vs método automatizado

71% IC

95%(0,53-0,89)

88% IC

95%(0,81-0,95)

65% 91% 0,57; SD=0,095

IC95%

(0,382-0,765) Moderada

Hb-f Certest FOB® vs método automatizado

83% IC

95%(0,67-0,98)

99% IC

95%(0,96-1,01)

95% 95% 0,85; SD=0,064

IC95%

(0,726-0,0978) Muy buena

Tf-f Certest FOB® vs método automatizado

100% IC

95%(1-1)

100% IC

95%(1-1)

100%

100%

1; SD=0,000; IC

95%(1,000-1,000)

Muy Buena

CC. DETECCIÓN RÁPIDA DE SOH (Hb + Tf)

Tf Hb Interpretación

+ +

Sangrado

abundante.

Superior/inferior.

+ -

Sangrado

abundante.

Superior.

- + Sangrado ligero.

Inferior

- - No sangrado

CC. DETECCIÓN RÁPIDA DE SOH Y OTRAS

PATOLOGÍAS GASTROINTESTINALES

• La SOH puede indicar:

– Existencia de pólipos benignos/malignos en el colon

– Hemorroides

– Fisuras anales

– Infecciones que causan inflamación

– Úlceras

– Colitis Ulcerosa

– Enfermedad de Crohn

– Diverticulitis

– Varices esofágicas

– Etc.

• ¡A lo que se une una muy baja sensibilidad en la detección de

CC!

CC. ACTITUD ANTE LA DETECCIÓN DE SOH

MARCADORES DE CC. M2PK

• Screening de CC por M2PK-fecal (4 mg de muestra). Técnica ELISA.

• Se trata de un marcador independiente de sangrado, que no se ve

afectado por la dieta ni ofrece falsos positivos por otros sangrados

intestinales.

MARCADORES DE CC. M2PK

• Se basan en encontrar marcadores (proteómicos/DNA/RNA) que sean

representatuivos de las fases por las que va pasando el desarrollo del CCR y

que tengan utilidad en diagnóstico, pronóstico y valgan como screening.

• Biología del colonocito:

– Liberación continua y recambio total a los 4 días.

– 10exp10 células al día se producen/eliminan.

– Por la propia genética del colonocito tumoral, este se encuentra 4-5 veces

más concentrado que los colonocitos normales.

– Es necesario evitar la lisis de los colonocitos y evitar la degradación del

DNA por parte de la flora (buffer de estabilización).

– Concentración de DNA humano en las heces: 309 ng/g stool. Supone el

0,01% del total de DNA. Por lo que es necesario un proceso de

enriquecimiento por PCR antes del análisis.

– Hay que mezclar biuen las muestras y preferentemente recoger diferentes

tiempos.

MARCADORES GENÉTICOS EN COLONOCITOS

• Kras: Oncogen transductor de señales. Mutaciones más

frecuentes en codones 12,13,61. Presente en el 35-42% de CC

y en el 50% de adenomas mayores de 1cm.

• Se ha detectado también en mucosa normal, pólipos

autolimitados y criptas aberrantes no displásicas.

MARCADORES GENÉTICOS SIMPLES

• TP53: Gen que codifica para la oncoproteína p53. Las mutaciones ocurren en los exones 5, 6, 7, o 8, resultando en la desregulación del cclo celular. Mutaciones identificadoas en el 50-70% de los CC.

• APC: Responsable de la regulación de la β-catenina, que es inductora (?) de los genes asociados a la ruta de señalización Wnt.an inductor of growth-promoting genes in the Wnt signalling pathway. Detectada en el 52–60% de los CC y en el 20–82% de los adenomas.

MARCADORES GENÉTICOS SIMPLES

• Microsatélites: Repeticiones múltiples (1-5nt) muy susceptibles a errores durante la replicación.

• Mutación en genes repardores postreplicativos: MLH1 (50%), MSH2 (40%), PMS1 PMS2, MSH3, MSH6.

• La MSI afecta a genes con microsatélites en su región codificante.

• Hereditary nonpolyposis CRC (>90% in CRCs and 80% adenomas), but less frequent in sporadic CRCs (15%) and adenomas (5%)

INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES (MSI)

• Secuencias de 1800-2400pb que no aparecen en colonocitos

normales apoptotizados y sí en colonocitos tumorales que no

han sufrido este proceso.

• Estudio de Callistri D et al. establecieron un valor de corte de

25-ng value, which emerged as the most accurate cut-off in the

pilot study, obtaining 79% (95% CI, 71-87%) sensitivity and 89%

(95% CI, 83-95%) specificity.

• Abbaszadegan's study, L-DNA was detected in 64% of stool

samples from patients with CRC (n = 45) with a specificity of

95% (control n = 20). A 1476 bp fragment including exons 6 to 9

of p53 gene was used for long DNA analysis.

LONG DNA

• Dos fenotipos de CRC según grados de metilación, cada uno

con sus características epidemiológicas, histológicas y

moleculares:

– CIMP- : Con escasa metilación.

– CIMP+ : Con metilación abundante y aberrante. Asociación positiva

con la mutación de kRAS y negativa con TP53

METILACIÓN

MICRO-RNA

MICRO-RNA

• Detección en sangre periférica que detecta la presencia de la forma metilada del gen Septina 9 (SEPT9).

• Específico de CC.

MARCADORES EN SANGRE PERIFÉRICA. SEPTINA 9

MARCADORES EN SANGRE PERIFÉRICA. SEPTINA 9