第三章 蛋白质 (protein) 　　　

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第三章 蛋白质 (protein) 　　　 (123 － 317 页 第 3 ， 4 ， 5 ， 6 ， 7 章 )

第一节 　氨基酸第二节 　蛋白质概述第三节 　蛋白质的共价结构第四节 　蛋白质的三维结构第五节 　蛋白质结构与功能的关系第六节 　蛋白质的性质、分离与纯化

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蛋白质 ?

存在于所有的生物细胞中，主要由 20 种 α －氨基酸按一定的序列通过肽键缩合而成，具有较稳定的构象，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。相对分子质量由数千到数千万。

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第一节 氨基酸（ amino acid ） 123 页

一、氨基酸—蛋白质的构件分子二、氨基酸的分类 go三、氨基酸的酸碱化学四、氨基酸的化学反应 go五、氨基酸的光学活性和光谱性质 go六、氨基酸混合物的分析分离 go

结构与三字符

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一、氨基酸—蛋白质的构件分子

（一）蛋白质水解 酸水解： 碱水解： 酶水解：

完全水解：混合的氨基酸 部分水解：肽段和氨基酸

（二）氨基酸的一般结构

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（一）蛋白质的水解

水解类型 使用试剂 优点 缺点

酸水解H2SO4 (4M) 或HCl (6M), 进行回流煮沸 20h

无消旋作用色氨酸 (P126) 被破坏，部分丝氨酸、苏氨酸水解(P125) ，天冬酰胺和谷氨酰胺 (P126) 脱酰胺基

碱水解 NaOH (5M) 共煮10-20h

色氨酸稳定大多数 aa 被破坏，有消旋作用，产物为 D- 和 L-氨基酸混合物；精氨酸脱氨

酶水解 蛋白酶 无消旋作用， aa不被破坏

不完全水解，需多种酶协同作用

完全水解

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1. 结构通式 COOH

Cα 　 HH2N

R

COO－Cα 　 H

R

H3N ＋或

（二）氨基酸的一般结构

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① 除脯氨酸 (Pro ， P126) 为 α- 亚氨基酸外，与羧基相邻的 α- 碳原子上都有一个氨基，因而称为 α- 氨基酸。

② 除甘氨酸 (Gly ， P125) R 是 H 外 , 其它所有氨基酸分子中的 α- 碳原子都为不对称碳原子。除甘氨酸外的氨基酸都具有旋光性。

2. 结构特点

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二、氨基酸的分类

( 一 ) 常见的蛋白质氨基酸 (20 种 )

( 二 ) 不常见的蛋白质氨基酸

( 三）非蛋白质氨基酸 (150 多种 )

（一）常见的蛋白质氨基酸

Y

R N

D

Q E

K

F

W

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（一）常见的蛋白质氨基酸

1.按R基团的化学结构分

2.按R基团的酸碱性分

3.根据侧链R基团是否有极性分

4.根据人体能否自身合成

5. 20种氨基酸

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1. 按 R 基团的化学结构分① 芳香族氨基酸： 3 种，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（ 126 下图）② 杂环氨基酸： 2 种，组氨酸、脯氨酸（ 126 中图右）③ 脂肪族氨基酸： 15 种

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2. 按 R 基团的酸碱性分① 中性氨基酸 :15 种② 酸性氨基酸： 2 种　天冬氨酸、谷氨酸③ 碱性氨基酸： 3 种　赖氨酸、组氨酸、精氨酸

极性氨基酸

不带电荷

6 种

丝氨酸 Ser

苏氨酸 Thr酪氨酸 Tyr

谷氨酰氨 Gln天冬酰氨 Asn

半胱氨酸 P125

甘氨酸

CysGly

带负电

天冬氨酸 Asp

谷氨酸 Glu

带正电

组氨酸 His

赖氨酸 Lys

精氨酸 Arg

3

根据侧链R

基团是否有极性 P

127

15

4. 根据人体能否自身合成

① 必需氨基酸（ 8 种）：

甲硫氨酸 (Met) 、异亮氨酸 (Ile) 、苯丙氨酸 (Phe) 、赖氨酸 (Lys) 、缬氨酸 (Val) 、亮氨酸 (Leu) 、 色氨酸 (Trp) 、苏氨酸 (Thr)

② 半必需氨基酸（ 2 种） ：

Arg 、 His

③ 非必需氨基酸：其余 10 种

甘氨酸 丙氨酸 丝氨酸 半胱氨酸 精氨酸 酪氨酸 （干饼丝拌精奶酪）

天冬氨酸 天冬酰胺 谷氨酸 谷氨酰胺 组氨酸 脯氨酸 （天天姑姑祖谱）

5. 20 种氨基酸

R为C、H基团的氨基酸

R为芳香族基团的氨基酸

R为含硫基团的氨基酸

R为含醇基基团的氨基酸

R为碱性基团的氨基酸

R为酸性基团的氨基酸

R为含酰胺基团的氨基酸

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R 为 C 、 H 基团的氨基酸

① 甘氨酸② 丙氨酸③ 缬氨酸④ 亮氨酸⑤ 异亮氨酸⑥ 脯氨酸

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R 为 C 、 H 基团的氨基酸

① 甘氨酸：② 丙氨酸：（ - 氨基丙酸）

唯一一个无旋光性的氨基酸

③ 缬氨酸：（ - 氨基异戊酸）④ 亮氨酸：（ - 氨基异己酸）⑤ 异亮氨酸：（ - 氨基 -β- 甲基戊酸）

均为必需氨基酸。

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⑥ 脯氨酸 : 是一个亚氨基酸。

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R 为芳香族基团的氨基酸

① 苯丙氨酸：（ - 氨基 -β- 苯丙酸）② 酪氨酸：（ - 氨基 -β- 对羟基苯丙酸）③ 色氨酸：（ β- 吲哚 -- 氨基丙酸）注： 280nm 强吸收

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R 为含硫基团的氨基酸① 半胱氨酸：（ - 氨基 -β- 巯基丙酸）侧链上含有一 巯基

（ -SH ），– SH 也是一个高反应性的基团。② 甲硫氨酸（蛋氨酸） ：（ - 氨基 -γ- 甲硫基丁酸）是个疏

水氨基酸。

Met 在生物合成中是一种重要的甲基供体

两个 Cys的巯基氧化生成二硫键

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R 为含羟基基团的氨基酸

① 丝氨酸：（ - 氨基 -β- 羟基丁酸）② 苏氨酸：（ - 氨基 -β- 羟基丁酸）

在大多数酶的活性中心都发现有 Ser残基

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R 为碱性基团的氨基酸

① 组氨酸：（ - 氨基 -β- 咪唑基丙酸）② 赖氨酸：（ , 　 - 二氨基己酸）一个双氨基酸。③ 精氨酸：（ - 氨基 -δ- 胍基戊酸）是 20 种氨基酸中碱性最强的氨基酸。

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R 为酸性基团的氨基酸

① 天冬氨酸：（ - 氨基丁二酸）② 谷氨酸：（ - 氨基戊二酸）

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R 为含酰胺基团的氨基酸

① 天冬酰胺：（ - 氨基 -β- 羧基丙酰胺）② 谷氨酰胺：（ - 氨基 -γ- 羧基丁酰胺）

Leu L

-C-C-CONH2-C-CONH2

-C-COOH -C-C-COOH

-H -CH3

-C-OH -C-SH

-C-C-S-C PPro

-C-C C N N+

-C-C-C-C-NH3+ -C-

-C- -OH

-C-N

Central line

Aliphatic

Acid

Imino,Circular

alkaline

SulfuricHydroxy

Aromatic-C-C-C-N-C-N

N+

=

C-C-C-C

C-C-C-C

C C-C

C C C HN C-COOH

-C-C OH

Gln QAsn N

Asp D Glu EPhe F

Arg R

Lys K

His H

Gly G AAAla VVal I Ile

YTyr

Ser S

Thr T Met M

Cys C

Amino Acid Subway Map

Trp W

acid amide

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三、氨基酸的酸碱化学

( 一 ) 氨基酸的兼性离子形式( 二 ) 氨基酸的解离( 三 ) 氨基酸的等电点

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氨基酸在中性 pH 时，氨基和羧基可以离子形式存在。这样的氨基酸分子含有正、负两种电荷－－兼性离子

( 一 ) 氨基酸的兼性离子形式

COOH

Cα 　 HH2N

R

COO－Cα 　 H

R

H3N ＋或

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( 二 ) 氨基酸的解离

依照 Bronsted-Lowry 的酸碱质子理论

　 HA A- + H+

氨基酸是一类两性电解质：在水中的偶极离子既起酸的作用（质子供体），又起碱的作用（质子受体）

COO －

Cα 　　 H

R

H3N ＋

碱的作用

酸的作用

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解离情况受环境中 pH 值的影响。

阳离子的 阴离子的

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解离常数　

pKa ：表示解离基团有一半解离时的 pH 。 解离常数按酸性递减顺序编号为： pKa1 ， pKa2 、 pKa3 等。 解离常数可以通过酸碱滴定来确定 P131 (133 页表：各氨基酸的解离常数 ) Handerson-Hasselbalch公式

Ka1= [H+] 　 pKa1= pH

Ka2= [H+] 　 pKa2= pH

[ 质子供体］

[ 质子受体］pH = pKa + lg

在任一 pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例

氨基酸的带电状况与溶液的 pH 值有关。

[A-][H+]Ka2 = [A0]

Ka1= [A0][H+][A+]

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( 三 ) 氨基酸的等电点（ isoelectric point,pI）

等电点：在某一特定 pH 值溶液时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液 pH 值称为该氨基酸的等电点。

COO-

C HH3N+

R

COOH

C HH3N+

R

COO-

C HH2N

RH+H H H

A0 A －A ＋

pK1 pK2

H+

中性氨基酸 : pI = (A + B)/2 　酸性氨基酸： pI = (A+ C)/2碱性氨基酸： pI = (B + C)/2

A －为 α- 羧基的解离常数； B －为 α- 氨基的解离常数； C －为侧链可解离基团的解离常数

例题： P133

等电点的计算

当溶液 pH低于氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之，为负。 应用：根据氨基酸的电荷不同分离混合物。常用电泳方法。

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四、氨基酸的化学反应　　

（一）α-氨基参加的反应

（二）α-羧基参加的反应

（三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应

（四）侧链R基参加的反应

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( 一 ) α- 氨基参加的反应

1.与亚硝酸反应 2.与酰化试剂反应3.烃基化反应4.生成西佛碱的反应5.脱氨基反应

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1. 与亚硝酸反应

标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量

NH2

R-CH-COOH + HNO2 OH

R-CH-COOH + N2 + H2O室温下

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2. 与酰化试剂反应

与酰氯或酸酐在弱碱 溶液中作用，氨基即被酰基化。

在多肽和蛋白质人工合成中被用作氨基的保护试剂。

5

1

15

丹磺酰氯

39

酰化试剂

40

3.烃基化反应

用于鉴定多肽或蛋白质的 N 端氨基酸及序列测定。

2,4－二硝基氟苯 （ DNFB 或 FDNB ， Sanger 试剂）苯异硫氰酸酯 （ PITC ， Edman 试剂）

（ DNP- 氨基酸）黄色

弱碱

6mol盐酸中

单肽链＋ FDNB

DNP －肽链（ 黄色）

DNP －（ N 端）氨基酸　＋　 n 个氨基酸

乙醚抽提后层析，与标准DNP－氨基酸比较，确定 N 端氨基酸

弱碱

① 与 DNFB （ FDNB ）反应

42

Frederick Sanger 

英国化学家，在生物化学领域的贡献很大，他两次获诺贝尔奖（ 1958 和 1980年）；

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② 与 PITC反应

苯氨基硫甲酰衍生物

PTC- 氨基酸苯乙内酰硫脲衍生物

PTH- 氨基酸（无色）

在弱碱中

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Edman法测定氨基酸序列

单肽链＋ PITC

弱碱

乙醚抽提后层析，与标准 PTH－氨基酸比较，确定 N 端氨基酸

PTH- 氨基酸 + 余下少一个氨基酸的肽链

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4. 生成西佛碱（ Schiff's base ）的反应

与醛类化合物反应生成弱碱，也就是西佛碱 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间物。

转氨基作用机制

异构体Schiff碱

Schiff碱

磷酸吡哆胺

磷酸吡哆醛

HOOC C O

R1

+ N

CH2OPO3H2

CH2

HO CH3

H2NH＋ 2O

H－ 2O NCHOOC

R1CH3HO

H

C

CH2OPO3H2

N

H

H＋ 2O

H－ 2O N

CH2OPO3H2

C

H

N

HO CH3

CHOOC

H

R1

+ N

CH2OPO3H2

C

H

O

HO CH3

HOOC C NH2

H

R1

５　脱氨基反应

氨基酸氧化酶

５　脱氨基反应

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作业1. 20 种常见蛋白质氨基酸是否都有旋光性 ？2. 带 -OH, 带 -HS、酸性氨基酸和碱性氨基酸各是哪些氨基酸？3. pI？氨基酸处在大于自身 pI 的 pH溶液中净电荷为正还是负？4.把一个氨基酸结晶加入到 pH7.0 的纯水中，得到了 pH6.0 的溶液，问此氨基酸的 pI值是大于 6.0？小于 6.0？等于 6.0？为什么？

5.写出组氨酸在 pH 　 1 、 4、 8 、 12 时组氨酸的净电荷是怎样的？对每个 pH 来说，当电泳时，组氨酸是向阳极还是向阴极迁移？

6.牢记蛋白质的 20 种氨基酸的结构特征与三字符缩写

哪种氨基酸在生理 pH范围内具有缓冲能力？为什么？

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( 二 )α- 羧基参加的反应

1 成盐和成酯：

羧基被保护，氨基被活化。

2 成酰氯反应：

氨基被保护，羧基被活化，在多肽人工合成中常用。

3 叠氮反应：

常用于多肽的合成。

4 脱羧基反应：

成酰氯反应

51

52

脱羧基反应

53

1. 成肽反应

( 三 )α- 氨基和 α- 羧基共同参加的反应

54

2. 与茚三酮反应

是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（ Pro ）。

用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测定各种氨基酸。释放的 CO2 可用于氨基酸定量。

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茚三酮指纹熏显柜氨基酸纸层析

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( 四 ) 侧链 R 基参加的反应　

侧链功能团： 酚基、胍基、巯基、咪唑基、吲哚基等。 介绍以下的反应：

1.酪氨酸的酚基

2.精氨酸的胍基

3.半胱氨酸的巯基（－SH）

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1. 酪氨酸的酚基

米伦反应（ Millon) ：酪氨酸与 HgNO3 、与 Hg （ NO3)2 和 HNO3 作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。

Pauly 反应：酚基与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。

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2. 精氨酸的胍基坂口反应（ Sagakuchi ）：胍基与 α-萘酚，次溴酸盐作用生成红色物质。

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3.Cys 侧链上的巯基（－ SH ）

介绍以下几方面：

①与卤化烷生成稳定的烷基衍生物

②巯基能和各种金属离子形成络合物

③巯基易受空气或其他氧化剂氧化

④与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应

⑤巯基能打开氮丙啶的环

pKR=8.33

60

① 与卤化烷生成稳定的烷基衍生物

可保护 -SH 以防被氧化。

61

② 巯基能和各种金属离子形成络合物

含 -SH 的 酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活。

对羟基汞苯甲酸对氯汞苯甲酸

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③ 巯基易受空气或其他氧化剂氧化　　　　　

形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用。 go 形成二硫化物：胱氨酸的形成。 go

形成两种氧化衍生物

63

形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用。

HCOOOH

磺酸基

过甲酸

64

形成二硫化物：胱氨酸的形成。

O2

二硫键

胱氨酸

65

二硫键的还原（打开） ?

常用的打开二硫键的试剂主要有：a 氧化剂：过甲酸（ HCOOOH ）b还原剂：巯基乙醇（ HSCH2CH2OH ） 、二硫苏糖醇等。

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a 氧化剂：过甲酸（ HCOOOH ）

67

b还原剂：巯基乙醇

④与二硫硝基苯甲酸（ DTNB ）反应

为半胱氨酸定量

pH8.0 时，在 412nm波长处有强烈吸收。可用比色法定量测定半胱氨酸的含量。

硫硝基苯甲酸

⑤ Cys巯基打开氮丙啶的环

氮丙啶

五、氨基酸的光学活性和光谱性质　

甘氨酸无旋光性苏氨酸、异亮氨酸L- ， D- 构型

( 一 ) 氨基酸的旋光性

( 二 ) 氨基酸的光谱性质

紫外吸收光谱

三种芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性 pH条件下，色氨酸 280nm，酪氨酸 275nm，苯丙氨酸 257nm，溶液中蛋白质在 280nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计可以测定样品中蛋白质的含量。

核磁共振波谱

72

六、氨基酸混合物的分析分离

（一）分配层析法的一般原理（二）分配柱层析（三）纸层析（四）离子交换层析（五）薄层层析（六）高效液相层析

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（一）分配层析法的一般原理

固相液相半液相液相气相

固定相 (静相 )

流动相 (动相 )

层析系统

CA 溶质在溶剂 I （动相）中的浓度

CB 溶质在溶剂 II （静相）中的浓度

分配系数 (Kd) =

层析法分离混合物的先决条件： 各种氨基酸成分的分配系数要有差异，差异越大，越容易分开

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( 二 ) 分配柱层析

填充物：

亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。洗脱剂：

与水不互溶的溶剂，如苯酚、正丁醇 等。

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( 三 ) 纸层析 滤纸纤维素上吸附的水是固定相，有机溶剂作为流动相 。 原理：是根据混合物中溶质物质的分配系数不同进行分离的。

相对迁移率 Rf = X/Y　　

原点

溶剂前沿亮苯丙缬脯赖

781. 点样

纸层析操作

2.展层3.显色4. 分析

基质 :树脂（不溶性的高分子化合物，球形颗粒）带电基团： 通过化学反应引入基质。种类

–阳离子交换树脂： 带酸性基团（ -SO3H 、 -COOH ）、能解离出质子，与溶液中阳离子发生交换

–阴离子交换树脂：氨基酸与树脂的亲和力：

–取决于它们之间的静电吸引–氨基酸侧链与 树脂基质之间的疏水相互作用。

(四 ) 离子交换层析

80

81

图示：　　

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（五）薄层层析

薄层层析是以均与涂布于玻璃板上的薄层基质为固定相，以液体为流动相的一种层析技术。

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（六）高压液相层析

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作业1.α- 氨基酸的烃基化反应常用的二种试剂？ Edma

n法测定氨基酸序列原理？2.半胱氨酸的巯基都有哪些反应？常用的打开二硫

键的氧化剂和还原剂是什么？3.氨基酸分配层析原理？4.离子交换层析原理？