protein-protein interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

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Protein-protein I nteraction 蛋蛋蛋 - 蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋 03/27/2009

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Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用. 03/27/2009. Protein-Protein Interactions- A Common Theme in Cell Biology 蛋白质 - 蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题. Protein-Protein Interactions. Cell assembly and function/ 细胞组装与功能. Stable, DNA mutation. Headquarter. - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Protein-protein Interaction 蛋白质 -蛋白质相互作用

03/27/2009

Page 2: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Protein-Protein Interactions-

A Common Theme in Cell Biology

蛋白质 - 蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题

Page 3: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

* DNA * RNA

* Protein

Cell assembly and function/ 细胞组装与功能

Messenger

Headquarter

Executor

Stable, DNA mutation

Stable/Versatile, rRNA, tRNA, mRNA

Versatile, Protein modificationProtein-Protein interactionProtein-Other component interaction

Protein-Protein Interactions

Page 4: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Single protein Protein complex

Protein complex interaction

Protein complex network

Cell, Versatile, Dynamic, Accurate regulation……

Cell assembly and functionProtein-Protein Interactions

Page 5: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Interaction Domain

- Structural basis for protein interaction

相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础

* 信号蛋白,调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具 有包括相互作用区域在内的好几个结构域; * 有些多肽仅由相互作用区域组成,从而充当蛋白质复合物的核心。

Page 6: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础

*SH2 domain: phosphotyrosine-containing peptides recognition domain 。SH2 分布最为广泛,识别特定的含有磷酸化 Tyr 的多肽模块。

SH3 SH2 Y kinase SH3 SH2 SH3

pYEEI pYVNV

Src SH2 domain: Grb2 SH2 domain:

Page 7: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Interaction domain and Protein interactionSignaling transduction pathway

Page 8: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Physiological functions of protein interactions

Localization 蛋白质的亚细胞定位

* 蛋白质的亚细胞定位与其 功能密切相关;

* 涉及: 蛋白质 -蛋白质相互作用; 蛋白质与磷脂的相互作用;

* 蛋白质的组织特异性与 亚细胞定位的研究是蛋白 质功能研究的起始步骤

Page 9: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Protein-protein interaction can be used to build complex biological systems.

蛋白质 -蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。 (如线粒体内膜呼吸链)

Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking

Page 10: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Aberrant interactions can contribute to pathogenesis;

错误的相互作用可能导致病理形象的出现。

如 Alzheimer’s disease, beta- 淀粉样结构的堆积;

Physiological functions of protein interactions

Localization and Trafficking

Page 11: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Inducible protein interaction &

posttranslational modifications

可诱导的蛋白相互作用与翻译后修饰

Dynamic behavior of cells in response to changi

ng conditions is highly dependent on posttransla

tional modifications;

细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。

Page 12: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques and computation

Elucidation of Protein-Protein

Interactions

Biophysical TechniquesMass Spectrometry

Surface Plasmon Resonance Atomic Force Microscopy

NMRX-ray Crystallography

High Throughput TechniquesLibrary Screening

Degenerate Peptide LibrariesSpot Blots

Co-IPsGST-pulldownsYeast 2-HybridPhage DisplayStandard Techniques

Co-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage Display

In vivo ImagingFRETBRET

Protein Interaction Networks

Page 13: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : Principle, Process, Advantage and Disadvantage

GST-Pull down

Principle: Affinity purification Affinity between Interaction motif /polypeptide and its interaction proteins;

Advantage: Direct interaction / In vitro

Process:

Interaction motifGSTImmobilized onGlutathione beads

Affinity column Making

Affinity purificationfrom tissue or cell lysate

Page 14: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫沉淀

Page 15: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

质量作用定律决定 IP 的成功度

Page 16: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫沉淀(非变性)

• 免疫沉淀的灵敏度取决于 Protein A (or G) 与 IgG 的 Kd 、 Ig

G 与抗原的 Kd 值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度;

Protein A Bead

IgG AntigenKd Kd*

* IgG Kd

Antigen

Page 17: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Co-Immunoprecipitation / 共免疫沉淀

Principle: Affinity purification/ 亲和纯化Advantage:

In vivo (Physiological status) / 代表生理状态下的相互作用

X YX Y

Cell

Cell Lysis andImmunoprecipitation of protein X

ZZ

细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀

Page 18: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫沉淀(非变性)

1. 生理活性的保持: a. 全程低温操作; b. 裂解液中加入蛋白酶抑制剂;

2. 免疫沉淀的灵敏度取决于 Protein A(or G) 与 IgG 的 Kd 、 IgG 与抗原的 Kd 值。 所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉 淀可以提高灵敏度;

Protein A Bead

IgG XKd Kd*

* IgG XKd

Page 19: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫沉淀(非变性)

免疫沉淀的产物如用于 SDS-PAGE 及及免疫印迹进一步分析时,

* 需要去除盐的干扰, PBS 或其它洗涤缓冲液应可能去除; 大量 IgG 掺入也影响电泳的效果,如脱尾和扩散。

检测信号十分微弱时,这种条带的扩散可能导致根本无法获得 信息;

Page 20: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫沉淀(非变性)

免疫沉淀的产物如用于 SDS-PAGE 及及免疫印迹进一步分析时,大量的 IgG 掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带;对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大;

IgG

目的蛋白

•用目的蛋白的抗体进行 免疫沉淀,再用免疫印 迹法进行检测;

Page 21: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

GFP WT YF Mut(6)

- + - + - +

IP: GFPIB: 4G10 (pTyr)

MTSS1-GFP

GFP

PDGF

115 93

49.8

35.8

29.2

198

- + - + - +

Reblot: GFP

MTSS1-GFP

GFP WT YF Mut(6)

Page 22: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀(非变性)

操作同非变性免疫沉淀,只是检测的是相互作用蛋白;其效率还涉及复合物中蛋白质 X, Y, Z的 Kd 值。

Protein A Bead

IgG

X YZ

Protein A

IgG

Protein X*

Protein Y

Protein Z

Kd

Kd

Kd

Kd

Page 23: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀(非变性)

1. 免疫复合物中蛋白质 X, Y , Z的 Kd 值越小,即越稳定, 有利于免疫共沉淀的进行 ;2. 免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀;

X YZ

Protein A

IgG

Protein X*

Protein Y

Protein Z

Kd

Kd

Kd

Kd

Page 24: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀(非变性)

细胞裂解液的几点考虑:1. 复合物的稳定,提高灵敏度,但会降低特异性;2. 针对特定的复合物,细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶 抑制剂或者 ATP 及一些金属离子以维持复合物的稳定;

Page 25: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀

免疫共沉淀中的非特异性:

BAx

Y

细胞裂解

蛋白质 X的抗体进行免疫沉淀

X Y

X Y

B

A

X

Page 26: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 I )

BAx

Y

细胞裂解

蛋白质 X的抗体进行免疫沉淀

AX

原因:抗体的非特异性

Page 27: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 I )

1. 抗体的质量:抗体的特异性;2.尽可能的设置多种阴性对照; 一般采用兔子免疫前的血清 (pre-immune serum) 同时进行免疫沉淀及后续分析 ;3. 使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较;4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫

沉淀并比较;5. 增强细胞裂解液的严谨性,降低非特异性;6. 检测两种蛋白质的相互作用时,同时用两个蛋白质

的抗体进行实验;

Page 28: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

BAx

Y

细胞裂解

蛋白质 X的抗体进行免疫沉淀

X Y

X Y

B

X

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 II )

•抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用;•抗原复合物解离

X

Page 29: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 II )

* 当 X-Y 的复合物不很稳定或解离常数大时,可以考虑使用细胞 可渗透的交联剂 (Cross-linker)

X NH2 YNH2活性基团 活性基团A

°

BAx

Y

细胞裂解

蛋白质 X的抗体进行免疫沉淀

Page 30: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 II )

* 当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时,可以考虑 使用细胞可渗透的交联剂 (Cross-linker)

X NH2 YNH2活性基团 活性基团

A °

Page 31: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

BAx

Y

细胞裂解

蛋白质 X的抗体进行免疫沉淀

X Y

Techniques : 免疫共沉淀: 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型 II )

Page 32: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

研究方案 :Affinity purification & MS

带 Tag 的目标蛋白与固相基质偶联

目标蛋白带上 Tag

目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化

目标蛋白复合物的 SDS-PAGE 分离

蛋白质条带的切割和酶解

质谱与生物信息学分析

文献与其他数据库的功能分析

实验验证与功能的探索

Page 33: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

MTSS1 过量表达促进 PDGF诱导的背部变皱膜形成

GFP

MTSS1-GFP

F-actin

F-actin

GFP

GFP

Page 34: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

研究方案 :Co-immunoprecipitation & MS

Serum starvation

MIM-GFP infected NIH 3T3 cell

PDGF stimulation

Crosslinker stabilize complex

Immunoprecipitation with GFP antibody

SDS-PAGE

Excise bands and digestion

Analyze by MS and bioinformatics

Page 35: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

核糖体蛋白 代谢酶类 热休克蛋白 泛肽酶 高丰度的细胞骨架蛋白 血清蛋白(如果使用是 IP 亲和的方式)

MS after affinity purification鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息

•去除这些常见的非特异结合的蛋白质(除非它们与你目标 蛋白质功能相关)

Page 36: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Transcriptional pattern of of MTSS1 and interacting protein candidates identified by Co-IP & MS

http://mouse.brain-map.org/

* 利用其他数据库进行的功能分析

Page 37: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

质谱鉴定数据的分类( Example )

F-actin affinity purification & MS 鉴定小脑发育相关的 F-actin binding protein;

Step:

(1) F-actin 亲和纯化; (2) MS 数据搜索和初步分析; (3) 按鉴定到的蛋白质与 F-actin 结合的属性分类 ;

(4) 按MS鉴定到的蛋白质的生物学功能分类; (5) 生物学功能相同或相近的蛋白质聚类 , 分析复合物组成; (6) 根据这些蛋白质在小脑不同发育时期的表达模式聚类; (7) 由此将与小脑发育相关的 F-actin 结合蛋白与小脑特定发育 时期的功能相联系。

Page 38: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

部分鉴定到的 F-actin 结合蛋白的功能归属

Page 39: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Proliferation & Cell death

Cell migration & differentiation

Dendrogenesis & axogenesis

Synaptogenesis

Postnatal development stages of cerebellum

Transcription level of MTSS1 in cerebellum

**

Page 40: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

蛋白质功能研究的策略

信息学 试验分析新蛋白

序列同源比较 相互作用区域 功能区

功能伙伴的预测

为抗体、siRNA,shRNA等的设计提供预测

试验工具:抗体,克隆,siRNA, shRNA

生理学背景:内源表达和组织及细胞定位

筛选相关蛋白

验证相关蛋白:1. 细胞内共定位;2. 去除相互作用区域的影响;3. 新蛋白与相关蛋白在功能上的一致性;

从找到的新相关蛋白开始,进行新一轮的筛选,建立功能 网络

Page 41: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

PRD

WH2CCD

Y39

7

Y39

8 IMD domain

F-actin bindingRac binding

Cortactin binding

G-actinbinding

Src SH2 binding

利用信息学分析新蛋白的结构和功能区,并进行相互作用蛋白的预测

Yamagishi et al, J Biol Chem, 279, 14929, 2004;Mattila et al, J Biol Chem, 278, 8452,2003;Bompard et al, J Cell Sci, 118, 5393, 2005.Lin et al, Oncogene,24, 2059,2005.

Page 42: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属

例 1 :从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白:

利用免疫共沉淀方法找到的 9 个 p53( 胞浆和核定位) 结合蛋白

1. GRP-94 GRP-94 2. Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侣 *** 3. MCM3 GRP-75 4. GRP-78 5. GRP-75 2 MCM3 DNA 复制准许因子 ** 6. Lamin A/C 7. Ezrin/Cytovillin Alpha-actinin 胞浆 8. CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纤层 细胞骨架 ? 9. Protein kinase C Ezrin/cytovilin 胞浆 4 Protein Kinase C 激酶 ?

5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X

1

Page 43: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

例 3 Sra1 与 Nap1 参与 Rac 诱导的片状伪足形成

从牛脑中用传统的柱层析分离到的蛋白质复合物,组分 经质谱鉴定,包括 Nap1,Sra-1 homologue , PIR121, WAVE1 and Abi 等组分。

Page 44: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

免疫共沉淀与 GST-Pull down验证Rac活化时复合物的存在

Page 45: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

Rac 活化时 Sra-1 与 Nap1 在细胞中的重新定位

Page 46: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

1. Sra-1 与 Nap1 定位于片状伪足顶部 (免疫荧光)

Page 47: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

RNA 干扰 Nap1 , Sra1 的表达对 Rac 功能的影响

Page 48: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

RNA 干扰 Nap1 , Sra1 的表达对 Rac 功能的影响

Page 49: Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

谢谢!