Kappelmayer János

Malignus hematológiai megbetegedésekmolekuláris háttere

MOLSZE IX. Nagygyűlése

Bük, 2005 szeptember 29-30.

Laboratóriumi vizsgálatok hematológiaimalignómákban

• Általános laboratóriumi vizsgálatok• A hematológiai betegség fenotípusának jellemzése:

– minőségi vérkép (periféria, csontvelő - MGG festés) – hematológiai automaták adatai?– citokémiai reakciók– immunfenotipizálás

• A hematológiai malignoma genotípusának jellemzése:– citogenetika/FISH (kromoszóma rendellenességek)– Ig/TcR génátrendeződések vizsgálata mol. biol. módszerekkel– transzlokációk kimutatása mol. biol. módszerekkel– MRD kimutatása– ploiditás vizsgálat

A B

Citokémiai reakció molekuláris diagnosztika ?

MPO PAS

LUC (large unstained cell) analízis

FVS: 204 G/L FVS: 1.2 G/LLUC: 56% LUC: 22%

Antigén kimutatás

CD61

Fluorokróm

antiCD61 Ab494 nm 517 nm

PMN érés markerei Monocyta érés markerei

Chronic Lymphocytic Leukemia

CD5

CD19

Leukemic cells: pos forCD5 and CD19

AL 4 color analízis

EWGCCA AL task force

2x4 felszíni marker

2x4 felszíni+IC marker

Fenotípus

Receptor kópiaszám

PSGL-1 kópiaszám

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

PMN MO AML-blast Monoblast

Hyperdiploid peak

Diploidpeak

Fenotípus

DNS tartalom

Multi Drug Rezisztencia (MDR) vizsgálata

Genetikai vizsgálatok jelentősége haematológiaimalignómákban

• Klonalitás igazolása (poliklonális és/vagy monoklonális sejtpopulációkjelenlétének igazolása)

• Diagnózis felállítása - tumor specifikus genetikai eltérések kimutatása(Philadelphia kromoszóma - CGL)

• Minimális reziduális betegség (MRD) kimutatása, monitorozás(terápiát követően a malignus sejtek reziduális klónjának jelenléte, mely standard patológiai és radiológiai módszerekkel nem mutatható ki)

• Prognózis becslése (specifikus gén mutáció jelenléte egy adott tumorban rossz vagy jó prognózissal jár együtt)

• Terápiára való reagálás megítélése (egyes génmutációk jelenléte bizonyos kezelésekkel szembeni rezisztenciára utal)

A leggyakoribb kromoszóma transzlokációkhaematológiai megbetegedésekben

Transzlokáció B-ALL T-ALL AML

gyerek felnőtt gyerek felnőtt gyerek felnőttt(1;19)(q23;p13) 5-8% 3-4% --- --- --- ---t(4;11)(q21;q23) 3-5% 3-4% --- --- <1% <1%t(9;22)(q34;q11) 3-5% 15-30% <1% <1% <1% <1%t(9;22)(q34;q11) 1-2% 10-15% <1% <1% <1% <1%t(12;21)(p13;q22) 25-30% <2% --- --- --- ---del(1)(p32;p32) --- --- 10-25% 10% --- ---t(8;21)(q22;q22) --- --- --- --- 10-14% 6-8%t(15;17)(q22;q21) --- --- --- --- 8-10% 5-15%inv(16)(p13;q22) --- --- --- --- 5-7% 5-6%

Genetikai elváltozások prognosztikaijelentősége

• t(1;19) - pre-B-ALL, rossz prognózis (magas fvs szám és LDH, CNS érintettség)

• t(4;11) - felnőtt ALL esetében rossz prognózis• t(8;22) - AML-M2, jó prognózis, jó válasz citozin arabinozidra• t(9;22) - felnőtt ALL esetében rossz prognózis (komplett remisszió

aránya alacsonyabb, betegségmentes túlélés ideje csökken)• t(12;21) - gyerekkori ALL, jó prognózis (sokkal később jelentkező

relapszus)• inv(16) - AML-M4(Eo), jó prognózis• t(17;19) - proB-ALL, rossz prognózis (gyakran társul DIC-kel)

A bcr/abl átrendeződés kromoszómálismechanizmusa

A bcr/abl expresszió változása Gleevecterápia során

Completeresponse

n = 14

Partialresponse

n = 18

Minorresponse

n = 10

Non-response

n = 23

p < 0.0001negative

100

10

1

0.1

0.01

Rat

io B

CR

-AB

L/G

6PD

H %

(n =

65)

Cytogenetics

Standard görbe:

G6PDH

Minták

Cro

ssin

g P

oint

(cik

luss

zám

)

log (kópiaszám)n

log

(F2/

F1)

n

log

(F2/

F1)

t (9;22)

n

G6PDH

A kvantitálás elve

Saját standard görbe 2130 fg

213,0 fg

2130 fg213 fg

21,3 fg

2,13 fg

A bcr/abl expresszió változása Gleevecterápia során

Freuhauf S. et al. J. Leuk Biol. 2003, 73: 600-603Imatinib restores expression of CD62L in BCR-ABL positives cells

FLT3 ITD/LM• a duplikált szekvencia a 14. exont érinti• ritkán 14. intront és 15. exont is (korábban 11., 12. exon) is érinti (JM

domént és TK1 domént kódoló régió)

FLT3 D835/TKD mutáció

• leggyakoribbak a pontmutációk a 835 kodonban(834, 836 kodon is érintett lehet)

• inszerció és deléció is előfordulhat

FLT3 ITDPrognosztikai jelentőség

• egységes álláspont: FLT3 ITD+ nagyobb a relapszusesélye

• gyakoribb terápia rezisztencia• rövidebb DFS (disease free survival), EFS (event free

survival) és OS (overall survival) • mutáns/vad típusú allél aránya fontos• vad típusú allél elvesztése különösen rossz prognózist jelez

FLT3 mutációk kimutatása

• hagyományos PCR reakciót használtunk, 11F és 12R primerekkel

• a vad típusú allél jelenlétére 329 bp nagyságú PCR termékutal

• nagyobb PCR termék ITD jelenlétére utal• a vad típusú allél el is veszhet• vad és a mutáns allél/ok intenzitásbeli különbségei is

fontosak• jobb a csontvelői minta vizsgálata

FLT3 ITD+ esetekK 1↓ 2 3 4 5 ↓ víz

MW50 bp

ITD→329 bp→

Vizsgált betegek

--6546my+ cALL

10.+-2039AML M49.-+9067AML M48.--7861AML M07.++9536AML M16.

-+3346AML v. CGL

5.2515AML M04.

--3534AML M23.

--4065AML M4 (MDS)

2.--7551my+ ALL1.

D835ITDkóros sejtek%

FLT3%Dg.Beteg

Közreműködők

•Dr. Antal Szalmás Péter

•Dr. Hevessy Zsuzsa

•Dr. Koczok Katalin

•Kissné Sziráki Valéria

•Győrffiné Veszprémi Anikó