Cripto-1和 p-STAT3 蛋白表达与胃癌发生和转移的关系及意义

张建国 赵晶 辛彦中国医科大学附属第一医院 肿瘤研究所

Cripto-1(CR-1) 为表皮生长因子 -CFC(Epidermal Growth Factor-Cripto-1/FRL-1/Cryptic) 家族成员，具有调节细胞分化和早期胚胎发育的功能。

CR-1 也是一个重要的癌基因生长因子，与人类多种恶性肿瘤的发生和转移密切相关。

目前研究表明 CR-1 主要通过激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 与 PI3K/AKT 信号通路及阻遏活化素（ activin ）、 TGF-β 信号的抑癌效应发挥其癌基因功能，如促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤血管形成等。。

STAT3是 JAK-STAT 信号途径中的一种关键性转录因子，该通路受细胞因子与生长因子的刺激而活化，并通过调控其下游靶基因来促进细胞异常增殖和恶性转化，进而参与肿瘤的发生发展。

本研究通过免疫组化及 Western blot 方法检测CR-1与 p-STAT3 蛋白在正常胃黏膜、癌前病变及胃癌组织中的表达，分析并探讨二者在胃癌发生发展过程中的作用及意义。

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20

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160

180

正常胃黏膜 慢性萎缩性胃炎 肠上皮化生 异型增生 胃癌

材料与方法1 、标本收集

另取 32 例新鲜原发胃癌及其配对远癌正常胃黏膜组织标本，进行免疫蛋白印迹实验

95

4048

25

178

乳头状腺癌高分化腺癌中分化腺癌低分化腺癌未分化癌粘液腺癌印戒细胞癌

178 例胃癌临床病理资料：

Bor Ⅰ

BorⅡ

BorⅢ

BorⅣ

WHO 组织学分型Borrmann 分型

男性 121 例，女性 57 例

140

4 2212 65

74

19 2

3

6

2 、实验试剂 鼠抗人 CR-1 单克隆抗体（ R&D 公司） 1 ： 80 （免疫组化） ,1： 300（Western blot ） 兔抗人 p-STAT3 单克隆抗体（ SAB 公司） 1 ： 25 （免疫组化） ,1： 300（Western blot ） 鼠抗人 β-Actin 单克隆抗体（ Santa Cruz ） 1:1000 PV-9000 免疫组化检测试剂盒、 DAB 显色试剂盒

（北京中杉金桥公司） Wesetern blot 二抗（ Santa Cruz ）

3 、免疫组化及结果判定采用 PV-9000 二步法进行免疫组化染色

结果判定： CR-1 蛋白定位于细胞浆， p-STAT3 定位于细胞浆和细胞核，二者均以出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。

染色强度 (A) 染色阳性细胞(B)

0 分 无特异性染色 <5%

1 分 浅黄色 5~25%

2 分 棕黄色 26~50%

3 分 棕褐色 51~75%

4 分 >75%A B 0 分 1 分 2 分 3 分0 分 (-) (-) (-) (-)

1 分 (-) (+) (+) (+)

2 分 (-) (+) (+) (++)

3 分 (-) (+) (++) (+++)

4 分 (-) (+) (++) (+++)

结果判定 A×B ： 0 分为阴性 (-)； 1~4 分为弱阳性 (+)； 5~8 分为中度阳性 (++)； 9~12 分为强阳性 (+++)

4 、蛋白免疫印迹与结果判定 蛋白免疫印迹实验

结果判定：对成像结果进行扫描，并使用 QUANTITY

ONE 4.6 采集数据。用目的蛋白 CR-1及 p-STAT3 分 别与 β-actin 的比值作为目的蛋白相对表达水平

5 、统计学分析结果采用 SPSS13.0 统计学软件分析

（蛋白表达阳性率的比较应用 χ² 检验；相关性分析应用 Kendall’s tau-b 等级相关；蛋白免疫印迹图像灰度值用独立样本 t检验）P<0.05视为差异有统计学意义

实验结果 CR-1 在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化 生、异型增生及胃癌中的表达（表1，图1） p-STAT3 在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎、肠上皮 化生、异型增生及胃癌中的表达（表2，图2）免疫蛋白印迹法检测 CR-1与 p-STAT3 在胃癌及正常 胃黏膜中的表达 (表3、图3 ）胃癌组织中 CR-1与 p-STAT3 表达与胃癌临床病理特征的 关系（表 4 、 5 ，图 4 ） 胃癌组织中 CR-1与 p-STAT3 蛋白表达的相关性分析 (表 6 ）

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100

正常胃黏膜慢性萎缩性胃炎肠上皮化生异型增生胃癌

43.2%

65.0%

83.3%

80.0% 71.3

%

表 1 ， CR-1 在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌中的表达

　组别

　例数

CR-1 表达　

+~+++ (%)　χ²

　P - + ++ +++

正常胃黏膜 117 61 31 19 6 47.9 5.575/19.226 0.018a /<0.001b

慢性萎缩性胃炎 42 13 14 11 4 69.0 2.729/0.957 0.099c/0.328d

肠上皮化生 54 9 22 19 4 83.3 2.675 0.102e

异型增生 25 5 12 7 1 80.0 8.552/0.653 0.003f/0.419g

胃癌 192 53 72 42 25 72.4 18.793/ 0.191 <0.001h/0.662i

注： a 正常胃粘膜 vs 慢性萎缩性胃炎 ; b 正常胃粘膜 vs 肠上皮化生 ; c 慢性萎缩性胃炎 vs 肠上皮化生 ; d慢性萎缩性胃炎 vs 异型增生 ; e 肠上皮化生 vs 胃癌 ; f 正常胃粘膜 vs 异型增生 ; g 异型增生 vs 胃癌 ; h 正常胃粘膜 vs 胃癌 ; i 异型增生 vs 胃癌

P〈 0.05

正常胃黏膜 肠上皮化生

图 1 ， CR-1 在正常胃黏膜、肠上皮化生和胃癌中表达情况（ A,B,C X200,PV-9000 二步法）

胃癌

A B C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

正常胃黏膜慢性萎缩性胃炎肠上皮化生异型增生胃癌

41.1%

60.0%

77.1% 68.0

% 60.1%

表 2 ， p-STAT3 在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌中的表达

组别 例数 p-STAT3 表达

+~+++ (%) χ² P- + ++ +++

正常胃黏膜 95 56 25 11 3 41.1 18.405 0.012a* / <0.001b

慢性萎缩性胃炎 40 16 22 2 0 60.0 0.113 c*/0.003 d*

肠上皮化生 48 11 28 6 3 77.1 6.604 0.087e

异型增生 25 8 7 8 2 68.0 6.259 0.022f*/0.103 g

胃癌 178 71 69 23 15 60.1 10.322/7.220 0.016h/0.065 i

P〈 0.05

注： *Fisher 确切概率法 ; a 正常胃粘膜 vs 慢性萎缩性胃炎 ; b 正常胃粘膜 vs 肠上皮化生 ; c 慢性萎缩性胃炎vs 肠上皮化生 ; d 慢性萎缩性胃炎 vs 异型增生 ; e 肠上皮化生 vs 胃癌 ; f 正常胃粘膜 vs 异型增生 ; g 异型增生vs 胃癌 ; h 正常胃粘膜 vs 胃癌 ; i 异型增生 vs 胃癌

正常胃黏膜 肠上皮化生

图 2 ， p-STAT3 在正常胃黏膜、肠上皮化生和胃癌中表达情况（ A,B,C X400,PV-9000 二步法）

胃癌

A B C

表 3 ，Western blot 法检测 CR-1与 p-STAT3 蛋白在胃癌及正常胃黏膜中的表达

　 n Cripto-1 蛋白值

t P p-STAT3 蛋白值

t P

胃癌 32 95.19±29.68 2.338 0.023 100.50±24.30 2.880 0.005

正常 32 78.04±29.02 　 　 84.91±18.66 　 　

β-actin

p-STAT3

Cripto-1

T N T N T N T N

图 3 ， Cripto-1和 p-STAT3 蛋白在胃癌（ T ）与正常胃黏膜（ N ）中的表达

表 4 ， CR-1 蛋白在胃癌中的表达与胃癌临床病理因素的关系

组别 例数Cripto-1 表达

+~+++(%) χ² P

- + ++ +++WHO 组织学分

型 40.125 0.002

乳头状腺癌 2 0 1 1 0 100 管状腺癌 高分化腺癌 9 3 2 2 2 66.7 17.872 <0.001a

中分化腺癌 65 8 28 11 18 87.7

低分化腺癌 74 27 27 16 4 63.5

未分化癌 3 0 1 2 0 100 粘液腺癌 19 11 3 3 2 42.1

印戒细胞癌 6 2 1 3 0 66.7

Lauren分型 28.523 <0.001 肠型 74 11 29 14 20 68.4 19.566 <0.001b

弥漫型 85 29 31 21 4 65.9 混合型 19 11 3 3 2 42.1淋巴结转移 12.394 0.006 无 49 23 14 9 3 53.1 有 129 28 49 29 23 78.3 　 　 注： a 高 - 中分化胃癌 vs 低分化胃癌， b 肠型胃癌 vs 弥漫型胃癌 CR-1 蛋白在胃癌中的表达与胃癌患者的性别、年龄和胃癌的 Borrmann 分型未见相关(P>0.05)

表 5 ， p-STAT3 蛋白在胃癌中的表达与胃癌临床病理因素的关系

组别 例数p-STAT3 表达

+~+++(%) χ² P

- + ++ +++

WHO组织学分 型 36.969 0.005

乳头状腺癌 2 0 0 0 2 100

管状腺癌 高分化腺癌 9 4 4 0 1 55.6

中分化腺癌 65 23 23 10 9 64.5

低分化腺癌 74 35 29 7 3 52.7

未分化癌 3 1 2 0 0 66.7

粘液腺癌 19 7 8 4 0 63.2

印戒细胞癌 6 1 3 2 0 83.3

Lauren分型 11.417 0.076

肠型 74 27 26 9 12 63.5

弥漫型 85 37 35 10 3 56.5

混合型 19 7 8 4 0 63.2

淋巴结转移 9.632 0.021

无 49 28 16 3 2 42.9

有 129 43 53 20 13 66.7 　 　p-STAT3 蛋白在胃癌中的表达与胃癌患者的性别、年龄和胃癌的 Borrmann 分型未见相关(P>0.05)

THANK YOU

图 4 ， CR-1与 p-STAT3 蛋白在无淋巴结转移胃癌 (A, C) 及伴淋巴结转移胃癌 (B,D) 的表达（ A,B,C,Dx400， PV-9000 二步法）

A

C

B

D

表 6 ，胃癌组织中 CR-1与 p-STAT3 表达的关系

Cripto-1 表达

p-STAT3 表达

合计- + ++ +++

- 24 21 6 0 51

+ 28 22 9 4 63

++ 13 17 3 5 38

+++ 6 9 5 6 26

合计 71 69 23 15 178

rk=0.189, P=0.002

讨论 CR-1 能通过与类肝素硫酸蛋白聚糖 -1（ Glypican-

1 ）特异结合而活化酪氨酸激酶 (c-Src) ，进而激活下游信号转导通路，如 MAPK与 PI3K/AKT 信号通路参与肿瘤发生发展。

CR-1 也可通过间接结合表皮生长因子受体（ EGFR ）促进细胞增殖，而酪氨酸激酶和 EGFR 均能活化STAT3 。

Adamson E D, Minchiotti G, Salomon D, et al. Cripto： A tumor growth factor and more.Journal of Cellular physiology, 2002,190: 267-278.

Adamson E D, Minchiotti G, Salomon D, et al. Cripto： A tumor growth factor and more.Journal of Cellular physiology, 2002,190: 267-278.

本研究发现在 178 例胃癌组织中 CR-1与 p-STAT3 的

表达呈正相关，进一步提示 STAT3可能是 CR-1 的一个下游分子，异常高表达的 CR-1 蛋白可能通过活化STAT3 而参与了胃癌的发生发展，但 CR-1和 STAT3

信号通路的相关分子生物学机制尚需深入研究探索。

CR-1和 p-STAT3 蛋白的高表达可能是胃黏膜癌变过程中的早期事件，二者的异常表达与代表胃癌恶性生物学本质的淋巴结转移密切相关，提示 CR-1和 p-

STAT3 蛋白可以作为胃癌预后判断的分子标志物。

CR-1与 STAT3 信号通路在胃癌的发生发展过程中起重要作用，对其进行深入研究有望为胃癌的诊断与治疗提供新的思路。

谢谢！