重组蛋白表达和纯化技术

蛋白质表达手册gibco 课堂系列

蛋白质表达

ii 蛋白质表达手册 仅供学习参考

目录

01.蛋白质表达概述 .......................................................................1 蛋白质是怎样生成的？ ...................................................................................1

用于蛋白质表达的克隆技术 ............................................................................3

转化和质粒分离..............................................................................................6

选择表达系统 .................................................................................................7

细胞裂解和蛋白质纯化 ...................................................................................7

02. 基于哺乳动物细胞的蛋白质表达 ..............................................9 瞬时、高产量的哺乳动物表达 ........................................................................ 12

稳定的蛋白质表达用于大规模的商品化生物生产 ..........................................21

靶向蛋白表达用于稳定的细胞系开发 ............................................................22

膜蛋白生成 ...................................................................................................28

病毒导入用于哺乳动物表达 ..........................................................................30

03. 基于昆虫细胞的蛋白质表达 ...................................................33 昆虫细胞培养 ...............................................................................................37

昆虫表达系统 ...............................................................................................40

04. 基于酵母细胞的蛋白质表达 ...................................................47 毕赤酵母表达 ...............................................................................................47

PichiaPink 酵母表达系统 ..............................................................................48

传统的毕赤酵母表达 ....................................................................................49

酿酒酵母表达 ............................................................................................... 51

酵母培养 ...................................................................................................... 51

05. 基于细菌细胞的蛋白质表达 ...................................................53 pTrc 表达系统 ...............................................................................................54

T7 表达系统 .................................................................................................54

Champion pET 表达系统 ..............................................................................55

pBAD 表达系统 ............................................................................................56

用于蛋白表达的感受态细胞 ..........................................................................58

MagicMedia 大肠杆菌表达培养基 ................................................................59

iiiThermo Fisher Scientific

目录

仅供学习参考

06. 基于藻类细胞的蛋白质表达 ...................................................61 GeneArt 衣藻蛋白表达试剂盒 ......................................................................62

MAX Efficiency藻类转化试剂 .......................................................................64

GeneArt 藻类冻存试剂盒 .............................................................................65

GeneArt聚球藻蛋白表达试剂盒 ...................................................................66

细长聚球藻 PCC 7942 的转化 ......................................................................68

07. 利用体外翻译 (IVT) 实现无细胞蛋白表达 ...............................69 哺乳动物无细胞蛋白表达 .............................................................................71

细菌无细胞蛋白表达.....................................................................................79

实时监测蛋白质表达 .....................................................................................80

使用MembraneMax 试剂盒表达膜蛋白 .......................................................80

细菌无细胞表达载体 ....................................................................................82

08. 细胞裂解和蛋白质提取 ..........................................................83 M-PER 哺乳动物蛋白抽提试剂 .....................................................................85

B-PER细菌蛋白抽提试剂 .............................................................................85

Y-PER 酵母蛋白抽提试剂 .............................................................................88

I-PER昆虫细胞蛋白抽提试剂 .......................................................................89

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和片剂 ............................................................91

09. 重组蛋白纯化 ........................................................................95 GST 和 His 标签融合蛋白的纯化 ..................................................................96

选择适当的树脂形式 .....................................................................................96

其他重组标签系统 ...................................................................................... 101

其他His 标签蛋白纯化试剂盒和树脂 ..........................................................103

10. 蛋白质生产服务 ...................................................................105

11. 蛋白表达支持中心的常见问题 ..............................................109

仅供学习参考蛋白质表达手册1

蛋白质表达概述

通过重组蛋白表达技术可以分析基因调控及蛋白质结构和功

能。重组蛋白表达的运用非常广泛——从体内功能研究到大规

模生产用于结构研究和生物治疗药物开发都有涉及。本手册将

覆盖蛋白质表达的基本知识，从选择宿主系统到构建蛋白质表

达载体，并重点介绍可用于优化重组蛋白生产和纯化的关键技

巧和产品。

根据蛋白质在细胞中的功能需要合成并调控蛋白质。蛋白质图谱储存于 DNA中，其可用作模板，通过高度调控的转录过程生成信使 RNA (mRNA)。mRNA 编码的信息随后被翻译成明确的氨基酸序列，形成蛋白质 (图 1.1)。转录是信息从DNA转移至mRNA，翻译是根据mRNA指定的氨基酸序列合成蛋白质。

蛋白质是怎样 生成的？

转录 翻译

DNA

AAAAA

mRNA 蛋白质

图1.1. 简单的转录和翻译示意图。本图介绍了从DNA碱基对序列(基因) 到氨基酸多肽序列(蛋白质)的通用流程。

第 1 部分：蛋白质表达简介

2Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

在原核生物中，转录和翻译过程是同时发生的。在成熟的 mRNA转录本完全合成前，mRNA翻译便开始了。这种同时发生的基因转录和翻译称为偶联的转录和翻译。在真核生物中，该过程是空间分隔的且顺序发生，转录发生在细胞核内，翻译发生在细胞质内。翻译结束后，可通过多种方式对多肽进行修饰，完成其结构，指派位置或调控其在细胞内的活性。翻译后修饰(PTM)是对新合成的蛋白质的化学结构进行不同的添加或改变，是细胞生物学中的关键特性。

一般而言，蛋白质组学研究是研究蛋白质的各个方面，如结构、功能、修饰、位置或与蛋白质或其他分子的相互作用。要研究特定的蛋白质是如何进行生物学调控的，研究人员通常需要一种生成(制造) 目的功能蛋白的方式。考虑到蛋白质的大小和复杂度，从头合成并不是一个可行的选择。而活细胞或细胞器可以用作生产和构建蛋白质的工厂(根据提供的遗传模板)。与蛋白质不同，使用成熟的重组DNA技术，很容易合成或体外合成DNA。因此，特定基因的DNA序列可以作为模板用于后续的蛋白质表达(图1.2)。从这些DNA模板生成的蛋白质称为重组蛋白。

质粒纯化转化至

大肠杆菌中克隆导入

和表达

质粒制备转化至

大肠杆菌中基因合成导入

和表达

GeneJET质粒试剂盒

PureLinkHiPure 试剂盒

One Shot感受态细胞

ExpiCHO 或 Expi293

Lipofectamine 导入

Bac-to-Bac 表达

BL21 大肠杆菌

PichiaPink 系统

限制酶、Gateway、

TOPO 或无缝克隆技术

GeneArtStrings DNA片段或文库

GeneArt基因合成

图1.2. 一般的蛋白质表达工作流程。

第 1 部分：蛋白质表达简介

3 仅供学习参考蛋白质表达手册

克隆是指将DNA片段或目的基因从一个生物体转移至自我复制的遗传元件(如表达载体)中的过程(图1.3)。

用于蛋白质表达的克隆技术

图1.3. 基本克隆载体

启动子选择：• CMV• EF-1α• UbC

可选的表位标签：• V5• Myc• His• Xpress

克隆方法选择：• 限制性克隆• Gateway 技术• TOPO 克隆

抗生素选择标记物选择：• 新霉素 (Geneticin 抗生素)• 杀稻瘟菌素 S• 潮霉素 B• Zeocin 选择性抗生素• 霉酚酸• 嘌呤霉素

表达载体范例

PCMV GOI BGH pA f1 ori SV40 ori

A

mp

icillin pUC ori

SV40 pA

Neo

myc

in

典型的表达载体包括至少4个主要元件：

• 目的基因 (GOI) 表达框(包括启动子和基因终止或 poly (A) 信号)

• 细菌的复制起始点 (ori)

• 特定宿主的抗生素选择框(如杀稻瘟菌素S、Geneticin™选择性抗生素、潮霉素B、霉酚酸、嘌呤霉素、Zeocin™选择性抗生素抗性)

• 大肠杆菌的抗生素选择框 (如氨苄青霉素、杀稻瘟菌素S、羧苄青霉素、Zeocin选择性抗生素抗性)

其他元件包括：

• 多克隆位点 (MCS) (即多酶切接头)

• 表位标签

• 分泌信号

• 蛋白酶识别位点

• 内部核糖体插入位点 (IRES)

第 1 部分：蛋白质表达简介

4Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

宿主 表达系统 组成型启动子 诱导型启动子 诱导剂

哺乳

动物

体内 CMV (巨细胞病毒)；EF-1α (人类延伸因子α) 1；UbC(人泛素C)；SV40(猿猴病毒40)

含TetO2 (四环素操纵子)的启动子；含GAL4-UAS (酵母GAL4 上游激活序列)的启动子

四环素或多西环素；米非司酮

无细胞(兔网织红细胞)

无 不适用 不适用

无细胞(HeLa 或 CHO)

需要 T7 启动子和 T7 RNA 聚合酶用于转录

不适用 不适用

昆虫

体内 Ac5 (肌动蛋白)；OpIE1 & 2；PH (多角体蛋白)；p10

MT (金属硫蛋白) 铜

酵母

体内 GAP (磷酸甘油醛脱氢酶)

AOX1 (醛氧化酶)；GAL1 (半乳糖激酶)

甲醇；半乳糖

大肠

杆菌

体内 非常规配备 Lac (乳糖操纵子)；araBAD (L-阿拉伯糖操纵子)

IPTG；L-阿拉伯糖

无细胞 需要 T7 启动子和 T7 RNA 聚合酶用于转录

不适用 不适用

大部分载体包含启动子，用于特定宿主细胞中的表达，但一些载体可由您自行添加启动子。表 1.1列出了常见的组成型和诱导型启动子。

表1.1. 重组蛋白表达系统中常用的组成型和诱导型启动子。

取决于宿主系统，另一个重要的考虑因素是包括 Shine-Dalgarno 核糖体结合序列 (原核系统) 或 Kozak 共有序列 (真核系统)。

第 1 部分：蛋白质表达简介

5 仅供学习参考蛋白质表达手册

表位标签通过将标签的序列编码与您的基因融合，常用于目的蛋白质的轻松检测或快速纯化。表位标签可位于您的重组蛋白的N 末端或C末端。表1.2提供了一些基本的指导原则，帮助您选择表位标签。

表1.2. 不同的表位标签的典型应用。

目的 说明 标签举例

检测 靶向标签的特性明确的抗体轻松观察

V5，Xpress，myc，6XHis，GST，BioEase标签，capTEV标签，GFP，Lumio标签，HA标签，FLAG标签

纯化 提供树脂方便纯化 6Xhis，GST，BioEase标签capTEV标签

剪切 表达后，蛋白酶识别位点(TEV、EK、HRV3C、Factor Xa) 去除标签获得天然蛋白质

带有蛋白酶识别位点的任意标签(仅位于N末端)

可以利用PCR制备基因及其变异体，分离为cDNA克隆，或合成为Invitrogen™GeneArt™ Strings™ DNA片段或文库。或者可以利用 Invitogen™ GeneArt™基因合成或定向进化服务合成基因。您可在我们的从基因到蛋白质手册(thermofisher.com/genetoprotein) 中阅读更多基因构建信息

Thermo Fisher Scientific可提供各种独特的克隆技术，将您的目的基因导入合适的载体，简化了克隆步骤，并有助于加快蛋白表达。

• 限制性酶切及连接酶克隆是分子生物学家眼中的业界标准

• Invitogen™ Gateway™ 技术在载体选择和下游应用方面提供了最大的灵活性

• Invitogen™ TOPO™ 克隆提供了简单、便捷的克隆反应，一般用时不到5分钟

• Invitrogen™ GeneArt™无缝克隆和遗传组装可将多达4个较大的DNA片段同时克隆至几乎所有的线性化大肠杆菌载体中，室温下30分钟即可完成(总大小可达到40 kb)

• Invitrogen™ GeneArt™第二型组装避免了同源重组，可以同时实现至多 8 个同源或重复序列片段的无缝克隆

• GeneArt基因合成提供了100%的序列准确性，并对基因进行优化，最大程度提高蛋白表达量

如需进一步了解如何选择克隆方法，请登录：thermofisher.com/cloningmethod 或 thermofisher.com/geneartproducts

第 1 部分：蛋白质表达简介

6Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

克隆完成后，质粒进入感受态细胞 (化学感受态或电感受态大肠杆菌) 扩增并保存，该过程称为转化。化学感受态细胞是使用盐进行处理，在膜和细胞壁上开孔。然后将质粒 DNA 加入细胞，通过温和的热休克在大肠杆菌细胞中开孔，使质粒进入。而当短脉冲作用于细胞和质粒 DNA 混合物时，DNA 通过大肠杆菌膜和细胞壁上形成的瞬时孔隙导入电感受态细胞。当选择感受态细胞株时，必须考虑下列因素：

• 基因型——将其与野生型大肠杆菌相区分的菌株遗传突变 (缺失、改变或插入) 列表

• 转化效率——检测成功转化至一定体积的细胞中的超螺旋质粒 (如pUC19) 的量；定义为每微克 DNA 的集落形成单位 (cfu/μg)；我们生产的感受态细胞的效率范围为 >1 x 106 至 >3 x 1010 cfu/μg

• 应用——感受态细胞适用的实验类型；应用包括常规克隆、蛋白质表达、文库生成、克隆不稳定 DNA、ssDNA 扩增、杆粒生成和 Cre-Lox 重组

• 试剂盒形式——形式包括高通量 (96 孔)、一次性使用 Invitrogen™ One Shot™ 试管、标准试剂盒或大包装形式

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳感受态细胞株，请登录thermofisher.com/compcells

利用大肠杆菌的分子机制复制质粒 DNA 后，可使用质粒试剂盒纯化质粒 DNA (包含您的目的基因)。我们提供了 2 种用于质粒纯化的主要技术：

• 阴离子交换

• 硅质材料

对于转染至细胞系用于蛋白质表达的克隆质粒的纯化，我们推荐阴离子交换纯化，其纯度更高，内毒素水平更低。基于硅质材料的纯化适用于克隆相关的工作流程，但不适用于转染质粒，因为其内毒素和杂质水平较高。使用阴离子交换柱纯化较大的质粒可以获得更佳的结果。Invitrogen™ PureLink™ HiPure Expi 质粒试剂盒用于大规模质粒分离可以获得更高的产量，所需的时间仅为一般的质粒 DNA 分离方法的一半。

如需了解有关质粒分离的更多信息，请登录：thermofisher.com/plasmidprep

转化和质粒分离

第 1 部分：蛋白质表达简介

7 仅供学习参考蛋白质表达手册

为特定应用选择合适的表达系统是成功的关键。在选择表达系统时，蛋白质溶解度、功能、纯化速度和产量通常是最重要的考虑因素。此外，每种系统均有其各自的优势和局限性，在选择表达系统时必须考虑。我们可提供6种独特的表达系统：哺乳动物、昆虫、酵母、细菌、藻类和无细胞系统。表1.3 概括了这些表达系统的主要特性，包括各系统最常见的应用、优点和局限性。

一旦选定一种系统，则需要考虑基因导入方法，用于蛋白质表达。主要的基因导入方法包括转染和转导。

转染是将核酸导入哺乳动物和昆虫细胞的过程。实验方案和技术差异较大，包括质粒转染、化学和物理方法，如电穿孔。如需查看不同的转染方法或我们的转染试剂选择指南，请登录：thermofisher.com/transfection

对于难于采用脂质介导进行转染的细胞类型，则通常使用病毒载体。病毒介导的转染又称为转导，其为难以转染的细胞类型提供了一种方法，可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。腺病毒、肿瘤逆转录病毒、慢病毒和杆状病毒载体广泛应用于体外和体内哺乳动物细胞的基因导入。

蛋白质表达的下一步通常是分离并纯化目的蛋白。选择合适的裂解试剂和纯化树脂可以最大程度地提高蛋白质产量和活性。我们可提供已经过优化的细胞裂解配方，适用于特定的宿主系统，包括哺乳动物培养物、酵母、杆状病毒感染的昆虫和细菌细胞。大多数重组蛋白表达为带有较短的亲和标签的融合蛋白，如多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶，用于目的蛋白的选择性纯化。使用固定化金属亲和层析(IMAC) 树脂纯化重组His标签蛋白，使用还原性谷胱甘肽树脂纯化GST标签蛋白。

选择表达系统

细胞裂解和蛋白质纯化

第 1 部分：蛋白质表达简介

8Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

表达系统 最常见应用 优点 局限性

哺乳动物 • 功能分析

• 结构分析

• 抗体生成

• 复杂蛋白的表达

• 蛋白质相互作用

• 病毒生成

• 最高水平的蛋白加工

• 可以通过瞬时或稳定表达生成蛋白质

• 可靠的优化瞬时系统，可以实现快速、超高产量的蛋白质生产

• 仅悬浮培养物的产量可达克级/升

• 更严苛的培养条件

昆虫 • 功能分析

• 结构分析

• 细胞内蛋白的表达

• 蛋白复合物的表达

• 病毒生成

• 与哺乳动物蛋白加工类似

• 可用于静置或悬浮培养

• 较原核系统更严苛的培养条件

• 重组杆状病毒载体的生成十分耗时

酵母 • 结构分析

• 抗体生成

• 功能分析

• 蛋白质相互作用

• 真核蛋白加工

• 可实现大规模发酵 (克/升)

• 简单的培养基要求

• 需要发酵，以获得极高的产量

• 培养条件需要优化

细菌 • 结构分析

• 抗体生成

• 功能分析

• 蛋白质相互作用

• 规模可扩展的

• 低成本

• 简单的培养条件

• 蛋白溶解度

• 可能需要蛋白质特异性的优化

• 难以表达一些哺乳动物蛋白

藻类 • 研究光合作用、植物生物学、脂质代谢

• 基因工程

• 生物燃料生产

• 适用于光合微藻的基因修饰和表达系统

• 适用于生物燃料、营养制品和特殊化学品生产的极佳实验控制品

• 优化系统可实现稳定的筛选和表达

• 新生的技术

• 与其他宿主平台相比，开发程度较低

无细胞 • 有毒蛋白质

• 整合非天然标记或氨基酸

• 功能分析

• 蛋白质相互作用

• 翻译抑制剂筛选

• 开放式系统；能够添加非天然组分

• 快速表达

• 简单易用的形式

• 将规模扩大至毫克级的成本可能较高

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

表1.3. 不同的重组蛋白表达系统的特性。

仅供学习参考蛋白质表达手册9

基于哺乳动物细胞的 蛋白质表达

哺乳动物宿主系统是适用于生成具有最天然结构和活性的哺乳

动物蛋白的首选表达平台。哺乳动物表达系统可以实现最高水

平的翻译后加工，使蛋白质获得最佳功能活性，适合在最类似

生理学的环境中研究特定蛋白质的功能。它常用于抗体和治疗

性蛋白质以及适用于人类功能细胞分析的蛋白质的生成。

Thermo Fisher Scientific 提供了最齐全的哺乳动物表达载体、专用的培养基、导入试剂和细胞，可实现重组蛋白的高效表达、筛选和分析。有多种哺乳动物表达系统可供选择，以满足您的特殊需求。主要的选择标准包括：

哪种基因导入方法最适合？您可以使用化学试剂转染质粒 DNA，或通过电穿孔或使用重组病毒进行病毒转导，将目的基因导入哺乳动物细胞中。导入方法的选择主要取决于您使用的哺乳动物细胞类型和想要的实验效果。

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

10Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

转染 (thermofisher.com/transfection) 广泛适用于多种细胞类型，而使用 Invitrogen™ Neon™ 转染系统 (thermofisher.com/neon) 进行电穿孔或病毒转导则适用于难以转染或非分裂的细胞类型。

• 对于目的基因的病毒转导，您可以从 Invitrogen™ ViraPower™ 慢病毒和腺病毒表达系统中选择 (第30–32页)。

• 如果选择转染进行基因导入，则需要进一步考虑下列问题：

是要瞬时表达蛋白质还是构建稳定的细胞系？哺乳动物表达实验可采用瞬时表达或稳定细胞系来表达目的蛋白。

• 瞬时转染一般可维持几天的高表达，适用于蛋白快速生产和数据的快速获得。您可以选择任意哺乳动物表达载体。

• 稳定表达需要将表达载体整合至宿主基因组中，形成稳定的细胞系。这些稳定的细胞系可用于较长时间的实验或多项实验。由于表达载体包含选择性标记 (如抗生素抗性基因)，因此可以通过在培养基中加入筛选试剂 (如抗生素)，筛选出整合有重组体的细胞 (表 2.1)。在构建稳定细胞系时，为了确定最佳抗生素浓度，我们推荐建立剂量反应曲线或杀伤曲线：

– 接种 25% 汇合的未转染细胞，使其在抗生素浓度递增的培养基中生长。对于某些抗生素，您将需要计算活性药物的量以控制批次差异。

– 每 3–4 天补充选择性培养基。10–12 天后，检查培养皿中的活细胞。细胞在选择性培养基中分裂一次或两次后会开始死亡。

– 查找细胞全部死亡的最低抗生素浓度。这是适用于稳定筛选的最佳抗生素浓度。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

11 仅供学习参考蛋白质表达手册

对于表达重组体的随机整合，可以使用任意Invitrogen™pcDNA™载体。对于表达重组体的靶向整合，我们提供了Invitrogen™Jump-In™系统和Invitrogen™Flp-In™系统(第22–27页)。

是否需要诱导型或组成型表达？• 诱导型启动子可控制基因表达的时序。无诱导剂存在时，基因不表达。加入诱导剂开启表达。这是毒

性蛋白表达的理想选择。对于目的基因的调控和诱导表达，我们提供了Invitrogen™T-REx™表达系统、Invitrogen™Flp-In™T-REx™系统和Invitrogen™GeneSwitch™系统(表2.2)。

表2.2. 哺乳动物细胞表达系统比较。

表2.1. 真核细胞选择性抗生素。

选择性抗生素 最常见的选择用法 常用的工作浓度 可提供的粉状规格 可提供的液体规格

杀稻瘟菌素 S 真核生物和细菌 1–20 μg/mL 50 mg 10 x 1 mL，20 mL

遗传霉素(Geneticin、G-418)

真核生物 100–200 μg/mL 细菌200–500 μg/mL 哺乳动物细胞

1 g，5 g，10 g，25 g 20 mL，100 mL

潮霉素 B 双重选择实验和真核生物

200–500 μg/mL — 20 mL

霉酚酸 哺乳动物和细菌 25 μg/mL 500 mg —

嘌呤霉素 真核生物和细菌 0.2–5 μg/mL — 10 x 1 mL，20 mL

博来霉素 (Zeocin) 哺乳动物、昆虫、酵母、细菌和植物

50–400 μg/mL — 8 x 1.25 mL，50 mL

系统 基础表达水平 诱导表达水平 最大表达的反应时间

T-Rex 系统 低 最高 24个小时

Flp-In T-Rex 系统 最低 高 24–48个小时

GeneSwitch 系统 最低 高 24 个小时

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

12Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

• 另一方面，如果操作的是无毒性基因，且什么时候表达不重要，则可选择带有组成型表达的启动子的表达载体。为此，我们提供了 pcDNA 载体。根据细胞类型的不同，有多种方案可供选择。pcDNA 载体可提供 CMV、EF-1 或 UbC 启动子、各种不同的表位标签、标准化的蛋白质检测或纯化、多种用于创建稳定细胞系的选择性标记以及不同的克隆形式，如限制酶克隆、TOPO 克隆和 Gateway 克隆。

• 我们还可提供各种特殊的哺乳动物表达载体，用于特定的应用领域，包括附着体表达、分泌表达和细胞内靶向。

本手册将重点介绍我们提供的主要的哺乳动物表达载体和系统，用于下列各种表达应用。

哺乳动物瞬时表达系统可实现灵活且快速的蛋白质生产 (图 2.1)。它们可以在 1 至 2 周内生成大量蛋白质。我们提供了两种经过全面优化的哺乳动物瞬时表达系统，可以在 CHO 和 HEK 293 细胞中获得超高的蛋白产量。这些系统适用于人或其他哺乳动物蛋白的表达，较大肠杆菌、酵母或昆虫细胞等宿主表达系统可实现更天然的折叠和翻译后修饰——包括糖基化。

瞬时、高产量的哺乳动物表达

转染

稳定表达

瞬时表达

表达、筛选和传代

表达

分离、适应、

保存并扩增

蛋白生产

蛋白生产

高转染效率

数月

5–7天

图2.1. 哺乳动物细胞表达系统的比较。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

13 仅供学习参考蛋白质表达手册

Gibco™ ExpiCHO™ 哺乳动物瞬时表达系统为 CHO 细胞中的重组蛋白瞬时生成带来了革命性的飞跃。这款已经过全面优化的系统可以获得高达3克/升的蛋白产量，高于最佳的基于 HEK 293 的系统。ExpiCHO 系统可使您在药物开发过程的早期快速且经济高效地获取 CHO 细胞表达的蛋白质，为您提供了最高的可信度，瞬时表达的候选药物将模拟 CHO 中生产的下游生物治疗药物。

Gibco™ ExpiCHO™ 表达系统将高表达的 CHO 细胞系、化学成分限定的非动物源性培养基、优化的培养养料以及高效转染试剂相结合，它们协同作用，滴度较 Gibco™ FreeStyle™ CHO 表达系统高 160倍，较 Gibco™ Expi293™ 表达系统高 3倍。人 IgG 蛋白的表达水平可达 3 g/L (图 2.2)。

ExpiCHO 表达系统

与现有的瞬时系统相比，具有出众的表达

水平

4

2

3

160x 3x 95x 4x 25x 2x

1

0FreeStyle

CHOExpi293

人 IgG

ExpiCHO

滴度

(g/L

)

2

1

0FreeStyle

CHOExpi293

兔 IgG

ExpiCHO

滴度

(g/L

)

600

400

200

0FreeStyle

CHOExpi293 ExpiCHO

滴度

(mg/

L)

人促红细胞生成素

图2.2. FreeStyle CHO、Expi293 和 ExpiCHO 系统中的重组蛋白滴度。人 IgG、兔 IgG 和促红细胞生成素在 FreeStyle CHO、Expi293 和 ExpiCHO 瞬时表达系统中的表达水平如图所示。ExpiCHO 滴度是 FreeStyle CHO 的 25–160倍，是使用 Expi293 系统获得的滴度的 2–4倍。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

14Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

ExpiCHO 表达系统将为 CHO 细胞在候选药物筛选早期瞬时蛋白表达中的应用带来变革。将 Expi293 和 ExpiCHO 瞬时表达系统生成的重组 IgG 的糖基化模式与在稳定 CHO 细胞中表达的相同蛋白质进行比较。在 ExpiCHO 系统中生成的重组 IgG 的糖基化模式无疑更接近稳定的 CHO 细胞系统的糖基化模式 (图 2.3)，为瞬时表达的候选药物和在 CHO 中生产的下游生物治疗药物提供了极强的相关性。

90%

60%

50%

40%

20%

10%

0%

30%

80%

70%

稳定的CHO-SExpiCHOExpi293

G0F

G1F_1

G1F_2

G0

G2F

A1

Man5A1F

图2.3. CHO 细胞 (瞬时和稳定) 和 HEK 293 细胞表达的蛋白质的糖基化模式。使用 Applied Biosystems™ POROS™ MabCapture™ A 树脂收集并纯化的人 IgG 上清液样本。经过 PNG 酶切和 APTS 标记后，在 Applied Biosystems™ 3500 系列遗传分析仪上利用毛细管电泳分析糖谱。

ExpiCHO 表达系统提供了简单且灵活的实验方案，可以实现蛋白质产量、速度和规模的完美平衡，满足您特定的需要或应用 (图 2.4–2.6)。

简单且规模可调的蛋白质生产

直接使用 CHO 细胞

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

15 仅供学习参考蛋白质表达手册

图2.4. 瞬时转染实验方案——7 或 8 步完成蛋白生产。ExpiCHO 系统为您提供3种不同的实验方案，使您可以根据您的独特研究需要、时间和设备情况来自定义您的工作。

以 3–3.5 x 106

个细胞/mL 的密度接种细胞

细胞储液

第 -1 天：细胞制备 第 0 天：细胞制备 第 0 天：DNA 稀释

第 0 天：ExpiFectamineCHO 稀释 第 0 天：络合反应

第 1 天：加入增强剂 & 辅料 #1

高滴度和最大滴度实验方案

第 5 天：加入 ExpiCHO 辅料 #2

* 仅适用于最大滴度实验方案

第 0 天：细胞转染

细胞储液 转染培养物

质粒DNA

Opti-Pro

稀释细胞至 6 x 106 个细胞/mL

1 2 3

4 5 6

7 8

转染培养物

37°C

32°C32°C* (37°C)

DNA/ExpifectamineCHO 复合物

ExpiFectamineCHO

ExpiFectamineCHO增强剂

&ExpiCHO辅料

ExpiFectamineCHOOpti-Pro

转染培养物

转染培养物

ExpiCHO辅料 #2

质粒DNA

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

16Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

图2.6. ExpiCHO 表达系统的规模可调性。ExpiCHO 系统可在 15% 的控制范围内调整，培养瓶体积为125 mL 至 3 L。我们还可以在线提供体积少于 35 mL 以及生物反应器规模的实验方案。

3

2

1

00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

培养天数

最大滴度实验方案

滴度

(g/L

)

高滴度实验方案 标准实验方案

图2.5. 采用不同实验方案的人 IgG 表达动力学。(灰线) 包括 1 次辅料且无温度变化的标准实验方案。(蓝线) 包括 1 次辅料且温度变化至 32°C 的高滴度实验方案。(紫线) 使用包括 2 次辅料且温度变化至 32°C 的最大滴度实验方案的人 IgG 动力学。

100

60

20

0

40

80

培养瓶体积培养物体积 35 mL 70 mL 140 mL 280m L 1 L

125 mL 250 mL 500 mL 1 L 3 L

对照百分比

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

17 仅供学习参考蛋白质表达手册

Expi293 表达系统是瞬时表达技术的一次巨大进步，可在人类细胞中实现快速且超高产量的蛋白生产。它采用 Gibco™ Expi293F™ 表达培养基对 Gibco™ Expi293F™ 细胞进行高密度培养。瞬时表达采用了基于阳离子脂质的 Gibco™ ExpiFectamine™ 293 转染试剂，结合专为与该转染试剂同时使用而设计的优化转染增强剂。所有组分协同作用，生成的蛋白产量较以前的 293 瞬时表达系统高 2 至 10 倍。IgG 和非 IgG 蛋白的表达水平超过 1 g/L (图 2.7)。

Expi293 表达系统

订购信息

产品 大小/规格 货号

ExpiCHO 表达系统试剂盒 1 套 A29133

ExpiCHO 表达培养基 1,000 mL A2910001

ExpiCHO 表达培养基 6 x 1 L A2910002

ExpiCHO 表达培养基 10 L A2910003

ExpiCHO 表达培养基 20 L A2910004

ExpiCHO-S 细胞 1 x 107 个细胞 A29127

ExpiCHO-S 细胞 6 x 1 x 107 个细胞 A29132

ExpiFectamine CHO 转染试剂盒 足够转染 1 L 培养物 A29129

ExpiFectamine CHO 转染试剂盒 足够转染 10 L 培养物 A29130

ExpiFectamine CHO 转染试剂盒 足够转染 50 L 培养物 A29131

抗体表达阳性对照载体 1 管 A14662

pcDNA 3.4 TOPO TA 克隆试剂盒 1 套 A14697

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

18Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Expi293 表达培养基是一种化学成分限定的无血清、无蛋白培养基，可实现高密度细胞培养和转染，单位体积蛋白产量明显高于传统的培养系统 (图 2.8)。

Expi293 表达系统的独特特性

人 IgG

FreeStyle 293 Expi293

1,200

1,000

800

600

400

200

0

1,200

1,000

800

600

400

200

0

Cripto

Crip

to (µ

g/m

L)

30 mL 规模30 mL 规模

hIgG

(µg/

mL)

图2.7. 人 IgG (hIgG) 和 Fc 标签 Cripto 蛋白在 Expi293 表达系统中的表达水平超过 1 g/L (与 Invitrogen™ FreeStyle™ 293 表达系统比较)。

16

14

12

10

8

6

4

2

0

100

75

50

25

0

Expi293 培养基测试培养基 1

测试培养基 2测试培养基 3

活细胞密度

(细胞数

/mL

x 10

6 )

存活率

(%)

培养天数

培养天数

2 3 4 5 6 7 8

图2.8. Expi293 表达培养基与其他 HEK 293 培养基中生长的细胞其随时间变化的细胞存活率与活细胞密度。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

19 仅供学习参考蛋白质表达手册

Expi293F 细胞经过特殊适应培养，产率 (pg/细胞/天) 高于一般的 HEK 293 细胞，在 Expi293 表达系统中使用时，其蛋白产量较 Invitrogen™ Freestyle™ 293-F 细胞高至 1.7 倍。ExpiFectamine 293 转染试剂能够实现高密度 HEK 293 培养物的高效转染，与转染增强剂结合使用，可以进一步提升转染性能和表达水平 (图 2.9)。

Expi293 FreeStyle 2931,200

1,000

800

600

400

200

0

24 孔板中 1 mL 125 mL 培养瓶中 30 mL 3 L 培养瓶中 1 L

总量

Crip

to (µ

g/m

L)

图2.9. 人 IgG 的表达，包含和不包含转染增强剂。

增强剂 1

增强剂 2

––

+–

–+

++

hIgG

的相对表达

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

Expi293 表达系统规模可调，可以在 24 孔板中转染 1 mL 培养物，亦可在摇瓶中转染 1 L 培养物 (图 2.10)，我们还提供了应用说明指导您使用 10 L 的生物反应器培养物，单位体积蛋白产量相当。

图2.10. Expi293 与 FreeStyle 293 系统。在 3 种不同的表达规模下，Fc 标签 Cripto 蛋白的单位蛋白产量相当。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

20Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Gibco™ Expi293™ MembranePro™ 表达系统结合了 Expi293 表达系统与 Gibco™ MembranePro™ 表达系统的优点。它可以实现哺乳动物细胞表面膜蛋白，包括 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 以水溶性形式的高产量瞬时表达。

Expi293 MembranePro 表达系统生成可以捕获细胞质膜的脂筏区域的病毒样颗粒 (VLP)，VLP在细胞表面生成并释放。使用该系统可以捕获并展示天然的内源性或过表达的 GPCR 及其他细胞表面膜蛋白，用于下游分析。由于细胞可以包装 VLP 并分泌至培养基中，因此只需倒出并澄清培养基，并通过沉淀分离 VLP 即可实现功能性膜蛋白分离。这大大节省了时间、精力和制备膜组分所需的仪器。由于 VLP 捕获质膜富含受体的区域，因此在膜的粗制过程中还可以富集您的 GPCR。

Expi293 MembranePro

表达系统

订购信息

产品 大小/规格 货号

Expi293 表达系统试剂盒 1 套 A14635

Expi293 表达培养基 1,000 mL A1435101

Expi293 表达培养基 6 x 1 L A1435102

Expi293 表达培养基 10 L A1435103

Expi293 表达培养基 20 L A1435104

Expi293F 细胞 1 x 107 个细胞 A14527

Expi293F 细胞 6 x 1 x 107 个细胞 A14528

ExpiFectamine 293 转染试剂盒 足够转染 1 L 培养物 A14524

ExpiFectamine 293 转染试剂盒 足够转染 10 L 培养物 A14525

ExpiFectamine 293 转染试剂盒 足够转染 50 L 培养物 A14526

抗体表达阳性对照载体 1 管 A14662

pcDNA3.4 TOPO TA 克隆试剂盒 1 套 A14697

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

21 仅供学习参考蛋白质表达手册

与贴壁细胞 MembranePro 系统相比，Expi293 MembranePro 表达系统的膜蛋白产量高于 20 倍 (图 2.11)。其他优点还包括易用性和规模可调性。

产品订购信息，请参见第 29 页。

准实验方案蛋白产量：1 mL，0.063 μg/μL每次结合反应使用 0.64 μg 蛋白质

Expi293 MembranePro 表达系统实验方案蛋白产量：1 mL，2.79 μg/μL每次结合反应使用 0.5 μg 蛋白质

特异性结合

Bmax 39.68 pmol 配体/mg 蛋白质Kd 0.93 nM

特异性结合

Bmax 30.08 pmol 配体/mg 蛋白质Kd 1.06 nM

配体结合

(pm

ol/m

g 蛋白质

)

[3H] DHA (nM)0 5 10 15 20 25 30

50

40

30

20

10

0

[3H] DHA (nM)

配体结合

(pm

ol/m

g 蛋白质

)

0 5 10 15 20 25 30

50

40

30

20

10

0

总结合特异性结合非特异性结合

图2.11. 贴壁细胞 MembranePro 表达系统标准实验方案和 Expi293 MembranePro 表达系统实验方案用于生成 MembranePro 颗粒的比较。

我们提供了 2 种基于 CHO 的 Gibco™ Freedom™ 细胞系开发试剂盒：Gibco™ Freedom™ CHO-S™ 试剂盒和 Gibco™ Freedom™ DG44 试剂盒。采用这些试剂盒，商用许可获取简便、灵活，不必支付版税。这两款试剂盒提供了完全整合的工作流程，使用非动物源性试剂和记录全面的亲代细胞系，能够稳定生产出产 IgG 的克隆，克隆规模可调，符合最新行业生产标准。试剂盒易于使用，一般能够在不到六个月的时间里使您的目的基因从转染进入到先导克隆阶段。

稳定的蛋白质表达用于大规模的商品化

生物生产

订购信息

产品 大小/规格 货号

Freedom CHO-S 试剂盒 1 套 A1369601

Freedom DG44 试剂盒 1 套 A1373701

pOptiVEC-TOPO TA 克隆试剂盒 1 套 12744017

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

22Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Jump-In 细胞工程平台Invitrogen™ Jump-In™ 定点整合技术利用 PhiC31 整合酶介导的重组，将目的 DNA 序列稳定整合到哺乳动物细胞中特定的基因组位点 (称为pseudo attP位点)。与众所周知的重组酶 (如 Cre 和 Flp) 不同，PhiC31 整合酶可催化 2 个不同的位点之间的重组，无需相应的切割酶，实现了单向且几乎不可逆的整合。

Jump-In Fast Gateway 系统Invitrogen™ Jump-In™ Fast Gateway™ 系统将 Invitrogen™ MultiSite Gateway™ Pro 克隆和 Invitrogen™ Jump-In™ 细胞工程技术相结合，可在 2 周内生成高表达的稳定克隆的多克隆库。系统使用 PhiC31 整合酶将遗传材料整合至细胞背景中，生成高阳性率的重靶向细胞。您只需筛选 10 个克隆，找出一个理想表达水平的克隆。

在 Jump-In Fast Gateway 系统中，整合的 DNA 序列中包含了目的遗传元件 (如启动子-报告子基因对)，该元件来自于采用 pJTI™ Fast DEST 载体和 Invitrogen™ MultiSite Gateway™ Pro Plus 载体模块所构建的定点表达载体。由于 pJTI Fast DEST 载体还携带潮霉素抗性基因，因此可使用潮霉素 B 对包含稳定整合序列的转化子进行筛选，并可扩展用于下游应用 (图 2.12)。

靶向蛋白表达用于稳定的细胞系开发

目的基因

Jump-In Fast 反应

MultiSiteGateway克隆

HygR

HSV-TK

pJTIPhIC31

PhiC31 Int

转基因哺乳动物基因组

pJTIFast DEST

PhiC31 attBattR1

CmR

ccdB

attR2HSV-TK

HygR

表达载体

HygR

HSV-TK

目的基因

PhiC31 attB

哺乳动物基因组

PhiC31 pseudo attP

+ +

图2.12. 使用 Jump-In Fast Gateway 系统的工作流程。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

23 仅供学习参考蛋白质表达手册

Jump-In TI Gateway 系统Invitrogen™ Jump-In™ TI™ Gateway™ 系统将 MultiSite Gateway Pro 克隆与 Jump-In 细胞工程技术相结合，可生成表达您的目的基因的等基因稳定细胞系。系统开始时使用 R4 整合酶生成包含可靶向的 R4 attP 位点的平台细胞系，然后使用 PhiC31 整合酶重靶向包含目的遗传元件的表达载体 (图 2.13)。Jump-In TI Gateway 系统可以避免实验中的染色体位置效应。

平台细胞系基因组

重靶向基因组

R4 attB

目的基因

EF1α

表达载体

R4 Int

pJTI R4 Int

第2步：重靶向

pTK

HygR promoterlessBsdR, NeoR,

or ZeoR

R4 attP

EF1αBsdR, NeoR,or ZeoR

Gene(s) ofinterest

哺乳动物基因组

平台细胞系基因组

PhiC31 pseudo attP

pJTI

PhiC31 attB

HygR

pTK

promoterless BsdR

NeoR, or ZeoR

R4 attP

PhiC31 Int

pJTIPhiC31 Int

第1步：平台构建

pTK

HygR promoterlessBsdR, NeoR,

or ZeoR

R4 attP

+ +

图2.13. 使用 Jump-In TI Gateway 系统的工作流程。

订购信息

产品 大小/规格 货号

Jump-In Fast Gateway 系统 20 次反应 A10893

Jump-In Fast Gateway 核心试剂盒 1 套 A10894

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

24Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Jump-In 亲代细胞系试剂盒Invitrogen™ Jump-In™ 亲代细胞系试剂盒提供了包含单一 R4 attP 位点的亲代 (平台) 细胞系，可以重靶向您的遗传材料，从而生成等基因细胞系。

订购信息

产品 大小/规格 货号

Jump-In TI Gateway 系统 20 次反应 A10895

Jump-In TI Gateway 载体试剂盒 1 套 A10896

Jump-In TI Platform 试剂盒 1 套 A10897

订购信息

产品 大小/规格 货号

Jump-In CHO-K1 试剂盒 1 套 A14148

Jump-In GripTite HEK 293 试剂盒 1 套 A14150

pJTI R4 Dest CMV N-EmGFP pA 载体 100 μg A14141

pJTI R4 Exp CMV EmGFP pA 载体 100 μg A14146

pJTI R4 CMV-TO MCS pA 载体 100 μg A15004

pJTI R4 EXP CMV-TO EmGFP pA 载体 100 μg A15005

Jump-In T-REx CHO-K1 重靶向试剂盒 1 套 A15007

Jump-In T-REx HEK 293 重靶向试剂盒 1 套 A15008

Flp-In 系统Invitrogen™ Flp-In™ 系统可以稳定整合并表达您的目的基因，提供单拷贝的等基因细胞系。Flp-In 表达系统将一个 Flp 重组靶向 (FRT) 位点导入您选择的哺乳动物细胞系基因组中。包含您的目的基因的表达载体然后通过 Flp 重组酶介导的 DNA 重组被整合至基因组的 FRT 位点 (图 2.14)。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

25 仅供学习参考蛋白质表达手册

我们可提供各种 Flp-In 产品，包括表达载体和系统，以及稳定整合 FRT 位点的亲代细胞系。这些产品可以实现快速、可重复且高效的整合和 Flp-In 表达载体中目的蛋白的高水平表达，快速生成稳定的细胞系。

+pOG44+pcDNA5/FRT

AmpPSV40 pUC oriFlp-In 宿主细胞系

IacZ 和 Zeocin 融合基因表达

ATG IacZ-ZeocinFRT

Flp-In 表达细胞系

AmpPSV40 pUC oriFlp-In Host Cell LineATG IacZ-ZeocinFRT

FRT

pcDNA5/FRT表达载体

pFRT/lacZeo 稳定转染至目的哺乳动物细胞中，生成 Zeocin 抗性 Flp-In 宿主细胞系。

包含您的目的基因 (GOI) 的 pcDNA5/FRT 表达载体与 pOG44 被共转染至 Flp-In 宿主细胞系。

pOG44 表达的 Flp 重组酶催化宿主细胞的 FRT 位点与 pcDNA5/FRT 表达载体的同源重组。

表达载体的整合可实现目的基因 (GOI) 转录并使细胞获得潮霉素抗性和 Zeocin 敏感性。

1

2

3

4

PSV40

您的基因表达潮霉素表达

ATG Hygromycin GOI BGH pAFRT FRT IacZ-ZeocinAmp AmppUC ori pUC ori PCMV

BGH pA Hygromycin

GO

I

pUC o

ri

Amp

PC

MV

图2.14. Flp-In 系统工作流程。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

26Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Flp-In T-Rex 系统Flp-In T-Rex 系统将 Flp-In 系统的定点整合与 T-REx 系统功能强大的诱导表达相结合，可快速生成稳定的等基因哺乳动物细胞系，实现特定基因组位点上目的基因的四环素诱导表达 (图 2.15)。我们还可提供 Invitrogen™ Flp-In™ T-REx™ 293 细胞系，旨在帮助您节省表达实验时间。

订购信息

产品 大小/规格 货号

Flp-In 全套系统 1 套 K601001

Flp-In 核心系统 1 套 K601002

pOG44 Flp-重组酶表达载体 20 μg V600520

pFRT/lacZeo 载体 20 μg V601520

pFRT/lacZeo2 载体 20 μg V602220

pEF5/FRT/V5-DEST Gateway 载体 6 μg V602020

pEF5/FRT/V5 Directional TOPO 克隆试剂盒 20 次反应 K603501

pSecTag/FRT/V5-His TOPO TA 表达试剂盒 20 次反应 K602501

pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO TA 表达试剂盒 20 次反应 K602001

pcDNA5/FRT 哺乳动物表达载体 20 μg V601020

Flp-In-BHK 细胞系 1 mL R76007

Flp-In-CHO 细胞系 1 mL R75807

Flp-In-CV-1 细胞系 1 mL R75207

Flp-In-293 细胞系 1 mL R75007

Flp-In-Jurkat 细胞系 1 mL R76207

Flp-In-3T3 细胞系 1 mL R76107

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

27 仅供学习参考蛋白质表达手册

订购信息

产品 大小/规格 货号

Flp-In T-REx 核心试剂盒 1 套 K650001

pcDNA5/FRT/TO TOPO TA 表达试剂盒 20 次反应 K651020

pcDNA5/FRT/TO 载体试剂盒 20 μg V652020

Flp-In T-REx 293 细胞系 1 mL R78007

1 pFRT/lacZeo 稳定转染至目的哺乳动物细胞中，生成 Zeocin 抗性 Flp-In 宿主细胞系。

2 pcDNA6/TR 载体稳定转染至 Flp-In 宿主细胞系，生成 Zeocin 抗性、杀稻瘟菌素抗性 Flp-In T-Rex 宿主细胞系。

+ pcDNA6/TR

AmpPSV40 pUC oriFlp-In 宿主细胞系

lacZ 和 Zeocin 融合基因表达

ATG IacZ-ZeocinFRT

AmpPSV40 pUC ori

IacZ 和 Zeocin 融合基因表达

Amp pUC ori

ATG IacZ-ZeocinFRT

PCMV SV40 pA PSV40

TetR 基因表达

TetR Blasticidin

2.15

图2.15. Flp-In T-Rex 系统工作流程。

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

28Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

对于研究 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 及其他膜蛋白的研究人员而言，MembranePro 表达系统可以高效且可靠地提供富集的功能性膜蛋白。

• 蛋白质展示在哺乳动物细胞膜上

• 细胞质量控制和哺乳动物翻译后加工有助于生成功能蛋白

• 可从培养基中轻松收集脂质颗粒中的蛋白

• 富集含有表达受体的脂质颗粒

Invitrogen™ MembranePro™ 功能性蛋白表达系统可用于贴壁细胞培养体系，Expi293 MembranePro 表达系统可用于悬浮细胞培养体系。

MembranePro 功能性蛋白表达系统可以实现功能性哺乳动物细胞表面膜蛋白，包括 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 以水溶性形式的高效表达和展示。这个系统使用病毒样颗粒 (VLP) 捕获细胞质膜的脂筏区域，并从细胞中分泌出来。使用该系统可以捕获并展示天然的内源性或过表达的 GPCR 及其他细胞表面膜蛋白，用于下游分析。由于细胞可以包装 VLP 并分泌至培养基中，因此只需倒出并澄清培养基，并通过沉淀分离 VLP 即可实现功能性膜蛋白分离。这大大节省了时间、精力和制备膜组分所需的仪器。由于 VLP 捕获质膜富含受体的区域，因此在膜的粗制过程中还可以富集您的 GPCR。

膜蛋白生成

MembranePro 功能性蛋白表达系统

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

29 仅供学习参考蛋白质表达手册

MembranePro 功能性蛋白表达系统利用了慢病毒 gag 蛋白的功能，该蛋白在 293FT 细胞中表达时，转移至质膜，在脂筏下方出芽。由于脂筏在膜蛋白的构象状态调控和动态分选中发挥了积极作用，因此重组和内源性 GPCR 及其他受体在通过细胞“质量控制”后，定位于这些微结构域内。VLP 从细胞中出芽时，被这部分质膜包裹，并捕获天然状态的膜蛋白。

这款功能多样的即用型系统只捕获富含膜蛋白的脂筏，因此可以将其与粗制的膜组分区分开，粗制的膜组分包含总的质膜及少量内质网、高尔基体和核膜。

订购信息

产品 大小/规格 货号

Expi293 MembranePro 表达系统 10 次反应 A25869

Expi293 MembranePro 表达系统 100 次反应 A25870

订购信息

产品 大小/规格 货号

MembranePro 功能性蛋白表达试剂盒 10 次反应 A11667

MembranePro 功能性蛋白支持试剂盒 10 次反应 A11668

MembranePro 功能性蛋白支持试剂盒 60 次反应 A11669

MembranePro 功能性蛋白支持试剂盒 600 次反应 A11670

Expi293 MembranePro 表达系统结合了 Expi293 表达系统与 MembranePro 表达系统的优点。它可以实现哺乳动物细胞表面膜蛋白，包括 GPCR 以水溶性形式的高产量瞬时表达和展示 (详情参见第 20–21 页)。

如需了解如何选择适合您的实验的 MembranePro 表达系统，请登录 thermofisher.com/membranepro

Expi293 MembranePro

表达系统

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

30Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如果您正在使用难以转染的哺乳动物细胞系、动物模型，或者需要进行高效的基因导入，我们的 Invitrogen™ ViraPower™ 产品系列都是理想的瞬时或稳定表达工具。我们可提供适用于慢病毒和腺病毒表达的 ViraPower 系统 (表 2.3)。两种系统均十分高效，可构建复制缺陷型病毒颗粒，帮助确保在任意哺乳动物细胞类型中安全、高效、可重复地导入并表达基因。

病毒导入用于哺乳动物表达

表2.3. 腺病毒和慢病毒导入系统比较。

病毒系统 瞬时表达 稳定表达

分裂细胞 非分裂细胞 分裂细胞 神经细胞 药物或生长停滞细胞

接触抑制细胞

腺病毒 * *

慢病毒 * * * * * *

Invitrogen™ ViraPower™ 慢病毒表达系统可将您感兴趣的基因稳定整合到靶细胞的基因组中，因此十分适合各种功能研究。它们提供了高效病毒导入和长期基因表达，适用于分裂和非分裂细胞 (如干细胞)。

由于慢病毒表达载体中存在旱獭肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE) 和中央聚嘌呤区 (cPPT) 元件，使用 Invitrogen™ ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒表达试剂盒，可在非分裂细胞中 (如干细胞和原代神经细胞) 获得更高水平的蛋白表达 (表达水平较标准的慢病毒试剂盒高 4 倍)。载体有 Gateway 和 TOPO 克隆形式可供选择，可实现灵活且高效的克隆。Invitrogen™ ViraPower™ HiPerform™ lentiviral FastTiter™ 试剂盒使用翠绿色荧光蛋白 (EmGFP) 作为报告基团，可在两天内准确测定功能性慢病毒的滴度。

ViraPower 慢病毒表达系统

ViraPower HiPerform 慢病毒表达

试剂盒

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

31 仅供学习参考蛋白质表达手册

我们还可提供标准 ViraPower 慢病毒表达试剂盒，其中的慢病毒表达载体缺乏 WPRE 和 cPPT 元件。

Invitrogen™ ViraPower™ 腺病毒表达系统可利用 CMV 启动子或您选择的启动子实现可靠的基因导入和高水平的瞬时基因表达。使用该系统可以构建复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 腺病毒颗粒，在分裂和非分裂细胞中导入并表达高水平的目的基因。腺病毒表达载体采用 Gateway 技术，可以快速、简单且准确地克隆目的基因。

ViraPower 腺病毒表达系统

订购信息

产品 大小/规格 货号

ViraPower HiPerform Lentiviral Gateway 表达试剂盒

1 套 K533000

pLenti6.3/V5-DEST Gateway 载体试剂盒 1 套 V53306

ViraPower HiPerform Lentiviral TOPO 表达试剂盒

1 套 K531000

pLenti6.3/V5-TOPO TA 克隆试剂盒 1 套 K531520

ViraPower HiPerform Lentiviral FastTiter Gateway 表达试剂盒

1 套 K534000

pLenti7.3/V5-DEST Gateway 载体试剂盒 1 套 V53406

ViraPower HiPerform Lentiviral FastTiter TOPO 表达试剂盒

1 套 K532000

pLenti7.3/V5-TOPO TA 克隆试剂盒 1 套 K532520

ViraPower HiPerform T-REx Gateway 表达系统 20 次反应 A11141

ViraPower HiPerform T-REx Gateway 载体试剂盒

20 次反应 A11144

ViraPower HiPerform Promoterless Gateway 表达系统

20 次反应 A11145

ViraPower HiPerform Promoterless Gateway 载体试剂盒

20 次反应 A11146

293FT 细胞系 3 x 106 个细胞 R70007

第 2 部分：基于哺乳动物细胞的蛋白质表达

32Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如需了解有关哺乳动物蛋白表达系统的更多信息，请登录 thermofisher.com/mammalianexpression

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳载体，请登录 thermofisher.com/vectors ，使用载体选择工具

如需有关开展实验的支持资源和使用技巧及疑难解析帮助，请登录蛋白表达支持中心thermofisher.com/proteinexpressionsupport

更多信息和支持

订购信息

产品 大小/规格 货号

ViraPower Adenoviral Gateway 表达试剂盒 1 套 K493000

pAd/CMV/V5-DEST Gateway 载体试剂盒 6 μg V49320

ViraPower Adenoviral Promoterless Gateway 表达试剂盒

1 套 K494000

pAd/PL-DEST Gateway 载体试剂盒 6 μg V49420

293A 细胞系 3 x 106 个细胞 R70507

仅供学习参考蛋白质表达手册33

基于昆虫细胞的蛋白质表达

昆虫细胞可提供高蛋白表达水平，带有近似于哺乳动物细胞的

翻译后修饰，易于放大，而且细胞生长条件简单，可方便地转

换为高密度悬浮培养，从而用于大规模的蛋白表达。哺乳动物

系统的大部分翻译后修饰通路在昆虫细胞中也存在，因此，与

酵母或其他真核系统表达相比，可以生产与天然哺乳动物蛋白

的抗原性、免疫原性和功能相似的重组蛋白。杆状病毒表达系

统是功能强大、用途多样的导入和表达载体，可用于在昆虫细

胞中高水平表达重组蛋白。据报道，利用杆状病毒表达系统可

以获得高达 500 mg/L 的表达水平。

Thermo Fisher Scientific 提供了各种杆状病毒系统(表 3.1)，可满足您的需要：

• Invitrogen™ BaculoDirect™ 杆状病毒表达系统是一种快速、简单的重组杆状病毒生产方法。BaculoDirect™ 线性 DNA 中含有 attR 位点，可通过 Invitrogen™ Gateway™ 入门克隆进行快速、高效的重组克隆。以此获得的重组 DNA 可从 Gateway LR 反应混合物中直接提取，用于转染昆虫细胞，节省了大量的时间。在一周时间内即可分离出纯化的病毒。BaculoDirect 系统可减少手工操作时间，因而是理想的高通量表达系统。

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

34Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

• Invitrogen™ Bac-to-Bac™ 杆状病毒表达系统采用独特的杆状病毒穿梭载体，该载体通过位点特异性转座，在细菌细胞中生成重组杆状病毒表达杆粒。随后，将杆状病毒表达杆粒转染到昆虫细胞内，生成重组杆状病毒。

• Invitrogen™ Bac-N-Blue™ 杆状病毒表达系统在高水平重组蛋白生产中的应用已有十余年的时间。

• 果蝇表达系统 (DES™) 采用了特性明确的果蝇 Schneider S2 细胞和简单的表达载体，以实现重组蛋白的稳定或瞬时表达。

表3.1. 杆状病毒表达系统及其各自的优点。

系统 宿主 分泌信号 位置 纯化 表位 启动子 表达/诱导剂

优点

Baculo-Direct 系统

Sf9、Sf21 或 High Five 细胞

— N 或 C 末端

6xHis V5 多角体

蛋白

感染 快速简单的重组杆状病毒生

产方法；适合高通量应用

Bac-to-Bac 或 Bac-to-Bac HBM 系统

Sf9、Sf21 或 High Five 细胞

蜂毒素 N 末端 6xHis — 多角体蛋

白或 p10感染产生 快速的杆状病毒生产；轻松

的重组菌落的蓝/白斑筛选

Bac-N-Blue 系统

Sf9、Sf21 或 High Five 细胞

蜂毒素 C 末端 6xHis XpressV5

多角体

蛋白

感染 值得信赖的经典表达系统，

可实现高水平的重组蛋白

生产

DES 表达系统

S2 细胞 BIP C 末端 6xHis V5 MT 或 Ac5 CuSO4 或组

成型

易于使用的稳定系统，组成

型或诱导型表达；使用简单

的质粒进行表达；转染质粒

的极高度整合，无需从克隆

细胞系中进行表达筛选

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

35 仅供学习参考蛋白质表达手册

昆虫细胞中的蛋白质的峰值表达取决于下列几个因素：感染复数(MOI)、表达时间和表达的特定蛋白质。系统优化指南包括使用 5–10 的 MOI，表达时间 48–72 小时。表达时间超过 72 小时的蛋白质可能会被异常加工，因为较大的病毒载量可引起细胞过程破坏。

昆虫细胞的病毒感染一般经历 3 个阶段，可采用倒置显微镜 40x–400x 放大观察。病毒感染的阶段(假定高转染效率)包括：

早期

• 细胞直径变大——可以观察到细胞直径增大 25–50%

• 细胞核体积变大——细胞核可能“充满”整个细胞

晚期

• 细胞生长停滞——与未经感染的细胞对照相比，细胞停止生长

• 颗粒状外观

• 病毒出芽征象——细胞呈囊泡状

• 病毒包涵体——一些细胞含有包涵体，在昆虫细胞核内显示为折射晶体状

• 解离——细胞从培养皿或培养瓶上解离下来

极晚期

• 一些细胞可能充满包涵体病毒，死亡，破裂，单层细胞出现透明征象

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

36Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

制备病毒储液后，强烈建议测定储液的滴度。可进行空斑分析，确定病毒储液的滴度。进行空斑分析的主要步骤如下：

• 将 80% 汇合的细胞接种于 6 孔板中

• 制备 P1 病毒储液的连续稀释液，加入细胞中

• 27°C 下孵育 1 小时

• 将融化的 1% 琼脂糖混入新鲜培养基中

• 弃病毒上清

• 用含有琼脂糖的培养基覆盖细胞

• 放置培养板 2–3 小时，使琼脂完全固化

• 孵育培养板 10–14 天

• 计数空斑

进行上述分析时，我们建议：

• 使用健康状态极佳、传代次数少(10–20)、呈对数期生长且存活率高(>95%)的细胞

• 确认病毒储液无菌(无细菌污染)

• 使用高质量、低熔点琼脂糖

• 含有琼脂糖的培养基的温度至关重要——过热，细胞会死亡；但过冷，培养基会过快固化

• 放置 2–4 小时后再移动培养板，以使琼脂可以完全固化

• 计数稀释的培养板中的空斑数

使用下列公式计算病毒滴度：

PFU/mL = 空斑数 / (稀释度 x 每孔接种的 mL 数)

例如：每孔接种 1mL，形成 20 个空斑，病毒稀释度为 10-6。通过上面的公式，我们计算出滴度为：

PFU/mL = 20 / (10-6 x 1) = 2 x 107

我们建议使用滴度 ≥1 x 108 PFU/mL 的病毒储液进行表达研究。要扩增病毒储液，应在 MOI 为 0.05 至 0.1 的范围内感染细胞(MOI 定义为每个细胞中的病毒颗粒数)。注：如果您未测定 P1 病毒储液的滴度，则可假设滴度范围为 1 × 106 至 1 × 107 PFU/mL。

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

37 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Fisher Scientific 生产的 Gibco™ 昆虫培养基可确保您获得最佳细胞生长效果和蛋白产量。这些培养基与 Gibco 预适应细胞系结合使用(表 3.2)，可提供一种便捷的系统，节省了您的时间和精力。如需了解更多信息，请登录thermofisher.com/insectmedia，查看昆虫培养基选择表

昆虫细胞对环境因素极为敏感。除化学和营养培养因素外，物理因素亦会影响昆虫细胞的培养，因此需要通过优化使细胞生长最大化。培养昆虫细胞时应考虑下列因素：

• 温度——培养并感染昆虫细胞的最佳温度范围为 27°C 至 28°C

• pH 值——6.1 至 6.4 的范围适合大多数培养系统采用。在正常通气条件和开放式培养系统中，Gibco™ Sf-900™ II SFM 可将 pH 保持在上述范围内。

• 渗透压——培养基的最佳渗透压一般为 345 至 380 mOsm/kg，具体取决于所用的细胞系

• 换气——昆虫细胞需要被动氧扩散，以实现最佳生长和重组蛋白表达。主动或受控氧化系统需要 10% 至 50% 的溶解氧饱和度。

• 剪切力——悬浮培养可形成机械剪切力。在含血清培养基 (10% 到 20% FBS) 中培养昆虫细胞一般可提供充分的细胞剪切力保护。如果您在无血清条件下培养昆虫细胞，则需要加入剪切保护剂，如 Gibco™ Pluronic™ F-68 非离子型表面活性剂。注：在 Sf-900 II SFM 或 Gibco™ Sf-900™ III SFM 中培养细胞无需加入剪切保护剂。

如需了解有关昆虫细胞培养的更多信息，请参阅杆状病毒表达载体(BEVS)和昆虫细胞培养技术指南，可登录 thermofisher.com/bevsguide 下载

昆虫细胞培养

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

38Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

表3.2. 最常见细胞系的细胞培养条件概括。

温度 贴壁培养 悬浮培养 含有血清的培养基 无血清 培养基

抗生素 CO2-V

Sf9 27°C ± 1°C 是 是 加入 10% 热灭活的(HI) FBS的 Grace 培养基(TNM-FH)；加入 0.1% Pluronic F-68 用于悬浮培养

Sf-900 II SFM Sf-900 III SFM

青链霉素 否

Mimic Sf9

27°C ± 1°C 是 是 加入 10% HI FBS 的 Grace 培养基(TNM-FH)；加入 0.1% Pluronic F-68 用于悬浮培养

否 青链霉素 否

Sf21 27°C ± 1°C 是 是 加入 10% HI FBS 的 Grace 培养基(TNM-FH)；加入 0.1% Pluronic F-68 用于悬浮培养

Sf-900 II SFM Sf-900 III SFM

青链霉素 否

High Five

27°C ± 1°C 是/否 是 否 Express Five SFM，并添加谷氨酰胺

青链霉素 否

S2 22°–24°C 是/否 是 加入 HI FBS 的 Schneider 培养基

果蝇 SFM 青链霉素 否

D.Mel2 22°–24°C 是/否 是 否 果蝇 SFM 青链霉素 否

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

39 仅供学习参考蛋白质表达手册

订购信息

产品 规格 货号

Grace 昆虫培养基(2X)，含添加剂 100 mL 11667037

Grace 昆虫培养基，含添加剂 500 mL 11605094

Grace 昆虫培养基，含添加剂 10 x 500 mL 11605102

Grace 昆虫培养基，不含添加剂 500 mL 11595030

Grace 昆虫培养基，不含添加剂，粉状 10 x 1 L 11300027

Sf-900 II SFM 1,000 mL 10902088

Sf-900 II SFM 500 mL 10902096

Sf-900 II SFM 6 x 1,000 mL 10902104

Sf-900 II SFM 5 L 10902161

Sf-900 II SFM 10 L 10902179

Sf-900 II SFM 20 L 10902187

Sf-900 III SFM 20 L 12658001

Sf-900 III SFM 500 mL 12658019

Sf-900 III SFM 1,000 mL 12658027

Sf-900 III SFM 10 L 12658035

Express Five SFM 1,000 mL 10486025

Mimic Sf9 昆虫细胞 1 mL 12552014

Sf-900 II SFM 中培养的 Sf9 细胞 1.5 mL 11496015

Grace 中培养的 Sf9 细胞 1 mL B82501

Sf-900 III SFM 中培养的 Sf21 细胞 1 vial 12682019

Sf-900 II SFM 中培养的 Sf21 细胞 1.5 mL 11497013

Grace 中培养的 Sf21 细胞 1 mL B82101

Express Five 培养基中培养的 High Five 细胞 3 x 106 个细胞

B85502

Schneider 培养基中培养的果蝇 S2 细胞 1 mL R69007

L-谷氨酰胺(200 mM) 100 mL 25030081

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

40Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

昆虫表达系统

BaculoDirect 杆状病毒表达系统使用快速的 1 小时 Gateway™ 重组反应生成转染所需的杆粒(图 3.1)，帮助您节省了生产重组杆状病毒所需的天数。一般只需不到 1 周即可分离出纯化的重组杆状病毒。BaculoDirect 系统的主要优点包括：

• 在最短的时间内生成重组病毒的快速方法

• 强大的多角体蛋白启动子，可实现高水平表达

• C 末端或 N 末端 6xHis 和 V5 标签，可轻松完成重组蛋白的检测和纯化

• 灵活的 Gateway 克隆可以使用任何入门载体

• 胸苷激酶(TK)基因可用于非重组病毒的更昔洛韦阴性选择

• lacZ 基因用于快速测定重组病毒纯度

• 简单、现成的实验方案，可用于高通量表达

请注意该 DNA 为线性 DNA，因此生成非重组病毒的几率极低。

BaculoDirect 杆状病毒表达系统

GOI 克隆至 Gateway 入门载体

收集 P1 病毒储液

收集 P2 病毒储液

蛋白纯化

感染2 天收集蛋白质

再感染培养 3 天

LR Clonase 反应转染培养 3 天

BaculoDirect 实验方案概述

第1天

第4天

第7天

第10天

图3.1. BaculoDirect 系统实验方案概述。

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

41 仅供学习参考蛋白质表达手册

我们的改造 BaculoDirect™ 线性 DNA 中含有 attR 位点，可将您的目的基因重组克隆至 Invitrogen™ Gateway™ 入门克隆内。只需将入门克隆与 BaculoDirect 线性 DNA 和 Invitrogen™ Gateway™ LR Clonase™ 酶混合，孵育 1 小时，然后转染 Sf9 或 Sf21昆虫细胞，生成重组病毒。我们不推荐使用 Invitrogen™ High Five™ 细胞生成病毒储液，因为其转染效率较低。生成高滴度的病毒储液后，您可以使用 Sf9、Sf21、High Five 或 Invitrogen™ Mimic™ Sf9 细胞进行蛋白表达。无需转化细菌和分离大型杆状病毒杆粒，无需将转移载体和线性杆状病毒 DNA 共转染到昆虫细胞中。因此大大缩短了操作时间，并可在1周内分离纯化的杆状病毒。

FHITkDa

64

51

39

28

hGH IL1ß MAP2K3 JNK2

Please provide high-reswestern blot graphic

图3.2. 使用 BaculoDirect 系统克隆和表达的 5 种蛋白质的蛋白质印迹分析。

BaculoDirect 线性 DNA 可以轻松生成重组杆状病毒并在昆虫细胞中表达(图 3.2)。除 attR 位点用于快速 Gateway™ 重组克隆外，其骨架包含强大的多角体蛋白启动子，可实现高蛋白表达，而 C 末端或 N 末端 6xHis 和 V5 标签则可用于检测和纯化。

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

42Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统是通过在大肠杆菌内进行位点特异性转座，而不是通过在昆虫细胞内同源重组的方法来生成重组杆状病毒。pFastBac™ 载体表达框与 DH10Bac™ 大肠杆菌中的亲代杆粒发生重组，形成杆状病毒表达杆粒。亲代杆粒中含有 lacZ-α 互补因子，可用于阳性重组体的高效蓝/白斑筛选。随后将重组杆粒转染至昆虫细胞内，产生重组杆状病毒颗粒(图 3.3)。

Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统

图3.3. Bac-to-Bac 杆状病毒实验方案概述。

利用空斑分析测定病毒滴度

重组杆状病毒颗粒昆虫细胞

感染

或

重组杆粒 DNA

重组基因表达或病毒扩增

采用 Cellfectin II 试剂转染昆虫

细胞

第 1 天

第 5–7 天

第 2–3 天

第 4 天

转化转座

抗生素选择

pFastBac供体质粒

克隆目的基因

含有重组杆粒的大肠杆菌 ( )感受态 DH10Bac 大肠杆菌细胞

外源基因

Tn7R Tn7L

供体

重组供体质粒

pPolh 外源基因

辅助

pPolh

供体

杆粒

mini-attTn7lrcZ

辅助

高分子量 DNA 的小量制备

lacZ-

订购信息

产品 规格 货号

BaculoDirect C-末端转染试剂盒 5 次转染 12562039

BaculoDirect C-末端表达试剂盒 5 次转染 12562013

BaculoDirect N-末端转染试剂盒 5 次转染 12562062

BaculoDirect N-末端表达试剂盒 5 次转染 12562054

LR Clonase II 用于 BaculoDirect 试剂盒 10 次反应 11791023

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

43 仅供学习参考蛋白质表达手册

Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统的主要优点包括：

• 高滴度(达 108 PFU/mL)，可实现大规模蛋白表达

• pFastBac 载体包含多角体蛋白启动子，可获得高产量的重组蛋白

• 可靠且快速，可在 5 分钟内完成平末端 TOPO™ 克隆，帮助您节省了时间

• N 末端和 C 末端 6xHis 标签，便于纯化

• TEV 蛋白酶位点可用于去除 N 或 C 末端标签，生成天然蛋白

pFastBac 载体包含启动蛋白表达的强大的多角体蛋白启动子，和方便操作的多克隆位点。Invitrogen™ Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ 分泌型表达系统可通过蜂毒素(HBM)分泌信号表达分泌型蛋白质，适用于有毒蛋白质和需要分泌信号来引发糖基化的糖蛋白。杆状病毒分泌的糖蛋白还可以轻松在体外去糖基化——这是蛋白质结晶的重要特性。关于杆状病毒的包装限制，杆状病毒杆将根据需要继续延长，以包装 DNA。因此，系统理论上可以容纳数百 kb 碱基。在出现包装限制问题之前，标准克隆技术首先会限制插入片段大小。

订购信息

产品 规格 货号

Bac-to-Bac N-His TOPO 克隆试剂盒 20 次反应 A11099

Bac-to-Bac C-His TOPO 克隆试剂盒 20 次反应 A11098

Bac-to-Bac C-His TOPO 表达系统 20 次反应 A11100

Bac-to-Bac N-His TOPO 克隆表达系统 20 次反应 A11101

MAX Efficiency DH10Bac 感受态细胞 5 x 100 μL 10361012

Bac-to-Bac HBM TOPO 克隆试剂盒 20 次反应 A11338

Bac-to-Bac HBM TOPO 分泌型表达系统 20 次反应 A11339

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

44Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Invitrogen™ Bac-N-Blue™ 转染试剂盒(货号：K85501)中的 Bac-N-Blue™ 线性 DNA 经过特别设计，可用于 pBlueBac 和 pMelBac 载体的重组。重组病毒包含全长功能性 lacZ 基因，可以生成蓝色空斑。这可以实现轻松鉴定和纯化。Bac-N-Blue 线性 DNA 可与任意基于多角体蛋白启动子的杆状病毒转染载体结合使用。DNA 的 3 个位点发生线性化，其中之一是病毒扩增必需的基因。其在非重组病毒中水平较低，有助于轻松筛选和纯化重组病毒。

DES 系统具有诸多优点，包括：

• 直接生成昆虫细胞系，稳定地高水平表达您的蛋白质

• 包含诸多特性的各种载体，如诱导型启动子(金属硫蛋白启动子)，可用于有毒蛋白、分泌信号和标签的表达

• 使用 Invitrogen™ Drosophila S2 细胞轻松实现高密度细胞培养

• 非裂解性表达减少降解

DES 表达载体与选择载体 pCoBlast 或 pCoHygro 共转染，生成稳定的 S2 细胞系(图 3.4)。一旦表达载体整合至 S2 细胞内，含有您的目的基因的数百拷贝的表达质粒将自发整合至基因组中。经过几周筛选后，您可以建立高水平地稳定表达您的蛋白质的多克隆细胞系。

Bac-N-Blue转染试剂盒

果蝇表达系统 (DES)

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

45 仅供学习参考蛋白质表达手册

简单的细胞培养

• 室温生长 • 无需 CO2 孵箱 • 无血清培养至高密度

S2细胞

转染

快速瞬时表达 (2–7 天)

• 分析筛选• 同时筛选多个重组体• 快速小规模表达

• 深入分析研究• 大规模生产• 冻存

在 2 周内选择稳定细胞系

共转染选择载体 pCoBlast 或

pCoHygro

目的基因

诱导或组成型

表达载体

MCSTag

Ampi

cilli

n DES表达载体

基本功能分析

稳定的长期表达

图3.4. DES 表达系统概述。

第 3 部分：基于昆虫细胞的蛋白质表达

46Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如需了解有关昆虫蛋白表达系统的更多信息，请登录 thermofisher.com/insectexpression

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳载体，请登录thermofisher.com/vectors，使用载体选择工具

如需有关实验开始的支持资源和使用技巧及疑难解析帮助，请登录蛋白表达支持中心thermofisher.com/proteinexpressionsupport

更多信息和支持

订购信息

产品 规格 货号

包含 pCoBlast 的 DES 诱导型试剂盒 1 套 K512001

包含 pCoHygro 的 DES 诱导型试剂盒 1 套 K412001

包含 pCoBlast 的 DES 诱导型/分泌型试剂盒 1 套 K513001

包含 pCoHygro 的 DES 诱导型/分泌型试剂盒 1 套 K413001

DES–杀稻瘟菌素支持试剂盒 1 套 K515001

DES TOPO TA 表达试剂盒 20 次反应 K412501

pMT/V5-His A, B, & C 果蝇表达载体 各 20 μg V412020

pMT/BiP/V5-His A, B, & C 果蝇表达载体 各 20 μg V413020

pMT-DEST48 Gateway 载体 6 μg 12282018

pAc5.1/V5-His A, B, & C 各 20 μg V411020

仅供学习参考蛋白质表达手册47

基于酵母细胞的蛋白质表达

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

经证实，酵母菌株极其适用于重组真核蛋白的表达和分析，亦

适用于大规模生产。这些单细胞真核生物的遗传性质已十分明

确，可进行多种翻译后修饰。它们可以在成分确定的培养基中

快速生长，处理方法较昆虫或哺乳动物细胞更简单且价格更便

宜，可轻松用于发酵培养。

毕赤酵母具有可进行翻译后修饰的大多数较高等的真核生物亚细胞结构，因而可提高获得功能性重组蛋白的可能性。毕赤酵母的其他优点包括生长快速、遗传背景清晰、培养基配方相对简单和操作简单等——所有这些优点使得毕赤酵母成为在短时间内生产大量蛋白质的理想宿主。

Thermo Fisher Scientific提供了 Invitrogen™ PichiaPink™ 酵母表达系统，与传统的毕赤酵母表达系统一样，用于优化表达 (图 4.1)。

毕赤酵母表达

图4.1. 转化的毕赤酵母显示为白斑菌落，未转化的毕赤酵母显示为红色至粉红色菌落。

第 4 部分：基于酵母细胞的蛋白质表达

48Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

PichiaPink 酵母表达系统可实现分泌型重组蛋白的高水平 (克/升) 和大规模 (>1,000 升) 生产。该系统含有低拷贝和高拷贝质粒骨架、8 种分泌信号序列和 4 种酵母菌株，可帮助您优化获得最高的重组蛋白产量。我们提供了两种不同的 PichiaPink 表达试剂盒，用于目的重组蛋白的分泌型表达：

• Invitrogen™ PichiaPink™ 分泌优化试剂盒可用于在低拷贝和高拷贝载体中 (分别为 pPink-LC 和 pPink-HC) 筛选含有目的基因的多个信号序列，以获得最佳的重组蛋白表达和分泌。pPink-LC 和 pPink-HC 载体还可作为 Invitrogen™ PichiaPink™ 载体试剂盒单独供应。

• Invitrogen™ PichiaPink™ 分泌型蛋白试剂盒可用于将目的基因克隆至带有酿酒酵母 α 交配因子前导序列的 pPinkα-HC 质粒中，实现重组蛋白的分泌型表达。pPinkα-HC 还可作为 Invitrogen™ PichiaPink™ 分泌型蛋白载体试剂盒单独供应。

PichiaPink 酵母表达系统

产品 规格 货号

PichiaPink 分泌优化试剂盒 1 套 A11150

PichiaPink 分泌型蛋白试剂盒 1 套 A11151

PichiaPink 分泌信号套组 各 8 种 A11155

PichiaPink 载体试剂盒 1 套 A11152

PichiaPink 分泌型载体试剂盒 1 套 A11153

PichiaPink 表达株套组 4 x 1 mL A11154

PichiaPink 培养基试剂盒 1 套 A11156

订购信息

第 4 部分：基于酵母细胞的蛋白质表达

49 仅供学习参考蛋白质表达手册

传统的毕赤酵母表达

Invitrogen™ EasySelect™ 毕赤酵母表达试剂盒包含 pPICZ 和 pPICZα 载体，分别用于目的基因的细胞内和分泌型表达 (图 4.2)。这些载体包含 AOX1 启动子，用于高水平的诱导表达，以及 Zeocin 抗生素抗性标记物，用于多拷贝组分的直接筛选。它们有助于简化亚克隆和纯化并促进了表达蛋白的快速检测。

EasySelect 毕赤酵母表达试剂盒

* 框依赖性的变异Bgl II

Bam H II

pPICZα A,B,C (3.6 kb)

pPICZ A,B,C (3.3 kb)

Cla

I*Pst

I*Eco

R I

Pml I

Sfi

IBsm

B I

Asp

7181

Kpn

IXho

ISac

IINot

IXba

I

pPICZ和

pPIZαA, B, C

STOPc-myc epitopeα-factor 6xHis

Bst

B I

Eco

R I

Pml I

Sfi

IBsm

B I

Asp

718

IKpn

IXho

ISac

IINot

IApa

I*Xba

I*Sna

B I*

STOPc-myc epitope 6xHis

5 A

OX

1

AOX1 TT

PTEF1

PE

M7

Zeo

cin

CYC1 TT

pUC ori

图4.2. EasySelect™ 载体图谱。

第 4 部分：基于酵母细胞的蛋白质表达

50Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

早期的 Invitrogen™ 毕赤酵母表达试剂盒包括 pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2 和 pHIL-S1 载体，携带可实现高水平诱导型表达的 AOX1 启动子和用于组氨酸缺陷型培养基中 his4 菌株筛选的 HIS4 基因。pPIC9 携带酿酒酵母 α-因子分泌信号，而 pHIL-S1 携带毕赤酵母碱性磷酸酶信号序列 (PHO)，直接转运表达蛋白至培养基中。pHIL-D2 和 pPIC3.5 适用于细胞内表达。

Invitrogen™ 多拷贝毕赤酵母表达试剂盒可使表达量最大化，包含 pPIC3.5K、pPIC9K 和 pAO815 载体，可生成并选择包含多个目的基因的毕赤酵母菌株。它们可以通过体内方法 (pPIC3.5K 和 pPIC9K) 或体外方法 (pAO815) 分离并生成多拷贝插入片段。上述所有载体均包含可实现高水平诱导型表达的 AOX1 启动子和用于组氨酸缺陷型培养基中 his4 菌株筛选的 HIS4 基因。pPIC9K 载体指导表达蛋白质的分泌，而 pPIC3.5K 和 pAO815 表达的蛋白质仍保留在细胞内。

早期的毕赤酵母表达试剂盒

多拷贝毕赤酵母表达试剂盒

订购信息

产品 规格 货号

毕赤酵母表达试剂盒，早期试剂盒 1 套 K171001

EasySelect 毕赤酵母表达试剂盒 1 套 K174001

多拷贝毕赤酵母表达试剂盒 1 套 K175001

GS115，毕赤酵母菌株 1 株 C18100

SMD1168H，毕赤酵母菌株 1 株 C18400

KM71H，毕赤酵母菌株 1 株 C18200

SMD1168，毕赤酵母菌株 1 株 C17500

X-33，毕赤酵母菌株 1 株 C18000

pPICZ A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V19020

pGAPZ A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V20020

pGAPZα A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V20520

pPICZα A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V19520

第 4 部分：基于酵母细胞的蛋白质表达

51 仅供学习参考蛋白质表达手册

我们提供了 Invitrogen™ YES™ 载体系列用于酿酒酵母的表达。各 pYES 载体携带 GAL1 基因启动子和增强子序列，用于诱导表达。GAL1 启动子经半乳糖诱导后具有很强的转录活性，是使用最广泛的酵母启动子之一。pYES 载体还携带 2μ 复制起始点，包含高拷贝数 (10–40 个拷贝/细胞)。

酵母培养用于维持并扩增各种菌株，如酿酒酵母和毕赤酵母，需要专门的复杂培养基配方，进行克隆和蛋白质表达。我们可提供各种酵母培养基，有粉末和即用型液体形式，以满足您特定的应用需要。

酿酒酵母表达

酵母培养

订购信息

订购信息

产品 规格 货号

PichiaPink培养基试剂盒 1套 A11156

Mav203酵母细胞用CSM培养基 2L A13292

酵母氮源 1袋 Q30007

酵母氮源 500g Q30009

YPD 肉汤 1 L A1374501

产品 规格 货号

pAO815 毕赤酵母表达载体 20 μg V18020

pPIC3.5K 毕赤酵母载体 20 μg V17320

pPIC9K 毕赤酵母载体 20 μg V17520

pPIC6 A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V21020

pPIC6α A, B, & C 毕赤酵母表达载体 各 20 μg V21520

第 4 部分：基于酵母细胞的蛋白质表达

52Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如需了解有关酵母蛋白表达系统的更多信息，请登录 thermofisher.com/yeastexpression

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳载体，请登录thermofisher.com/vectors，使用载体选择工具

如需有关开展实验的支持资源和使用技巧及疑难解析帮助，请登录蛋白表达支持中心 thermofisher.com/proteinexpressionsupport

更多信息和支持

仅供学习参考蛋白质表达手册5353

基于细菌细胞的蛋白质表达

由于原核表达系统使用方便、产量较高且易于扩大规模，因此

常用于制备重组蛋白。Thermo Fisher Scientific 可提供各种适

用于大肠杆菌中重组蛋白表达的系统。表 5.1 显示了我们提供

的原核表达系统及其表达水平、表达调控严格程度 (即非诱导

表达遗漏) 差异以及蛋白表达量是否受加入的诱导剂的量控制

(滴定能力, titratability)。

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

表5.1. Thermo Fisher Scientific 提供的细菌蛋白表达系统。

表达系统 表达水平 严格的表达调控 滴定能力

pTrc ++ + ++

T7 ++/+++ + +

Champion pET +++ ++ +

pBAD + +++ +++

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

54Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

pTrc 系统是受 trc 启动子驱动的强杂合系统，包含 –35 区域的 trp 启动子和 –10 区域的 lacUV5 启动子/操纵子。pTrc 表达受 LacI 蛋白抑制，受启动子异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导。pTrc 系统相比其他细菌表达系统的主要优势之一是，由大肠杆菌 RNA 聚合酶而非 T7 聚合酶识别 trc 启动子。因此，一旦您的目的基因被克隆至 pTrc 载体，基因可在任意大肠杆菌菌株中表达，而并非只在 BL21 表达细胞株中表达。这样您就可以在克隆后直接表达，从而节省了时间。此外，由于常用菌株 (如 TOP10、DH5α™) 为 endA– 和 recA–，因此甘油储液更稳定。但如果您的目的基因有毒，则克隆步骤较为困难。另外，这些克隆菌株并非蛋白酶缺陷型的，因此目的蛋白可能会被降解。

pTrc 表达系统

订购信息

产品 规格 货号

pTrcHis A, B, & C 细菌表达载体 各 20 μg V36020

pTrcHis2 A, B, & C 细菌表达载体 各 20 μg V36520

T7 表达系统可以使用强噬菌体 T7 启动子实现高水平表达。该启动子可被 BL21 (DE3) 大肠杆菌菌株中生成的 T7 RNA 聚合酶特异性地识别。它适用于在大肠杆菌中表达可溶性、无毒的重组蛋白。T7 表达载体有助于利用 Gateway 技术、TOPO 技术或限制酶技术进行克隆，可轻松实现蛋白纯化和检测。

表达系统使用噬菌体 T7 元件控制大肠杆菌中异源基因的表达。在噬菌体 T7 中，T7 启动子驱动基因 10 (φ10 ) 的表达。T7 RNA 聚合酶特异性地识别该启动子。要表达您的目的基因，需要诱导聚合酶表达 (使用 IPTG 作为诱导剂) 或使用表达聚合酶的噬菌体感染细胞，将 T7 RNA 聚合酶导入细胞内。一旦生成足够的 T7 RNA 聚合酶，它们可与 T7 启动子结合，转录您的目的基因。

T7 表达系统

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

55 仅供学习参考蛋白质表达手册

Invitrogen™ Champion™ pET 表达系统可以在任意原核表达系统中生成最高水平的蛋白质。强 T7 lac 启动子诱导表达。该系统中的 Invitrogen™ BL21 Star™ (DES) 大肠杆菌表达菌株可以提升 mRNA 稳定性，进一步增加蛋白质产量。该细菌表达系统适用于蛋白质生物生产、抗体生成、X 线晶体学或质谱分析。与 T7 表达系统相比，Champion pET 表达载体包含额外的 lac 操纵子，位于 T7 启动子下游。lac 操纵子可以作为 lac 抑制子 (lacI 基因编码) 的结合位点，抑制 T7 RNA 聚合酶诱导的目的基因的基础转录。其相比传统的 T7 载体调控更严格，提高了质粒稳定性和细胞存活率。

Champion pET 表达系统

订购信息

产品 规格 货号

Gateway pDEST14 载体 6 μg 11801016

Gateway pDEST15 载体 6 μg 11802014

Gateway pDEST17 载体 6 μg 11803012

Gateway pDEST24 载体 6 μg 12216016

pRSET A, B, & C 细菌表达载体 各 20 μg V35120

pRSET-BFP 细菌表达载体 10 μg V35420

pRSET-CFP 细菌表达载体 10 μg V35220

pRSET-EmGFP 细菌表达载体 10 μg V35320

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

56Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

pBAD 表达系统通过调控特定的碳源，如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖，可实现严格的蛋白表达调控，表达量可调节。pBAD 适用于在大肠杆菌中表达有毒蛋白质并优化蛋白质溶解度。该系统可帮助生成蛋白质，当蛋白质低于阈值水平时变得不可溶。

pBAD 载体使用大肠杆菌 L-阿拉伯糖操纵子的调控元件精确调控异源表达水平，优化目的蛋白的产量。调控蛋白基因 AraC 位于 pBAD 载体骨架上，可用于 araBAD 启动子的阴性和阳性调控。AraC 是一种转录调节因子，可与 L-阿拉伯糖形成复合物。在 L-阿拉伯糖不存在的情况下，AraC 二聚体与 araBAD 操纵子的 O2 和 I1 半结合位点接触，形成 210 bp DNA 环 (图 5.1)。为最大程度地转录激活，需要下列两个条件：

• L-阿拉伯糖结合 AraC，引起蛋白质释放 O2 位点，结合 I1 位点相邻的 I2 位点。这会释放 DNA 环，开始转录。

• cAMP 激活蛋白 (CAP)-cAMP 复合物结合 DNA，刺激 AraC 与 I1 和 I2 结合。

pBAD 表达系统

订购信息

产品 规格 货号

Champion pET300/NT-DEST 和 pET301/CT-DEST Gateway 载体试剂盒

各 6 μg K630001

Champion pET302/NT-His 和 pET303/CT-His 载体试剂盒 各 10 μg K630203

Gateway pET-DEST42 载体 6 μg 12276010

包含 BL21 Star (DE3) One Shot 化学感受态大肠杆菌的 Champion pET100 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K10001

包含 BL21 Star (DE3) One Shot 化学感受态大肠杆菌的 Champion pET101 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K10101

包含 BL21 Star (DE3) One Shot 化学感受态大肠杆菌的 Champion pET151 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K15101

采用 Lumio 技术的 Champion pET160 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K160001

采用 Lumio 技术的 Champion pET161 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K16101

包含 BL21 Star (DE3) One Shot 化学感受态大肠杆菌的 Champion pET200 Directional TOPO 表达试剂盒

20 次反应 K20001

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

57 仅供学习参考蛋白质表达手册

我们可提供各种 pBAD 表达载体，有助于使用 Gateway 技术和 TOPO 试剂盒进行克隆，并帮助简化蛋白质检测和纯化。

AraC 二聚体

L-阿拉伯糖

转录

N N

l2l1

l2l1pBAD

pBAD

CAP

PC

PC

O2

C

C 未转录

CC

N N

图5.1. pBAD 调控概览。

请注意：当使用 pBAD 表达系统时，可以在培养基中加入葡萄糖，抑制基础表达水平。葡萄糖通过降低 cAMP 水平，减少 CAP 的结合。随着 cAMP 水平的下降，转录活性被降低。

订购信息

产品 规格 货号

pBAD/His A, B, & C 载体 1 套 V43001

pBAD/gIII A, B, & C 载体 1 套 V45001

pBAD-DEST49 Gateway 目标载体 6 μg 12283016

pBAD/Myc-His A, B, & C 载体 1 套 V44001

pBAD202 Directional TOPO 表达试剂盒 20 次反应 K420201

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

58Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

大肠杆菌生长快速，使用成本低廉，且可产生大量蛋白，因此是用于重组蛋白过表达的最流行的宿主之一。Thermo Fisher Scientific 提供了各种 BL21 感受态细胞和 BL21 衍生物，适用于使用 T7 启动子的蛋白质表达。所有细胞均由 IPTG 或 L-阿拉伯糖诱导，采用便捷的 Invitrogen™ One Shot™ 形式，可在一个试管中完成转化和回收。如需查看感受态细胞用于蛋白表达的选择表，请登录 thermofisher.com/compcells-expression

BL21 菌株来源于大肠杆菌 B 菌株，已经过特殊构建，可用于重组蛋白的高水平表达。这些菌株具有两个重要属性，使其极其适用于蛋白表达：重要遗传标记和蛋白表达的可诱导性。最重要的遗传标记帮助重组 RNA 和/或蛋白质积聚至高水平，且不会降解。可诱导性有助于最大程度地降低一些重组蛋白的毒性效应。所有感受态细胞均遵照严格的质量控制标准生产，有助于确保您获得极高的转化效率。细胞菌株的主要优点包括：

• BL21 Star(DE3)——BL21 Star(DE3) 细胞不含 RNA 酶 E，因此您的目的基因的 mRNA 更稳定。

• BL21 (DE3)pLysS/pLysE——这些大肠杆菌表达菌株包含表达低水平 T7 溶菌酶的质粒，它是 T7 RNA 聚合酶的抑制剂。这些菌株几乎无泄露表达。pLysE 一般可以提供较 pLysS 更高的 T7 溶菌酶表达水平。

• BL21-AI™ 细胞——BL21-AI 菌株中的 T7 RNA 聚合酶由 pBAD 启动子控制，L-阿拉伯糖诱导 T7 RNA 聚合酶的表达。

用于蛋白表达的感受态细胞

订购信息

产品 规格 货号

One Shot BL21 (DE3) 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C600003

One Shot BL21 Star (DE3) 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C601003

One Shot BL21 (DE3)pLysE 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C656503

One Shot BL21 (DE3)pLysS 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C606003

One Shot BL21 (DE3)pLysS 化学感受态大肠杆菌 10 x 50 μL C606010

BL21 Star (DE3)pLysS One Shot 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C602003

BL21-AI One Shot 化学感受态大肠杆菌 20 x 50 μL C607003

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

59 仅供学习参考蛋白质表达手册

Invitrogen™ MagicMedia™ 大肠杆菌表达培养基 (货号：K6803) 使用极其简单，省去了传统的 LB + IPTG 方法所需的耗时的光密度 (OD) 监测和诱导步骤 (图 5.2)。只需将适当的培养物接种到制备好的 MagicMedia 培养基中，过夜培养，收集即可。此外，使用 MagicMedia 配方所需的大肠杆菌培养体积较 LB 培养基大大减少，简化了操作和规模扩大过程。MagicMedia 培养基还适用于同时高效地表达多个克隆，用于高通量应用领域。

MagicMedia 大肠杆菌表达培养基

简单的 MagicMedia实验方案

传统实验方案——繁琐的多个步骤

挑取克隆，接种培养。

培养体积小于 100 mL 时，可省去第 1 步。

挑取克隆，接种培养。

1 1

2

3

接种到 MagicMedia 培养基中表达过夜。

早上收集并分析表达结果。

2

接种到 LB 培养基中表达。

3–7

检测 OD 值 (3–7 次)。

8

达到适当的 OD 值时，加入 IPTG 诱导剂，培养 3–5 小时。

9

晚上收集并冻存细胞沉淀。

图5.2. 使用 MagicMedia 培养基与使用传统培养基的蛋白表达比较。

第 5 部分：基于细菌细胞的蛋白质表达

60Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

MagicMedia 配方提供了高效调控 T7 启动子表达的最佳条件，适用于许多大肠杆菌系统。图 5.3 显示了使用 MagicMedia 大肠杆菌培养基培养不同的样本，提高了蛋白质产量。

如需了解有关细菌蛋白表达的更多信息，请登录 thermofisher.com/bacterialexpression

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳载体，请登录thermofisher.com/vectors，使用载体选择工具

如需有关开展实验的支持资源和使用技巧及疑难解析帮助，请登录蛋白表达支持中心 thermofisher.com/proteinexpressionsupport

更多信息和支持

98

6249

382817

kDa M 1 2 3 1 2 3 1 2 3

IL1 HPHLA2 JNK2 RacKin ER BetaINTFatty

Acid BPHSU

18291

M 1 2 3 1 2 3 1 2 3 M 1 2 3 1 2 3

图5.3. 使用 3 种培养基配方进行 8 个克隆 ORF 的表达。采用 Gateway 克隆将 8 个不同的人 ORF 克隆至 Invitrogen™ Champion™ pET300/NT-DEST 载体中。将阳性克隆转化至 BL21(DE3) 大肠杆菌中。在 LB + IPTG (泳道 1)、即用型液体 MagicMedia 培养基 (泳道 2) 或用粉末制备的 MagicMedia 培养基 (SoluPouch™ 形式) (泳道 3) 中表达克隆。取各种培养物各 200 微升裂解，在 Coomassie 亮蓝染料染色的 Invitrogen™ NuPAGE™ Novex™ 4–12% Bis-Tris 凝胶上分析。M = Invitrogen™ Novex™ SeeBlue™ 蛋白质分子量标准。

仅供学习参考蛋白质表达手册61

基于藻类细胞的蛋白质表达

莱茵衣藻 137c 和细长聚球藻 PCC 7942 是模式蓝藻生物，适

用于光合作用、植物生物学、脂质代谢及其他研究。莱茵衣藻

137c 是一种淡水绿藻，而细长聚球藻 PCC 7942 则是一种淡

水蓝绿藻 (蓝藻菌)。它们还可用作生物燃料、营养制品和特殊

化学品的生物生产平台。Thermo Fisher Scientific 提供了第一

款针对光合微藻的商品化基因修饰和表达系统。

我们最近推出的 Invitrogen™ GeneArt™ 藻类试剂盒适用于带有双重蛋白标签的高水平蛋白表达检测和纯化，以及衣藻中常见的基因沉默选择。而我们的第一代藻类试剂盒提供了灵活的基因工程方案，可生成藻类用于受强表达限制的应用领域，如信号通路工程和低水平表达的突变基因互补。我们的第一代试剂盒不适用于大量蛋白质的表达。

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

62Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Invitrogen™ GeneArt™ 衣藻蛋白表达试剂盒是第二代衣藻克隆和表达系统。与第一代 Invitrogen™ GeneArt™ 衣藻工程试剂盒一样，该系统适用于真核绿藻莱茵衣藻 137c 的核基因组的转基因表达，但已经过优化，可用于高水平表达，以及基因沉默选择，并提供了双重蛋白质标签，用于您的目的蛋白的检测和/或纯化。

该试剂盒包括冷冻的莱茵衣藻 137c 细胞、Invitrogen™ MAX Efficiency™ 藻类转基因试剂、表达载体、Invitrogen™ One Shot™ TOP10 感受态大肠杆菌细胞和简便易操作的实验方案。我们单独提供的 Gibco™ TAP 生长培养基适用于衣藻的培养和维持。

衣藻核基因组中重组基因的表达一般不稳定，且其分子机制尚未完全清楚。可能的原因包括启动子功能较差、基因组整合位置效应和转基因沉默。GeneArt 衣藻蛋白表达试剂盒提供了全新的解决方案，可用于高水平表达的蛋白质 (图 6.1 和 6.2) 和沉默选择 (图 6.3)。通过 pChlamy_4 载体从衣藻核基因组中进行转基因表达，相比叶绿体表达具有诸多优点，如翻译后修饰和蛋白质靶向和/或分泌。pChlamy_4 载体还可与无缝组装试剂盒兼容，构建重组体。如需了解有关 Invitrogen™ GeneArt™ 无缝克隆和组装的更多信息，请登录 thermofisher.com/geneartcloning

GeneArt 衣藻蛋白表达试剂盒

GeneArt 衣藻蛋白表达试剂盒的独特特性

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

63 仅供学习参考蛋白质表达手册

Prot ExpN 末端标签

木聚糖酶相对活性

Prot ExpC 末端标签

Genetic EngN 末端标签

Genetic EngC 末端标签

SimplyBlue SafeStain 染色的凝胶 采用抗 V5 抗体进行蛋白质印迹

WT

nont

rans

form

ed

Lysa

te

Supe

rnat

ant

Pelle

t

Flow

Was

h 1

Was

h 4

Elue

nt 1

Elue

nt 2

Mar

ker

Mar

ker

WT

nont

rans

form

ed

Lysa

te

Supe

rnat

ant

Flow

Was

h

Elue

nt

图6.1. 第一代和第二代衣藻蛋白表达策略比较。将里氏木霉中的水解酶木聚糖酶基因 (xyn1) 克隆至载体 pChlamy_4 中，并转化至莱茵衣藻 137c 中。使用 Molecular Probes™ EnzChek™ Ultra 木聚糖酶分析试剂盒 (货号：E33650) 检测木聚糖酶活性。使用第二代系统从 pChlamy_4 重组体中获得的木聚糖酶活性水平 (Prot Exp) 较我们的第一代 GeneArt 衣藻工程试剂盒系统 (Genetic Eng) 高 17 倍。

图6.2. 转化的衣藻中的蛋白表达分析。将里氏木霉中的水解酶木聚糖酶基因 (xyn1) 克隆至载体 pChlamy_4 中，并转化至莱茵衣藻 137c 中。利用蛋白质印迹分析检测木聚糖酶表达，结果显示木聚糖酶蛋白占总的可溶性蛋白的约 1%。

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

64Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

将衣藻用于研究和开发所面临的最大障碍之一是难以将外源性 DNA 导入衣藻菌株内。可以采用诸如玻璃微珠搅拌、电穿孔和微粒轰击等方法，但转化效率较低。

Thermo Fisher Scientific 提供了 Invitrogen™ MAX Efficiency™ 藻类转化试剂，在电穿孔前使用该试剂预先处理细胞，可以提高多种衣藻菌株的转化效率。它增加了衣藻细胞的通透性，提高了电穿孔将 DNA 导入细胞核的效率。我们观察到，在 10 种不同的衣藻菌株 (包括野生型和突变型) 中，使用环状或线性 DNA 以及 PCR 片段，与此前推荐的转化条件相比，采用该试剂盒可以将转化效率提高 >200 倍。

MAX Efficiency 藻类转化试剂

表达天数

木聚

糖酶

活性

变化

(相

对)

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

-0.2

1 4 8 12 20

无沉默基因沉默

图6.3. 消除基因沉默。将里氏木霉中的水解酶木聚糖酶基因 (xyn1) 克隆至载体 pChlamy_4 中，并转化至莱茵衣藻 137c 中。使用 EnzChek Ultra 木聚糖酶分析试剂盒检测木聚糖酶活性，每日检测 1 次，检测 3 周，将其与在其他系统中的表达水平相比较。将木聚糖酶基因和博来霉素/Zeocin 选择性抗生素抗性基因 Sh ble (来源于印度斯坦链异壁菌) 在 pChlamy_4 载体中融合，避免了基因沉默，这样蛋白质可以在多代细胞中表达 (不论有无选择压力)。

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

65 仅供学习参考蛋白质表达手册

Invitrogen™ GeneArt™ 藻类冻存试剂盒可用于保存莱茵衣藻和普通小球藻菌株和克隆，–80°C 至少可保存 2 年，无需液氮储存和连续培养即可保存您的克隆 (图 6.6)。

GeneArt 藻类冻存试剂盒

订购信息

产品 规格 货号

GeneArt 衣藻蛋白表达试剂盒 10 次反应 A24244

TAP 生长培养基，适用于衣藻培养 1 L A1379801

TAP 生长培养基，适用于衣藻培养 6 x 1 L A1379802

MAX Efficiency 藻类转化试剂 40 次反应 A24229

复苏后的时间 (h)

OD

750

160

140

120

100

80

60

40

20

0

0 16 24 40 48 64 80

新鲜培养物

冻存密度 2.5 x 107 个细胞/mL

冻存密度 1.25 x 107 个细胞/mL

图6.6. 冻存衣藻的复苏。对在 TAP 培养基中培养的新鲜的衣藻培养物 (深蓝色线) 和此前使用 GeneArt 藻类冻存试剂盒冻存并遵循标准实验步骤在 TAP 培养基中复苏的衣藻培养物 (紫色和浅蓝色线) 进行 80 小时的 OD750 值测量 (24°C，110 rpm 振荡器)。在上述三种条件下，生长情况一致，证明使用 GeneArt 藻类冻存试剂盒制备冻存的衣藻样本复苏后的生长特性与新鲜样本类似。在小球藻中也观察到类似的结果 (野生型和转化体，数据未显示)。

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

66Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Invitrogen™ GeneArt™ 聚球藻蛋白表达试剂盒是第二代聚球藻克隆和表达系统。与第一代 Invitrogen™ GeneArt™ 聚球藻工程试剂盒一样，该表达系统采用蓝藻菌细长聚球藻 PCC 7942，但已经过优化，可用于高水平表达，并提供了双重蛋白质标签，用于您的目的蛋白的检测和/或纯化。

该试剂盒包括冷冻的蓝藻菌细胞、表达载体、One Shot TOP10 感受态大肠杆菌细胞和简便易操作的实验方案。我们单独销售的 Gibco™ BG-11 培养基可用于部分蓝藻菌的生长和维持，包括细长聚球藻。

GeneArt 聚球藻蛋白表达试剂盒可通过 pSyn_6 载体实现稳定的组成型表达 (图 6.4 和 6.5)。载体还可与无缝组装试剂盒兼容，构建重组体。

GeneArt 聚球藻蛋白表达试剂盒

GeneArt 聚球藻蛋白表达试剂盒的独特特性

订购信息

产品 规格 货号

GeneArt 藻类冻存试剂盒 100 次 A24228

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

67 仅供学习参考蛋白质表达手册

使用 SimplyBlue SafeStain 染色的 SDS-PAGE 凝胶

采用抗 V5 抗体进行蛋白质印迹

pSyn_6GUS_V5_His

TSP Eluent

pSyn_6_GUS

M TSP Eluent

pSyn_6GUS_V5_His

TSP Eluent

pSyn_6_GUS

M TSP Eluent

pSyn_6_GUS_no tag

GU

S 相

对活性

(OD

405/

OD

750)

pSyn_6_GUS_with tag pSyn_1_GUS_no tag

160

140

120

100

80

60

40

20

0

图6.4. 第一代和第二代聚球藻蛋白表达策略比较。将 β-葡萄糖苷酸酶基因 (GUS) 克隆至载体 pSyn_6 内，并转化至细长聚球藻中 (GUS 活性阴性)。使用 pSyn_6 载体获得的 GUS 活性水平明显高于我们的第一代 GeneArt™ 藻类工程系统 (pSyn_1)。

图6.5. 转化的细长聚球藻的蛋白表达分析。采用推荐的实验方案将 β-葡萄糖苷酸酶基因 (GUS) 克隆至载体 pSyn_6 内，并转化至细长聚球藻中 (GUS 活性阴性)。利用 SDS-PAGE 分离蛋白质， (左) 使用 Invitrogen™ Novex™ SimplyBlue™ SafeStain 显示总蛋白表达。(右) 利用蛋白质印迹分析检测 GUS 表达，结果显示 GUS 蛋白占总可溶性蛋白的 >20%。M = 蛋白Marker，TSP = 总可溶性蛋白。

第 6 部分：基于藻类细胞的蛋白质表达

68Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

细长聚球藻 PCC 7942 的转化需依赖细胞染色体和含有与染色体同源的外源非自主性复制 DNA 之间的同源重组。染色体的整合位置 (中性位点，NS1) 已被用作克隆位点，因为它可破坏中性位点，且无表型异常，从而实现异位序列的同源重组。当采用含有抗生素抗性基因盒和中性位点序列的载体 (pSyn_1 和 pSyn_6) 转化时，载体中性位点序列和细长聚球藻染色体之间会发生双重同源重组。启动子促进目的基因和筛选标记 (壮观霉素抗性基因) 插入中性位点内，载体骨架 (pUC) 丢失，从而实现了细长聚球藻 PCC 7942 中重组基因的表达，整合效率 >80%。

细长聚球藻PCC 7942 的转化

如需了解有关藻类表达试剂盒的更多信息，请登录thermofisher.com/algaeexpression

如需我们帮助您选择适合您的实验的最佳载体，请登录thermofisher.com/vectors

如需有关开展实验的支持资源和使用技巧及疑难解析帮助，请登录 thermofisher.com/proteinexpressionsupport

更多信息和支持

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产品 规格 货号

GeneArt 聚球藻蛋白表达试剂盒 10 次反应 A24243

BG-11 培养基，适用于蓝藻菌 1 L A1379901

BG-11 培养基，适用于蓝藻菌 6 L A1379902

仅供学习参考蛋白质表达手册69

利用体外翻译 (IVT) 实现 无细胞蛋白表达

无细胞蛋白表达是使用全细胞的可翻译提取物进行蛋白质的体

外合成。一般而言，全细胞提取物中包含翻译和翻译后修饰

所需的全部大分子组分。这些组分包括调节蛋白因子、转录因

子、核糖体、tRNA 和氨基酸。加入 RNA 聚合酶、辅助因子、

核糖核苷酸和特定的基因模板后，这些提取物可在几个小时内

合成目的蛋白。

无细胞蛋白表达系统较传统的体内系统具有诸多优点。无细胞表达无需细胞培养即可实现重组蛋白的快速合成。无细胞系统可以用修饰的氨基酸实现蛋白质标记以及蛋白表达，在其他情况下这些蛋白质会被细胞内的蛋白酶快速蛋白降解。此外，采用无细胞方法更易于同时表达多种不同的蛋白质 (例如：通过多种不同的重组 DNA 模板小量表达来检测蛋白突变) [1]。

Thermo Fisher Scientific 提供了多种优化的无细胞表达系统 (表 7.1)，可使用来源于人类细胞、中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、兔网织红细胞或细菌细胞的裂解物快速合成重组蛋白。细菌来源的系统可以获得高蛋白产量，哺乳动物系统则更容易生成带有天然翻译后修饰的蛋白质。人类和 CHO 细胞系来源的蛋白质一般为全长和功能活性蛋白，其产量较使用兔网织红细胞裂解物获得的产量高几倍。对于膜结合蛋白，可用 Invitrogen™ MembraneMax™ 蛋白表达系统来表达，其包括带有蛋白支架的脂质双层。

Algal

Cell Free Bacterial

MammalianInsect

Yeast

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

70Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

表7.1. 无细胞蛋白表达系统比较。

HeLa(哺乳动物 )

CHO(哺乳动物 )

兔网织红细胞(哺乳动物 )

大肠杆菌(细菌 )

产量 高(达 750 μg/mL)

高(达 750 μg/mL)

低(达 10 μg/mL)

高(达 1 mg/mL)

模板 DNA/mRNA DNA/mRNA mRNA DNA

推荐用于 >100 kDa 的蛋白质 是 是 否 可能

推荐用于 <20 kDa 的蛋白质 是 是 否† 是

使用 CECF* 方法获得更高的表达 是 是 否† 未检测

二硫键形成 是 是 是 可能

磷酸化 是 是 是 否

糖基化 是 (N-连接) 否 可能‡ 否

膜蛋白表达 可能 可能 可能‡ 是§

荧光和比色分析 是 是 否 是

* CECF = 连续交换式无细胞系统，通过透析膜添加营养物。† 由于血红蛋白的干扰。‡ 需要加入微粒体膜。§ 使用 MembraneMax 系统。 全部系统均可用于研究蛋白质–蛋白质相互作用、蛋白质–DNA 相互作用和同源分析。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

71 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Fisher Scientific 提供了多种优化的无细胞表达系统，可使用基于 HeLa-、CHO- 或兔网织红细胞裂解物系统快速合成重组蛋白。这些哺乳动物系统可以生成全长的功能活性蛋白，CHO 和 HeLa 系统的蛋白产量一般高于兔网织红细胞系统。此外，来源于培养细胞的系统 (如 HeLa 或 CHO 细胞系) 的性能较来源于活的动物的系统 (如兔网织红细胞裂解物系统) 更稳定。

特点：

• 灵活——系统可以使用 DNA、mRNA 或 PCR 模板

• 快速——蛋白质可以在 90 分钟内表达

• 使用简单——试剂盒包括蛋白表达实验所需的全部试剂和附件

• 高性能——与其他供应商的同类产品相比，试剂盒可以最大程度地提高蛋白产量和功能

• 更多选择——提供各种哺乳动物表达系统，可适应不同的载体、标签、产量要求、功能需要和成本考虑

Thermo Scientific™ 一步法人体外翻译试剂盒是独特的基于 HeLa 细胞裂解物的蛋白表达系统，可用于体外翻译或偶联的转录/翻译反应 (图 7.1)。与优化的 pT7CFE1 表达载体结合使用时，90 分钟内完成的蛋白表达反应可延长达 6 小时，连续蛋白产量达 100 μg/mL。人 IVT 试剂盒可以表达功能性酶、磷酸化蛋白、N-连接糖蛋白和膜蛋白，立即用于蛋白质相互作用研究、快速突变分析和活性检测。

特点：

• 功能性——使用人的翻译机制表达活性蛋白

• 便捷——一步完成转录和翻译

• 高性能——较兔网织红细胞裂解物体外翻译更高的产量

• 可重复——生产的蛋白质具有批次间一致性

哺乳动物无细胞蛋白表达

一步法人体外翻译试剂盒

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

72Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Thermo Scientific™ 一步法高产量体外翻译系统 (图 7.2) 可用于功能蛋白的表达，每 mL 产量较其他哺乳动物体外翻译系统高 10 到 100 倍 (图 7.3)。这些系统使用 HeLa 或 CHO 细胞提取物，利用其稳定的翻译机制，生成功能性全长蛋白。在这些系统中，蛋白表达在专利的透析装置中进行，可以连续供应核苷酸、氨基酸和能量生成基质，同时去除蛋白合成的抑制剂。这种连续交换式无细胞 (CECF) 系统过夜孵育的蛋白表达量可达 750 μg/mL。这些全套小量试剂盒包括重组基因转录和翻译所需的全部组分，如优化的表达载体——基于 PT7CFE1 的质粒。当在 HeLa 和 CHO 系统之间选择时，成本和目标应用领域是两项重要的标准。CHO 提取物系统的单位反应成本较 HeLa 提取物系统更低，且来源细胞系与生成治疗性蛋白的细胞系相同。

特点：

• 高表达——表达的蛋白质达 750 μg/mL

• 快速——6 小时到过夜孵育可表达高水平的蛋白质

• 功能性——获取功能活性蛋白质，包括含有二硫键的蛋白质

• 组分稳定性方案——低压冻干的 CHO 细胞裂解物可 –20°C 保存

• 经济型方案——CHO 系统的单位反应成本更低

一步法高产量体外翻译试剂盒 (HeLa 和 CHO

细胞)

订购信息

产品 规格 货号

一步法人体外翻译试剂盒 – DNA 8 次反应 (各 25 μL) 88881

一步法人体外翻译试剂盒 – DNA 40 次反应 (各 25 μL) 88882

mRNA 或线性或环状DNA 模板

转录/翻译90 分钟，30°C

图7.1. 用于 DNA 的一步法人体外翻译试剂盒概览。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

73 仅供学习参考蛋白质表达手册

旋开锥形管的螺旋盖。取出透析装置。操作透析装置时请使用手套。

1 2 3

4 5 6

7 8

将透析装置轻轻置于干净的表面上。

在锥形管中使用无核酸酶的水稀释 4X 透析缓冲液。盖上盖子，混匀。

旋开盖子，将装置放回锥形管中，再水化透析膜。确认透析膜完全浸湿。

在 30°C 孵箱中孵育 30 分钟。 从孵箱中取出透析装置，旋开螺旋盖。将含有 CHO 裂解物的反应上清液转移至透析装置中。

更换锥形管中的装置，盖上盖子。

在 30°C 振荡培养箱中孵育 6 小时至过夜。

图7.2. Thermo Scientific™ 一步法 CHO 高产量体外翻译试验试剂盒的步骤总结。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

74Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

His.GST.HRV3c.Protein.HA His.GST.HRV3c.Protein.HA

His.GST.HRV3c.Protein.HA

人 CHO

Rb1

SK

SK

EPO

人 CHO

体外翻译表达(6 小时)

结合至谷胱甘肽树脂(过夜，4°C)

使用 50 mM GSH洗脱 GST-标签蛋白

体外翻译表达(6 小时)

结合至谷胱甘肽树脂(过夜，4°C)

利用 GST-HRV3c 进行柱上剪切(5 小时，4°C)

洗脱纯化蛋白质

Protein.HA

图7.3. 采用一步法 CHO 高产量体外翻译试剂盒和 Thermo Scientific™ 一步法人高产量体外翻译试剂盒表

达蛋白质的纯度比较。使用谷胱甘肽琼脂糖纯化 GST-链激酶 (SK) 和 GST-促红细胞生成素 (EPO)，如图所

示，使用 50 mM 谷胱甘肽洗脱 (左图)，在 SDS-PAGE 上电泳并使用 Coomassie 染料染色。在右图上，GST-

视网膜母细胞瘤-1 (Rb1) 和 GST-SK 蛋白首先结合至谷胱甘肽分离柱上，然后使用 HRV3C 蛋白酶进行柱上

剪切，如图所示，洗脱不含标签的纯化蛋白质。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

75 仅供学习参考蛋白质表达手册

每个试剂盒中均包括表达载体 pT7CFE1-NHis-GST-CHA (货号：88871)。这是包含 N 末端 9X-组氨酸和谷胱甘肽-s-转移酶 (GST) 标签及 C 末端人流感血凝素 (HA) 标签的三重标签载体。载体 5´ UTR 还包含脑心肌炎病毒 (EMCV) 内部核糖体插入位点 (IRES)，是高水平 mRNA 翻译的关键。3´ 区域的 poly(A) 序列可促进 mRNA 稳定化，保护其不被核酸酶降解，确保高水平的翻译。N 末端 GST 标签可帮助蛋白质溶解，增加使用谷胱甘肽亲和树脂纯化的总蛋白的数量 (图 7.4)。pT7CFE1-NHis-GST-CHA 载体包含人鼻病毒 (HRV) 3C 蛋白酶剪切位点，用于去除 His-GST-标签。使用靶向 C 末端 HA 标签的抗 HA 抗体进行蛋白质印迹分析，可用于确定全长蛋白质的合成。

与一步法高产量体外翻译试剂盒兼容的载体

订购信息

产品 规格 货号

一步法 CHO 高产量体外翻译试验试剂盒 2 次反应 (各 100 μL) 88893

一步法 CHO 高产量体外翻译试剂盒 2 次反应 (各 2 mL) 88894

一步法人高产量小量体外翻译试剂盒 2 次反应 (各 100 μL) 88890

一步法人高产量小量体外翻译试剂盒 10 次反应 (各 100 μL) 88891

一步法人高产量大量体外翻译试剂盒 2 次反应 (各 2 mL) 88892

Mar

ker

CA

V1

BA

D

Str

epto

kina

se

GF

P

Gre

en R

enill

a

CC

ND

1

GA

PD

H

Gau

ssia

AK

T3

AG

O2

RB

1

31.2

5 ng

62.5

ng

125

ng

250

ng

500

ng

1,00

0 ng

BSA

GFP

*

*

图7.4. 使用固定化谷胱甘肽纯化 N 末端 GST 融合蛋白。将指定的蛋白质基因克隆至 pT7CFE1-NHis-GST-CHA 中，在一步法 CHO 高产量体外翻译系统中表达 GST 融合蛋白 6 小时。表达的蛋白质与谷胱甘肽琼脂糖树脂结合，冲洗掉未结合的蛋白质后，使用 50 mM 谷胱甘肽洗脱 GST 融合蛋白。利用 SDS-PAGE 分离纯化蛋白质约各 500 ng，使用 Thermo Scientific™ Pierce™ Power Stainer (货号：22833) 染色。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

76Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Thermo Scientific™ T7 无细胞表达载体 (pT7CFE1，表 7.2) 是已经过优化的克隆质粒，可与一步法体外蛋白表达系统结合使用。pT7CFE1 来源的载体可提供 N 或 C 末端单一或串联亲和标签，以便于蛋白质纯化和检测。每种载体包含 0.5 μg/uL DNA，溶解于 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) 中。

表7.2. 用于 HeLa 和 CHO 无细胞表达系统的 Thermo Scientific™ T7 载体。

载体 N 末端标签 C 末端标签 剪切位点

pT7CFE1-NHis 6xHis

pT7CFE1-CHis 6xHis

pT7CFE1-NHA HA

pT7CFE1-CHA HA

pT7CFE1-NMyc c-Myc

pT7CFE1-CMyc c-Myc

pT7CFE1-NFtag Ftag

pT7CFE1-CFtag Ftag

pT7CFE1-NHA-CHis HA 6xHis

pT7CFE1-CGST-HA-His GST HA 6xHis

HRV 3C(C-末端)

pT7CFF1-CGFP-HA-His GFP HA 6xHis

HRV 3C(C-末端)

pT7CFE1-NHis-GST 9xHis GST

HRV 3C(N-末端)

pT7CFE1-NHis-GST-CHA 9xHis GST

HA HRV 3C(N-末端)

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

77 仅供学习参考蛋白质表达手册

Invitrogen™ Novex™ Retic Lysate IVT™ 试剂盒可高效翻译体外合成的转录本、poly(A) RNA 和总 RNA，包括难以翻译的 RNA。优化的裂解物可以获得高蛋白产量和生物活性。

特点：

• 高效——翻译由帽状和非帽状 mRNA 编码的各种高分子量蛋白质

• 灵活——提供不同的缓冲液配方，以优化各种长度 mRNA 的表达

兔网织红细胞系统用于蛋白质表达

订购信息

产品 规格 货号

pTC7CFE1-Nhis 载体 10 µg 88859

pTC7CFE1-CHis 载体 10 µg 88860

pTC7CFE1-NHA 载体 10 µg 88861

pTC7CFE1-CHA 载体 10 µg 88862

pTC7CFE1-NMyc 载体 10 µg 88863

pTC7CFE1-CMyc 载体 10 µg 88864

pTC7CFE1-NFtag 载体 10 µg 88865

pTC7CFE1-CFtag 载体 10 µg 88866

pTC7CFE1-NHA-CHis 载体 10 µg 88867

pTC7CFE1-CGST-HA-His-载体 10 µg 88868

pTC7CFE1-CGFP-HA-His-载体 10 µg 88869

pTC7CFE1-NHis-GST 载体 10 µg 88870

pTC7CFE1-NHis-GST-CHA 载体 10 µg 88871

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

78Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

裂解物已经过优化，加入 ATP 再生系统、血晶质和牛肝脏 tRNA，可用于翻译。试剂盒中包括优化的翻译混合物 (-Met 或 -Leu)，用于帽状和非帽状信息的翻译 (图 7.5)，以及高盐和低盐缓冲液。这些缓冲液可以最大程度地提高难以翻译的序列的蛋白质产量和活性。尽管一些商品化的兔网织红细胞裂解物使用相关 AUG 起始密码子的保真度较差，但 Retic Lysate IVT 试剂盒已采用 Kozak 序列重组体测试过，证明其使用适当的 AUG 密码子具有高保真度。

订购信息

产品 规格 货号

Retic Lysate IVT 试剂盒 60 次反应 AM1200

Co

ntro

l (–D

NA

)

Xef

-1ɑ

Glo

bin

Luci

fera

se

Ava

nin

Co

ntro

l (–D

NA

)

MS

2

DH

FR

Ava

nin

ST

NV

Glo

bin

帽状 mRNA 缓冲液 非帽状 mRNA 缓冲液

94

65

43

30

21

16

(kDa)

图7.5. 使用 Retic Lysate IVT 试剂盒翻译各种帽状和非帽状信息。使用 20 μCi 35S-蛋氨酸翻译帽状和非帽状 mRNA，反应时间 60 分钟，反应体积 25 μL。取各种反应物各 5 μL 进行 12.5% 聚丙烯酰胺/SDS 凝胶电泳，过夜曝光。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

79 仅供学习参考蛋白质表达手册

细菌体外表达系统采用高效转录和翻译反应，可从大肠杆菌细胞裂解物中生成高产量的全长功能性蛋白。该系统大大减少了耗时的基于细胞的蛋白生产步骤；从质粒或线性 DNA 到蛋白质生成只需几小时。

Thermo Fisher Scientific 提供了 Invitrogen™ Expressway™ 无细胞大肠杆菌表达系统，可以在一次反应中完成目标 DNA 到蛋白质的体外转录和翻译 (图 7.6)。使用这些灵活的系统，只需 3 小时即可从表达重组体生成目的重组蛋白。纯化后，生成的重组蛋白适用于其他下游应用领域，包括生物化学、物理学和结构鉴定。该系统可提供两种不同的规格：Expressway 小量 (20 次反应) 和 Expressway 大量 (20–100 次反应)。

Expressway 无细胞大肠杆菌表达系统提供了一种生成高水平的重组蛋白的方法，可轻松检测和纯化。

特点：

• 高产量——使用独特配方的缓冲液，可在 4 到 6 小时内生成毫克级蛋白质

• 高通量兼容性——反应在 96 孔板中完成，一旦检测到阳性表达，即可进行大规模生产

• 优化的 Invitrogen™ TOPO™ TA 载体——可最大程度地减少干扰天然蛋白折叠和功能的其他氨基酸序列

细菌无细胞蛋白表达

Expressway 无细胞大肠杆菌表达系统

合成的蛋白质

总合成量

(μg

)

GFP

15401382

17091397

855

1333

NT-CKB β-GAL HLA-DOA

2,000

1,500

1,000

500

0CT-CKM CALML3

图7.6. 在 Invitrogen™ Expressway™ 大量无细胞大肠杆菌表达系统中生成各种高产量的蛋白质。将 GFP、lacZ 和其他 4 种开放阅读框克隆至 pEXP5-NT/TOPO™ 或 pEXP5-CT/TOPO™ 载体中。使用获得的表达重组体生成重组蛋白，反应体积为 2 mL (1 mL 起始反应物加 1 mL 缓冲液)。采用 35S-蛋氨酸标记测定 37°C 反应 6 小时后的表达水平。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

80Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Invitrogen™ Expressway™ Lumio™ 表达和检测系统利用 Lumio 识别序列——较小的 6 氨基酸序列 (Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys)。Lumio 检测试剂高特异性且高亲和力地结合识别序列，发出明亮的荧光信号，用于实时蛋白生成分析和即时凝胶蛋白检测。此外，Expressway 技术使用来源于 slyD 突变的特殊的大肠杆菌裂解物，避免了 Lumio Green 检测试剂与内源性 SlyD 蛋白的非特异性结合，为重组蛋白检测提供了最佳背景。Invitrogen™ Novex™ Lumio™ Green 检测试剂盒包含在该系统内。

实时监测蛋白质表

订购信息

产品 规格 货号

Expressway 小量无细胞大肠杆菌表达系统 20 次反应 K990100

Expressway 大量无细胞大肠杆菌表达系统 (包含 pEXP5-NT/TOPO 和 pEXP5-CT/TOPO)

100 次反应 K990096

Expressway 大量无细胞大肠杆菌表达系统 100 次反应 K990097

pEXP-5-CT/TOPO TA 表达试剂盒 10 次反应 V96006

pEXP-5-NT/TOPO TA 表达试剂盒 10 次反应 V96005

订购信息

产品 规格 货号

Expressway Lumio 无细胞表达和检测系统 20 次反应 K990060

pEXP3-DEST 载体试剂盒 40 μL V96003

pEXP4-DEST 载体试剂盒 40 μL V96004

膜蛋白在细胞间接触、表面识别、细胞骨架接触、信号传导、酶活性和转运过程中发挥了重要作用。其具有各种细胞功能，是理想的药物靶点。但是，在体内系统中生成膜蛋白十分困难，因为其表达产物对细胞有毒性或可生成内涵体，限制了蛋白质产量，此外，繁琐的优化使纯化过程变得复杂且耗时。

使用 MembraneMax 试剂盒表达膜蛋白

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

81 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Fisher Scientific 提供的 Invitrogen™ MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒有助于克服上述挑战，可使用 MembraneMax™ 试剂——支架蛋白包被的平面磷脂双层膜 (也称为纳米脂蛋白颗粒或 NLP)——生成高产量的可溶性 (分散) 膜蛋白 (图 7.7)。

特点：

• 高产量——表达纳克至毫克级的蛋白质

• 蛋白质溶解度增强——在 NLP 复合物中生成蛋白质

• 便于纯化——包含 His 亲和标签

• 全套试剂盒——只需加入您的目的基因即可

溶解度

(%)

120

100

80

60

40

20

0

Gly

coph

orin

E (N

M_0

0210

2)

CO

24 (N

M_0

1323

0)

Gly

coph

orin

B (N

M_0

0210

0)

CK

LF (N

M_8

1640

)

Gly

coph

orin

A (B

C00

5319

)

MG

ST2

(NM

_002

413)

MG

ST1

(BC

0091

55)

Epi

regu

lin (N

M_0

0795

0)

Epi

regu

lin (N

M_0

0143

2)

Mpv

17 tr

ansg

ene

(NM

_008

622)

Mito

chon

dria

l MpV

17 (N

M_0

0243

7)

TIM

M22

(NM

_013

337)

Nin

gurin

2 (N

M_0

1653

3)

SP

PL2

B (B

C00

1788

)

CK

LF-l

ike

MA

RV

EL

(NM

_181

268)

AG

TRA

P (N

M_0

0104

0194

)

ALO

X5A

P (N

M_0

0162

9)

UN

Q18

87 (B

C02

5781

)

Em

rE (Z

1187

7)

LEP

RO

T (N

M_0

1752

8)

MG

ST2

(NM

_004

528)

PPA

PD

C1B

(NM

_032

483)

Bac

terio

rhod

opsi

n (J

0275

5)

OP

RL1

(NM

_000

913)

CH

RM

2 (N

M_0

0073

9)

His

tam

ine

rece

ptor

H2

(BC

0545

10)

Dop

amin

e re

cept

or D

1 (N

M_0

0079

4)

Mel

anoc

ortin

5 re

cept

or (N

M_0

0591

3)

CR

HR

1 (N

M_0

0438

2)

HTR

1A (N

M_0

0052

4)

CH

RM

1 (N

M_0

0073

8)

b2 a

dren

ergi

c re

cept

or (

NM

_000

024)

2 TMSs 3 TMSs 4 TMSs 7 TMSs

图7.7. 使用 Invitrogen™ MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒进行可溶性膜蛋白表达。我们分析了具有不同拓扑结构、大小、来源和功能的膜蛋白的体外表达和溶解度。在 MembraneMax HN 试剂存在 (深蓝色条块) 或不存在 (浅蓝色条块) 的条件下表达蛋白。分析的数据组的总溶解度从 17.3 ± 2.2% (不存在 NLP) 增至 78.8 ± 3.4% (存在 NLP)。在 MembraneMax 试剂存在时，GPCR 的溶解度出现显著增加。TMS = 跨膜区。

第 7 部分：利用体外翻译实现无细胞蛋白表达

82Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

pEXP5-NT/TOPO 和 pEXP5-CT/TOPO 载体包括在 Expressway 大量试剂盒中，也可单独提供，其可简化包含目的基因的 TOPO 克隆介导的表达重组体的快速生成。载体包含 Expressway 系统中生成高水平重组蛋白所需的全部调控元件。此外，载体还可以使您的目的基因与 N 或 C 末端肽融合 (情况允许时)，其中包含多聚组氨酸 (6xHis) 标签，用于生成蛋白质，采用商品化抗体可轻松检测，且可使用金属螯合树脂纯化。

细菌无细胞表达载体

参考文献1. Katzen F, Chang G, Kudlicki W (2005) The past, present and future of cell-free protein synthesis.

Trends Biotechnol 23(3):150–156.

订购信息

产品 规格 货号

MembraneMax 蛋白表达试剂盒 20 次反应 A10632

MembraneMax 蛋白表达试剂盒 100 次反应 A10633

MembraneMax HN 蛋白表达试剂盒 20 次反应 A10634

MembraneMax HN 蛋白表达试剂盒 100 次反应 A10635

表7.3. 载体可用于 Expressway 无细胞表达系统和 MembraneMax 蛋白表达试剂盒。

货号 载体 克隆系统 融合基因标签 推荐的无细胞表达系统

V96001 pEXP1-DEST Gateway N 末端 Xpress 标签，6xHis E, M

V96002 pEXP2-DEST Gateway C 末端 V5，6xHis E

V96003 pEXP3-DEST Gateway N 末端 6xHis，Lumio 标签 E, M

V96004 pEXP4-DEST Gateway C 末端 6xHis，Lumio 标签 E, M

V96005 pEXP5-NT/TOPO TOPO N 末端 6xHis E, M

V96006 pEXP5-CT/TOPO TOPO C 末端 6xHis E, M

E = Expressway 无细胞表达系统，M = MembraneMax 蛋白表达试剂盒。

仅供学习参考蛋白质表达手册83

细胞裂解和 蛋白质提取

蛋白质纯化和分析的第一步是细胞裂解。蛋白提取方法有很多

种，具体取决于起始材料的来源以及下游应用。现已开发出

了多种技术，旨在从不同类型的细胞中获得最佳蛋白产量和纯

度，同时考虑到蛋白提取物与下游实验的兼容性。

蛋白表达系统一般使用特定的细胞类型，包括细菌、酵母、培养的哺乳动物细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞。这些生物体包含不同的外部细胞结构，需要不同的裂解方法。哺乳动物培养细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞仅通过质膜将细胞内容物与环境隔离开，因此采用含有去垢剂及其他成分的试剂可以轻松破坏蛋白质-脂质双层膜，相对简单地提取总蛋白。而细菌和酵母则含有细胞壁，早期使用机械方法破碎细胞。目前已经开发出了基于去垢剂的溶液，可以高效裂解细胞，无需采用物理破碎法。

我们提供多种易于使用且高效的细胞裂解试剂 (表 8.1) 用于提取活性蛋白，无需机械破碎。这些试剂适用于最常用的下游蛋白研究应用领域。此外，我们还提供了方便易用的广谱蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂混合物和片剂，最大程度地减少蛋白质降解。

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

84Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

表8.1. 细胞类型和推荐的 Thermo Scientific™ 蛋白抽提试剂概述。

样本类型 推荐产品 蛋白质分析兼容性 下游应用兼容性

哺乳动物培养细胞

(HeLa、NIH 3T3)M-PER 哺乳动物蛋白抽

提试剂

(货号：78501、78503、78505)

BCA，Coomassie Plus，660 nm，去垢剂兼

容的 Bradford

蛋白纯化、免疫沉淀 (IP)、免疫分析 (蛋白质印迹、

ELISA)、报告基因检测、

氨基反应性蛋白标记、

激酶分析和酶分析

细菌细胞

(大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)B-PER 细菌蛋白抽提试剂

(货号：78243、78248、90084、78250、78266)

BCA，Coomassie Plus，660 nm (1:2 稀释)，去垢剂兼容的 Bradford

SDS-PAGE 和蛋白纯化

B-PER 细菌蛋白完全抽

提试剂

(货号：89821、89822)

BCA，660 nm，去垢剂兼

容的 Bradford (去除背景)SDS-PAGE 和蛋白纯化

酵母细胞 (啤酒酵母、裂殖

酵母和毕赤酵母)还适用于枯草芽胞杆菌和

其他细菌细胞

Y-PER 酵母蛋白抽提试剂

(货号：78991、78990、78998)

BCA，去垢剂相容的 Bradford

SDS-PAGE、蛋白纯化、报

告基因检测、基因组和质

粒 DNA 提取

杆状病毒感染的昆虫细胞 (Sf9)

I-PER 昆虫蛋白抽提试剂

(货号：89802)BCA，去垢剂相容性 Bradford

SDS-PAGE 和蛋白纯化

BCA =二喹啉甲酸。

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

85 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Scientific™ M-PER™ 哺乳动物蛋白抽提试剂旨在从哺乳动物培养细胞中高效提取所有的可溶性蛋白。M-PER 试剂是一种非变性去垢剂配方，可在 5 分钟内溶解细胞膜并提取细胞中所有的可溶性蛋白。M-PER 试剂几乎无需机械破碎，不会使蛋白质变性，适用于下游分析。

特点：

• 温和——温和的去垢剂裂解，提取物可直接用于 Coomassie (Bradford)、 Pierce™ BCA 和 Pierce™ 660 nm 蛋白定量检测及 SDS-PAGE 分离、免疫沉淀和其他亲和纯化步骤

• 易于使用——溶液配方不含氨基，且去垢剂可透析去除，适用于与后续实验兼容

• 方便——即可直接在培养板中裂解贴壁细胞，也可收集并悬浮后再裂解

• 稳定——已经过产量和提取效率验证，适用于 HeLa、NIH 3T3、CHO 和 Jurkat 等多种哺乳动物培养细胞

M-PER 哺乳动物蛋白抽提试剂

订购信息

产品 规格 货号

M-PER 哺乳动物蛋白抽提试剂 25 mL 78503

M-PER 哺乳动物蛋白抽提试剂 250 mL 78501

M-PER 哺乳动物蛋白抽提试剂 1 L 78505

Thermo Scientific™ B-PER™ 细菌蛋白抽提试剂旨在从细菌细胞中提取可溶性蛋白，无需采用剧烈的化学试剂或机械破碎。细菌蛋白裂解试剂是非离子型去垢剂溶液，可高效破碎细胞并溶解天然或重组蛋白，且不会使蛋白质变性。

B-PER 细菌蛋白抽提试剂

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

86Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

特点：

• 即用型——使用专利的温和、非离子型去垢剂进行一步法革兰氏阳性和阴性细菌细胞裂解，采用 Tris 或磷酸盐缓冲液配方

• 快速且简单——只需在细菌沉淀中加入 B-PER 试剂，混匀后孵育 10 至 15 分钟，待细胞碎片沉淀后即可回收可溶性蛋白

• 便捷——Thermo Scientific™ B-PER™ 细菌蛋白完全抽提试剂在裂解液中已包含溶菌酶和通用核酸酶

• 产量高——从细菌裂解物中回收重组蛋白

• 灵活——B-PER 试剂适用于任何规模的蛋白质提取，有磷酸盐及 1X 和 2X Tris 配方可供选择，含或不含酶的组合均可提供

• 兼容——可与蛋白酶抑制剂完全兼容；获得的蛋白提取物可用于蛋白质分析、一般的亲和纯化 (如 GST、6xHis) 和其他应用领域

B-PER 细菌抽提试剂较传统的超声裂解或一般的自制裂解缓冲液更高效，很多自制裂解缓冲液中会含有干扰下游应用的组分。B-PER 试剂使用生理 pH 下的 Tris 或磷酸盐缓冲液配制而成。该试剂可提取天然和可溶性重组蛋白，所得抽提物能直接用于大部分下游工作流程，如电泳、亲和纯化、免疫沉淀、蛋白质相互作用分析、交联和蛋白质标记。

B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂包含浓度优化的溶菌酶和 Thermo Scientific™ Pierce™ 通用核酸酶。溶酶体通过溶解细菌细胞壁裂解细菌。Pierce 通用核酸酶通过酶切 DNA 和 RNA 降低了蛋白提取物的粘度，改善了下游应用的结果。B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂处理冻存细胞样品效率最高，但在其他如，新鲜或冻存的革兰氏阳性和阴性细菌等样品中也已经过验证和优化，可获得高产量 (如需在新鲜的革兰氏阴性细菌中获得最佳提取效果，建议添加 1 mM EDTA)。不像其他裂解缓冲液配方有可能会抑制酶的功能，B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂可用于 GST 融合蛋白纯化 (图 8.1)。

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

87 仅供学习参考蛋白质表达手册

6xHis-Klenow GST-Syk GST-StpB

B-PER Bug B-PER Bug B-PER Bug

L C S E S E S E S E S E S E L

图8.1. B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂可用于 6xHis 和 GST 融合蛋白纯化。将大肠杆菌 ER2566/pLATE51-Klenow 和 ER2566/pGSH-Syk 细胞沉淀 (0.5 g) 重悬于 2.5 mL B-PER 完全试剂或 BugBuster™ 预混液中，室温轻轻涡旋振荡 15 分钟。4°C、16,000 x g 离心 20 分钟，去除不溶性细胞碎片。使用 Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA Superflow 琼脂糖纯化 6xHis-Klenow 蛋白质。使用 Thermo Scientific™ Pierce™ 谷胱甘肽琼脂糖纯化 GST-Syk 蛋白。L = Thermo Scientific™ PageRuler™ 预染蛋白质分子量标准，C = 阴性对照 (IPTG 诱导前的总蛋白)，S = 使用 0.1 mM IPTG 诱导后的可溶性蛋白，E = 蛋白纯化后的洗脱组分

订购信息

产品 规格 货号

B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂 250 mL 89821

B-PER 细菌蛋白完全抽提试剂 500 mL 89822

B-PER 细菌蛋白抽提试剂 165 mL 78243

B-PER 细菌蛋白抽提试剂 250 mL 90084

B-PER 细菌蛋白抽提试剂 500 mL 78248

B-PER 试剂 (磷酸盐缓冲液) 500 mL 78266

B-PER II 细菌蛋白抽提试剂 (2X) 250 mL 78260

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

88Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Thermo Scientific™ Y-PER™ 酵母蛋白抽提试剂使用温和去垢剂裂解步骤，可快速高效地释放功能活性溶解蛋白。

基于去垢剂的细胞裂解缓冲液，无需通过玻璃微珠或机械破碎法破碎厚的蛋白质细胞被膜来提取蛋白质。Y-PER 试剂适用于啤酒酵母及其他常见种属，所得蛋白样品可适用于融合标签蛋白纯化及模式生物的报告基因的酶检测。Y-PER 裂解试剂还可用于从酵母中提取基因组和质粒 DNA。此外，Y-PER Plus 采用基于 Tris 的配方，去垢剂为可透析去除型，具有极低的离子强度，适用于对上述组分敏感的下游应用。

特点：

• 便捷——即用型室温试剂，采用可透析去除的去垢剂配方

• 极高的产量——比传统玻璃微珠法蛋白提取量高两倍 (图 8.2)

• 易于使用——避免了使用传统玻璃微珠裂解法可能会碰到的问题，如带静电的微珠会产生粘附、蛋白质–微珠形成团块，部分微珠损失等。

• 适用性广——适用于酿酒酵母、裂殖酵母和毕赤酵母，以及枯草芽胞杆菌

Y-PER 酵母蛋白抽提试剂

相关产品

产品 规格 货号

细胞裂解通用核酸酶 5 kU 88700

细胞裂解通用核酸酶 25 kU 88701

细胞裂解通用核酸酶 100 kU 88702

溶菌酶 5 g 89833

溶菌酶溶液 (50 mg/mL) 0.5 mL 90082

DNA 酶 I 溶液 (1 个单位/μL)，不含 RNA 酶 1,000 个单位

89836

DNA 酶 I 溶液 (2,500 个单位/μL) 0.5 mL 90083

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

89 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Scientific™ I-PER™ 昆虫细胞蛋白抽提试剂可以从悬浮培养的杆状病毒感染的昆虫细胞或单层培养细胞中温和且高效地提取可溶性蛋白。杆状病毒昆虫细胞表达系统是一种常用且高效的系统，可在细胞培养物内实现高水平的重组真核蛋白生产。杆状病毒系统中表达的蛋白质可用于结构分析、生物化学分析和各种其他应用领域。I-PER 试剂保护了提取蛋白的功能，可直接用于诸如 6xHis 标签蛋白纯化等下游应用领域 (图 8.3)。

I-PER 昆虫细胞蛋白抽提试剂

裂殖酵母

蛋白质

(μg

)

Thermo ScientificY-PER 试剂

玻璃微珠

枯草芽胞杆菌啤酒酵母

700

600

500

400

300

200

100

0

图8.2. 使用 Y-PER 试剂提取获得更高产量的可用蛋白。在全部 3 种生物样品测试中，Y-PER 试剂提取物较传统玻璃微珠裂解提取物均含有更多的可用蛋白。

订购信息

产品 规格 货号

Y-PER 酵母蛋白抽提试剂 500 mL 78990

Y-PER 酵母蛋白抽提试剂 200 mL 78991

Y-PER Plus 可透析型酵母蛋白抽提试剂 500 mL 78999

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

90Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

特点：

• 温和提取——已经过优化的温和、非离子型去垢剂，可从昆虫细胞中提取最大产量的可溶性蛋白

• 高效——蛋白提取效率高于超声破碎法

• 兼容——适用于蛋白质免疫印迹、6xHis 标签蛋白纯化、蛋白分析和离子交换层析等下游应用

• 灵活——适用于从悬浮或贴壁培养的昆虫细胞中提取蛋白质

Mar

ker

上样

流穿液

沉淀

洗涤组分

1

洗涤组分

2

E1

E2

E3

E4

E5

E6

E7

E8

E9

E10

E11

E12

E13

215

kDa

120

84

60

39

28

洗脱组分

图8.3. I-PER 试剂提取物中 6xHis- 细胞周期蛋白 B1 的亲和纯化。收集杆状病毒感染的 Sf9 细胞，使用 I-PER 试剂裂解。将提取物直接上样至镍离子螯合琼脂糖 (IMAC) 柱并纯化。利用 SDS-PAGE 分离蛋白质样本，使用 Thermo Scientific™ GelCode™ Blue Stain 试剂染色凝胶。

订购信息

产品 规格 货号

I-PER 昆虫细胞蛋白抽提试剂 250 mL 89802

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

91 仅供学习参考蛋白质表达手册

细胞裂解破坏了细胞膜和细胞器，导致酶活性失调，从而降低了蛋白产量，并影响了蛋白功能。要防止提取蛋白的降解并获得最佳产量和活性，可以在裂解试剂中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。我们已经鉴别出了多种化合物，通过与蛋白酶和磷酸酶的可逆或不可逆的结合，灭活或阻断其活性。大多数研究人员使用几种不同的抑制剂的混合物，以确保在分析目的蛋白之前，蛋白提取物不会降解。几乎在所有情况下都需要使用蛋白酶抑制剂，而磷酸酶抑制剂只有在研究磷酸化状态 (活化状态) 时需要。特定的研究实验可能需要使用单一抑制剂或定制的混合物，但大多数蛋白研究可以通过使用广谱蛋白酶抑制剂混合物达到最佳效果。

Thermo Scientific™ Halt™ 抑制剂混合物是即用型的广谱蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂的 100X 浓缩液。只需加入样本所需体积的浓缩混合液，确保对蛋白提取物的充分保护即可。Thermo Scientific™ Pierce™ 蛋白酶、磷酸酶及蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂组合产品为快速溶解的片剂，可在提取制备物前配制，以达到最佳抑制效果。

抑制剂混合物的液体和片剂均提供含或不含 EDTA 的配方，有多种体积和规格可选 (表 8.2)。我们的抑制剂混合物，与大多数同类配方的抑制剂效果相当或更高，能为蛋白抽提物提供更全面的保护 (图 8.4)。

特点：

• 多种包装规格——液体混合物提供 100 μL 一次性使用或 1、5 和 10 mL 包装规格；片剂提供两种规格，适合溶解配置 10 或 50 mL 体积溶液

• 便捷——可在冰箱中稳定储存，100X 液体或片剂较单独的抑制剂更高效、更简单；只需吸取所需的量，或加入片剂至 10 或 50 mL 溶液内溶解后即可使用

• 不含专利组分——组分完全公开

• 两种常见的配方——提供含或不含 EDTA 的配方；不含 EDTA 的配方可与等电聚焦或 His 标签纯化等下游应用兼容

• 全面保护——包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的多合一配方

• 兼容——可与 Thermo Scientific™ Pierce™ 细胞裂解缓冲液或几乎各种商品化或自制的基于去垢剂的裂解试剂结合使用；还可直接或稀释后用于标准蛋白浓度测定，包括 BCA 和 coomassie (Bradford) 分析

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和片剂

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

92Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

我们的蛋白酶抑制剂混合物和片剂靶向丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶以及氨肽酶。您还可以加入 EDTA (在片剂形式产品中会直接包含 EDTA，而在液体形式的产品中 EDTA 则会分单管提供) 抑制金属蛋白酶。磷酸酶抑制剂混合物和片剂靶向丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶。这些抑制剂可以在培养细胞、酵母或细菌制备物提取或裂解过程中保护蛋白质。所有 Halt 抑制剂混合物和 Pierce 抑制剂片剂均可与 Thermo Scientific Pierce 蛋白抽提试剂兼容。

抑制剂组分 靶点 (机制) 蛋白酶抑制剂混合物液体和片剂

磷酸酶抑制剂混合物液体和片剂

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物液体和片剂

AEBSF 丝氨酸蛋白酶 (不可逆) • •

抑肽酶 丝氨酸蛋白酶 (可逆) • •

抑氨肽酶 氨肽酶 • •

E-64 半胱氨酸 (不可逆) • •

亮抑酶肽 丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶 (可逆) • •

胃酶抑素 天冬氨酸蛋白酶 (可逆) •

EDTA* 金属蛋白酶 (可逆) • •

氟化钠 丝氨酸/苏氨酸和酸性磷酸酶 • •

正钒酸钠 酪氨酸和碱性磷酸酶 • •

β-甘油磷酸盐 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 • •

焦磷酸钠 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 • •

* 不含 EDTA 配方中无 EDTA。

表8.2. Halt 抑制剂混合物和 Thermo Scientific Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂中的化合物。

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

93 仅供学习参考蛋白质表达手册

半胱氨酸蛋白酶活性

(460

nm

处底物的荧光

)

丝氨酸蛋白酶活性

(530

nm

处底物的荧光

)

来源和规格

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

含 EDTA

不含 EDTA

94 94 9492 91 93 92

79 7780 79

70

17

不含抑制剂

Halt液体

迷你片剂

迷你片剂片剂 片剂

Sigma

超大片剂片剂

Thermo Scientific

来源和规格

不含抑制剂

Halt液体

迷你片剂

迷你片剂片剂 片剂

Sigma

超大片剂片剂

RocheThermo Scientific

含 EDTA

不含 EDTA

94

82 8177

8175 77

59

69

61

68

96 97

8785

A

B

图8.4. 商品化的蛋白酶抑制剂混合物液体和片剂比较。在添加或未添加蛋白酶抑制剂 (配方含 EDTA——用深蓝色标记，或不含 EDTA——用浅蓝标记) 的条件下，将胰腺提取物 (50 μL，1μg/μL 蛋白) 或胰蛋白酶 (25 μL，0.1 单位/μL) 与半胱氨酸 (A) 或丝氨酸蛋白酶 (B)，同可被蛋白酶裂解并释放出荧光信号的底物一起孵育。37°C 反应 2 小时后，在指定发射光波长下测定荧光值。图中数字为各品牌蛋白酶抑制剂的蛋白酶活性抑制率。

第 8 部分：细胞裂解和蛋白质提取

94Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如需了解有关我们的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和片剂的更多信息，包括其他包装规格，请登录 thermofisher.com/inhibitorcocktails

订购信息

产品 规格 货号

Halt 蛋白酶抑制剂混合物，单次使用 (100X) 24 x 100 μL 78430

Halt 蛋白酶抑制剂混合物 (100X) 1 mL 87786

Halt 蛋白酶抑制剂混合物 (100X) 5 mL 78429

Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂 (1/10 mL) 30 片 88665

Pierce 蛋白酶抑制剂片剂 (1/50 mL) 20 片 88265

Halt 蛋白酶抑制剂混合物，单次使用，不含 EDTA (100X) 24 x 100 μL 78425

Halt 蛋白酶抑制剂混合物，不含 EDTA (100X) 1 mL 87785

Halt 蛋白酶抑制剂混合物，不含 EDTA (100X) 5 mL 78437

Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTA (1/10 mL) 30 片 88666

Pierce 蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTA (1/50 mL) 20 片 88266

Halt 磷酸酶抑制剂混合物，单次使用 (100X) 24 x 100 μL 78428

Halt 磷酸酶抑制剂混合物 (100X) 1 mL 78420

Halt 磷酸酶抑制剂混合物 (100X) 5 x 1 mL 78426

Pierce 磷酸酶抑制剂迷你片剂 (1/10 mL) 20 片 88667

Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，单次使用 (100X) 24 x 100 μL 78442

Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 (100X) 1 mL 78440

Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂 (1/10 mL) 20 片 88668

Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，单次使用，不含 EDTA (100X) 24 x 100 μL 78443

Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，不含 EDTA (100X) 1 mL 78441

Pierce 蛋白酶磷酸酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTA (1/10 mL) 20 片 88669

仅供学习参考蛋白质表达手册95

重组蛋白纯化

重组蛋白表达和纯化是蛋白调控、结构和功能研究的关

键。大部分重组蛋白表达为带有短亲和标签的融合蛋

白，如多聚组氨酸 (6xHis，图 9.1) 或谷胱甘肽-s-转移酶

(GST，图 9.2)。这些标签可使研究人员从细胞中的数千

种蛋白质中选择性地分离出目的蛋白。采用固定化金属

亲和层析 (IMAC) 纯化重组 His 标签蛋白，纯化树脂是螯

合有镍离子或钴离子的介质，这些离子可与组氨酸侧链

结合。采用还原型谷胱甘肽树脂纯化 GST 标签蛋白。

Ni2+

O

O

OO

O

O

HN

NH

N

NN

蛋白质

图9.1. 多聚组氨酸 (His) 标签。将编码 5~9 个组氨酸残基的 DNA 序列插入到目的基因 C 末端或 N 末端，即可表达获得带有多聚组氨酸标签的重组蛋白。采用固定化金属亲和层析 (IMAC) 纯化 His 标签蛋白。将镍或钴固定化至固相层析树脂上，选择性地结合细胞裂解物中的 His 标签蛋白。一般而言，镍可以获得更高的蛋白产量，而钴可以获得更高的纯度。

第 9 部分：重组蛋白纯化

96Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

小规模和大规模的融合蛋白纯化均需要采用可靠的方法，以获得高产量和高纯度。Thermo Fisher Scientific 提供了各种产品，用于从哺乳动物培养物、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母中亲和纯化包含多聚组氨酸或 GST 标签的重组蛋白。我们可提供钴或镍 IMAC 树脂，纯化 His 标签蛋白 (图 9.3)。对于 GST 标签蛋白纯化 (图 9.4)，我们提供了固定化谷胱甘肽树脂。这些树脂有多种形式可供选择，能满足从筛选、批量分析、中试试验到纯化工艺建立的各种需要 (表 9.1 和 9.2)。Superflow 树脂已经过了全面的化学特征分析，符合大规模纯化的要求。

特点：

• 产品选择丰富——多种配体和支持物可供选择，以满足您的纯化目标

• 性能优越——所提供树脂能够最大程度提高结合能力、纯度、批量大小和/或缩短处理时间

• 灵活——有多种产品形式可供选择，包括大包装琼脂糖树脂、离心柱和试剂盒、FPLC 色谱预装柱、96 孔板和磁珠 (参见第 103 页的表 9.3)

主要根据您进行的蛋白纯化的规模选择介质。磁珠或琼脂糖树脂可用于纯化蛋白质数量较多的筛选实验。琼脂糖一般用于中等流速、规模稍小的纯化，而 Superflow 树脂则适用于高流速的较大规模纯化。

GST 和 His 标签融合蛋白的纯化

选择适当的树脂形式

Glutathione (GSH)MW 307.32

O

HO

HO

NH

NH2

HS

OO

O

HN

图9.2. 谷胱甘肽-s-转移酶标签。利用 GST 和还原型谷胱甘肽 (GSH) 之间的高亲和力选择性地分离重组蛋白。将编码酶 GST 序列的基因克隆至编码目的蛋白基因的 C 端或 N 端。将还原型谷胱甘肽固定在固相层析树脂上，选择性地结合细胞裂解物中的 GST 标签蛋白。

第 9 部分：重组蛋白纯化

97 仅供学习参考蛋白质表达手册

总量 筛选 批量 中试试验 工艺

技术 • 自动化磁珠处理系统

• 96孔板

• 重力流

• 离心柱

中等流速的 FPLC 高速的 FPLC

产量 微克 毫克 毫克至克 克至千克

应用 • 高通量筛选

• 相互作用研究

• 突变分析

• 功能分析

• 结构分析

结构分析 批量生产

推荐的树脂类型 磁珠

琼脂糖

Superflow

表9.1. 根据纯化规模和应用推荐的产品形式。

磁珠适用于低蛋白浓度的少量样本中的蛋白富集。这些磁珠仅提供悬液形式，适用于采用诸如 Thermo Scientific™ KingFisher™ 磁珠处理系统等仪器的自动化分析。磁珠更适用于筛选而非纯化。

推荐用于突变分析、高通量筛选、Pull-Down 检测。

6% 琼脂糖适用于实验室规模的融合蛋白纯化，从微量制备到体积 ≤25 mL 的柱式纯化。琼脂糖较 Superflow 树脂更软，因此适用于较低流速。普通的台式微量离心机常用于固液相分离。

推荐用于小体积样本，低至中等流速、批量、重力或离心纯化，可同时纯化多种蛋白质。

Superflow 树脂适用于高流速的中试试验至工艺流程规模的纯化。高度交联的树脂具有更高的硬度，可以耐受高压和高流速，且不会被压缩，因此可以轻松从实验室规模扩大至工业规模的纯化。

推荐用于大体积样本、中等至高流速、根据需要装柱、配合快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 仪器使用。

何时使用磁珠

何时使用 6% 琼脂糖树脂

何时使用 superflow 树脂

第 9 部分：重组蛋白纯化

98Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

HisPur Ni-NTA 琼脂糖树脂

HisPur Ni-NTA Superflow 树脂

HisPur 钴琼脂糖树脂

HisPur 钴 Superflow 树脂

谷胱甘肽琼脂糖树脂

谷胱甘肽 Superflow 树脂

靶点 His 标签融合蛋白 His 标签融合蛋白 His 标签融合蛋白 His 标签融合蛋白 GST 标签融合蛋白 GST 标签融合蛋白

静态结合能力* ~60 mg/mL >60 mg/mL ≥15 mg/mL >30 mg/mL ~40 mg/mL ~30 mg/mL

动态结合能力* 18 mg/mL 20 mg/mL ND† >20 mg/mL ~10.5 mg/mL ~10 mg/mL

纯度 高 高 更高 更高 高 高

最大流速 800 cm/小时 1,200 cm/小时 800 cm/小时 1,200 cm/小时 800 cm/小时 1,200 cm/小时

最大压力 0.35 MPa 0.65 MPa 0.35 MPa 0.65 MPa 0.35 MPa 0.65 MPa

支持物 6% 琼脂糖 高度交联 6% 琼脂糖

6% 琼脂糖 高度交联 6% 琼脂糖

6% 琼脂糖 高度交联 6% 琼脂糖

应用规模 筛选、批量、中试试验

批量、中试试验、工艺流程

筛选、批量、中试试验

批量、中试试验、工艺流程

筛选、批量、中试试验

批量、中试试验、工艺流程

重复使用次数 5 25 5 25 5 25

包装规格 10 mL、100 mL 和1 L 瓶装；0.2、1 和 3 mL 离心柱和试剂盒；1 mL 和 5 mL FPLC 色谱预装柱；96 孔板

10、50、250 mL 和 1 L 瓶装

10 mL、100 mL 和1 L 瓶装；0.2、1 和 3 mL 离心柱和试剂盒；1 mL 和 5 mL FPLC 色谱预装柱；96 孔板

10、50、250 mL 和 1 L 瓶装

10 mL、100 mL 和1 L 瓶装；0.2、1 和 3 mL 离心柱和试剂盒；1 mL 和 5 mL FPLC 色谱预装柱；96 孔板

10、50、250 mL 和 1 L 瓶装

* 详情请参见网站产品页面。† 未检测。

表9.2. Thermo Scientific™ Pierce™ 琼脂糖树脂用于重组蛋白纯化的选择指南。

第 9 部分：重组蛋白纯化

99 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Scientific HisPurNi-NTA Superflow 琼脂糖

3,000

2,500

2,000

1,500

1,000

500

0

1,0000 2,000 3,000 4,000

体积 (mL)

Qiagen Ni-NTASuperflow 琼脂糖

100

80

60

40

20

0

1,0000 2,000 3,000 4,000

体积 (mL)

纯度 = 86.5%

L FT W E M

纯度 = 86.7%

L FT W E M

缓冲液

B (%

)

280

nm 吸

光值

(mA

U)

图9.3. 高产量、高纯度、中等规模的 6xHis 标签蛋白纯化。在 200 mL纯化柱中，用 HisPur™ Ni-NTA Superflow 琼脂糖或 Qiagen™ Ni-NTA Superflow，在 3 小时内纯化超过 4 克过表达的 6xHis-GFP。以 20 mL/分钟的流速上样 1 升裂解物，然后使用含有 30 mM 咪唑的洗涤缓冲液冲洗杂蛋白，直至达到基线值。再使用含有 300 mM 咪唑的缓冲液洗脱结合蛋白。收集含有纯化 6xHis-GFP 的组分，使用 Pierce 660 nm (货号：22662) 进行蛋白浓度检测。利用 SDS-PAGE 分离上样 (L)、流穿 (FT)、洗涤 (W) 和洗脱 (E) 组分以及分子量标准 (M)，采用 Thermo Scientific™ Imperial™ 蛋白染料 (货号：24615) 染色，利用 Thermo Scientific™ myImageAnalysis™ 软件 (货号：62237) 分析，测定纯度。

第 9 部分：重组蛋白纯化

100Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

FT EM L

GEHealthcare

ThermoScientific

Pierce Qiagen Clontech Sigma

FT E FT E FT E FT EkDa

250

150

100

50

37

2520

15

10

75

产量 537 µg 562 µg 285 µg 299 µg 410 µg

供应商

ThermoFisher

ScientificGE

Healthcare Qiagen Clontech Sigma

93% 93% 90% 91% 94%纯度

图9.4. 谷胱甘肽琼脂糖可纯化高纯度、高产量的 GST 融合蛋白。参照制造商的说明，将含有过表达的 GST 的大肠杆菌裂解物 (14.4 mg 总蛋白) 与不同供应商的 50 μL GSH 树脂共同孵育并纯化。采用 Thermo Scientific™ Coomassie Plus 蛋白分析试剂对从树脂中洗脱的 GST 进行定量 (产量)。测定染色的凝胶泳道的光密度，评估纯度。M = 分子量标准品；L = 上样裂解物；FT = 流穿液；E = 洗脱液。

第 9 部分：重组蛋白纯化

101 仅供学习参考蛋白质表达手册

Thermo Scientific™ Pierce™ 抗 HA 琼脂糖和抗 c-Myc 琼脂糖是适用于带有人流感病毒血凝素 (HA) 或 c-Myc 序列标签的重组蛋白纯化的高亲和树脂，这些标签可在人体外表达系统或细菌和哺乳动物细胞裂解物中表达。

特点：

• 特异——高特异性的抗 HA 单克隆抗体 (克隆号 2-2.2.14) 或抗 c-Myc 单克隆抗体 (克隆号 9E10)，可纯化获得高产量和高纯度的标签蛋白

• 规模灵活——提供多种包装体积，可实现更大规模的纯化

• 高结合能力——抗 HA 琼脂糖可结合多至 150 nmol 蛋白/mL 树脂，抗 c-Myc 琼脂糖可结合多至 144 nmol 蛋白质/mL树脂

• 通用——适用于离心柱或重力柱，以及 FPLC 色谱预装柱

• 便捷——洗脱和检测 HA 标签融合蛋白的试剂可单独提供

用于生产 Pierce 抗 HA 琼脂糖的抗 HA 抗体是高度特异的小鼠 IgG1 亚型单克隆抗体，可识别来源于 HA 蛋白的 HA 标签 (YPYDVPDYA) 表位。用于生产 Pierce 抗 c-Myc 琼脂糖的抗 c-Myc 抗体是高度特异的小鼠 IgG1 亚型单克隆抗体，可识别来源于人 c-myc 致癌基因 (p62 c-Myc) 的 c-Myc 表位标签 (EQKLISEEDL)。

支持物是交联的 4% 琼脂糖珠。这些树脂可装至重力纯化柱、离心纯化柱或 FPLC 色谱预装柱中，纯化细菌或哺乳动物细胞中表达的 HA 或 c-Myc 融合蛋白。

应用：

• Thermo Scientific™ 人体外翻译 (IVT) 试剂盒中表达的 HA 或 c-Myc 标签融合蛋白的纯化 (图 9.5)

• 重组 HA 或 c-Myc 标签蛋白的大规模纯化

• 融合蛋白和相互作用分子的高通量富集

• 免疫沉淀 (IP) 和免疫共沉淀 (Co-IP) 实验

其他重组标签系统

第 9 部分：重组蛋白纯化

102Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

75 kDa

MWGFP-HA

对照

50 kDa

37 kDa

25 kDa

1 2 3

图9.5. 从人体外表达裂解物中纯化 HA 标签蛋白。采用 Thermo Scientific™ 一步法高产量人源蛋白体外表达试剂盒 (货号：88892) 表达 HA 标签的 GFP (来源于羽小角水蚤)，采用 Pierce 固相化抗 HA 琼脂糖纯化。将抗 HA 琼脂糖浆液 (50 μL) 加入 Pierce 离心柱 (货号：69705) 中，将 60 μL 体外翻译产物在 TBS 中稀释至终体积 200 μL。4°C 颠倒混匀树脂和样本 1 小时。离心沉淀树脂，用 10 倍柱体积的 TBS-T 冲洗 3 次。加入 3 x 1 倍柱体积的 1 mg/mL Pierce HA 多肽 (货号：26184)，从树脂上洗脱带有 HA 标签的 GFP。将洗脱组分混合，取 20% 的洗脱组分在 SDS-PAGE 上电泳，采用 Gel Code Blue (货号：24590) 染色。泳道 1：不含 DNA 的人体外翻译产物的免疫沉淀洗脱液 (阴性对照)；泳道 2：含有 GFP-HA DNA 的人体外翻译产物的免疫沉淀洗脱液；泳道 3：分子量标准。

第 9 部分：重组蛋白纯化

103 仅供学习参考蛋白质表达手册

Invitrogen™ Ni-NTA 纯化系统是包括纯化缓冲液和树脂的全套系统，可在天然、变性和混合条件下完成多至 6 次纯化。生成的蛋白质可直接用于多种目标应用领域。树脂包括 6% 琼脂糖，可结合多至 60 mg/mL His 标签蛋白。Ni-NTA 树脂可单独购买，有 10、25 和 4 x 25 mL 包装大小可供选择。

其他 His 标签蛋白纯化试剂盒和树脂

形式/配体 Ni-NTA 钴 谷胱甘肽 抗 c-Myc 抗 HA

磁珠 88831 (2 mL), 88832 (10 mL)

无 88821 (4 mL), 88822 (20 mL)

88842 (1 mL), 88843 (5 mL)

88836 (1 mL), 88837 (5 mL)

松散树脂 (琼脂糖) 88221 (10 mL), 88222 (100 mL), 88223 (500 mL)

89964 (10 mL), 89965 (100 mL), 89966 (500 mL)

16100 (10 mL), 16101 (100 mL), 16102 (500 mL)

20168 (2 mL), 20169 (10 mL)

26181 (1 mL), 26182 (5 mL)

离心柱 (琼脂糖) 88224 (0.2 mL), 88225 (1 mL), 88226 (3 mL)

89967 (0.2 mL), 89968 (1 mL), 89969 (3 mL)

16103 (0.2 mL), 16104 (1 mL), 16105 (3 mL)

无 无

带有离心柱 (琼脂糖) 的试剂盒

88227 (0.2 mL), 88228 (1 mL), 88229 (3 mL)

90090 (0.2 mL), 90091 (1 mL), 90092 (3 mL)

16106 (0.2 mL), 16107 (1 mL), 16108 (3 mL)

无 无

96 孔板 (琼脂糖) 88230 (2 块板) 90095 (2 块板) 16111 (2 块板) 无 无

层析色谱预装柱 (琼脂糖)

90098 (1 mL), 90099 (5 mL)

90093 (1 mL), 90094 (5 mL)

16109 (1 mL), 16110 (5 mL)

无 无

Superflow 树脂 (琼脂糖)

25214 (10 mL), 25215 (50 mL), 25216 (250 mL), 25217 (1 L)

25228 (10 mL), 25229 (50 mL), 25230 (250 mL), 25231 (1 L)

25236 (10 mL), 25237 (50 mL), 25238 (250 mL), 25239 (1 L)

无 无

表9.3. 重组蛋白亲和纯化产品的货号和包装规格。

订购信息

产品 规格 货号

Ni-NTA 纯化系统 6 次纯化 K95001

Ni-NTA 琼脂糖 10 mL R90101

Ni-NTA 琼脂糖 25 mL R90115

Ni-NTA 琼脂糖 4 x 25 mL R90110

第 9 部分：重组蛋白纯化

104Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

Invitrogen™ Novex™ ProBond™ 镍离子螯合树脂是一种镍离子亲和树脂，可用于纯化含有多聚组氨酸序列的重组蛋白。可利用低 pH 缓冲液洗脱与树脂结合的蛋白质，或通过咪唑或组氨酸竞争获得蛋白质。在天然或变性条件下进行一步法纯化。ProBond™ 树脂使用螯合配体亚氨基二乙酸 (IDA) 与高度交联的 6% 琼脂糖树脂结合，可用于 FPLC、批量和重力流应用。树脂装至 50 或 150 mL 柱内。

Invitrogen™ Novex™ ProBond™ 纯化试剂盒是包括纯化缓冲液和树脂的全套系统，可在天然、变性或混合条件下纯化蛋白质。生成的蛋白质可直接用于多种目标应用领域。该试剂盒足够完成至多 6 次纯化。

订购信息

产品 规格 货号

ProBond 纯化试剂盒 1 套 K85001

ProBond 镍离子螯合树脂 50 mL R80101

ProBond 镍离子螯合树脂 150 mL R80115

如需了解有关我们的重组蛋白亲和纯化树脂的更多信息，请登录 thermofisher.com/recombinantproteinpurification

仅供学习参考蛋白质表达手册105

蛋白质生产服务

快速可靠的哺乳动物细胞蛋白质生产

Invitrogen™ GeneArt™ Genes-to-Proteins 服务是一种极为迅速地获取瞬时转染的哺乳动物细胞中的正确折叠的天然蛋白的方法。只需要核苷酸序列，我们一般可在 30 个工作日内提供纯化的蛋白质 (图 10.1)。我们将您的表达优化基因克隆至一种表达载体中，生成转染级的质粒 DNA，然后采用先进的表达系统获得高表达产量。随后利用亲和层析法纯化分泌型或细胞内蛋白 (如 Fc 标签、His 标签)。如果您需要高纯度的蛋白质，则可提供进一步纯化。每种纯化蛋白质均提供详细的文件，包括 Coomassie 染料染色的 PAGE 凝胶和蛋白质印迹。交付产品是您的目的蛋白和用于转染的表达载体。请参阅表 10.1，了解有关服务的更多信息。

表10.1.蛋白质生产服务总结。

服务 说明 交付产品

Genes-to-proteins 中试试验

瞬时转染的 Gibco ExpiCHO-S、Expi293F、Invitrogen FreeStyle CHO-S 或 FreeStyle 293-F 细胞中蛋白质产量测定的可行性研究

• 生产您指定量的蛋白质的报价

• 文件，包括Coomassie 染料染色的凝胶和蛋白质印迹

• 纯化的蛋白质

Genes-to-proteins 纯化

使用您指定的培养体积，从瞬时转染的 ExpiCHO-S、Expi293F、FreeStyle CHO-S 或 FreeStyle 293-F 细胞中表达并纯化蛋白质

• 从指定的培养体积纯化的全部蛋白质(或培养上清液或细胞)

• 文件，包括Coomassie 染料染色的凝胶和蛋白质印迹

Genes-to-proteins 全套

从瞬时转染的 ExpiCHO-S、Expi293F、FreeStyle CHO-S 或 FreeStyle 293-F 细胞中表达并纯化指定量的蛋白质 (必须的中试服务)

• 指定量的纯化蛋白质

• 文件，包括 Coomassie染料染色的凝胶和蛋白质印迹

Part 10: Protein production services

106Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

如需了解更多信息，请登录 thermofisher.com/g2pservice

完整的服务链从基因到蛋白质

更佳的性能 方便快捷

• 节省时间：从基因到蛋白质只需 30 个工作日

• 从寡核苷酸合成到纯化蛋白，每个步骤均为内部生产

• 可靠且先进的表达系统，如 Gibco ExpiCHO-S、Gibco Expi293F、Invitrogen FreeStyle CHO-S 或 Invitrogen FreeStyle 293-F 细胞和培养基；所有试剂均有售

• 表达规模从 30 mL 到 20 L 的摇瓶至 WAVE 细胞培养

• 我们拥有大型项目的经验

• 简单便捷的电子邮件订购：填写调查问卷并发送至指定邮箱

• 专业且经验丰富的项目管理团队在所有项目阶段与您保持密切沟通

适当表达载体内的优化基因，用于进一步研究

在较短时间内获得目标蛋白的最便捷的 方式

及

1 2 3

图10.1. GeneArt Genes-to-Proteins 服务的优势。

Part 10: Protein production services

107 仅供学习参考蛋白质表达手册

与未经优化的基因相比，Thermo Fisher Scientific 的 GeneArt 表达优化和先进的表达系统 (如 Expi293F 细胞) 通常可以提高整体项目的可靠性和表达产量 (图 10.2)。通过 GeneArt™ GeneOptimizer 算法可以实现蛋白表达优化，确定您的表达实验的最佳基因序列。使用多参数方法可以合理并系统地解决蛋白质表达的常见痛点，如产量 (参见图 10.3)。经实验证实，优化可以提高各种宿主系统中的蛋白表达速率达 100 倍 (Fath et al. 2011)。

请登录 thermofisher.com/g2pservice 了解更多信息或询价。

野生型 已经过优化

野生型相对表达

IL-2

空对照组

IL-2

20

15

1 2 3

已经过优化

1 2 3

A

B

图10.2. 利用基因优化提高蛋白表达。(A) 利用蛋白质印迹分析三种野生型和优化的 IL-2 重组体转染。(B) 利用光密度分析生成的条带。参考资料 [1]。

Part 10: Protein production services

108Thermo Fisher Scientific仅供学习参考

参考文献1. Fath S, Bauer AP, Liss M et al. (2011) Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance

autologous mammalian gene expression. PLoS One 6(3):e17596.

stem-loopV

stem XA

htc

htc

stem-loopN

100

stem-loopM

stem-loopBC

stem JD

stem-loopJK

AX

stem 1

A

A

A

AA

A AA

A

A

A A

A

A

AA

AA

A

A

A

A

AA

A

AA

AA

AA

A

A

A

A

A AA

A AAA

A

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A

A

AA

AA A A

A

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A

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A

A

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UU

UU

U

UG

GG

G

G

G

G

GG

GGG

GG

GG

G

GG

G

G

G

G GGG

GG

GGG

G

GG G

G

G G

G GG GGG GGG

GG

G

GG

G

G G

G

G

GG

GGGG

GGGG

GGGG

G

G

GG

G

G

GC

C

C

C

CC

C

C

C

CC

CC

C

C

C

C

CC

CC

C C

C

C

C

CC

CC

C

C

C

C

CC

C

C

Remove sequence repeats

100

60

20

0

40

80

1 31 81 91 121

151

181

211

241

271

301

331

381

391

421

451

481

511

541

571

601

631

661

691

721

751

781

811

841

871

901

931

961

991

1021

1031

108111

1111

4111

7112

0112

3112

6112

9113

2113

3113

8114

1114

41

Adjust codon usage

70

40

10

0

20

30

50

60

Optimize GC contentPosition

% G

C

61 101

141

181

221

261

301

341

381

421

461

501

541

561

621

661

481

511

541

601

631

661

901

941

981

1021

1061

1101

1141

1181

1221

1261

1301

1341

1381

1421

1461

1501

1541

1561

1621

1661

1701

1741

1761

1821

1861

1901

1941

1961

2021

2061

2101

2141

2181571

Eliminate killer motifs Remove splice sites Avoid RNA 2º structure

优化的基因

AAAAAA AAAAAA

PABPPABP

PABPAAAAAA

图10.3. GeneOptimizer 算法可为您的实验确定最佳的基因序列。算法可去除 DNA 序列重复，优化密码子使用和 GC 含量，最大程度地减少会降低蛋白产量的 RNA 二级结构的形成。蛋白序列不受优化过程影响。

蛋白质表达手册109 仅供学习参考

蛋白表达支持中心的常见问题

thermofisher.com/proteinexpressionsupport

1. 常用于蛋白表达的启动子有哪些？

表 11.1 列出了常用于重组蛋白表达系统的启动子。

蛋白表达支持中心的常见问题

表11.1. 重组蛋白表达常用的组成型和诱导型启动子。

宿主 组成型启动子 诱导型启动子 诱导剂

大肠

杆菌 非常规配备 Lac (乳糖操纵子)；

araBAD (L-阿拉伯糖操纵子)

IPTG；L-阿拉伯糖

酵母

GAP (磷酸甘油醛脱氢酶)

AOX1 (醛氧化酶)；GAL1 (半乳糖激酶生物合成)

甲醇；半乳糖

昆虫

Ac5 (肌动蛋白)；OpIE1 和 2；PH (多角体蛋白)

MT (金属硫蛋白) 铜

哺乳

动物

CMV (巨细胞病毒)；EF-1 (人类延伸因子 1)；UbC (人泛素 C)；SV40 (猿猴病毒 40)

含 TetO2 (四环素操纵子) 的启动子；含 GAL4-UAS (酵母 GAL4 上游激活序列) 的启动子

四环素或多西环素；米非司酮

蛋白表达支持中心的常见问题

110仅供学习参考 Thermo Fisher Scientific

2. 什么是用于哺乳动物表达的共有 Kozak 序列？当我将目的基因克隆至哺乳动物表达载体之一时，是否需要包括 Kozak 序列？

共有 Kozak 序列是 A/G NNATGG，其中 ATG 表示起始密码子。ATG 周围核苷酸中的点突变可以调控翻译效率。尽管在一般情况下，我们建议包括 Kozak 共有序列，但其必要性取决于目的基因，通常 ATG 足够实现高效翻译起始。最佳建议是在 cDNA 周围保持天然起始位点，除非您知道其无法提供足够的功能。如果担心表达，我们建议您检测两个重组体，一个带有天然起始位点，另一个带有共有 Kozak 序列。一般而言，所有包括 N 末端融合的表达载体都已经带有翻译起始位点。

3. 我对哺乳动物表达系统很感兴趣，它们可以提供极高的蛋白产量。您可以提供哪些系统？

对于稳定的高产量表达，我们可提供FreedomCHO-S和FreedomDG44试剂盒。对于瞬时高产量表达，我们可提供ExpiCHO表达系统和Expi293表达系统，前者在瞬时CHO系统中的蛋白质产量达3克/升，后者在瞬时293系统中的蛋白质产量达1克/升。对于在Exp293F细胞中高产量表达功能膜蛋白，我们可提供Expi293MembranePro表达系统，它结合了Expi293表达系统和MembranePro技术的可扩展性和易用性，与标准的贴壁细胞MembranePro功能蛋白表达系统相比，膜蛋白产量增加超过20倍。

4. 什么是剂量反应曲线或杀伤曲线？您能否列出相关步骤？

剂量反应曲线或杀伤曲线是在建立稳定细胞系时，确定最佳抗生素浓度的简单方法。在含有不同浓度抗生素的培养基中培养未转染细胞，确定细胞全部死亡所需的最少抗生素的量。建立剂量反应曲线或杀伤曲线的基本步骤如下：

• 接种 25% 汇合的未转染细胞，使其在含有不同浓度抗生素的培养基中生长：对于某些抗生素，您将需要计算活性药物量，以控制批次差异。

• 每 3–4 天补充选择性培养基。10–12 天后，检查培养皿中的活细胞。细胞在选择性培养基中分裂一次或两次后会开始死亡。

• 查找细胞全部死亡的最低抗生素浓度。这是适用于稳定筛选的最佳抗生素浓度。

蛋白表达支持中心的常见问题

111 仅供学习参考蛋白质表达手册

5. 我如何决定使用慢病毒还是腺病毒表达系统？

腺病毒表达适用于瞬时表达，而慢病毒表达则适用于较长期的表达。腺病毒载体可以在 293A 细胞中扩增数倍，但浓缩慢病毒的唯一方法是离心。腺病毒要求宿主细胞带有柯萨奇病毒和腺病毒受体 (CAR) 以实现高效转导；但是，慢病毒则对各种哺乳动物细胞类型具有广泛细胞嗜性，因为慢病毒颗粒上包被有水泡性口炎病毒 G 蛋白 (VSVG) 膜。

6. 什么是 MOI？我如何知道应使用哪种 MOI？

MOI 表示感染复数。理论上，MOI 1 表示培养板中每个细胞含有 1 个病毒颗粒，MOI 10 表示每个细胞含有 10 个病毒颗粒。但是，一些因素可影响最佳 MOI，包括哺乳细胞系的性质 (非分裂与分裂)、转导效率、目的应用领域以及目的蛋白。

当您第一次将腺病毒或慢病毒重组体转导至选择的哺乳动物细胞系中时，我们建议您使用一定范围的 MOI (如0、0.5、1、2、5、10、50)，以确定获得最佳基因表达的 MOI (对于慢病毒神经元转导，MOI 一般大于 50)。确定可提供最佳基因表达的 MOI 后，在最佳 MOI 条件下进行后续转导。

7. 杆状病毒感染的早期、晚期和极晚期形态如何？

杆状病毒感染的阶段：

早期

• 细胞直径变大——可以观察到细胞直径增大 25–50%

• 细胞核体积变大——细胞核可能“充满”整个细胞

蛋白表达支持中心的常见问题

112仅供学习参考 Thermo Fisher Scientific

晚期

• 细胞生长停滞——与未经感染的细胞对照相比，细胞停止生长

• 颗粒状外观

• 病毒出芽征象——细胞呈囊泡状

• 病毒包涵体——一些细胞含有包涵体，在昆虫细胞核内显示为折射晶体状

• 解离——此前的贴壁细胞从培养皿或培养瓶上解离下来

• 极晚期细胞裂解——一些细胞可能充满包涵体病毒，死亡，破裂，单层细胞出现透明征象

8. 如何测定杆状病毒储液的滴度？

我们建议您进行空斑分析，确定杆状病毒储液的滴度。如果需要，您还可以进行空斑分析，纯化单个病毒克隆。

9. 在细菌表达中，“泄露表达”是什么意思？

泄露表达是指观察到一些基础水平表达。例如，在所有 BL21 (DE3) 细胞系中，一直存在一些基础水平的 T7 RNA 聚合酶表达。如果将有毒基因克隆至 T7 启动子的下游，则这种“泄露表达”会导致生长速度变慢、细胞死亡或质粒不稳定。

10. 我希望通过非随机整合构建稳定的藻类细胞系。您推荐哪种试剂盒？

我们推荐聚球藻试剂盒，其整合至聚球藻基因组的中性位点 1。

蛋白质表达手册

致谢我们对为本手册内容和制定做出贡献的所有人表示感谢。

Amrik Basi

Aric Christopherson

Asha Venkateswaran

Atul Deshpande

Frederick Solomon

Gicell Schaenzler

Henry Chiou

Jennifer Lee

Jim Stefl

Jon Zmuda

Krishna Vattem

Monica O’Hara

Nina Raab

Rebecca Burnham

Thomas Landon

蛋白质表达手册

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