issn 03551180 helsingin yliopisto elintarvike- ja
TRANSCRIPT
1
ISSN 03551180
HELSINGIN YLIOPISTO
Elintarvike- ja ravitsemustieteiden osasto
EKT-sarja 1873
PAPUMAISEEN FLAVORIKIRJOON KUULUVIEN HAIHTUVIEN YHDISTEIDEN
MUODOSTUMINEN HÄRKÄPAVUSSA JA LUPIINISSA ERI LIPIDISUBSTRAATEISTA
Otto Mustonen
Helsinki 2018
2
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – FacultyMaatalous-metsätieteellinen tiedekunta
Laitos/Institution– DepartmentElintarvike- ja ravitsemustieteiden osasto
Tekijä/Författare – AuthorOtto Mustonen
Työn nimi / Arbetets titel – TitlePapumaiseen flavorikirjoon kuuluvien haihtuvien yhdisteiden muodostuminen härkäpavussa ja lupiinissa eri lipidisubstraateista
Oppiaine /Läroämne – SubjectElintarvikekemia
Työn laji/Arbetets art – LevelMaisterin tutkielma
Aika/Datum – Month and year12/2018
Sivumäärä/ Sidoantal – Number of pages 92
Tiivistelmä/Referat – Abstract
Elintarvikkeissa palkokasvien käyttöä hankaloittaa ei-toivottujen haihtuvien yhdisteiden muodostuminen elintarvikematriisiinvarastoinnin sekä prosessoinnin aikana. Nämä haihtuvat yhdisteet aiheuttavat papumaista flavoria, mistä johtuvat aistinvaraisetongelmat palkokasvimatriiseissa. Koska haihtuvien yhdisteiden muodostuminen on nopeaa, entsymaattisella hapettumisella onsuuri merkitys lipidien hapettumisreaktioissa palkokasveilla. Tutkielman kirjallisuusosassa perehdyttiin lipidienhapettumismekanismeihin, entsyymeihin sekä papumaiseen flavoriin kuuluvien haihtuvien yhdisteiden muodostumiseenpalkokasvimatriiseissa. Tutkielman kokeellisessa osassa tavoitteena oli tutkia, miten härkäpavun ja lupiinin eri endogeenisetentsyymit pystyvät muodostamaan haihtuvia yhdisteitä erilaisista lipidisubstraateista. Lipoksigenaasientsyymin aktiivisuus sekäkäytetyt inkubaatio- ja mittausolosuhteet optimoitiin ensin, ja optimoituja olosuhteita käytettiin analysoitaessa varsinaisia näytteitä.
Tutkimuksen näytematriisina toimi neljä härkäpapulajiketta ja kaksi lupiinilajiketta. Palkokasvimatriisit esikäsiteltiin jauhamallapalkokasvin pavut tiettyyn partikkelikokoon. Jauhot lietettiin veteen entsyymien uuttamiseksi, ja entsyymiuutteita käytettiinlipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrityksessä sekä haihtuvien yhdisteiden tuotossa. Lipoksigenaasin merkittävän roolinvuoksi lipidien entsymaattisessa hapettumisessa sen optimiolosuhteet haarukoitiin pH:n osalta molemmille palkokasvimatriiseilleUV/VIS-spektrofotometrisesti, mikä osoittautui parhaaksi pH:ssa 6. Haihtuvien flavoriyhdisteiden muodostumista jamittausolosuhteita optimoitiin HS-SPME-GC-MS-laitteistolla (kiinteäfaasimikrouutto-kaasukromatografiamassaspektrometrisesti)käyttäen optimoituja olosuhteita varsinaisten näytteiden mittauksissa. Lisäksi tutkittiin palkokasvinäytteiden lipaasientsyyminaktiivisuutta sekä lipoksigenaasientsyymin tuotespesifiyttä.
Molempien palkokasvien lipoksigenaasientsyymien optimi-pH oli 6, joten haihtuvien yhdisteiden tuottoa tutkittiin tässä pH:ssa.Kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti haihtuvia flavoriyhdisteitä muodostui eniten linolihapon toimiessa substraattina, jolloin muodostuierilaisia alkoholeja, ketoneita, aldehydejä sekä furaaneita. Heksanaalia muodostui eniten linolihapon toimiessa substraattina javähiten α-linoleenihapon toimiessa substraattina. Trilinoleiinin sekä rypsiöljyn toimiessa substraatteina haihtuvista flavoriyhdisteistäanalysoitiin vain aldehydejä ja ketoneja sekä kvantitatiivisesti että kvalitatiivisesti vähemmän, kuin linolihapon toimiessasubstraattina. Rypsiöljyn saippuoituminen paransi haihtuvien flavoriyhdisteiden muodostusta, jolloin analysoitiin em. yhdisteryhmienlisäksi alkoholeja sekä furaaneja. Lisäksi haihtuvia yhdisteitä syntyi huomattavasti enemmän saippuoidusta rypsiöljystä kuinkäsittelemättömästä rypsiöljystä. Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasin havaittiin tuottavan linolihaposta erilaiset hydroperoksidit:härkäpavussa syntyi enemmän 13-hydroperoksideja kuin 9-hydroperoksideja ja lupiinista syntyi vain 13-hydroperoksideja. Käytetylläanalyysimenetelmällä ei voitu havaita vapaiden rasvahappojen syntyä, mikä olisi osoittanut lipaasiaktiivisuutta härkäpapu- jalupiiniuutteissa. Tulos ei kuitenkaan yksiselitteisesti kerro, että palkokasvimatriiseissa ei ollut lipaasiaktiivisuutta.
Molemmat palkokasvimatriisit muodostivat monenlaisia haihtuvia yhdisteitä erilaisista lipidisubstraateista tutkituissa olosuhteissa,joten haihtuvien yhdisteiden muodostumisella on aistinvaraista laatua heikentäviä vaikutuksia palkokasvimatriiseissa. Koska suurinosa elintarvikematriiseista esiintyy aika neutraaleissa pH-arvoissa, on haihtuvien yhdisteiden muodostuminen palkokasvejasisältäviin elintarvikematriiseihin erittäin todennäköistä oikeanlaisten substraattien sekä olosuhteiden läsnäollessa. Entsyymieninaktivointia voidaan tehdä esimerkiksi lämpötilaa nostamalla elintarvikematriisin ravitsemuksellisen arvon kuitenkin laskiessa.
Avainsanat – Nyckelord – Keywordshaihtuvat yhdisteet, entsymaattinen hapettuminen, HS-SPME-GC-MS, papumainen aromi
Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where depositedHelsingin yliopiston digitaalinen arkisto Helda
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
EKT-sarja 1873
3
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – FacultyFaculty of Agriculture and Forestry
Laitos/Institution– DepartmentDepartment of Food and Nutrition
Tekijä/Författare – AuthorOtto Mustonen
Työn nimi / Arbetets titel – TitleBeany flavor: formation of volatile compounds in faba bean and lupine matrices by using different lipid substrates
Oppiaine /Läroämne – SubjectFood chemistry
Työn laji/Arbetets art – LevelMaster’s thesis
Aika/Datum – Month and year12/2018
Sivumäärä/ Sidoantal – Number of pages 92
Tiivistelmä/Referat – Abstract
In food matrices usage of legumes is challenging due to formation of volatile compounds during storage and processing. Thesevolatile compounds form beany flavors, which cause sensory problems in food matrices. Because the formation of volatilecompounds in legume matrices is quite quick, it is supposed that enzymatic oxidation is significant when lipids are oxidized inlegume matrices. The literature review of this thesis focused on the mechanisms of lipid oxidation in plants, enzymes and formationof volatile compounds in food matrices. The aim of the experimental part was to investigate how volatile compounds are formedfrom different faba bean and lupine cultivars by endogenic enzymes using different lipid substrates. The activity of lipoxygenaseand incubation conditions were optimized at first and those conditions were used to analyse the actual samples.
The main legume matrix in this study was faba bean (4 cultivars) and two lupine cultivars were also investigated. The selectedlegumes were pretreated by grinding the dried pods of legumes in certain particle size. Legume flours were mixed with water toprepare slurries to extract the endogenic enzymes of legume matrices. Due to lipoxygenase’s significant role in enzymaticoxidation of lipids the optimum pH-level of lipoxygenase was determined by using UV/VIS-spectrophotometer. The optimum pH-level for lipoxygenase was found at the pH 6. Optimization and formation of volatile compounds was determined by using HS-SPME-GC-MS-method. In addition, the activity of lipase and product specificity of lipoxygenase (formation of hydroperoxides) weredetermined.
In both legume matrices the pH-optimum of lipoxygenase was at 6 and all the actual samples were measured at that pH.Quantitatively and qualitatively the widest spectrum of volatile compounds was formed when using linoleic acid as a substrate. Thespectrum of volatile compounds included different alcohols, ketones, aldehydes and furans. The amounts of hexanal were at thehighest when using linoleic acid as a substrate and the lowest when using α-linolenic acid as a substrate. When using trilinoleinand rapeseed oil as substrates aldehydes and ketones were the only volatile compounds which were formed. Saponification ofrapeseed oil improved the formation of the volatile compounds. In addition, from the saponified rapeseed oil a wider spectrum ofvolatile compounds were formed when compared to untreated rapeseed oil. The lipoxygenases of faba bean and lupine wereshown to form different types of hydroperoxides from linoleic acid: the faba bean produced more 13-hydroperoxides than 9-hydroperoxides and lupine produced only 13-hydroperoxides. Used method when measuring the formation of free fatty acids oflegume matrices did not revealed the activity of lipase. On the other hand, this result only tells that lipase activity couldn’t bemeasured by using this particular method and other methods could reveal lipase activity on those legume matrices.
Both of the legume matrices formed different kinds of volatile compounds from different lipid substrates in certain reactionconditions. When those volatile compounds are formed in foods containing legume matrices they lower the sensory value of thosefoods. The formation volatile compounds in food matrices containing legumes is very plausible due to food matrices pH-level(many of them are at neutral) and usage of suitable lipid substrates and reaction conditions. Inactivation of enzymes can beobtained for example by heating, which could at the same time lower the nutritional value of foods.
Avainsanat – Nyckelord – Keywordsvolatile compounds, enzymatic oxidation, HS-SPME-GC-MS, beany flavor
Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where depositedDigital archive of University of Helsinki, Helda
Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
EKT-series 1873
4
ESIPUHE
Tämä maisterin pro gradu tehtiin Helsingin yliopiston maatalous-metsätieteellisen
tiedekunnan elintarvike- ja ravitsemustieteen osastolle. Työ alkoi keväällä 2017 ja
päätökseen se saatiin vuoden 2018 syksyllä. Pro graduni käsittelee hyvinkin ajankohtaista
aihetta, mitä on tutkittu nykyisellä elintarvike-ja ravitsemustieteiden osastolla (myös
muillakin maatalous-metsätieteellisen tiedekunnan osastoilla) erittäin laajalti.
On tullut kiitosten aika. Ensiksi, tahdon kiittää pro graduni ohjaajia eli yliopistonlehtori
Anna-Maija Lampea sekä professori Vieno Piirosta. Annukka ja Vieno, kiitän arvokkaista
kommenteista, neuvoista sekä ohjauksesta pro gradun parissa. Yliopiston henkilökunnasta
osoitan kiitokseni myös tutkimusteknikoille Miikka Olin sekä Outi Brinck laitteiden käytön
avustamisen sekä näytteiden hankinnan suhteen.
Seuraavat kiitokset (tähän voisi luetella nimiä vaikka kuinka paljon) menevät lukioaikaisille
ystävilleni Janille, Villelle ja Jannelle. Kiitos näistä kaikista ystävyyden vuosista nyt ja
tulevaisuudessa. Yliopiston aloitettua olen saanut tutustua moniin upeisiin ihmisiin, mutta
näistä muutaman olen onneksi saanut myös erittäin hyviksi ystävikseni. Yliopistolta kiitän
ystäviäni Mikko Immosta sekä Niklas Renneriä kaikista opiskeluvuosista sekä tulevista
vuosista ystävinä.
Viimeiseksi lämpimimmät kiitokseni menevät perheelleni: Paula-äiti, Jari-isä, Kirsi, Juha
sekä sisarukseni Aku, Arttu ja Sara. Laura ja Mirva, myös teitä tahdon kiittää. Oli
kysymyksessä sitten se sunnuntai-päivällinen Tuusulassa tai saunailta Sipoossa, niillä
kaikilla hetkillä teidän kaikkien kanssa on ollut valtava merkitys tämän pro gradun sekä
ylipäätään valmistumiseni kanssa.
”A scientist in his laboratory is not a mere technician:
he is also a child confronting natural phenomena
that impress him as though they were fairy tales.”
-Marie Curie-
5
SISÄLLYSLUETTELO
TIIVISTELMÄ
ABSTRACT
ESIPUHE
1 JOHDANTO .................................................................................................................................. 7
2 KIRJALLISUUSTUTKIMUS ................................................................................................... 10
2.1 Rasvojen hapettumismekanismit ........................................................................................ 10
2.1.1 Autoksidaatio .................................................................................................... 10
2.1.2 Foto-oksidaatio .................................................................................................. 11
2.1.3 Entsymaattinen hapettuminen ........................................................................... 12
2.1.4 Hapettumista katalysoivat tekijät ..................................................................... 12
2.2 Entsyymit ............................................................................................................................ 14
2.2.1 Entsyymit yleisesti ja niiden rakenne ................................................................ 14
2.2.2 Entsyymien luokat ............................................................................................. 15
2.2.3 Entsyymien substraatti- ja reaktiospesifisyys ................................................... 16
2.2.4 Entsyymireaktioiden kinetiikkaa ....................................................................... 17
2.2.5 Entsyymien toimintaan vaikuttavat tekijät ........................................................ 18
2.3 Palkokasvit ja palkokasvien lipidejä muokkaavat entsyymit ............................................. 20
2.3.1 Palkokasvien makro- ja mikroravintoaineet ...................................................... 20
2.3.2 Palkokasvien sisältämät lipidejä muokkaavat entsyymit .................................. 24
2.3.3 Lipoksigenaasientsyymi .................................................................................... 25
2.3.4 Hydroperoksidilyaasi ........................................................................................ 27
2.3.5 Alkoholidehydrogenaasi .................................................................................... 28
2.3.6 Lipaasit .............................................................................................................. 28
2.4 Palkokasvien lipideissä tapahtuvat muutokset ja vaikutukset elintarvikkeiden laatuun .... 29
2.4.1 Lipoksigenaasientsyymin toiminta palkokasvimatriiseissa .............................. 30
2.4.2 Rasvahappojen hydroperoksidien hajoamiseen osallistuvat entsyymit sekäniiden toiminta palkokasvimatriiseissa ........................................................................ 31
2.4.3 Linoli- ja α-linoleenihaposta muodostuvien hydroperoksidien hajoaminenpalkokasvimatriiseissa .................................................................................................. 32
2.4.4 Rasvahappojen entsyymikatalysoitujen hajoamisreaktioiden aistinvaraisetongelmat ....................................................................................................................... 34
3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ..................................................................................... 37
3.1 Tutkimuksen tausta ja tavoitteet ......................................................................................... 37
6
3.2 Reagenssit ........................................................................................................................... 38
3.3 Näytteiden valmistuksessa käytetyt laitteistot .................................................................... 38
3.4 Määrityksissä käytetyt analyysilaitteistot ........................................................................... 39
3.5 Näytteet ja muut materiaalit ................................................................................................ 40
3.6 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrittäminen ................ 41
3.7 Haihtuvien yhdisteiden seuranta ja tunnistus HS-SPME-GC-MS-menetelmällä ............... 42
3.7.1 Haihtuvien yhdisteiden määritysmenetelmän optimointi .................................. 42
3.7.2 Haihtuvien yhdisteiden muodostuminen ja tunnistus erilaisistalipidisubstraateista ........................................................................................................ 44
3.8 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden todentaminen vapaidenrasvahappojen määrittämisellä.................................................................................................... 45
3.9 Härkäpavun ja lupiinin entsymaattisessa hapettumisessa muodostuvien hydroperoksidienanalysointi NP-HPLC-DAD-menetelmällä ................................................................................ 47
4 TULOKSET ................................................................................................................................. 48
4.1 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin pH-optimin määrittäminen ................... 48
4.2 Haihtuvien yhdisteiden määrittäminen headspace-kiinteäfaasimikrouutto-kaasukromatografia-massaspektrometrisesti ja syntyminen palkokasvinäytteisiin .................... 49
4.2.1 Haihtuvien yhdisteiden määritysmenetelmän optimointi ja HS-SPME-GC-MS-laitteiston toimivuus ..................................................................................................... 49
4.2.2 Haihtuvien yhdisteiden tunnistaminen härkäpapu- ja lupiininäytteistä ............ 52
4.2.3 Haihtuvien yhdisteiden syntyminen härkäpapu- ja lupiininäytteissäsubstraattikohtaisesti .................................................................................................... 56
4.3 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden todentaminen vapaidenrasvahappojen määrittämisellä.................................................................................................... 65
4.4 Härkäpavun ja lupiinin entsymaattisessa hapettumisessa muodostuvien välituotteidenanalysointi NP-HPLC-DAD-menetelmällä ................................................................................ 65
5 POHDINTA ................................................................................................................................. 67
5.1 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin pH-optimin ja aktiivisuuden arviointi .. 67
5.2 Haihtuvien yhdisteiden muodostumisen seurannan arviointi ja tunnistus headspace-kiinteäfaasimikrouutto-kaasukromatografia-massaspektrometrisesti ......................................... 68
5.3 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden arviointi koeolosuhteissa........... 70
5.4 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasin tuottamien hydroperoksidien arviointi ................ 71
6 PÄÄTELMÄT ............................................................................................................................. 74
7 LÄHDELUETTELO .................................................................................................................. 76
LIITTEET ........................................................................................................................................ 81
7
1 JOHDANTO
Rasvojen hapettuminen on yksi yleisimmistä elintarvikkeita pilaavista reaktioista ja sitä on
tutkittu runsaasti eri elintarvikeryhmillä (McClements ja Decker 2008; Schaich ym. 2013).
Palkokasvit on yksi elintarvikeryhmä, jossa rasvojen hapettuminen aiheuttaa virhehajujen
syntymistä elintarvikematriisiin heikentäen samalla tuotteen aistinvaraista laatua ja
kuluttajien hyväksyntää tuotetta kohtaan (Sessa 1979). Koska kiinnostus lihaa korvaaviin,
vaihtoehtoisiin proteiinilähteisiin kasvaa, aistinvaraiset ongelmat tulisi ratkaista ennen
palkokasveja sisältävien elintarvikkeiden yleistymistä.
Aistinvaraisesta näkökulmasta tarkasteltuna palkokasvimatriiseihin muodostuvan
papumaisen aromin aiheuttavat palkokasvien lipidien hapettumisessa muodostuvat haihtuvat
yhdisteet (Rackis ym. 1979; Vara-Ubol ym. 2004). Haihtuvien yhdisteiden muodostuminen
palkokasvimatriiseihin on nopeaa johtuen palkokasvien lipidien kyvystä hapettua
ensisijaisesti entsymaattisesti (Sessa ja Rackis 1977). Näihin haihtuviin yhdisteisiin luetaan
esimerkiksi erilaisia alkoholeja, aldehydejä, ketoneita sekä furaaneita (Frankel 2005; Gigot
ym. 2010).
Rasvojen hapettumismekanismeja ovat autoksidaatio, foto-oksidaatio sekä entsymaattinen
hapettuminen. Nämä eri hapettumismekanismit käynnistävät rasvahappojen
hapettumisreaktioita tuottaen hydroperoksideja primäärisinä hapettumistuotteina ja erilaisia
haihtuvia yhdisteitä sekundäärisinä hapettumistuotteina (McClements ja Decker 2008;
Belitz ym. 2009). Rasvojen hapettumisreaktioihin vaikuttaa monien kemiallisten ja
fysikaalisten (valo, lämpö) tekijöiden lisäksi muun muassa monet entsyymit sekä pro-
oksidanttien että antioksidanttien toiminta. Lisäksi rasvojen hapettumisnopeuteen- ja
herkkyyteen vaikuttaa rasvahapon tyydyttymättömyysaste eli kaksoissidosten määrä
rasvahappomolekyylin hiiliketjussa. Suurimmassa osaa rasvojen hapettumisreaktioiden
keskiössä ovat vapaat radikaalit, jotka syntyvät kun atomeista tai molekyyleistä irtoaa
elektroneja. Rasvojen hapettumisen kannalta alkyyli-, alkoksyyli- sekä
peroksyyliradikaaleilla on valtava merkitys, mutta myös hydroksyyliradikaali voi korkean
energiansa avulla hapettaa melkein minkä tahansa molekyylin (McClements ja Decker 2008;
Schaich ym. 2013).
8
Palkokasveista härkäpapu (Vicia faba) on yksivuotinen, hernekasvien heimoon ja virnojen
sukuun kuuluva yksi maailman vanhimmista viljelykasveista. Sitä kasvatetaan ympäri
Eurooppaa, Aasiaa ja Afrikkaa (Duc 1997). Härkäpapua käytetään suuren
proteiinipitoisuutensa johdosta suuressa määrin rehuna ja ihmisravintona (Yoshida ym.
2010). Härkäpavun koostumus vaihtelee lajikkeittain. Tärkkelystä se sisältää 37-50 %
kuivapainostaan ja proteiinia 24-37 % kuivapainostaan (Duc ym. 1999, Lizarazo ym. 2014).
Rasvaa härkäpapu sisältää kuivapainostaan vain 1-4 %:a (Duc ym. 1999; Lizarazo ym. 2014)
ja se esiintyy pääasiassa triasyyliglyseroleina (~49 %) ja fosfolipideinä (~49 %) (Yoshida
ym. 2010). Rasvahapoista härkäpapu sisältää varsinkin öljyhappoa, linolihappoa ja α-
linoleenihappoa (Lizarazo ym. 2014). Härkäpavun on todettu olevan aliarvostettu
ravinnonlähde johtuen sen sisältämistä ravitsemuksellista arvoa alentavista yhdisteistä.
Näitä ravintoarvoja alentavia yhdisteitä härkäpavussa ovat muu muassa fytiinihappo,
tanniinit sekä letaalia favismia aiheuttavat konvisiini ja visiini. Idätyksellä ja
lämpöprosessoinneilla voidaan alentaa ravitsemuksellista arvoa alentavien yhdisteiden
pitoisuutta härkäpavuissa (Khalil ja Mansour 1995). Palkokasveista lupiinit (Lupinus)
kuuluvat härkäpapujen ohella hernekasvien heimoon ja niitä on olemassa useita eri
ravinnoksi levinneitä ja jalostettuja lajikkeita (Erbaş ym. 2005). Jalostetuista lajikkeista niin
sanottuja ”makeita” lupiineja viljellään ravinto- ja rehukäyttöön johtuen niiden sisältämistä
suurista proteiini- ja öljypitoisuuksista sekä pienistä kitkerän makuisten, toksisten
alkaloidien pitoisuuksista (Huyghe 1997; Kohajdová ym. 2011).
Tämän maisterin pro gradun kirjallisuustutkimuksessa tavoitteena oli selvittää, miten
rasvojen entsymaattisessa hapettumisessa syntyy papumaista flavoria muodostavia haihtuvia
yhdisteitä palkokasvimatriiseihin. Kirjallisuuskatsauksessa perehdyttiin varsinkin rasvojen
hapettumisen eri mekanismeihin, entsyymeihin yleisesti sekä palkokasvien sisältämiin
entsyymeihin ja papumaista flavoria muodostavien haihtuvien yhdisteiden muodostumiseen
erilaisista rasvahapoista. Pääasiallisena tavoitteena kokeellisessa osassa oli tutkia, millaisia
haihtuvia yhdisteitä eri palkokasvimatriisit tuottavat erilaisista lipidisubstraateista
tunnistamalla haihtuvia yhdisteitä kiinteäfaasimikrouutto-headspace-kaasukromatografia-
massaspektrometrisesti (HS-SPME-GC-MS) luomalla optimaaliset olosuhteet palkokasvien
lipoksigenaasientsyymeille. Lisäksi kokeellisessa osassa määritettiin tutkittujen
palkokasvien lipaasi-entsyymin aktiivisuutta HPLC-ELSD-menetelmällä (High
Performance Liquid Chromatography, Evaporative Light Scattering Detector, korkean
erotuskyvyn nestekromatografi valonsirontadetektorilla) sekä rasvojen hapettumisen
9
välituotteiden eli hydroperoksidien esiintyvyyttä käyttäen apuna HPLC-DAD-menetelmää
(High Performance Liquid Chromatography, Diode Array Detector, korkean erotuskyvyn
nestekromatografi diodirividetektorilla).
10
2 KIRJALLISUUSTUTKIMUS
2.1 Rasvojen hapettumismekanismit
2.1.1 Autoksidaatio
Autoksidaatio on yleistävä termi yhdelle rasvojen hapettumismekanismeista, jossa rasvat
hapettuvat hapen läsnäollessa ei-entsymaattisesti (Belitz ym. 2009). Autoksidaation
keskiössä ovat vapaat radikaalit, jotka ovat parittoman valenssielektronin omaavia atomeita,
molekyylejä tai ioneja. Monivaiheisena ketjureaktiona autoksidaation alkuvaiheessa
muodostuu hydroperoksideja, jotka ovat primäärisiä hapettumistuotteita. Hydroperoksidit
reagoivat hapettumisen edetessä taasen haihtuviksi tai haihtumattomiksi yhdisteiksi,
sekundäärisiksi hapettumistuotteiksi. Autoksidaation nopeuteen voidaan vaikuttaa muun
muassa lämpötilalla, valolla ja hapen konsentraatiolla tai erilaisten pro- ja antioksidanttien
läsnäololla. Sekä vapaat että glyseroliin esteröityneet rasvahapot voivat hapettua
autoksidaatiossa. Rasvojen hapettuminen autoksidaatiolla käsittää kolme vaihetta:
initiaation, propagaation ja terminaation (Frankel 2005; McClements ja Decker 2008).
Initiaatiossa vapaan rasvahapon tai asyyliryhmän hiilivetyketjun kaksoissidoksen
läheisyydessä oleva vetyatomi irtoaa hiilivetyrungosta muodostaen rasvahapporadikaalin eli
ns. alkyyliradikaalin. Alkyyliradikaalin muodostumisen jälkeen tämä vapaa radikaali
stabiloituu delokalisoitumisen kautta, jolloin kaksoissidos siirtyy molekyylissä. Jos
initiaatioreaktio tapahtuu monityydyttymättömälle rasvahapolle, rasvahapporadikaalin
stabiloituessa muodostuu konjugoitunut kaksoissidos-systeemi hiilivetyketjuun.
Delokalisoitumisen kautta kaksoissidokset voivat muodostaa joko cis- tai trans-
konfiguraatioita kuitenkin trans-konfiguraation ollessa hallitsevampi johtuen sen
suuremmasta stabiiliudesta (McClements ja Decker 2008).
Propagaatiovaiheessa muodostuneeseen rasvahapporadikaaliin liittyy molekylaarinen happi
(3O2), jolloin muodostuu kovalenttinen kaksoissidos ja reaktiotuotteena peroksyyliradikaali.
Peroksyyliradikaali vastaanottaa taasen erittäin helposti vetyatomin toiselta rasvahapolta.
Tällöin peroksyyliradikaalista muodostuu rasvahappohydroperoksidi. Lisäksi
11
rasvahappohydroperoksidiin liittyneen vetyatomin luovuttanut asyyliryhmä saa alkuun
uuden initiaatioreaktion toisessa vapaassa rasvahapossa tai asyyliryhmässä muodostaen
uuden rasvahapporadikaalin. Täten propagaatioreaktio aloittaa myös uuden
initiaatioreaktion ja kiihdyttää hapettumista entisestään (McClements ja Decker 2008).
Propagaatiovaiheessa rasvahappojen hydroperoksidit voivat hajota esimerkiksi
ultraviolettivalon, metallien ja lämmön vaikutuksesta tuottaen uusia alkoksyyli-, peroksyyli-
ja hydroksyyliradikaaleja. Näistä edellä mainituista radikaaleista voi taas muodostua uusia
monenlaisia propagaatiovaihetta ylläpitäviä radikaaleja ja molekyylejä (Schaich ym. 2013).
Terminaatioreaktioissa kaksi rasvahapporadikaalia muodostavat ei-radikaaleja, jolloin
hapettuminen pysähtyy eli terminoituu nimensä mukaisesti. Olosuhteilla on suuri merkitys
terminaatioreaktioon: olosuhteita muutettaessa (hapen läsnäolo, kovempi paine jne.)
terminaatioreaktioita voi tapahtua erityyppisille radikaaleille (McClements ja Decker 2008).
Terminaatioreaktiot voivat tapahtua neljällä erilaisella mekanismilla: radikaalien
uudelleenliittymisillä, alkoksyyliradikaalien alfa- ja betalohkeamisilla veden läsnäollessa,
ei-lipidi-molekyylien hapettumisella tai hapettumista kiihdyttävien molekyyliryhmien
eliminoinnilla rasvahappomolekyyleistä (Schaich ym. 2013).
2.1.2 Foto-oksidaatio
Foto-oksidaatiossa rasvojen hapettuminen käynnistyy joko UV- tai näkyvän valon avulla,
minkä jälkeen hapettumisreaktiot etenevät kuin autoksidaatiossa. Lisäksi valon energia voi
katalysoida esimerkiksi hydroperoksidien hajoamista ja peroksidien hajoamista erilaisiksi
radikaaleiksi. Valon energian lisäksi foto-oksidaation avulla käynnistyvä rasvojen
hapettuminen vaatii jonkinlaisen herkistimen, joita on kahdentyyppisiä (Belitz ym. 2009;
Schaich ym. 2013).
Tyypin 1 herkistäjien toiminta perustuu vapaiden radikaalien muodostumiseen valon avulla,
missä herkistäjät reagoivat suoraan substraatin kanssa. Radikaalit voivat edelleen reagoida
esimerkiksi hapen kanssa muodostaen rasvahappojen hydroperoksideja (Frankel 2005;
Belitz ym. 2009; Schaich 2013). Tyypin 2 herkistäjien toiminta perustuu taasen
singlettihapen (1O2) muodostumiseen molekulaarisesta hapesta valon avulla. Singlettihapen
liittyessä tyydyttymättömään rasvahappoon additioreaktiossa syntyy hydroperoksidi
12
(Frankel 2005; Belitz ym. 2009; Schaich 2013). Elintarvikkeet sisältävät monia yhdisteitä,
jotka luokitellaan tyypin 1 tai 2 herkistäjiksi. Tällaisia yhdisteitä ovat esimerkiksi feofytiini
(tyyppi 1), klorofyllit a ja b (tyypit 1 ja 2), riboflaviini (tyyppi 1) sekä lihasten ja veren
hemiproteiinit (tyyppi 1) (Schaich 2013).
2.1.3 Entsymaattinen hapettuminen
Rasvojen entsymaattisessa hapettumisessa rasvojen hapettumisreaktioita katalysoidaan
monien eri entsyymien avulla, joista yleisin ja merkittävin on lipoksigenaasi (Belitz ym.
2009; Schaich 2013). Entsymaattisessa hapettumisessa tärkeässä roolissa ovat entsyymin
kohdemolekyylit eli substraatit, koska varsinkin lipoksigenaasi entsyymi osoittaa
spesifisyyttä monityydyttymättömien rasvahappojen kaksoissidoksia (1,4-
pentadieenirakenne) kohtaan (McClements ja Decker 2008; Schaich 2013).
Tyydyttymättömien rasvahappojen entsymaattisessa hapettumisessa lipoksigenaasin
katalysoimana tapahtuu hydroperoksidin muodostuminen ilman radikaalia, josta
hydroperoksidi edelleen hajoaa eri entsyymien, esimerkiksi hydroperoksidilyaasin sekä
alkoholidehydrogenaasin, avulla haihtuviksi yhdisteiksi. Hydroperoksidin hajoaminen voi
tapahtua myös kemiallisesti (Belitz ym. 2009; Schaich 2013). Lipoksigenaasientsyymi on
inaktiivinen sen sisältämän raudan ollessa ferro-muodossa (Fe2+) ja entsyymi aktivoituu, kun
rauta hapettuu ferri-muotoon (Fe3+) yleensä jonkun peroksidin katalysoimana.
Lipoksigenaasin aktivoiduttua se muodostaa alkyyliradikaali-lipoksigenaasi-kompleksin
irrottamalla vetyatomin rasvahaposta samanaikaisesti palauttaen entsyymin raudan
pelkistyneeseen muotoon. Muodostuneesta kompleksista syntyy hapen kanssa reagoidessa
peroksyyliradikaali. Reaktiossa muodostunut hydroperoksidi syntyy, kun
peroksyyliradikaali sitoo itseensä vetyatomin (McClements ja Decker 2008; Schaich 2013).
2.1.4 Hapettumista katalysoivat tekijät
Elintarvikkeiden hapettumiseen voivat vaikuttaa useat tekijät johtuen elintarvikematriisien
sisältämistä moninaisista kemiallisista yhdisteistä sekä monista ulkopuolisista fysikaalisista
tekijöistä. Monien hapettumista katalysoivien yhdisteiden ja tekijöiden yhteisvaikutuksen
13
seurauksena hapettuminen elintarvikkeilla voi olla tehokasta ja nopeaa, kun rasvojen lisäksi
elintarvikematriiseissa hapettuvat esimerkiksi proteiinit. Hapettumista edistäviä eli
katalysoivia yhdisteitä ja tekijöitä kutsutaan pro-oksidanteiksi (McClements ja Decker 2008;
Schaich ym. 2013).
Elintarvikkeissa pro-oksidantteja ovat esimerkiksi singlettihappi, siirtymämetallit,
klorofyllit, vesi ja lämpö (McClements ja Decker 2008; Schaich ym. 2013). Singlettihappi
(1O2) toimii merkittävänä pro-oksidanttina elintarvikkeissa ja sitä muodostuu
molekulaarisesta hapesta (3O2) valon avulla. Singlettihapen toiminta perustuu korkeampaan
elektrofiilisyyteen molekulaariseen triplettihappeen nähden. Tästä syystä singlettihappi on
tehokas pro-oksidantti elintarvikematriiseissa, missä on paljon kaksoissidoksellisia
rakenteita (McClements ja Decker 2008; Schaich ym. 2013). Singlettihapen toiminnasta on
kerrottu aiemmin foto-oksidaatio-kappaleessa.
Siirtymämetalleja tavataan paljon elintarvikkeissa, koska niitä esiintyy aina biologisista
matriiseista (vesi, kasvit jne.) pakkauksiin saakka. Siirtymämetalleista varsinkin kupari,
rauta ja koboltti ovat aktiivisimpia pro-oksidantteja elintarvikematriiseissa.
Siirtymämetallien toiminta pro-oksidantteina voi olla joko suoraa tai epäsuoraa riippuen
siirtymämetallin hapettumisasteesta. Hapettuneet muodot siirtymämetalleista suosivat
suoraa pro-oksidatiivisuutta, mikä perustuu vapaiden radikaalien tuotantoon
kaksoissidoksen vapauttaessa elektroneja. Siirtymämetallien pelkistyneet muodot taasen
suosivat epäsuoraa pro-oksidatiivisuutta, mikä voi perustua esimerkiksi aktiivisten metalli-
happi-kompleksien muodostumiseen tai reagoimattomien hydroperoksidien hajottamiseen
takaisin alkyyliradikaaleiksi (Schaich ym. 2013).
Elintarvikematriisit sisältävät paljon orgaanisia molekyylejä, joilla on värin muodostuksen
kannalta suuri merkitys elintarvikematriiseissa. Tällaisia orgaanisia molekyylejä ovat
esimerkiksi klorofyllit. Niiden toiminta pro-oksidantteina elintarvikkeissa perustuu valon
keräämiseen kasvimateriaaleissa ja siten niiden toiminta on keskiössä foto-oksidaatiossa
(McClements ja Decker 2008; Schaich ym. 2013). Klorofyllit ovat porfyriini-renkaisia
komplekseja, jossa keskusatomina on magnesium. Kasvimatriiseissa klorofyllit ovat yksiä
tehokkaimpia pro-oksidantteja johtuen niiden kyvystä hapettaa rasvoja muodostamalla sekä
vapaita radikaaleja että singlettihappea (McClements ja Decker 2008; Schaich ym. 2013).
14
Vesi (kosteuspitoisuus) ja lämpö ovat myös merkittäviä pro-oksidantteja elintarvikkeissa.
Rasvojen hapettuminen elintarvikematriiseissa tehostuu varsinkin, kun veden aktiivisuus
sekä kosteuspitoisuus kasvavat elintarvikkeissa. Elintarvikematriiseissa rasvojen
hapettumista tapahtuu huomattavasti todennäköisemmin, jos elintarvikkeiden sisältämä vesi
ei ole jollain tapaa sidottu matriisiin tai siirretty pois matriisista (Schaich ym. 2013).
Elintarvikkeiden pro-oksidanttina lämmöllä on vaikutusta elintarvikkeisiin esimerkiksi
varastoitaessa tai valmistettaessa niitä. Lämpö vaikuttaa rasvojen hapettumiseen
elintarvikkeilla eri tavoin. Esimerkiksi matalissa lämpötiloissa lämmön toiminta pro-
oksidanttina perustuu sen hydroperoksideja hajottavaan vaikutukseen. Korkeissa
lämpötiloissa (esimerkiksi uppopaisto) lämmön toiminta pro-oksidanttina perustuu rasvojen
asyyliketjujen hajoamisissa muodostuneisiin vapaisiin radikaleeihin (Schaich ym. 2013).
2.2 Entsyymit
2.2.1 Entsyymit yleisesti ja niiden rakenne
Entsyymit luokitellaan proteiineiksi ja ne ovat biokatalyytteja esittäen spesifisyyttä tiettyä
substraattia kohtaan. Entsyymien jaottelu voidaan suorittaa monella eri tapaa, mutta yleisesti
ne voidaan jakaa niiden esiintyvyyden perusteella joko endogeenisiin (matriisin sisällä
oleviin tai sinne muodostuviin) tai eksogeenisiin (matriisin ulkopuolella oleviin eli
tuotettuihin) entsyymeihin. Entsyymit rakentuvat L-muotoisista aminohapoista ja niillä on
ihmiskehossa elintärkeitä toimintoja: ne ovat avainasemassa mm. solujen viestinvälityksessä
ja metabolisissa reaktioissa (Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
Entsyymien katalyysimekanismeja tunnetaan erilaisia ja yleisesti katalyysimekanismeihin
sekä niiden ominaisuuksiin vaikuttavat entsyymimolekyylien aktiiviset keskukset.
Entsyymien katalyysimekanismeja ovat mm. kovalenttinen katalyysi, happo-emäs-katalyysi
ja approksimaatio-katalyysi. Samasta entsyymistä voi esiintyä pienillä muutoksilla olevia
entsyymeitä, jotka voivat katalysoida samoja reaktioita. Tällaisia entsyymeitä kutsutaan
isoentsyymeiksi (Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
15
Entsyymit ovat globulaarisia proteiineja ja niiden rakenteen määräävät L-
aminohapposekvenssi ja kolmiulotteinen rakenne. Entsyymien molekyylikoon kasvaessa
niiden sisältämien aminohapposekvenssien lukumäärä suurenee. Entsyymin rakenteella on
erittäin suuri merkitys esimerkiksi entsyymin aktiivisuuteen ja spesifisyyteen
(kolmiulotteinen rakenne) sekä entsyymin optimaalisiin toimintaoloihin
(aminohapposekvenssi) (Belitz ym. 2009).
Jotkin entsyymit tarvitsevat toimiakseen kofaktorin, joka on entsyymin osa mikä ei esitä
proteiineille tyypillisiä ominaisuuksia. Entsyymien kofaktorit voivat osallistua katalyysiin,
ja ne jaetaan kosubstraatteihin sekä prosteettisiin ryhmiin. Prosteettisia ryhmiä entsyymeille
ovat muun muassa flaviinit, pyridoksaalifosfaatti sekä erilaiset metalli-ionit, kuten
esimerkiksi rauta, molybdeeni, magnesium ja kupari. Entsyymien kosubstraatteja tunnetaan
vähemmän ja niitä ovat muun muassa adenosiinitrifosfaatti eli ATP ja
nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi eli NAD (Parkin 2008).
Entsyymeiden nimeämisessä ja tunnistamisessa noudatetaan IUBMB:n (International Union
of Biochemistry and Molecular Biology) sääntöjä. Nimeäminen perustuu entsyymeiden
reaktiospesifisyyteen eli millaisia reaktioita entsyymit katalysoivat. Kunkin entsyymin
nimeämisessä entsyymin nimi koostuu systemaattisesta nimestä, triviaalinimestä sekä EC-
numerosta. Jokainen luokka jaetaan alakategorioihin ja edelleen alakategorioiden
alakategorioihin. Entsyymeiden aktiivisuutta kuvataan aktiivisuusyksiköllä (U=µmol x s-1)
ja se kuvastaa, mikä määrä entsyymiä katalysoi yhden mikromoolin substraattia minuutissa
(Whitaker 2002 (a)).
2.2.2 Entsyymien luokat
Entsyymit jaetaan IUBMB:n (International Union of Biochemistry and Molecular Biology)
luokitusten perusteella kuuteen luokkaan entsyymien reaktiospesifisyyksien mukaisesti.
Nämä kuusi entsyymiluokkaa ovat oksidoreduktaasit, transferaasit, hydrolaasit, lyaasit,
isomeraasit sekä ligaasit (Whitaker 2002 (a)).
Oksidoreduktaasit (luokka 1) ovat entsyymejä, jotka nimensä mukaisesti hapettavat tai
pelkistävät substraatteja. Hapetus-pelkistysreaktiot perustuvat vedyn ja elektronien siirtoon
16
tai hapen lisäämiseen. Oksidoreduktaaseista varsinkin alkoholidehydrogenaasi (EC 1.1.1.1)
sekä katalaasi (EC 1.11.1.6) ovat tunnettuja. Luokan 2 entsyymeiksi eli transferaaseiksi
luokitellaan sellaiset entsyymit, jotka siirtävät erilaisia atomeja tai ryhmiä substraateilta
vastaanottajasubstraateille. Hydrolaasit ovat luokan 3 entsyymejä, mitkä toimivat
kovalenttisten sidosten katkaisemisissa. Hydrolaasien toiminnassa vesi on aina toisena
substraattina reaktioissa, ja ne toimivat esimerkiksi rasvoissa (esterisidosten katkaisu) ja
hiilihydraateissa (glykosidisten sidosten katkaisu) (Whitaker 2002 (a)).
Lyaasit ovat luokan 4 entsyymeitä, jotka siirtävät ei-hydrolyyttisesti atomeja tai ryhmiä
substraateiltaan muodostamalla tuotteisiin kaksoissidoksia katalysoiden samalla myös itse
atomien tai ryhmien siirtoa. Lyaaseista esimerkiksi fumaraasi eli fumaraattihydrataasi (EC
4.2.1.2) katalysoi veden lohkeamista omenahaposta muodostaen fumaarihappoa (Whitaker
2002 (a)).
Luokan 5 entsyymien eli isomeraasien toiminta perustuu yhden tai useamman substraatissa
olevan atomin tai ryhmän uudelleenjärjestäytymiseen molekyylissä atomien lukumäärän
pysyessä muuttumattomana. Isomeraaseista käytetään spesifisimpiä nimityksiä riippuen
millainen isomeraatio molekyylissä tapahtuu. Esimerkiksi asymmetristen ryhmien inversiota
katalysoivia isomeraaseja kutsutaan rasemaaseiksi tai epimeraaseiksi. Ligaasit ovat luokan
6 entsyymejä, joiden toiminta perustuu kahden molekyylin yhteenliittämisen katalyysiin.
Nämä yhteenliitettävät molekyylit ovat korkeaenergisiä yhdisteitä, jotka sisältävät
pyrofosfaattisidoksia (esimerkiksi adenosiinitrifosfaatti tai kreatiinifosfaatti). Tästä johtuen
esimerkiksi makroravintoaineiden synteeseissä käytetään spesifisiä ligaaseja (Whitaker
2002 (a)).
2.2.3 Entsyymien substraatti- ja reaktiospesifisyys
Entsyymien spesifisyyttä voidaan tarkastella sekä substraatin että reaktion näkökulmista.
Substraattispesifisellä entsyymillä on ominaisuus katalysoida vain sellaisten substraattien
konversiota, joissa substraattimolekyylit omaavat tietyn tai tietyt funktionaaliset ryhmät.
Entsyymien spesifisyys substraattia kohtaan voi vaihdella entsyymistä ja substraatista
riippuen (Whitaker 2002 (a); Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
17
Entsyymien reaktiospesifisyyttä voidaan tutkia ennalta esimerkiksi entsyymin ja sen
substraatin rakenteen ja funktionaalisten ryhmien perusteella (Parkin 2008; Belitz ym.
2009).
2.2.4 Entsyymireaktioiden kinetiikkaa
Kinetiikalla tarkoitetaan mitattavan asian nopeutta tietyssä aikayksikössä: tässä tapauksessa
entsyymien katalysoimien reaktioiden nopeutta. Koska entsyymejä käytetään valtavasti
elintarviketeollisuudessa ruoantuotannossa eri ominaisuuksien aikaansaamiseksi, tulee
entsyymien kinetiikkaa ymmärtää. Reaktioiden nopeudet entsyymeillä riippuvat kineettisistä
tekijöistä ja esimerkiksi reagenssien ja katalyyttien konsentraatioista. Entsyymien
suhteellista katalyyttista voimaa tarkastellaan kineettisten vakioiden kautta johtuen
reagenssien ja katalyyttien konsentraatioiden vaihtelusta reaktio-olosuhteissa (Parkin 2008).
Entsyymien reaktiokinetiikkaa voidaan mallintaa useilla erilaisilla malleilla. Tunnetuin
näistä malleista on Michaelis-Menten-kinetiikka, jossa mallinnetaan substraatin
muuntumista entsyymin avulla tuotteeksi. Kyseisen kinetiikan avulla saadaan määriteltyä
ns. dissosiaatiovakio, joka kertoo entsyymin määrän ja affiniteetin suuruudesta entsyymin ja
substraatin välillä (Kuva 1). Michaelis-Menten kinetiikan vaihtoehtoisessa
lähestymistavassa entsyymisubstraatti-kompleksin hajoamisnopeus vaikuttaa entsyymin
jakautumiseen entsyymin ja entsyymisubstraatti-kompleksin välillä. Täten saadaan
määritettyä reaktionopeusyhtälöistä ns. Michaelisin vakio (Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
18
Kuva 1. Kaaviokuva Michaelis-Menten-kinetiikasta, substraatin konsentraation sekä reaktionopeuden
yhteydestä.
2.2.5 Entsyymien toimintaan vaikuttavat tekijät
Entsyymien toimintaan vaikuttavia ulkopuolisia tekijöitä on useita ja näistä merkittävimpiä
ovat lämpötila, pH ja veden aktiivisuus elintarvikematriisissa. Lämpö lisää vapaan energian
määrää samalla madaltaen katalyysien aktivoitumisenergiaa. Lämpö voi siis katalysoida
entsyymikatalyysireaktioita tai inhiboida niitä riippuen lämmön määrästä eli energiasta, joka
tuodaan elintarvikematriisiin (Whitaker 2002 (b); Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
Jokaisella entsyymillä on optimilämpötila, jossa entsyymin katalyyttinen aktiivisuus on
korkeimmillaan. Varsinkin elintarviketeollisuus ja muut teollisuuden haarat käyttävät ja
tarvitsevat näitä entsyymien fysikaalisia ominaisuuksia, jotta teollisuuden prosessit olisivat
mahdollisimman tehokkaita taloudellisesti, ajallisesti ja ympäristönäkökulmasta katsottuna.
Lisäksi elintarviketeollisuuden käyttämien entsyymien stabiilius ja aktiivisuus ovat hyvin
lämpötilariippuvaisia.
Elintarvikematriiseissa entsyymiaktiivisuuksien deaktivoitumiseen johtaa liiallisen
lämpömäärän tuominen, jolloin entsyymien avaruudellinen rakenne polypeptidiketjussa
muuttuu saaden aikaan entsyymien funktionaalisuuksien kärsimisen.
19
Entsyymiaktiivisuuksien määrityksissä reaktio-olosuhteilla on merkitystä ja esimerkiksi
optimilämpötilan määrityksissä yleinen ja käytetty tapa on inkuboida substraattia
entsyymiliuoksissa eri olosuhteissa. Entsyymin lämpötilaoptimi on vaikea määrittää tarkasti
johtuen optimilämpötilakohdan rajallisesta kestosta. Yleisesti entsyymin lämpötilaoptimi
määritellään entsyymin reaktionopeusvakion ollessa suurin tietyssä lämpötilassa (Parkin
2008; Belitz ym. 2009).
Vaikka kullakin entsyymillä on oma optimilämpötilansa, voidaan yleisiä johtopäätöksiä
tehdä entsyymien lämpötilastabiiliudesta. Esimerkiksi ligandien läsnäolo lisää entsyymien
lämpöstabiiliutta johtuen niiden kyvystä ylläpitää proteiinien ja polypeptidiketjujen
natiivirakenteita. Lisäksi entsyymien lämpöstabiiliutta voidaan parantaa muun muassa
pienentämällä proteiinimolekyylien kokoa tai lisäämällä stabiloivien disulfidisidosten
määrää proteiinimolekyylien välille (Whitaker 2002 (b); Parkin 2008).
Entsyymien koostuessa aminohapoista niiden toimintaan ja stabiiliuteen vaikuttaa myös pH
johtuen aminohappojen amfolyyttisistä ominaisuuksista ja muutamalla aminohapolla on
huomattu olevan tässä iso rooli. Optimi-pH:n näkökulmasta tietyillä ionisoituvilla
aminohapoilla substraattien sitoutuvuudella sekä konformationaalisen stabiiliuden
entsyymien aktiivisilla alueilla on merkitystä. Entsyymin pH-stabiiliutta määritettäessä
entsyymiä inkuboidaan useissa pH-arvoissa, minkä jälkeen saatuja arvoja verrataan
standardoituihin olosuhteisiin (optimilämpö ja pH). Optimi-pH-arvoon vaikuttaa lisäksi
muun muassa entsyymin substraatin ionisoitumisaste, jokin inhibiittori tai tuote (Whitaker
2002(b);Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
Vedellä on merkittävä vaikutus entsyymien toimintaan ja stabiiliuksiin johtuen sen kyvystä
toimia liuottimena, ionien ja molekyylien kuljettajina sekä proteiinien plastisoijana. Veden
aktiivisuuden kasvaessa entsyymien aktiivisuus kasvaa elintarvikematriiseissa.
Entsyymiaktiviisuutta saadaan päinvastoin vähennettyä veden aktiivisuutta laskemalla eli
esimerkiksi lisäämällä vettä sitovia ioneja tai molekyylejä (suola ja sokeri), konsentroimalla
(haihdutus) tai jäädyttämällä matriisia (pakastus). Veden poisto matriisista aikaansaa myös
viskositeetin kasvua, jolla on entsyymiaktiivisuuksia laskeva vaikutus
elintarvikematriiseissa (Parkin 2008).
20
2.3 Palkokasvit ja palkokasvien lipidejä muokkaavat entsyymit
Palkokasvit määritellään hernekasvien heimoon (Fabaceae) kuuluviksi viljelykasveiksi,
joita käytetään pääasiallisesti ravinto- ja rehukasveina. Palkokasvien hedelmää kutsutaan
paloksi ja palot tarjoavat merkittävän osan ravinnon proteiineista suuressa osassa maailmaa,
varsinkin ”kolmannen maailman maissa”. Merkittäviä palkokasveja ovat muun muassa
soijapapu ja linssit. Palkokasveissa on kuitenkin ravitsemuksellista arvoa heikentäviä
komponentteja, kuten esimerkiksi erilaisia lektiinejä, allergeeneja ja syanogeenisia
glykosideja, jotka kaikki määritellään antinutritiivisiksi ainesosiksi. Makroravintoaineista
palkokasvit sisältävät muun muassa proteiineja, hiilihydraatteja ja rasvoja. Palkokasvilaji-
sekä lajikekohtaisesti makroravintoaineiden määrä voi vaihdella paljonkin. Palkokasvit
sisältävät myös jonkin verran mikroravintoaineita eli vitamiineja sekä kivennäis- ja
hivenaineita (Belitz ym. 2009; Zhou ym. 2013).
Kypsät palkokasvin siemenet koostuvat rakenteellisesti kolmesta komponentista: siemenen
ulkokerroksesta (testa), alkiosta sekä endospermistä. Endospermin koko on suurella osaa
palkokasvilajeista suhteellisen pieni johtuen alkiosta muodostuvien sirkkalehtien määrästä
ja painosta. Ravitsemuksellisesti alkioista muodostuvat sirkkalehdet sisältävät palkokasvien
osalta suuren osan kiinnostuksen kohteina olevista makro- ja mikroravintoaineista
ravintokuitua sekä kalsiumia lukuunottamatta (Zhou ym. 2013).
2.3.1 Palkokasvien makro- ja mikroravintoaineet
Ravintoainekoostumukseltaan palkokasvien välillä on suuresti vaihtelua ja tähän vaikuttavat
muun muassa palkokasvilajike sekä ympäristötekijät. Erilaisten palkokasvien makro- ja
mikroravinnepitoisuuksia esitellään alla olevissa taulukoissa 1 ja 2. Palkokasvit ovat hyvin
proteiinirikkaita ravintokasveja. Proteiinien ravitsemuksellinen arvo on kuitenkin
palkokasveilla heikompi verrattaessa esimerkiksi lihaproteiineihin johtuen palkokasvien
erittäin vähäisistä rikkiä sisältävien aminohappojen (esimerkiksi metioniini) määristä.
Ravitsemuksellinen arvo on siis heikompi palkokasveilla kuin esimerkiksi lihalla, koska
rikkiä sisältävät aminohapot ovat välttämättömiä aminohappoja kehollemme. Palkokasvien
proteiinit voidaan jakaa liukoisuutensa mukaan albumiineihin, globuliineihin ja
21
gluteliineihin globuliinien ollessa määrällisesti suurin proteiiniryhmä. Suuri
globuliinipitoisuus palkokasveilla indikoi sitä, että ne toimivat pääasiallisesti
varastoproteiineina. Palkokasvien globuliinit jaetaan kahteen ryhmään: 7S- ja 11S-
globuliineihin. Ne eroavat toisistaan vain alayksikkörakenteen sekä aminohapposekvenssin
perusteella (Belitz ym. 2009; Zhou ym. 2013). Härkäpavussa sekä lupiinissa on todettu
olevan proteiinia peräti kolmannes kuivapainosta. Merkittävimmät aminohapot määrällisesti
molemmille palkokasveille ovat glutamiinihappo, arginiini sekä asparagiini (Lizarazo ym.
2014).
Palkokasvilajikkeittain kokonaishiilihydraattien määrä vaihtelee suuresti ja yleisesti
kokonaishiilihydraattien määrä koostuu sekä liukoisista että liukenemattomista
hiilihydraattifraktioista. Liukoisia hiilihydraatteja palkokasveissa ovat esimerkiksi mono- ja
oligosakkaridit, kun taas liukenemattomiksi hiilihydraateiksi voidaan luokitella esimerkiksi
tärkkelys sekä ravintokuitu. Tärkkelys muodostaa palkokasvien hiilihydraattifraktioista
suurimman osan, mutta sen määrä vaihtelee palkokasveittain. Palkokasvit sisältävät myös
liukenemattomista hiilihydraateista muun muassa ravintokuitua ja liukoisista
hiilihydraateista esimerkiksi raffinoosia, sakkaroosia, glukoosia, verbaskoosia sekä
ajugoosia. Liukoisten hiilihydraattien määrät palkokasvien
kokonaishiilihydraattipitoisuuksiin verrattuna ovat suhteellisesti erittäin pieniä.
Palkokasveissa liukoiset raffinoosisarjan hiilihydraatit ovat suuren kiinnostuksen kohteena
johtuen kyseisten hiilihydraattien kyvystä aiheuttaa vatsavaivoja palkokasveja nautittaessa
(Zhou ym. 2013). Härkäpapu ja lupiini eroavat hiilihydraattikoostumukseltaan varsinkin
tärkkelyksen osalta, jota härkäpapu sisältää peräti 40 % kuivapainostaan. Lupiinin
tärkkelyspitoisuuden ollessa alle 10 % sen ravintokuitupitoisuus on taasen lähes
kaksinkertainen härkäpapuun nähden (Lizarazo ym. 2014).
22
Taulukko 1. Palkokasvien ravintoainekoostumuksia (g/kg, kuivapainosta) (Lizarazo ym. 2014).
Taulukko 2. Palkokasvien rasvahappokoostumuksia (mg/g tuorepainosta) (Lizarazo ym. 2014).
Härkäpapu Linssi Sinilupiini
Proteiini ( N x 6,25) 32,3 29,3 33
Merkittävät aminohapot
Glutamiinihappo 4,9 4,2 6,2
Asparagiinihappo 3,2 3 2,9
Arginiini 3,1 2,2 3,1
Tärkkelys 39,2 43,7 6,6
Liukoiset sokerit 2,8 2,6 5,7
Ravintokuitu 24,5 17,7 43
Rasva 1 - 6,8
Kivennäis- ja hivenaineet 3,6 3,8 3,8
Härkäpapu Linssi Sinilupiini
C16:0 Palmitiinihappo 1,6 1,5 5,5
C18:0 Steariinihappo 0,3 0,2 4,1
C18:1 Öljyhappo 3,3 2,8 21,3
C18:2 Linolihappo 6,9 5,6 19,3
C18:3 Linoleenihappo 0,6 1,7 2,9
23
Yleisesti palkokasveja ei voida lukea erilaisten rasvojen lähteiksi Belitzin ym. (2009) sekä
Grelan ja Günterin (1995) mukaan johtuen niiden erittäin alhaisista lipidipitoisuuksista
muutamaa poikkeusta lukuunottamatta (esimerkiksi soijapapu). Palkokasveissa
merkittävimpiä lipidejä määrällisesti ovat erilaiset rasvahapot, jotka esiintyvät
palkokasveissa esteröityneinä muotoina eli asyyleinä. Näistä esteröityneistä rasvahapoista
palkokasveissa esiintyy varsinkin tyydyttymättömiä rasvahappoja, kuten öljyhappoa,
linolihappoa ja α-linoleenihappoa. Tyydyttyneistä rasvahapoista palmitiinihapolla ja
steariinihapolla on merkitystä palkokasvien rasvahappojen koostumuksessa. Koska
palkokasvit sisältävät paljon varsinkin tyydyttymättömiä rasvahappoja, niiden kyky
vastustaa hapettumista on heikko. Rasvoista palkokasvit sisältävät lisäksi kasvisteroleja sekä
fosfolipidejä, joista fosfolipideihin kuuluva lesitiini on tunnetuin. Soijalesitiinillä on
monenlaisia terveydellisiä vaikutuksia ja sitä käytetään myös laajasti lisäaineena
elintarvikkeissa (Belitz ym. 2009: Zhou ym. 2013). Härkäpavun on todettu sisältävän rasvaa
10 mg/g, kun taas lupiini sisältää rasvaa 67 mg/g. Tyydyttymättömistä rasvahapoista
härkäpavun ja lupiinin on todettu sisältävän varsinkin öljy-, linoli- sekä α-linoleenihappoa.
Tyydyttyneistä rasvahapoista edellä mainitut palkokasvit sisältävät varsinkin
palmitiinihappoa (Lizarazo ym. 2014).
Mikroravintoaineista puhuttaessa palkokasvit ovat yleisesti hyviä vitamiinien, mineraalien
ja fytokemikaalien lähteitä. Vitamiineista palkokasvit sisältävät varsinkin B-sarjan
vitamiineja eli tiamiinia (B1), riboflaviinia (B2), niasiinia (B3), pyridoksiinia (B6) sekä
foolihappoa (B12). Myös E-vitamiinipitoisuudet ovat yleisesti ottaen palkokasveilla
suurempia kuin viljoissa, minkä johdosta palkokasvit ovat hyviä antioksidantteja.
Härkäpavun sekä lupiinin on todettu sisältävän varsinkin B-sarjan vitamiineista niasiinia (~
2,8 mg/100 g). Lisäksi härkäpavun on todettu sisältävän pienet määrät tiamiinia sekä
riboflaviinia (Oomah ym. 2011). E-vitamiinista puhuttaessa härkäpavussa ja lupiinissa on
todettu olevan varsinkin γ-tokoferolia (härkäpapu ~50 µg/g, lupiini 60-130 µg/g), mutta α-
tokoferoliakin löytyy molemmista palkokasveista. Lisäksi lupiinin on todettu sisältävän δ-
tokoferolia (Grela ja Günter 1995; Boschin ja Arnoldi 2011). Ravitsemuksellisesti kuitenkin
vain kahdella α-tokoferolin muodolla esiintyy E-vitamiiniaktiivisuutta (Food and Nutrition
Board 2000).
Mineraaleista palkokasvit sisältävät varsinkin rautaa ja sinkkiä, mutta myös kuparia sekä
alumiinia tavataan palkokasveista. Mineraaleista härkäpavun on todettu sisältävän varsinkin
24
rautaa (~80 µg/g), sinkkiä (~41 µg/g) sekä kuparia (~4 µg/g) (Oomah ym. 2011; Lizarazo
ym. 2014).
Palkokasvit sisältävät myös monia bioaktiivisia yhdisteitä, joiksi luokitellaan erilaiset
lektiinit, entsyymi-inhibiittorit, fytaatit ja erilaiset fenoliset yhdisteet. Fenolisista yhdisteistä
varsinkin fenoliset hapot sekä antosyaanit ovat yleisiä palkokasveissa. Jotkut edellä
mainituista bioaktiivisista yhdisteistä luokitellaan kuitenkin antinutrienteiksi eli
ravitsemuksellista arvoa heikentäviksi yhdisteiksi (esimerkiksi lektiinit) (Oomah ym. 2011).
2.3.2 Palkokasvien sisältämät lipidejä muokkaavat entsyymit
Palkokasvit sisältävät myös entsyymeitä, joilla on merkittävä vaikutus palkokasvien
aistinvaraiseen laatuun. Entsyymit ovat merkittäviä tekijöitä monissa elintarvikematriiseissa
(mukaan lukien palkokasveissa) aistinvaraisen laadun heikentävinä tekijöinä johtuen
entsyymien kyvystä katalysoida rasvojen hapettumista ja haihtuvien, pienimolekyylisten
(pahanhajuisten) yhdisteiden muodostumista (McClements ja Decker 2008; Parkin 2008;
Belitz ym. 2009). Kuvassa 2 esitetään yleistetysti kaaviokuvana eri entsyymien funktioita
rasvojen hapettumisessa sekä entsymaattisen hapettumisen reaktioketjun etenemistä vaihe
vaiheelta.
Palkokasvien ja yleisesti kasvimatriisien endogeenisiä lipidejä muokkaavia entsyymejä ovat
esimerkiksi lipoksigenaasi, hydroperoksidilyaasi, peroksigenaasi sekä lipaasi (Gardner
1991; Brecht ym. 2008; Belitz ym. 2009; Gigot ym. 2010; Yang ym. 2017). Muita
entsyymejä, jotka osallistuvat haihtuvien yhdisteiden tuottoon rasvojen hydroperoksidien
hajotessa ovat esimerkiksi alkoholidehydrogenaasi, enaali-isomeraasi, alleenioksidisyntaasi
sekä alleenioksidisyklaasi (Belitz ym. 2009; Gigot ym. 2010). Palkokasvien sisältämistä
entsyymeistä lipoksigenaasilla ja sen eri isoformeilla on merkittävä vaikutus aistinvaraisen
laadun heikkenemisen kannalta, koska lipoksigenaasi aloittaa rasvojen hapettumisen
katalysoimalla hydroperoksidien muodostumista elintarvikematriiseissa (Gigot ym. 2010).
25
lipaasit
lipoksigenaasit
isomeraasit
lyaasit
alkoholidehydrogenaasit
Kuva 2. Yleiskaaviokuva rasvojen entsymaattisesta hapettumisesta vaiheittain.
2.3.3 Lipoksigenaasientsyymi
Lipoksigenaasientsyymi (EC 1.13.11.12) on oksidoreduktaaseihin kuuluva entsyymi, ja sitä
tavataan kasvi- ja eläinmatriiseissa. Lipoksigenaasientsyymi voi esiintyä useissa eri
isoformeissa lähteestä riippuen ja sen eri isoentsyymit tuottavat erilaisia hydroperoksideja
spesifisyydestä johtuen. Yhtenäistä kaikille entsyymin isoformeille eli lipoksigenaasin
muodoille on se, että kyseinen entsyymi pystyy hapettamaan vain sellaisia rasvahappoja,
jotka sisältävät 1-cis,4-cis-pentadieeni-rakenteen. Lipoksigenaasientsyymi luokitellaan
merkittäväksi lipidien hydroperoksidien muodostusta edistäväksi pro-oksidantiksi, koska se
katalysoi spesifisesti muutamien tyydyttymättömien rasvahappojen reaktioita niiden
vastaaviksi monohydroperoksideiksi. Entsyymikatalysoiduissa reaktioissa muodostuneet
hydroperoksidit voivat olla kemiallisilta rakenteiltaan hyvinkin erilaisia, kuin
autoksidaatiossa syntyneet hydroperoksidit. Tästä syystä lipoksigenaasientsyymeitä
käytetään tiettyjen haihtuvien yhdisteiden massatuotannossa, koska entsyymien spesifisyys
substraattia kohtaan ja ominaisuudet (optimaaliset lämpötilat ja pH) ovat hyvin tiedossa ja
laajasti tutkittuja (Gardner 1991; Brecht ym. 2008; McClements ja Decker 2008; Parkin
2008; Belitz ym. 2009).
Kasveissa olevat lipoksigenaasientsyymin isoentsyymit ovat sytoplasmisia entsyymeitä,
jotka sisältävät lisäksi hemittömän raudan. Lipoksigenaasientsyymin ollessa inaktiivisessa
Triasyyliglyserolit
Vapaattyydyttymättömät
rasvahapot
Rasvahappojenhydroperoksidit
Pienimolekyylisethaihtuvat yhdisteet:
alkoholit, ketonit,aldehydit, furaanit
26
tilassa, sen sisältämä rauta on pelkistyneessä muodossa (ferro-rauta). Lipoksigenaasin
aktivoiduttua rauta hapettuu kolmiarvoiseksi ferri-raudaksi peroksidin avustuksella.
Muodostuneella aktiivisella lipoksigenaasi-isoentsyymillä on tällöin kyky katalysoida vedyn
lohkeamista hiiliatomista, jolloin muodostuu alkyyliradikaaleja tai rasvahapon
alkyyliradikaali ja lipoksigenaasi-isoentsyymien muodostamia komplekseja. Reaktiosarja
jatkuu peroksyyli-anionin muodostumisella, kun pelkistyneeltä raudalta saatu elektroni
luovutetaan peroksyyliradikaalille. Peroksyyli-anioni muodostaa edelleen vedyn kanssa
hydroperoksidin, jolloin rasvahappo-entsyymi-kompleksi hajoaa. Reaktiosarja päättyy
raudan muuntumiseksi inaktiiviseen tilaan eli ferro-raudaksi. Kun lipoksigenaasientsyymin
ei-hemi-rauta on inaktiivisessa tilassa, siirtyy tällöin itse entsyymikin inaktiiviseen tilaan
(Gardner 1991; McClements ja Decker 2008).
Johtuen lipoksigenaasientsyymin lähtöainespesifisyydestä 1-cis-,4-cis-pentadieeni-
rakenteita kohtaan, ovat esimerkiksi kasvimatriisien sisältämät tyydyttymättömät rasvahapot
linoli- ja α-linoleenihappo lipoksigenaasientsyymin suosimia substraatteja (Gardner 1991;
McClements ja Decker 2008; Sanz ja Pérez 2010). Siedowin (1991) mukaan kasvien
sisältämät lipoksigenaasientsyymit voidaan luokitella yleisesti kahteen luokkaan: luokan 1
lipoksigenaaseihin (toiminta-alue pH:ssa 8-9) ja luokan 2 lipoksigenaaseihin (toiminta-alue
pH:ssa 6-7). Maccarone ym. (1994) ovat todenneet, että soijapavulla luokan 1
lipoksigenaasientsyymit käyttävät substraatteinaan vapaita rasvahappoja, kun taas luokan 2
lipoksigenaasit hapettavat esteröityneitä tyydyttymättömiä rasvahappoja.
Lipoksigenaasientsyymin aktiivisuutta eri palkokasvimatriiseissa on tutkittu eri tutkijoiden
toimesta. Van Osin ym. (1978) mukaan esimerkiksi soijapavun tyypin 1 lipoksigenaasin
aktiivisuus on korkein pH:ssa 9, kun taas tyypin 2 lipoksigenaasin pH:ssa 6-7. Farkas ja
Goldblith (1962) totesivat, että soijapavun lipoksigenaasin tehokas inaktivaatio tapahtuu
riittävän lämmön tuomisella kasvimatriisiin. Eskin ja Henderson (1974) sekä Al-Obaidy ja
Siddioi (1981) ovat tutkineet aiemmin härkäpavun lipoksigenaasientsyymin aktiivisuutta
todeten se olevan aktiivisimmillaan pH:ssa ~ 6,0-6,5. Lipoksigenaasientsyymin
ominaisuuksista on lisätietoa taulukossa 3.
Määritettäessä lipoksigenaasientsyymin aktiivisuutta voidaan soveltaa useaa eri
menetelmää. Menetelminä lipoksigenaasin aktiivisuuden määrittämiseen voidaan käyttää
esimerkiksi konjugoituneiden dieenien muodostumisen määrittämistä (Theorell ym. 1947),
27
hapen kulutuksen laskemista (Mitsuda ym. 1967) tai pigmenttien hapettumisasteen
määrittämistä (Ben Aziz ym. 1971). Spektrofotometristen tekniikoiden kehittyessä yleiseksi
ja siteeratuksi menetelmiksi lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrityksessä on tullut
Axelrodin ym. (1981) sekä Gökmenin ym. (2002) kehittämät menetelmät, joissa
lipoksigenaasientsyymin aktiivisuudet lasketaan ja esitetään konjugoituneina dieeneinä.
Taulukko 3. Lipoksigenaasi- sekä hydroperoksidilyaasientsyymien ominaisuuksia kasvimatriiseittain (Parkin
2008).
2.3.4 Hydroperoksidilyaasi
Hydroperoksidilyaasit (EC 4.2.1) ovat (Parkin 2008; Belitz ym. 2009) sytokromisia
entsyymejä, jotka esiintyvät tetrameerisinä muotoina. Hydroperoksidilyaasit ovat kooltaan
55-60 kDa monomeeriselta yksiköltään ja ne ovat kudoksissa membraaneihin sitoutuneina,
plastisidisina yksiköinä. Sytokromisina entsyymeinä ne ovat poikkeus, koska
hydroperoksidilyaasit eivät tarvitse happea tai korkeaenergisiä yhdisteitä katalysaatioissa ja
kemiallisissa reaktioissa. Kun hydroperoksidilyaasit muodostavat uusia sidoksia (varsinkin
hiilen ja hapen välille), ne hyödyntävät rasvahappojen hydroperoksideja sekä substraatteina
Lipoksigenaasin Optimaalinen pH Lipoksigenaasin spesifisyys Hydroperoksidilyaasin Dominoivat haihtuvatlähde (isoformi) 9:13-(S/R)-hydroperoksidien spesifisyys yhdisteet kasvimatriisissa
jakaumana
Soijapapu 1 9 (4:96) 13S (pH 9) S-13-LOOH n-heksanaali(23:77) 13S (pH 6,6)
2 6,5 (50:50) 9R ≥ 9S3 7 (65:35) R ~ S
Maissinjyvä 6,5 (93:7) 9S n-heksanaali
Herne 6,6 (67:33) R ~ S (pH 6,6)(3 isoformia) (59:41) 13S , 9R (pH 9)
Peruna 5,5 (95:5) 9S 9/13-LOOH trans-2-cis-6-nonadienaali
Tomaatti 5,5 (96:4) 9S 13-LOOH trans-2-heksenaali, cis-3-heksen-1-oli,n-heksanaali
Kurkku 5,5 (75:25) 9,13-LOOH trans-2-cis-6-nonadienaali
Vihreä paprika 5,5-6,0 13-LOOH cis-3-heksenaali, trans-2-heksenaali,n-heksanaali
Päärynä 6 (95:5) 9-LOOH trans-2-cis-6-nonadienaali
Omena 6,0-7,0 (15:85) 13-LOOH n-heksenaali, trans-2-heksenaali
Sieni 8 (10:90) 13S S-10-LOOH 1-okten-3-oli, 1-okten-3-oni
28
että hapen luovuttajina. Eri hydroperoksidilyaasit tuottavat erilaisia jatkoreaktiotuotteita.
Siten esimerkiksi kurkun ja sienien pienimolekyyliset, tuoksuvat yhdisteet ovat hieman
erilaisia. Hydroperoksidilyaasi-entsyymien tehtävä kasvimatriiseissa on lohkaista
rasvahappojen hydroperoksideista pienempiä yhdisteitä, jotka edelleen muuntuvat
entsymaattisesti haihtuviksi, tuoksuviksi yhdisteiksi (Parkin 2008; Belitz ym. 2009; Gigot
ym. 2010).
Hydroperoksidilyaasien aktiivisuus on optimaalinen pH:ssa 6-9 sekä noin 30 °C:ssa, mistä
johtuen ne ovat herkkiä kylmälle (Rodrigo ym. 2007). Hydroperoksidilyaasien aktiivisuudet
korreloivat isomeraasi-entsyymien aktiivisuuksien kanssa, mistä johtuu useiden erilaisten
haihtuvien yhdisteiden tuotto (Gigot ym. 2010). Hydroperoksidilyaasientsyymin
ominaisuuksista on lisätietoa taulukossa 3.
2.3.5 Alkoholidehydrogenaasi
Alkoholidehydrogenaasi (EC 1.1.1.1) on dimeerinen dehydrogenaaseihin kuuluva entsyymi,
jonka koko on keskimäärin 80 kDa koostuen useista isotsyymeistä. Alkoholidehydrogenaasit
ovat erityislaatuisia entsyymeitä johtuen niiden kyvystä joko katalysoida hapettumista tai
pelkistymistä. Kasvimatriiseissa alkoholidehydrogenaasit toimivat aina pelkistävinä
entsyymeinä pelkistäen rasvahappojen hydroperoksideista muodostuneita aldehydejä
vastaaviksi alkoholeiksi. Kasvimatriiseissa alkoholien muodostuminen vaatii
korkeaenergisten yhdisteiden (esimerkiksi NADH:n) läsnäoloa. Lisäksi
alkoholidehydrogenaasien spesifisyys vaihtelee matriisista riippuen (Parkin ym. 2008;
Belitz ym. 2009, Gigot ym. 2010).
2.3.6 Lipaasit
Lipaasit eli triasyyliglyserolin asyylihydrolaasit ovat luokan 3 entsyymejä (EC 3.1.1.3),
jotka osoittavat spesifisyyttä toimien vain öljy-vesi-rajapinnoilla. Vaikkakin muut luokan 3
entsyymit eli esteraasit noudattavat Michaelis-Menten-kinetiikkaa, lipaasit poikkeavat tästä
johtuen sen liukoisuudesta. Michelis-Menten- kinetiikan noudattaminen lipaaseilla alkaa
vasta, kun ne ovat saavuttaneet tietyn liukoisuuden asteen, jolloin ne alkavat muodostamaan
29
kolloidisia aggregaatteja. Karboksyyliesteraasien tavoin lipaasit hydrolysoivat
karboksyyliesterisidoksia muodostaen esimerkiksi diasyyliglyseroleita ja vapaita
rasvahappoja (Wong 2002; Parkin 2008; Belitz ym. 2009).
Puhuttaessa elintarvikkeiden pilaantumisesta endogeeniset lipaasit liitetään yleisesti siihen
johtuen niiden kyvystä ja funktiosta hydrolysoida asyyliglyseroleista ulos vapaita
rasvahappoja. Nämä rasvahapot aloittavat taasen hapettumisen, josta seuraa ja juontuu
elintarvikkeiden aistinvaraisten ominaisuuksien heikkeneminen. Lipaasien selektiivisyys on
riippuvainen monesta eri tekijästä ja näitä tekijöitä ovat muun muassa rasvahappotähteen
(asyylin) paikka glyseroliketjussa ja asyyliryhmän luonne. Kaikki edellä mainitut
selektiivisyyden osa-alueet voivat vaikuttaa myös yhdessä, jolloin lipaaseilla esiintyy myös
stereoselektiivisyyttä. Lipaasi-entsyymit toimivat optimaalisesti pH-alueella 5-9 ja 30-60
°C:n lämpötiloissa. Elintarvikkeissa lipaasi-entsyymien aktiivisuutta voidaan määrittää
muun muassa fluorokromisilla substraateilla (Wong 2002; Belitz ym. 2009). Dundas ym.
(1978) ovat tutkineet härkäpavun lipaasi-entsyymiä eristäen sen osittain ja toteamalla
kyseisen entsyymin olevan aktiivisimmillaan pH:ssa 8,5.
2.4 Palkokasvien lipideissä tapahtuvat muutokset ja vaikutukset elintarvikkeiden
laatuun
Palkokasvimatriisien sisältämien lipidien (pääasiassa triasyyliglyserolien sekä vapaiden
monityydyttymättömien rasvahappojen) hapettuminen johtaa palkokasvimatriiseja
sisältävien elintarvikkeiden aistinvaraisen laadun heikkenemiseen. Entsyymien
katalysoimien hapettumisreaktiosarjojen sekundääriset hapettumistuotteet eli erilaiset
haihtuvat yhdisteet sekä niiden muodostuminen elintarvikematriisiin ovat aistinvaraisen
laadun heikkenemisen keskiössä. Palkokasvimatriiseissa olevat lipaasit hydrolysoivat
triasyyliglyseroleista vapaita rasvahappoja, kun taas lipoksigenaasit katalysoivat
monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista vastaaviksi hydroperoksideiksi.
Rasvahappojen hydroperoksidit muuntuvat taasen muiden entsyymien (esimerkiksi
alkoholidehydrogenaasi ja hydroperoksidilyaasi) katalysoimina pienimolekyylisimmiksi,
haihtuviksi yhdisteiksi. Näillä haihtuvilla yhdisteillä on merkittävä vaikutus haju- ja
makuprofiilien syntymisessä palkokasvimatriiseihin ja sitä kautta aistinvaraiseen laatuun
(Zhuang ym. 2002; McClements ja Decker 2008; Brecht ym. 2008; Belitz ym. 2009).
30
2.4.1 Lipoksigenaasientsyymin toiminta palkokasvimatriiseissa
Lipoksigenaasientsyymi vastaa kasvimatriiseissa suurelta osin tyydyttymättömien
rasvahappojen katalysoiduista hapettumis- ja hajoamisreaktioista sekä niiden kautta
muodostuvien haihtuvien yhdisteiden muodostumisesta (Zhuang ym. 2002).
Lipoksigenaasientsyymin eri isoentsyymit voivat tuottaa monia luonteenomaisia haihtuvia
yhdisteitä johtuen niiden spesifisistä ominaisuuksista 1Z,4Z-pentadieenirakenteita kohtaan.
Muodostuvia haihtuvia yhdisteitä, joita muodostuu rasvahappojen hydroperoksideista
lipoksigenaasin katalysoimana (reaktiomekanismia selvitetty kuvassa 3), ovat esimerkiksi
erilaiset aldehydit ja ketonit sekä edelleen näiden vastaavat alkoholit. Esimerkkejä
haihtuvista yhdisteistä ovat muun muassa nonadienaali, heksenaali ja 1-okten-3-oli, joilla on
tyypilliset tuoreiden sienien, kurkkujen ja tomaattien tuoksut (Gardner 1991; Lindsay 2008).
LOX- Fe2+ +R
1 OH
O
H HR
1 OH
O
HLipoksigenaasin Tyydyttymätön rasvahappoja raudankompleksi
vedyn lohkeaminen
Alkyyliradikaali
R1 OH
O
H
ohapen liittyminen
O2
R1 OH
O
H
OO
Peroksyyliradikaali
R1 OH
O
H
OOH
Rasvahapon hydroperoksidi
Kuva 3. Lipoksigenaasientsyymin toiminta hydroperoksideja muodostettaessa (Gardner 1991).
31
Vick ja Zimmermann (1987) totesivat tutkimuksessaan, että monityydyttymättömät
rasvahapot (linolihappo ja α-linoleenihappo) ovat pääasiallisia substraatteja
lipoksigenaasientsyymille kasvikunnan tuotteissa. Edellä mainittujen rasvahappojen
hapettuminen alkaa 1Z,4Z-pentadieenirakenteen konfiguraation muutoksella, jossa
rasvahapon Z-kaksoissidokseen hyökännyt happiatomi muuttaa konjugaatiota viereiseen Z-
kaksoissidokseen aikaansaaden E-konfiguraation rasvahappoon. Tästä eteenpäin
reaktioketjussa hapettuminen jatkuu entsymaattisesti ja muodostuvien hydroperoksidien
(rasvahappojen 9- tai 13-hydroperoksidit) luonteeseen sekä esiintyvyyteen vaikuttavat muun
muassa kasvimatriisi ja entsyymien eri muodot.
Clemente ym. (2000) ovat muun muassa tutkineet härkäpavun lipoksigenaasientsyymiä
todeten, että lipoksigenaasientsyymin isoformeja härkäpapumatriisissa on kaksi ja näiden
isoentsyymien aktiivisuus on paras kapealla pH-alueella 5,6-5,8.
2.4.2 Rasvahappojen hydroperoksidien hajoamiseen osallistuvat entsyymit sekä niiden
toiminta palkokasvimatriiseissa
Lipoksigenaasientsyymin merkitys rasvahappojen hydroperoksidien muodostumisessa on
valtava ja sen roolia hydroperoksidien muodostumisessa on tutkittu paljon. Kuitenkin,
aistinvaraisen laadun heikkenemisessä yleisesti elintarvikkeissa (ja palkokasveissa) on
mukana useita entsyymeitä, jotka toimivat ja ovat aktiivisia eri kohdissa reaktioketjua.
Yleisesti tiedetään, että flavori- eli makukomponenttien muodostumiseen
elintarvikematriiseissa vaikuttavat lipoksigenaasientsyymin lisäksi muun muassa
hydroperoksidilyaasi-entsyymi. Reaktioketjujen edetessä toimivien ja aktiivisten
entsyymien nimet – ja sitä mukaa tuotteet – vaihtelevat muun muassa lähtöaineista ja reaktio-
olosuhteista riippuen (Gigot ym. 2010).
Rasvahappojen hydroperoksidien hajoaminen tapahtuu eläin- ja kasvimatriiseissa eri
entsyymien johdosta eri tavoilla (Belitz ym. 2009). Täten kasvimatriiseissa tapahtuva
entsymaattinen hajoaminen tuottaa erilaisia hapettumistuotteita, kuin eläinmatriiseissa
tapahtuva. Kasvimatriiseissa hydroperoksidien entsymaattisesta hajottamisesta vastaavat
pääasiassa erilaiset lyaasi-, ja isomeraasi-entsyymit. Varsinkin hydroperoksidilyaasi ja
hydroperoksidi-isomeraasi ovat aktiivisia entsyymeitä kasvimatriiseissa hajottamaan
32
entsymaattisesti rasvahappojen hydroperoksideja. Hydroperoksidilyaasi on suurena
kiinnostuksen kohteena kasvimatriiseissa johtuen hydroperoksidien roolista haihtuvien
yhdisteiden muodostumisessa ja niiden prekursorina. Palkokasvit ovat herkkiä hapettumaan
johtuen niiden sisältämistä tyydyttymättömistä rasvahapoista. Näistä rasvahapoista
varsinkin linolihapolla ja α-linoleenihapolla on merkittävät jalansijat elintarvikkeiden
aistinvaraisen laadun heikentäjinä (Vick ja Zimmerman 1976; Matsui ym. 2000; Kuroda ym.
2005).
2.4.3 Linoli- ja α-linoleenihaposta muodostuvien hydroperoksidien hajoaminen
palkokasvimatriiseissa
Yleisesti tiedetään, että linolihaposta muodostuu linolihapon 13-hydroperoksidi
entsymaattisen hapettumisreaktiosarjan alussa. Hydroperoksidilyaasientsyymi katalysoi
rasvahapon hydroperoksidin hajoamista, jolloin muodostuu edelleen haihtuvia ja
pienimolekyylisiä yhdisteitä eli sekundäärisiä hapettumistuotteita. Esimerkiksi linolihapon
ollessa lähtöaineena muodostuneesta tietystä rasvahapon hydroperoksidista muodostuu
ensin hydroperoksidilyaasin katalysoimana heksanaalia ja edelleen toisen entsyymin,
alkoholidehydrogenaasin, avulla 1-heksanolia (Hamberg ja Hamberg 1990; Hamberg ja
Fahlstadius 1992; Velíšek 2014). Linolihapon hapettumista entsymaattisesti on selvitetty
tarkemmin kuvassa 4.
Myös α-linoleenihapon hajoamista ja siihen liittyviä entsyymeitä on yleisesti paljon tutkittu.
α-linoleenihaposta muodostuvan hydroperoksidin eli oktadeka-9,11,15-trieenihapon 13-
hydroperoksidin hajoamisessa hydroperoksidilyaasi-entsyymi katalysoi hydroperoksidin
hajoamista muodostaen 3-heksenaalia. Tästä eteenpäin reaktiosarjan tiedetään jatkavan
kahta eri reittiä, kuten kuvassa 5 on selvitetty. 3-heksenaalista voi alkoholidehydrogenaasin
avulla pelkistyä heks-3-en-1-olia. Kaksoissidoksesta johtuen heks-3-enaali voi edelleen
isomeroitua enaali-isomeraasin avulla 2-heksenaalia ja edelleen pelkistyä
alkoholidehydrogenaasin avulla heks-2-en-1-oliksi (Gigot ym. 2010; Velíšek 2014).
33
CH3
O
OHlinoleic acid
lipoxygenase O2
CH3
O
OH
O OH(9Z,11E,13S)-13-hydroperoxyoctadeca-9,11-dienoicacid
hydroperoxide-lyase
CH3
O
Hhexanal
alcoholdehydrogenase
CH3 OH hexan-1-ol
Kuva 4. Linolihapon hapettuminen ja hydroperoksidin hajoaminen entsymaattisesti (Velíšek 2014).
CH3
O
OH linolenic acid
lipoxygenase O2
CH3O
OH
O OH
(9Z,11E,13S,15Z)-13-hydroperoxy-octadeca-9,11,15-trienoic acid
hydroperoxide lyase
CH3
O
hex-3-enal
enal isomerase
CH3 O
hex-2-enal
alcohol dehydrogenase
CH3
OHCH3 OH
hex-3-en-1-ol hex-2-en-1-ol
Kuva 5. α-linoleenihapon hapettuminen ja hydroperoksidin entsymaattinen hajoaminen (Velíšek 2014).
34
2.4.4 Rasvahappojen entsyymikatalysoitujen hajoamisreaktioiden aistinvaraiset ongelmat
Aistinvaraisesta näkökulmasta rasvojen hapettuminen ja siihen liittyvä rasvojen kemiallinen
hydrolyysi ovat elintarvikkeiden yleisimpiä aistinvaraista laatua heikentäviä tekijöitä ja
kemia hapettumisreaktioiden takana on hyvin tiedetty ja tutkittu. Yleisesti tiedetään, että
rasvojen sekä öljyjen autoksidaatiolla on merkittävä vaikutus maku- ja aromivirheiden
muodostumisessa elintarvikkeissa. Kasvimatriiseissa tyydyttymättömien rasvahappojen
entsyymikatalysoitu oksidatiivinen hajoaminen tuottaa monia luonteenomaisia ja spesifejä
aromeja, kun kasvisolukko hajoaa (McClements ja Decker 2008; Lindsay 2008; Belitz ym.
2009). Taulukossa 4 on kuvattu härkäpapumatriiseista analysoituja haihtuvia yhdisteitä sekä
niiden ominaistuoksuja.
Monityydyttymättömien rasvahappojen entsyymikatalysoidut hajoamisreaktiot tuottavat
pääasiassa 6-, tai 9-hiilisiä aldehydejä, joilla on ominaiset tuoksut (Matsui ym. 2006). Näistä
aldehydeistä muuntuu Shiojirin ym. (2006) mukaan vastaavia estereitä ja alkoholeja.
Hatanaka (1993) totesi, että varsinkin edellä mainituilla 6-hiilisillä yhdistetyypeillä
(”vihreän makumaailman yhdisteet”) on merkittävä osuus kasvimatriiseissa aromi- ja
makuprofiilien muodostumisessa. Aistinvaraisesta näkökulmasta katsottuna edellä
mainituilla yhdistetyypeillä on joko haluttuja aistinvaraisia ominaisuuksia (varsinkin
hedelmät) tai sitten ei (varsinkin juurekset ja palkokasvit). Monilla aistinvaraisia ongelmia
aiheuttavilla yhdisteillä on lisäksi löydetty olevan antimikrobiaalisia vaikutuksia (Hubert
ym. 2008).
Palkokasveista aromi- ja makuvirheiden muodostumista on tutkittu varsinkin soijapavulla.
Papumaisen virhearomiprofiilin muodostumisessa varsinkin heksanaalilla on soijapavuissa
erittäin suuri merkitys (Wu ym. 1995). Härkäpavussa aromi- ja makuvirheprofiilin
aiheuttamia haihtuvia yhdisteitä ovat tutkineet muun muassa Jiang ym. (2016) sekä Oomah
ym. (2014). Kyseisissä tutkimuksissa härkäpavussa aromi- ja makuvirheprofiilin
muodostivat useat haihtuvat yhdisteet, joista heksanaalilla, nonanaalilla sekä 2-
pentyylifuraanilla oli suuret osuudet makuvirheprofiilin muodostumisessa. Lisäksi Oomah
ym. (2014) totesivat, että härkäpavussa edellä mainittujen yhdisteiden lisäksi myös
heksanolilla, oktenonilla sekä 1-okten-3-olilla oli vaikutusta makuvirheprofiilin
35
muodostumisessa, kun härkäpapususpensioita analysoitiin headspace-
kaasukromatografisesti.
Taulukko 4. Härkäpapumatriiseista tunnistettuja haihtuvia yhdisteitä sekä niiden kuvausta.
Monityydyttymättömien rasvahappojen entsyymikatalysoiduissa hajoamisreaktioissa
muodostuvien haihtuvien yhdisteiden maku- ja aromiprofiili vaihtelee kasvimatriiseittain
(Belitz ym. 2009). Muodostuvat haihtuvat yhdisteet tuoksuvat esimerkiksi vastaleikatulle
ruoholle (heksanaali ja heksenaali) tai sienille (oktenoli). Heksanaali, heksenaali ja vastaavat
alkoholit ovat muun muassa Fauconnierin ja Marlierin (1996) sekä Elshofin ym. (1996)
mukaan varsin yleisiä hydroperoksidien hajoamistuotteita kasvimatriiseissa ja kyseiset
haihtuvat yhdisteet tuottavat muun muassa ”vihreän ruohon” ja tuoreen kurkun tuoksua.
Heksanaalin muodostumistapa rasvahappojen hydroperoksideista kasvimatriiseissa riippuu
siitä, onko matriisissa mukana vettä. Esimerkiksi heksanaalia muodostuu
protonikatalysoidussa hydroperoksidin lohkeamisreaktiossa veden läsnäollessa, kun taas
vesivapaissa rasvamatriiseissa heksanaalin muodostumistavaksi mainitaan
hydroperoksidien homolyyttinen betalohkeaminen (Belitz ym. 2009).
Wurzenberger ja Grosch (1986) ovat tutkineet hydroperoksidilyaasin roolia rasvahappojen
hydroperoksidien hajoamisreaktioissa. Heidän tutkimuksensa osoitti rasvahappojen
hydroperoksidien hajoamisen tapahtuvan hydroperoksidilyaasin katalysoidessa beta-
36
lohkeamista tuottaen erilaisia haihtuvia aromiyhdisteitä, esimerkiksi heksanaalia ja
nonanaalia, eri matriisista riippuen.
37
3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
3.1 Tutkimuksen tausta ja tavoitteet
Tämä maisterin tutkielma tehtiin Helsingin yliopiston maatalous-metsätieteellisen
tiedekunnan elintarvike- ja ravitsemustieteiden osastolle. Elintarvikekemian sekä muiden
laitoksen osastojen yhteistyönä on viime vuosia tuotettu tutkimustietoa palkokasvien
viljelyksestä, kemiasta sekä ravitsemuksesta, joten tutkielmani aihe on erittäin ajankohtainen
tarjoten uutta ja vahvistavaa tutkimustietoa jo edellisten tietojen pohjalle.
Elintarvikkeissa erilaisten palkokasvien käyttöä ja hyödyntämistä hankaloittaa sopivien
prosessointiolosuhteiden sekä varastoinnin vaikutuksesta muodostuvien, pahalta haisevien
haihtuvien yhdisteiden synty elintarvikematriisiin. Nämä papumaista flavoria aiheuttavat
haihtuvat yhdisteet muodostuvat elintarvikematriisiin pääasiassa lipidien entsymaattisessa
hapettumisessa. Tässä maisterin pro gradussa tutkittiin lipidien entsymaattista hapettumista
erilaisissa palkokasvimatriiseissa rakentaen koeasetelma siten, että koeolosuhteet suosivat
lipoksigenaasientsyymin toimintaa (eli hydroperoksidien muodostusta).
Lipoksigenaasientsyymin toiminnan johdosta muodostuneet hydroperoksidit voivat taasen
hajota haihtuviksi yhdisteiksi kemiallisesti, entsymaattisesti tai niiden yhdistelmällä.
Haihtuvista yhdisteistä merkittävimpiä ovat esimerkiksi erilaiset alkoholit, ketonit, furaanit
sekä aldehydit.
Kokeellisen tutkimuksen päätavoitteena oli tutkia kahden palkokasvimatriisin (härkäpapu ja
lupiini) eri lajikkeiden lipidejä muokkaavien entsyymien ominaisuuksia keskittyen
erilaisista lipidisubstraateista entsymaattisesti muodostuviin haihtuviin
hapettumistuotteisiin. Haihtuvat, sekundääriset hapettumistuotteet analysoitiin
kiinteäfaasimikrouutto-headspace-kaasukromatigrafia-massaspektrometrisesti (HS-SPME-
GC-MS). Osatavoitteina kokeellisessa osassa oli optimoida inkubaatio-olosuhteet
lipoksigenaasille pH:n sekä inkubaatioseoksen (lipidisubstraatin, uutteen sekä puskurin
suhteet) osalta. Osatavoitteina oli tutkia myös haihtuvien yhdisteiden muodostusta
erityyppisistä lipideistä, kuten vapaista rasvahapoista, triasyyliglyserolista (trilinoleiini),
rypsiöljystä sekä saippuoidun rypsiöljyn rasvahapoista. Lopuksi haluttiin selvittää,
tapahtuiko inkubaatio-olosuhteissa myös entsymaattisen hapettumisketjun aiempien
38
vaiheiden reaktioita: lipaasin aiheuttamaa lipidien hydrolyysiä (HPLC-ELSD-menetelmä) ja
lipoksigenaasin aiheuttamaa hydroperoksidien muodostumista (HPLC-DAD-menetelmä).
3.2 Reagenssit
Tässä maisterin pro gradu-työssä käytettiin seuraavia reagensseja:
Kaliumdivetyfosfaatti KH2PO4; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Kaliumhydroksidi KOH; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Natriumhydroksidi NaOH; FF-Chemicals Oy, Haukipudas, Suomi
Tween 20; Sigma-Aldrich, Ranska
Etikkahappo CH3COOH; RdH Laborchemikalien GmbH & Co, Saksa
Natriumasetaatin trihydraatti CH3COONa x 3 H2O; Sigma-Aldrich, Ranska
Heptaani; Sigma-Aldrich, Ranska
Metanoli; Sigma-Aldrich, Ranska
Dietyylieetteri; Sigma-Aldrich, Ranska
Suolahappo HCl; Sigma-Aldrich, Ranska
Isopropanoli; Sigma-Aldrich, Ranska
Linolihappo linolihapon kantaliuoksessa (heptaani); Nu-Check Prep, Elysian, USA
α-linoleenihappo α-linoleenihapon kantaliuoksessa (heptaani); Nu-Check Prep, Elysian,
USA
Trilinoleiini trilinoleiinin kantaliuoksessa (heptaani); Nu-Check Prep, Elysian, USA
3.3 Näytteiden valmistuksessa käytetyt laitteistot
Tässä maisterin pro gradussa näytteiden valmistuksessa käytettiin seuraavia laitteistoja
esikäsiteltäessä näytteitä varsinaisia analyysejä varten:
Ultrasentrifugaalinen mylly Retsch ZM200; Retsch GmbH, Saksa
Ultrasentrifugaalisen myllyn ravistelija Retsch DR100; Retsch GmbH, Saksa
Analyysivaaka Mettler-Toledo PE360
39
Analyysivaaka Presica 240A
Lämpöhaude Grant GLS 400
Sentrifuugi Hermle Z323
Rotavapor-pyöröhaihdutin
3.4 Määrityksissä käytetyt analyysilaitteistot
Tässä maisterin pro gradussa käytettiin esikäsiteltyjen näytteiden analysoinnissa seuraavia
analyyttisia ja kromatografisia laitteistoja:
UV/VIS-spektrofotometri Perkin-Elmer Lambda 25
pH-mittari MeterLab PHM 220
HS-SPME-GC-MS-laitteisto:
kaasukromatografi HP 6890-series; Agilent Technologies Inc., USA
massaspektrometri ja detektori Agilent 5973 Network; Agilent Technologies Inc., USA
HS-SPME-injektori combiPAL; CTC Analytics, USA
SPB-624-kapillaarikolonni; Supelco, USA
DVB/CAR/PDMS-kuitu; Supelco, USA
HPLC-ELSD-laitteisto:
HPLC-nestekromatografi Agilent 1200, Agilent Technologies Inc., USA
ELSD-detektori Waters 2420, Waters, USA
diolikolonni LiChrosorb (5 µm, 3 x 100 mm), VDS optilab Chromatographie Technik
GmbH, Saksa
HPLC-DAD-laitteisto:
HPLC-nestekromatografi Agilent 1200, Agilent Technologies Inc., USA
Fotodiodirividetektori Waters 996, Waters, USA
diolikolonni LiChrosorb (5 µm, 3 x 100 mm), VDS optilab Chromatographie Technik
GmbH, Saksa
40
3.5 Näytteet ja muut materiaalit
Näytematriiseiksi valikoitui kaksi palkokasvia, härkäpapu sekä lupiini. Palkokasvimatriiseja
hienonnettiin ultrasentrifugimyllyllä partikkelikokoon 0,5 mm ja jauhetut
palkokasvimatriisit säilytettiin -18°C:ssa Kaikki palkokasvimateriaalit olivat kasvaneet
Suomessa ja ne esitellään alla lajikkeineen ja satovuosineen:
Härkäpapu, Kontu-lajike, satovuosi 2011
Härkäpapu, Kontu-lajike, satovuosi 2015
Härkäpapu, Alexia-lajike, satovuosi 2015
Härkäpapu, Fatima-lajike, satovuosi 2015
Härkäpapu, SSNS-1-lajike, satovuosi 2015
Lupiini, Haags Blaue-lajike, satovuosi 2012
Lupiini, Boruta-lajike, satovuosi 2012
Vertailumateriaaliksi haihtuvien yhdisteiden tunnistamiseen (HS-SPME-GC-MS-
menetelmä) valittiin vaniljalla maustettu soijamaito (Alpro Soya vanilja-soijajuoma,
valmistaja: Alpro C.V.A, Vlamingstraat 28, 8560 Wevelgem, Belgia, eränumero AC 0210).
Vertailumateriaalia pipetoitiin 3 millilitraa ruskeisiin korkillisiin näyteampulleihin, joita
tehtiin 30 kappaletta. Vertailumateriaalia säilytettiin pakkasessa -20°C:ssa.
Yhtenä substraattina toimi suomalainen rypsiöljy (Keiju-rypsiöljy, valmistaja: Bunge
Finland Oy, 21201 Raisio, Suomi). Rypsiöljyä säilytettiin valolta suojattuna pimeässä
hapettumisen ehkäisemiseksi. Koska rypsiöljyn sisältämien triasyyliglyserolien johdosta se
oli huono substraatti lipoksigenaasientsyymille, päätettiin edellä kuvatusta rypsiöljystä
valmistaa yhdeksi substraatiksi haihtuvien yhdisteiden tunnistamista varten saippuoitua
rypsiöljyä. Saippuoidussa rypsiöljyssä triasyyliglyserolit ovat hydrolysoituneet vapaiksi
rasvahapoiksi, jolloin myös sen soveltuvuus lipoksigenaasille on todennäköisesti parempi ja
muodostuvien haihtuvien yhdisteiden kirjo täten monipuolisempi.
Saippuoidun rypsiöljyn valmistus suoritettiin erillisellä ohjeella. Rypsiöljyä punnittiin
tarkasti ~ 250 mg uuttoputkeen lisäten samalla 8 ml etanolia sekä 0,5 ml kylläistä
kaliumhydroksidin vesiliuosta. Putkea vorteksoitiin 10 sekuntia, minkä jälkeen seosta
41
hydrolysoitiin 30 minuuttia 85°C:ssa ravistelijassa vesihauteessa. Putken annettiin jäähtyä,
minkä jälkeen seokseen lisättiin 12 ml Milli-Q-vettä sekä 20 ml heptaani-dietyylieetteri-
seosta (1:1). Putkea ravisteltiin 10 minuuttia, minkä jälkeen faasien annettiin erottua.
Ylemmän faasin poisottamisen jälkeen jäänyt vesifaasi happamoitiin suolahapolla arvoon
pH 4. Happamassa vesifaasissa olevat vapaat rasvahapot uutettiin uudelleen 20 ml:lla
heptaani-dietyylieetteri-seosta (1:1) ja molemmat heptaani-dietyylieetteriseokset
yhdistettiin pyörökolviin, minkä jälkeen liuotin haihdutettiin pyöröhaihduttimella. Vapaat
rasvahapot sisältävä kuiva jäännös liuotettiin heptaaniin, siirrettiin kvantitatiivisesti 20 ml:n
mittapulloon sekä täytettiin merkkiin.
3.6 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrittäminen
Härkäpavusta ja lupiinista määritettiin lipoksigenaasientsyymin optimi-pH Axelrodin ym.
(1981) sekä Gökmenin ym. (2002) kuvaamilla menetelmillä hieman muunnellen käyttäen
eri pH-arvoihin (pH 4, 5, 6, 6,8 ja 8,5) säädettyjä puskuriliuoksia. Härkäpavulle
lipoksigenaasin optimi-pH määritettiin verraten aktiivisuutta kaikissa edellä mainituissa pH-
arvoissa, lupiinin lipoksigenaasin aktiivisuutta tutkittiin pH-arvoissa 5, 6 ja 6,8.
Ultrasentrifuugimyllyllä hienonnettuja jauhoja (tarkasti ~0,5 g) suspendoitiin MilliQ-veteen
(tarkasti 20 ml), jonka jälkeen seosta inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämmössä. Suspensiot
sentrifugoitiin 10000 x g-voimalla 10 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit kerättiin
talteen. Supernatanteista eli uutteista laimennettiin eri vahvuisia uute-laimennoksia
lipoksigenaasin aktiivisuusmäärityksiä varten (1:25, 1:20, 1:10 sekä 1:5). Uutteita
laimennettiin erivahvuisiksi johtuen lipoksigenaasientsyymin erilaisista aktiivisuuksista eri
pH-arvoissa. Myös UV/VIS-spektrofotometrin toiminta-alueen riittämättömyydestä johtuen
uutteista jouduttiin tekemään laimennoksia. Sekä uutteita että niistä tehtyjä laimennoksia
säilytettiin jäissä määritysten ajan.
Substraattina lipoksigenaasin aktiivisuusmäärityksessä toimi linolihappo, jonka
kantaliuoksesta (heptaanissa, N2-haihdutus) valmistettiin päivittäin tuore pitoisuudeltaan 10
mM oleva substraattiliuos Tween 20:sta (1 %-kantaliuos, substraattiliuoksessa pitoisuus 0,3
%), MilliQ-vedestä ja NaOH:sta (1 M, 50 µl). Lipoksigenaasin aktiivisuusmäärityksessä
jokaista puskuriliuosta (2,6 ml) sekoitettiin substraattiin (0,2 ml) ja halutun vahvuiseen
42
uutteeseen (0,2 ml), minkä jälkeen putket sekoitettiin ja niitä inkuboitiin 3 minuuttia
30°C:ssa. Inkuboitumisen jälkeen lisättiin 3 ml NaOH:a, jolloin entsyyminuutteen ja
substraatin välinen hapettumisreaktio pysähtyi (konsentraatio NaOH:lla joko 0,1 M tai 1,0
M riippuen pH:sta).
Liuosten absorbanssit mitattiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 234 nanometriä ja
tulokset laskettiin konjugoituneiden dieenien määränä (mmol/(g x min)) käyttämällä
hydroperoksidien molaarista absorptiviteettiä (ε = 26 000 l/mol x cm). Laskettaessa
inkuboitujen näytteiden lipoksigenaasin aktiivisuutta jokaisesta inkuboidusta näytteestä
vähennettiin inaktivoitujen vertailunäytteiden keskiarvo. Mittaukset suoritettiin
inkuboiduille näytteille kolmesta rinnakkaisuutteesta tehden kolme rinnakkaisinkubaatiota
jokaisesta uutteesta. Inaktivoiduille vertailunäytteille mittaukset suoritettiin kahdesta
rinnakkaisuutteesta tehden jokaisesta kaksi rinnakkaisinkubaatiota. Lisäksi substraatin
toimivuutta testattiin ja seurattiin päivittäin kahdella näytteellä (substraattinollat)
sekoittamalla 2,6 ml puskuria, 3 ml NaOH:a (0,1 M), 200 µl substraattia ja 200 µl MilliQ-
vettä.
3.7 Haihtuvien yhdisteiden seuranta ja tunnistus HS-SPME-GC-MS-menetelmällä
Härkäpavusta ja lupiinista määritettiin entsymaattisen hapettumisen seurauksena
syntyneiden haihtuvien yhdisteiden profiilit headspace-kiinteäfaasimikrouutto-
kaasukromatografia-massaspektrometrisesti (HS-SPME-GC-MS) Dameraun ym. (2014)
käyttämällä menetelmällä ja parametreilla. Kaasukromatografiin oli lisäksi kytketty
massaspektrometri, jonka avulla haihtuvien yhdisteiden tunnistus tapahtui. Haihtuvien
yhdisteiden määriä tarkasteltiin kromatogrammien piikkien pinta-aloina
kokonaisionimäärinä ilmaistuna.
3.7.1 Haihtuvien yhdisteiden määritysmenetelmän optimointi
Haihtuvien yhdisteiden profiilien muodostumisen optimointi suoritettiin härkäpavulla
(Kontu-lajike, satovuosi 2011) kahtena rinnakkaisena näytteenä. Ultrasentrifugaalisella
43
myllyllä jauhettuja palkokasvijauhoja punnittiin tarkasti (~0,5 g). Jauhot suspendoitiin ensin
veteen (20 ml), minkä jälkeen suspensiota inkuboitiin 15 minuuttia. Suspensiot
sentrifugattiin nopeudella 10000 g 10 minuutin ajan, minkä jälkeen uutteet kerättiin talteen
säilyttäen niitä jäissä. Vaihtelevat määrät puskuria, substraattiliuosta ja laimentamatonta
entsyymiuutetta vorteksoitiin ruskeissa kierrekorkillisissa näyteampulleissa ja seoksen
annettiin inkuboitua 30°C:ssa 10 minuutin ajan. Entsyymireaktion ja hapettumisen
pysäyttämiseksi näyteampullin korkin septumin läpi ruiskutettiin ~300 µl 1M NaOH:ia
pitäen samalla haihtuvat yhdisteet näyteampullin sisällä.
Optimoinnin parametreina toimivat substraatin, entsyymiuutteen ja puskurin määrä sekä
haihtuvien yhdisteiden keruulämpötila näytteensyöttäjän agitaattorissa. Parametrien
optimoinnin tarkoituksena oli löytää sellaiset reaktio-olosuhteet, jossa sekä muodostuvien
haihtuvien yhdisteiden profiilit että piikkien pinta-alat olisivat suurimmat. Substraattina
reaktioissa toimi linolihaposta tehty 10 mM-liuos, jonka koostumus ja valmistus on kuvattu
edellä lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrityskappaleessa.
Valittujen optimaalisten olosuhteiden perusteeksi valittiin kahden haihtuvan yhdisteen
(heksanaali ja 1-okten-3-oli) piikkien pinta-alojen suuruus, tasaisuus sekä haihtuvien
yhdisteiden lukumäärään suuruus kokonaisuudessaan. Lipoksigenaasientsyymin ollessa
aktiivisin pH:ssa 6 kyseistä puskuria käytettiin luomaan optimaaliset olosuhteet haihtuvien
yhdisteiden muodostumiseen.
Vertailunäytteenä (in-house-reference) toimi vaniljalla maustettu soijajuoma, ja
vertailunäyte analysoitiin jokaisen analyysisekvenssin alussa laitteiston toiminnan
oikeanlaiseksi varmentamiseksi.
Haihtuvat yhdisteet analysoitiin HS-SPME-GC-MS-menetelmällä käyttäen
divinyylibentseeni-karbokseeni-polydimetyylisiloksaani-kuitua (DVB/CAR/PDMS, 50/30
µm filmin paksuus). Kaasukromatografi oli varustettu lisäksi SPB-624-kapillaarikolonnilla
(30 m x 0,25 mm, filmin paksuus 1,4 mm). SPME-kuidun kunnostus tapahtui tarpeen
vaatiessa ennen analyysejä, ja sen vaihto suoritettiin laitteiston maahantuojan ohjeiden
mukaisesti. Uuttoaika combiPAL-näytteensyöttäjällä oli jatkuvasti 30 minuuttia.
Tasapainottumisaika näytteensyöttäjällä oli 10 minuuttia jatkuvasti. Kaasukromatografissa
kantokaasuna toimi helium ja sen virtaus oli 0,7 ml/min. Kaasukromatografin uunin
44
lämpötila nousi 5°C minuutissa aina 200°C:en saakka (aloituslämpötila 40°C), jossa
lämpötilaa pidettiin 10 minuuttia. Massaspektrometrin ionisaatioenergia oli 70 eV ja
skannausalue 50-300 amu:a. HS-SPME-GC-MS-laitteiston käytön parametrit olivat samat
myös varsinaisia näytteitä analysoitaessa. Inkubointilämpötilaa kaasukromatografilla
nostettiin 10 celsiusasteen nousuin välillä 40°C-60°C haarukoiden optimaalinen lämpötila.
3.7.2 Haihtuvien yhdisteiden muodostuminen ja tunnistus erilaisista lipidisubstraateista
Optimaalisten olosuhteiden löydyttyä varsinaisten näytteiden haihtuvien yhdisteiden määrät
sekä tunnistaminen suoritettiin valittuja optimaalisia olosuhteita käyttäen. Näytematriiseina
toimivat härkäpavun eri lajikkeet (4 kpl) sekä lupiinin eri lajikkeet (2 kpl). Substraatteina
toimivat linolihappo, α-linoleenihappo, trilinoleiini, rypsiöljy sekä saippuoitu rypsiöljy.
Saippuoitua rypsiöljyä tutkittiin vain Kontu-härkäpavulla sekä Haags Blaue-lupiinilla.
Linolihaposta, α-linoleenihaposta sekä trilinoleiinista (kantaliuoksissa, N2-haihdutus)
valmistettiin aina tarpeen vaatiessa substraattiliuokset pitoisuuksien ollessa 10 mM.
Heptaanista haihdutetut substraatit sekoitettiin substraattiliuoksiksi Tween 20:sta (1 %-
kantaliuos, substraattiliuoksessa pitoisuus 0,3 %), MilliQ-vedestä ja NaOH:sta (1 M, 50 µl).
Rypsiöljyn ja saippuoidun rypsiöljyn toimiessa substraatteina valmistettiin
substraattiliuokset, joiden linolihappopitoisuus rypsiöljyn rasvahappokoostumuksen
perusteella oli ~ 10 mM. Lipidisubstraattia punnittiin (tarkasti) sellaiset määrät, jotka
vastasivat lopullisessa substraattiliuoksessa olevaa haluttua linolihapon konsentraatiota.
Substraattiliuosten valmistus on kuvattu tarkemmin edellisessä kappaleessa.
Palkokasvimatriiseista tehdyt entsyymiuutteet valmistettiin samalla tavalla kuin menetelmää
optimoitaessa.
Puskuria (2200 µl), haluttua lipidisubstraattia (400 µl) sekä halutun palkokasvin
entsyymiuutetta (400 µl) vorteksoitiin ruskeissa kierrekorkillisissa näyteampulleissa ja
niiden annettiin inkuboitua 30°C:ssa 10 minuutin ajan. Entsyymireaktion ja hapettumisen
pysäyttämiseksi näyteampullin korkin septumin läpi ruiskutettiin ~300 µl 1M NaOH:ia
pitäen samalla haihtuvat yhdisteet näyteampullin sisällä. Näyteampullin sisään
muodostuneet haihtuvat yhdisteet tunnistettiin ja niiden määrät laskettiin piikkien pinta-
45
aloista. Jokaisesta palkokasvimatriisista mittaukset suoritettiin kahdesta rinnakkaisuutteesta
tehden kaksi inkubaatiota jokaisesta rinnakkaisuutteesta.
Koska hapettumista lipideissä voi tapahtua ilman entsyymejä, valmistettiin inaktivoidut
vertailunäytteet kahdesta rinnakkaisuutteesta. Inaktivoitujen vertailunäytteiden valmistus
erosi varsinaisten näytteiden valmistuksesta vain siten, että natriumhydroksidi-lisäys
näyteampulliin tehtiin ennen entsyymiuutteen lisäämistä. Tällöin lipoksigenaasientsyymin
johdosta tapahtuvaa entsymaattista hapettumista ei voi tapahtua liuoksen pH:n ollessa liian
korke.
Haihtuvat yhdisteet analysoitiin HS-SPME-GC-MS-menetelmää apuna käyttäen samalla
tavalla ja samoilla laitteiston parametreilla kuin haihtuvien yhdisteiden määritysmenetelmää
optimoitaessa. Haihtuvat yhdisteet tunnistettiin vertaamalla spektrejä NIST-kirjastoon.
Haihtuvien yhdisteiden määriä laskettaessa jokaisen varsinaisen näytteen kokonaisionipiikin
pinta-alasta vähennettiin inaktivoitujen vertailunäytteiden rinnakkaisnäytteiden piikkien
pinta-alojen keskiarvot. Tällöin saatiin selville ne haihtuvat yhdisteet, joiden
muodostuminen oli entsymaattisen hapettumisen johdosta tapahtuvaa. Haihtuvien
yhdisteiden määristä laskettiin keskiarvot, keskihajonnat sekä vaihteluväli. Laaja-
alaisempaa tilastollista analysointia (esimerkiksi linolihaposta ja α-linoleenihaposta
muodostuvien haihtuvien yhdisteiden määrien eroavuus) haihtuvien yhdisteiden määristä ei
katsottu tarpeelliseksi tehdä, koska linolihapon ja α-linoleenihapon tiedetään tuottavan
erilaisia haihtuvia yhdisteitä.
3.8 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden todentaminen vapaiden
rasvahappojen määrittämisellä
Härkäpavusta (Kontu) ja lupiinista (Haags Blaue) määritettiin mahdollisen lipaasi-
entsyymin aktiivisuuden seurauksena vapaiden rasvahappojen muodostumista ja määriä.
Vapaiden rasvahappojen muodostumista analysoitiin HPLC-ELSD-menetelmällä Lammen
ym. (2015) mukaisesti. Molemmista palkokasvijauhosta valmistettiin kaksi uutetta ja
jokaisesta uutteesta valmistettiin inkuboidut näytteet kahtena rinnakkaisena ja inaktivoidut
vertailunäytteet näytteet kerran.
46
Ultrasentrifugaalisella myllyllä jauhettuja palkokasvijauhoja punnittiin tarkasti (~0,5 g) ja
jauhot suspendoitiin veteen (20 ml). Suspensiota inkuboitiin 15 minuuttia. Suspensiot
sentrifugattiin nopeudella 10000 g 10 minuutin ajan, minkä jälkeen uutteet kerättiin talteen
säilyttäen niitä jäissä. Substraattina tässä kokeessa toimi trilinoleiini eli linolihapon
triglyseridi, josta valmistettiin pitoisuudeltaan 10 mM liuos. Substraattiliuoksen valmistus
on kuvattu tarkemmin edellä. Näytteiden inkuboinnissa puskuria, uutetta ja substraattia
inkuboitiin 10 minuuttia 30°C:ssa, jonka jälkeen entsymaattisen hapettumisreaktion
pysäyttämiseen käytettiin ensimmäisessä koesarjassa metanolia ja toisessa koesarjassa 1 M
suolahappoa.
Inkuboiduista seoksista uutettiin lipidit dietyylieetterin avulla erotussuppiloihin, joissa
seoksia pestiin kylläisellä NaCl:n vesiliuoksella. Faasien erottumisen jälkeen alemmat
suolaliuokset laskettiin erotussuppiloista pois ja ylemmät, lipidejä sisältävät
dietyylieetterifaasit, siirrettiin kvantitatiivisesti pyörökolveihin. Dietyylieetteri haihdutettiin
pois pyöröhaihduttimen avulla ja lipidijäännökset liuotettiin uudelleen heptaaniin siirtäen
samalla jäännökset kvantitatiivisesti mittapulloihin. Mittapullot täytettiin merkkiin saakka ja
näytteet suodatettiin HPLC-analyysiä varten. HPLC-analyysissä näytteiden
triasyyliglyserolit ja vapaat rasvahapot erotettiin diolikolonnin avulla käyttäen
gradienttiajoa. Ajoliuoksena toimi heptaani, joka sisälsi 0,1 % etikkahappoa ja kasvavat
määrät isopropanolia (alussa 0,06 %, lopussa 2 %). Ajoliuosten virtaus oli 0,5 ml/min.
Tarkemmat tiedot HPLC-ELSD-ajon gradienteista on esitetty liitteessä 3.
Näytteet kvantitoitiin ulkoisia standardeja vastaan ja ulkoisina standardeina toimivat
linolihappo sekä trilinoleiini. Standardit valmistettiin heptaaniin kantaliuoksista
laimentamalla siten, että linolihapon ja trilinoleiinin pitoisuudet olivat ~ 50 ng/µl (Standardi
1) ja ~ 5 ng/µl (Standardi 2). Standardien avulla luotiin kalibraatiosuora kattaen
lipidipitoisuudet välillä 20-1500 ng.
47
3.9 Härkäpavun ja lupiinin entsymaattisessa hapettumisessa muodostuvien
hydroperoksidien analysointi NP-HPLC-DAD-menetelmällä
Härkäpavun ja lupiinin entsymaattisten hapettumisreaktiosarjojen primääristen
hapettumistuotteiden, hydroperoksidien, osoittamiseen käytettiin Nuñezin ym. (1995)
menetelmää hieman muunnellen. 13- ja 9-hydroperoksidien analysoinnissa käytettiin
normaalifaasi-nestekromatografia, jossa detektorina toimi diodirividetektori (NP-HPLC-
DAD-laitteisto).
Ultrasentrifugaalisella myllyllä jauhettuja palkokasvijauhoja punnittiin tarkasti (~0,5 g).
Jauhot suspendoitiin veteen (20 ml) ja suspensiota inkuboitiin 15 minuuttia
huoneenlämmössä. Suspensiot sentrifugattiin nopeudella 10000 g 10 minuutin ajan, jonka
jälkeen uutteet kerättiin talteen säilyttäen niitä jäissä. Linolihapon kantaliuoksesta
valmistettiin 10 mM substraattiliuos samalla tavoin kuin edellä on mainittu. Puskuria,
substraattia ja entsyymiuutetta inkuboitiin 10 minuutin ajan 30 °C:ssa, minkä jälkeen reaktio
pysäytettiin 150 µl:lla 1 M HCl:a tehden seos happamaksi. Happamuus tarkistettiin pH-
paperilla ja se säädettiin arvoon ~ 3. Seosten inkuboiduttua ne siirrettiin kvantitatiivisesti
suurempiin putkiin, joissa hydroperoksidit uutettiin dietyylieetterillä. Dietyylieetterillä
uutettuja seoksia pestiin kylläisellä NaCl:n liuoksella erotussuppiloissa, minkä jälkeen
faasien annettiin erottua. Alemmat faasit laskettiin pois ja ylemmät, hydroperoksidit
sisältävät dietyylieetterifaasit, laskettiin pyörökolveihin. Dietyylieetterit haihdutettiin pois
pyöröhaihduttimella, kunnes näytteet olivat kuivia. Näytteet liuotettiin uudelleen heptaaniin
ja ne suodatettiin NP-HPLC-DAD-analysointia varten.
Hydroperoksidien esiintymistä palkokasvinäytteissä todennettiin konjugoituneiden dieenien
avulla. Käytössä ollut diodirividetektori asetettiin tarkkailemaan spektrejä aallonpituudella
190-600 nm mitaten absorptiota aallonpituudella 234 nm. Käytetyn gradienttiajon
ajoparametrit poikkesivat vain hieman vapaiden rasvahappojen analyysissä käytetystä
gradienttiajosta. Gradientteina toimivat heptaanin ja etikkahapon (0,1 %) liuos (gradientti
A) sekä heptaanin ja isopropanolin (2 %) liuos (gradientti B). Gradienttien virtaukset olivat
0,5 ml/min. Tarkemmat tiedot HPLC-DAD-ajon gradienteista on esitetty liitteessä 3.
48
4 TULOKSET
4.1 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin pH-optimin määrittäminen
Kokeellisen työn aluksi määritettiin lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden optimi-pH. Tätä
koetta varten härkäpapu- ja lupiinijauhoista saatuja uutteita inkuboitiin
linolihapposubstraattia sisältävissä eri pH-arvoisissa seoksissa ja mitattiin linolihaposta
syntyneiden hydroperoksidien määrää UV/VIS-spektrofotometrisesti.
Molemmilla palkokasvimatriiseilla lipoksigenaasientsyymin aktiivisuus oli suurin pH:ssa 6,
kuten kuvassa 6 on esitetty. Edellä mainitussa pH-arvossa Kontu-härkäpavusta uutettu
lipoksigenaasientsyymin aktiivisuus oli ~295-390 µmol / (g x min), ja Haags Blaue-
lupiinista uutettuna ~350-410 µmol / (g x min). Lipoksigenaasientsyymin aktiivisuus pH-
arvoissa 5 ja 6,8 oli selvästi pienempi molemmilla palkokasvimatriiseilla ja
lipoksigenaasientsyymin aktiivisuutta ei havaittu juuri lainkaan pH-arvoissa 4 ja 8,5
härkäpavulla. Tulokset olivat hyvin samankaltaisia keskenään molemmilla
palkokasvimateriaaleilla. Rinnakkaisuutteiden välillä esiintyi hieman enemmän vaihtelua
rinnakkaisinkubaatioihin verrattuna. Joitakin uutteita jouduttiin laimentamaan
hydroperoksidien sopivan määrän aikaansaamiseksi spektrofotometristä mittausta varten.
Tarkemmat tulokset erilaisine laimennuskertoimineen lipoksigenaasientsyymin
aktiivisuuksista palkokasvimatriiseittain ovat liitteissä 1 ja 2.
49
Kuva 6. Lipoksigenaasientsyymin aktiivisuudet palkokasvimatriiseittain eri pH-arvoissa, n=9, keskiarvo ± 1
keskihajonta.
4.2 Haihtuvien yhdisteiden määrittäminen headspace-kiinteäfaasimikrouutto-
kaasukromatografia-massaspektrometrisesti ja syntyminen palkokasvinäytteisiin
4.2.1 Haihtuvien yhdisteiden määritysmenetelmän optimointi ja HS-SPME-GC-MS-
laitteiston toimivuus
Haihtuvien yhdisteiden ja aromiprofiilien muodostumisen optimointi suoritettiin
härkäpavulla (Kontu-lajike, satovuosi 2011). Optimoinnin parametreinä toimivat
substraatin, entsyymiuutteen ja puskurin määrä sekä uuttolämpötila. Parametrien
optimoinnin tarkoituksena oli löytää sellaiset reaktio-olosuhteet, jossa sekä muodostuvien
haihtuvien yhdisteiden profiilit että piikkien pinta-alat olisivat suurimmat. Taulukossa 5 on
esitetty tulokset eri optimointiparametreilla saaduista tuloksista.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
pH 4 pH 5 pH 6 pH 6.8 pH 8.5
LOX-
aktii
visu
usµm
ol/(
gx
min
)Lipoksigenaasi-entsyymin aktiivisuudet eri pH-arvoissa
härkäpapu Kontu lupiini Haags Blaue
50
Taulukko 5. Haihtuvien yhdisteiden analysoinnin optimointiin käytettyjen parametrien tulokset erilaisissa
reaktio-olosuhteissa (entsyymin lähde Kontu-härkäpapu, substraattina linolihappo).
Optimaaliset olosuhteet löytyivät substraatin ja entsyymiuutteen tilavuuksien ollessa 400 µl,
puskurin tilavuudella 2200 µl sekä agitaattorin lämpötilan ollessa 60 °C. Olosuhteiden
valinta perustui heksanaalin ja 1-okten-3-olin määrien suuruuteen, määritysten
toistettavuuteen sekä haihtuvien yhdisteiden lukumäärään. Substraattina optimoinnissa toimi
linolihappo. Uuttolämpötilan nosto 40°C:sta 60°C:een suurensi haihtuvien yhdisteiden
lukumäärää hieman. 1-okten-3-olia havaittiin vasta, kun agitaattorin lämpötila oli 50°C.
HS-SPME-GC-MS-laitteiston toimintakykyä jokaisella analyysikerralla tarkasteltiin
vaniljalla maustetulla soijamaidolla, josta analysoitiin heksanaalin sekä vanilliinin määriä.
Tarkemmat tulokset vertailunäytteiden heksanaalin ja vanilliinin määristä on esitetty kuvissa
7 ja 8. Teknisistä syistä johtuen kaasukromatografin SPME-kuitu tuli vaihtaa aina tietyn
näytemäärän analysoinnin jälkeen. Vertailunäytteiden tuloksista nähdään, että vanilliinin
määrä oli huomattavasti suurempi kuin heksanaalin määrä (taulukko 6). Kuidun vaihdot
osuivat mittauspisteiden 10-11 sekä 19-20 välille, mitkä näkyvät vertailunäytteiden
tuloksissa. Yleisesti havaittiin, että mittausten tasot laskivat selkeästi juuri ennen kuidun
Heksanaalin 1-okten-3-olin Rinnakkaisnäytteiden Tunnistettujen haihtuvienpinta-ala pinta-ala lukumäärä yhdisteiden lukumäärä
Reaktio-olosuhteet
lämpötila 40°C substraatti 200 µl 164721499 2 10entsyymi 200 µl
substraatti 400 µl 182284108 2 12entsyymi 200 µl
substraatti 200 µl 214672509 2 10entsyymi 400 µl
substraatti 400 µl 237647912 293261 2 12entsyymi 400 µl
lämpötila 50°C substraatti 200 µl 215101305 373979 2 14entsyymi 200 µl
substraatti 400 µl 227169343 917716 2 14entsyymi 200 µl
substraatti 200 µl 192416020 234745 2 14entsyymi 400 µl
substraatti 400 µl 195744376 613326 2 14entsyymi 400 µl
lämpötila 60°C substraatti 200 µl 189617706 1787828 2 14entsyymi 200 µl
substraatti 400 µl 152132578 1803322 2 14entsyymi 200 µl
substraatti 200 µl 165540321 1044001 2 13entsyymi 400 µl
substraatti 400 µl 170530407 1652303 2 14entsyymi 400 µl
51
vaihtoa. Heksanaalin määriä tarkasteltaessa mittausten toistettavuus oli selvästi parempaa
kuidun vaihdon jälkeen kuin ennen sitä. Vanilliin määrissä toistettavuus oli selvästi
huonompaa verrattuna heksanaaliin, mikä näkyy vanilliinin selvästi korkeampana
keskihajontana sekä variaatiokertoimena.
Taulukko 6. Vertailunäytteiden (vaniljalla maustettu soijamaito) tulosten tilastollinen tarkastelu.
Kuva 7. HS-SPME-GC-MS-laitteiston toimintakyvyn tarkistusta varten analysoidun vertailunäytteen
(vaniljalla maustettu soijamaito) heksanaalitulokset eri mittauspäivinä (kuidun vaihdosta indikaationa kolmio
ympyrän sijaan).
otoskoko
20
2064,7
%Piikin pinta-ala
heksanaali
vanilliini
keskiarvo keskihajonta variaatiokerroin
2875506
88031348
1165427
56939905
40,5
0100000020000003000000400000050000006000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Piik
inpi
nta-
ala
Mittauspiste
Heksanaalin määrä, vertailunäyte
52
Kuva 8. HS-SPME-GC-MS-laitteiston toimintakyvyn tarkistusta varten analysoidun vertailunäytteen
(vaniljalla maustettu soijamaito) vanilliinitulokset eri mittauspäivinä (kuidun vaihdosta indikaationa kolmio
ympyrän sijaan).
4.2.2 Haihtuvien yhdisteiden tunnistaminen härkäpapu- ja lupiininäytteistä
Härkäpapu- ja lupiinilajikkeille tunnistettiin erilaisia haihtuvien yhdisteiden profiileita,
joiden pääasiallisina yhdisteryhminä olivat erilaiset alkoholit, aldehydit, ketonit sekä
furaanit. Eri palkokasvimateriaalien haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammeja on
esitetty kuvissa 9-13. Alkoholeista kiinnostavimmat ja odotetuimmat olivat heksanoli ja sen
isomeerit sekä 1-okten-3-oli. Kaikki kromatogrammeista tuloksiin poimitut haihtuvat
yhdisteet tunnistettiin NIST-kirjaston avulla ja laboratorion omien massaspektrien avulla.
Linolihapon sekä saippuoidun rypsiöljyn ollessa substraatteina suurimmat piikit eluoituvat
retentioajoilla 13,8 minuuttia, 19,9 minuuttia ja 27,8 minuuttia, jotka vastasivat heksanaalia,
2-pentyylifuraania ja nonanaalia. -linoleenihapon ollessa substraatti
kaasukromatogrammeissa oli muun muassa seuraavat yhdisteet, jotka retentoituivat 9,8
minuutin ja 16,3 minuutin kohdalla. Nämä olivat 1-penten-3-oni ja 2-heksenaali. Muutaman
edellä mainitun haihtuvan yhdisteen massaspektrit on esitetty liitteessä 6.
0
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Piik
inpi
nta-
ala
Mittauspiste
Vanilliinin määrä, vertailunäyte
53
1-okten-3-olia muodostui vain linolihapon toimiessa substraattina ja sitä muodostui kaikilla
palkokasvimatriiseilla piikkien pinta-alojen ollessa ~ 1,5-2,5 miljoonaa. 1-heksanolia tai sen
isomeerejä ei havaittu muodostuvan mistäkään substraatista tai palkokasvimatriisista.
Furaaneita muodostui vain linoli- ja α-linoleenihapon toimiessa substraatteina ja niiden
määrät piikkien pinta-aloina vaihtelivat furaanista, substraatista sekä palkokasvimatriisista
riippuen muutamasta sadasta tuhannesta noin 25 miljoonaan. Haihtuvien yhdisteiden
profiileista näytteillä havaittiin ja tunnistettiin myös erilaisia ketoneita, mutta suurimmalla
osalla palkokasvinäytteistä ketonien muodostuminen matriisiin ei ollut entsymaattisesta
hapettumisesta johtuvaa substraatin ollessa mikä tahansa. Vain muutamalla substraatilla ja
palkokasvilajikkeella havaittiin muutaman ketonin muodostumista matriisiin.
Kuva 9. Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammi: Kontu-härkäpapu, substraattina linolihappo.
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Time-->
Abundance
TIC: OM170228_07.D\data.ms
1.732 8.574 12.002
12.923
13.822
17.33617.622
18.961
19.982
20.17420.52921.05022.69922.922
23.651
23.81023.975
24.18224.28424.47724.603
27.818
27.95828.86629.04829.348
30.380
31.11131.81732.38832.780
33.986
35.10537.58939.08039.298
54
Kuva 10. Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammi: Alexia-härkäpapu, substraattina linolihappo.
Kuva 11. Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammi: Kontu-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Time-->
Abundance
TIC: OM170228_03.D\data.ms
1.768 1.814 3.405
8.566
9.948
11.99412.922
13.831
17.33217.618
18.95519.980
20.16920.52821.05522.69922.922
23.650
23.80724.18124.28324.609
27.819
27.95528.86329.04729.347
30.378
31.10631.81232.38633.141
33.986
35.10435.92636.10137.584
39.296
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Time-->
Abundance
TIC: OM170307_02.D\data.ms
1.727 1.774
8.561
9.65811.99512.91913.81515.95616.14016.29316.37717.571
17.935
18.951
19.480
19.641
19.768
21.82322.35324.09524.17224.27924.60426.197
27.83328.53129.04129.342
30.374
30.79231.10733.98135.91937.577
55
Kuva 12. Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammi: Alexia-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
Kuva 13. Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatogrammi: Kontu-härkäpapu, substraattina saippuoitu rypsiöljy.
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Time-->
Abundance
TIC: OM170303_06.D\data.ms
1.739 1.781 1.825
8.564
9.66611.99912.93315.95816.14416.29616.381
17.575
17.941
18.963
19.484
19.648
19.776
21.82422.35323.66024.09524.18024.28424.60824.98626.203
27.835
28.53529.04829.349
30.379
30.78731.10933.98735.10435.93036.10137.586
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Time-->
Abundance
TIC: OM170327_02.D\data.ms
1.769 1.816 1.864
8.568
8.808 9.65612.920
13.811
15.96016.01716.14316.29416.37917.337
17.576
17.938
18.957
19.483
19.645
19.770
19.978
20.17020.53321.23021.57721.83122.36522.92623.04523.224
23.65224.18324.281
24.605
25.98227.432
27.823
28.53628.89229.04929.34631.75233.986
36.368
56
4.2.3 Haihtuvien yhdisteiden syntyminen härkäpapu- ja lupiininäytteissä
substraattikohtaisesti
Palkokasvinäytteistä entsymaattisesti lipoksigenaasientsyymin optimiolosuhteissa (pH 6, 30
°C, 10 minuutin inkubointi) syntyneet haihtuvat yhdisteet on esitetty alla
yksityiskohtaisemmin diagrammein sekä tekstissä substraattikohtaisesti. Kaikista haihtuvien
yhdisteiden kromatogrammeista on vähennetty inaktivoiduista vertailunäytteistä havaitut
haihtuvien yhdisteiden määrät, jotka on esitetty liitteessä 4. Haihtuvien yhdisteiden
tuloksista piikkien pinta-alojen keskiarvot, keskihajonnat sekä arvojen vaihteluvälit on
esitetty substraattikohtaisesti liitteessä 5.
Linolihapon toimiessa substraattina, haihtuvien yhdisteiden kirjo käsitti 12 erilaista
yhdistettä (kuva 14). Näistä yhdisteistä 11 osoittautui entsymaattisen hapettumisen
aikaansaamiksi haihtuviksi yhdisteiksi (haihtuvat yhdisteet voivat muodostua kuitenkin
hydroperoksideista entsymaattisesti, kemiallisesti tai niiden yhdistelmällä). Yhdisteryhmistä
varsinkin erilaisia aldehydejä ja furaaneita esiintyi. Aldehydeistä heksanaalia muodostui
eniten piikkien pinta-alojen ollessa 80-150 miljoonaa, mutta myös esimerkiksi heptanaalia
ja pentanaalia todettiin muodostuvan. Furaaneista 2-pentyylifuraania muodostui myös
runsaasti piikkien pinta-alojen ollessa 6-25 miljoonaa, kun taasen 2-butyylifuraania ei
muodostunut läheskään niin paljoa. Ketoneista 2-heptanonin piikkien pinta-alat olivat 3-6,5
miljooonaa. Vain 3-heptanoni osoittautui ei-entsymaattisen hapettumisen aikaansaamaksi
yhdisteeksi matriisissa. Eri härkäpapulajikkeiden kesken haihtuvien yhdisteiden määrät
olivat keskenään hyvinkin samanlaisia, heksanaalin ja 2-pentyylifuraanin määrissä oli
kuitenkin hieman enemmän eroavaisuuksia. Heksanaalia ja 2-pentyylifuraania muodostui
eniten Alexia-härkäpavulla sekä Boruta-lupiinilla. 2,4-nonadienaalia muodostui hieman
enemmän härkäpavuilla kuin lupiineilla. Lupiinilajikkeiden kesken haihtuvien yhdisteiden
määrissä oli suurimmat vaihtelut heksanaalilla, jota Boruta tuotti noin 1,5-kertaisesti Haags
Blaueen nähden. Verrattaessa yleisesti härkäpapu- sekä lupiinimatriiseja keskenään
härkäpapumatriisit tuottivat haihtuvista yhdisteistä 2-pentyylifuraania sekä 2,4-
nonadienaalia enemmän kuin lupiinimatriisit haihtuvien yhdisteiden kirjon ollessa täysin
sama palkokasvimatriisien kesken.
57
Kuva 14. Entsymaattisesti syntyneiden haihtuvien yhdisteiden määrät piikkien pinta-aloina, substraattina
linolihappo, rinnakkaisnäytteiden määrä jokaista palkokasvimatriisia kohden n=4, keskiarvo ± 1 keskihajonta.
Härkäpapulajikkeita ovat Kontu, Fatima, SSNS ja Alexia, kun taas lupiinilajikkeita ovat Haags Blaue (HB)
sekä Boruta.
-2,0E+07
0,0E+00
2,0E+07
4,0E+07
6,0E+07
8,0E+07
1,0E+08
1,2E+08
1,4E+08
1,6E+08
1,8E+08
Kontu Fatima SSNS Alexia HB Boruta
Piik
inpi
nta-
ala
pentanaali heksanaali 2-butyylifuraani 2-heptanoni
heptanaali 2-pentyylifuraani 2-heptenaali 1-okten-3-oli
oktanaali nonanaali 2,4-nonadienaali
58
α-linoleenihapon toimiessa substraattina haihtuvien yhdisteiden kirjo käsitti 13 erilaista
yhdistettä (kuva 15). Palkokasvilajikkeesta riippuen entsymaattisen hapettumisen
aikaansaamiksi yhdisteiksi todettiin 4-8 kappaletta. Kuten linolihapon toimiessa
substraattina, α-linoleenihapolla muodostui myös laaja joukko erilaisia aldehydejä.
Ketoneita, alkoholeja sekä furaaneita esiintyi myös. Furaaneista todettiin esiintyvän vain 2-
etyylifuraania piikkien pinta-alojen ollessa vain muutama satatuhatta, kun taas 2-
pentyylifuraania ei todettu esiintyvän missäkään näytteessä. Aldehydeistä heksanaali ja 2-
heksenaali olivat määrällisesti hallitsevia piikkien pinta-alojen ollessa muutaman miljoonan
luokkaa, kun taasen esimerkiksi oktanaalia todettiin vähäisiä määriä esiintyvän verrattaessa
muihin aldehydeihin. Heksanaalin määrät eivät olleet kuitenkaan aivan niin vallitsevia, kuin
linolihapon toimiessa substraattina. Heksanaalia ei todettu esiintyvän, kun näytematriisina
olivat lupiinit. Ketoneista 1-penten-3-onia sekä 3,5-oktadieeni-2-onia havaittiin kaikilla
näytematriiseilla. Piikkien pinta-alat 1-penten-3-onilla olivat myös muutaman miljoonan
luokkaa. Alkoholeista entsymaattisen hapettumisen tuotteeksi todettiin 1-penten-3-oli,
minkä piikkien pinta-alat olivat muutamasta sadasta tuhannesta miljoonaan. Härkäpavuista
Kontu tuotti selvästi eniten nonanaalia. mitä ei esiintynyt läheskään niin paljon muissa
palkokasveissa. 2-heksenaalin määrä oli lähes samanlainen palkokasvista ja lajista
riippumatta Boruta-lupiinia lukuunottamatta. 3,5-oktadieeni-2-onin määrä oli myös lähes
sama kaikilla palkokasveilla ja lajikkeilla. SSNS-härkäpavun sekä Alexia-härkäpavun
väliset tulokset haihtuvien yhdisteiden määrissä olivat lähes identtiset verrattuna muihin
härkäpapuihin. Lupiinilajikkeiden välillä haihtuvien yhdisteiden määrissä oli selvästi
suuremmat erot varsinkin 1-penten-3-olin, 1-penten-3-onin (Boruta tuotti tuplaten Haags
Blaueen nähden) sekä 2-heksenaalin välillä (Haags Blaue tuotti huomattavasti Borutaa
enemmän). Verrattaessa palkokasveja keskenään lupiineilla muodostui selvästi enemmän
1-penten-3-onia sekä sen vastaavaa alkoholia eli 1-penten-3-olia kuin härkäpavuilla.
Palkokasvimatriisien välillä haihtuvien yhdisteiden kirjo oli hyvin samanlainen Boruta-
lupiinia lukuunottamatta.
59
Kuva 15. Entsymaattisesti syntyneiden haihtuvien yhdisteiden määrät piikkien pinta-aloina, substraattina
linoleenihappo, rinnakkaisnäytteiden määrä jokaista palkokasvimatriisia kohden n=4, keskiarvo ± 1
keskihajonta. Härkäpapulajikkeita ovat Kontu, Fatima, SSNS ja Alexia, kun taas lupiinilajikkeita ovat Haags
Blaue (HB) sekä Boruta.
Linolihapon triglyseridin eli trilinoleiinin toimiessa substraattina haihtuvien yhdisteiden
kirjo väheni 8 kappaleeseen (kuva 16). Inkuboimattomien vertailunäytteiden tulosten
vähentämisen jälkeen palkokasvilajikkeesta sekä rinnakkaisnäytteistä riippuen
entsymaattisen hapettumisen aikaansaamiksi yhdisteiksi todettiin 5-6 kappaletta. Lisäksi
-4,0E+06
-2,0E+06
0,0E+00
2,0E+06
4,0E+06
6,0E+06
8,0E+06
1,0E+07
Kontu Fatima SSNS Alexia HB Boruta
Piik
inpi
nta-
ala
2-etyylifuraani 1-penten-3-oni 1-penten-3-oli heksanaali
2-heksenaali 3-heptanoni 2-oktanoni oktanaali
nonanaali 3,5-oktadieeni-2-oni
60
molemmilla lupiineilla muutamien haihtuvien yhdisteiden osalta tulokset
rinnakkaisnäytteiden välillä poikkesivat toisistaan siten, että joissain rinnakkaisnäytteissä
tiettyjä haihtuvia yhdisteitä havaittiin ja toisissa ne puuttuivat. Tällöin tulos näiden
yhdisteiden osalta tietyillä palkokasveilla jäi epäselväksi. Aldehydien ja ketonien lisäksi
kaikilla palkokasvimatriiseilla muodostui entsymaattisen hapettumisen seurauksena
alkoholeihin kuuluvaa 3-heptanolia. Verrattaessa palkokasvikohtaisesti heksanaalin määrä
oli aika samanlainen härkäpavuilla, mutta lupiineista Haags Blaue tuotti heksanaalia noin
puolet Borutaan verrattuna. Haihtuvien yhdisteiden kirjo palkokasvimatriisien välillä oli
samanlaista, mutta lupiinimatriisit tuottivat härkäpapumatriiseihin verrattuna enemmän
heksanaalia.
61
Kuva 16. Entsymaattisesti syntyneiden haihtuvien yhdisteiden määrät piikkien pinta-aloina, substraattina
trilinoleiini, rinnakkaisnäytteiden määrä jokaista palkokasvimatriisia kohden n=4, keskiarvo ± 1 keskihajonta.
Härkäpapulajikkeita ovat Kontu, Fatima, SSNS ja Alexia, kun taas lupiinilajikkeita ovat Haags Blaue (HB)
sekä Boruta.
Verrattaessa haihtuvien yhdisteiden määriä linolihapon sekä trilinoleiinin (linolihapon
triglyseridin) kesken linolihappo tuotti huomattavasti enemmän haihtuvia yhdisteitä
määrällisesti sekä lukumääräisesti palkokasvista sekä palkokasvilajikkeesta riippumatta.
-1,0E+07
0,0E+00
1,0E+07
2,0E+07
3,0E+07
4,0E+07
5,0E+07
6,0E+07
7,0E+07
Kontu Fatima SSNS Alexia HB Boruta
Piik
inpi
nta-
ala
2-heptanoni 3-heptanoni 3-heptanoli heksanaali
heptanaali 3-oktanoni 2-oktanoni oktanaali
62
Heksanaali oli edelleen suurin yhdiste määrällisesti jokaisella palkokasvilajikkeella.
Linolihapon toimiessa substraattina heksanaalien määrät olivat keskimäärin 10-kertaiset
verrattuna trilinoleiinin tuloksiin.
Rypsiöljyn toimiessa substraattina haihtuvien yhdisteiden määrä oli vähäisin, 7 kappaletta
(kuva 17). Näistä 7 kappaleesta haihtuvia yhdisteitä entsyymien avulla syntyneiksi todettiin
0-7 kappaletta. Boruta-lupiinilla ei havaittu yhtään haihtuvia yhdisteitä, kun taas joillakin
härkäpapulajikkeilla havaittiin kaikki 7 kappaletta entsyymien avulla muodostuneiksi
haihtuviksi yhdisteiksi. Aldehydeistä entsymaattisen hapettumisen seurauksena
muodostuneista haihtuvista yhdisteistä todettiin heksanaali, heptanaali, oktanaali sekä
nonanaali. Ketoneista aikaisemmin todentamattomat 3-heptanoni sekä 2-heptanoni todettiin
muodostuvan entsymaattisen hapettumisen seurauksena kaikilla palkokasvimatriiseilla
lukuunottamatta Boruta-lupiinia. Verrattaessa palkokasvikohtaisesti haihtuvien yhdisteiden
määriä tulokset olivat hyvin samanlaisia palkokasvimatriisien kesken. Härkäpapulajikkeilla
haihtuvien yhdisteiden määrät olivat kaikilla hyvin samanlaiset Alexia-härkäpavun
tuottaessa eniten nonanaalia ja Kontu-härkäpavun eniten heksanaalia. Vertailua
lupiinilajikkeiden välillä on mahdotonta tehdä, koska Boruta-lupiini oli kyvytön tuottamaan
rypsiöljystä haihtuvia yhdisteitä entsymaattisesti.
63
Kuva 17. Entsymaattisesti syntyneiden haihtuvien yhdisteiden määrät piikkien pinta-aloina, substraattina
rypsiöljy, rinnakkaisnäytteiden määrä jokaista palkokasvimatriisia kohden n=4, keskiarvo ± 1 keskihajonta.
Härkäpapulajikkeita ovat Kontu, Fatima, SSNS ja Alexia, kun taas lupiinilajikkeita ovat Haags Blaue (HB)
sekä Boruta.
Saippuoidun rypsiöljyn toimiessa substraattina haihtuvien yhdisteiden määrä todettiin
molemmilla palkokasvinäytteillä olevan 12 kappaletta, joista Kontu-härkäpavulla kaikki 12
yhdistettä todettiin entsymaattisen hapettumisen aikaansaamiksi (kuva 18). Haags Blaue-
lupiinilla entsymaattisen hapettumisen aikaansaamiksi yhdisteiksi todettiin 8 yhdistettä.
Molemmilla palkokasvinäytteillä muodostui paljon aldehydejä, kuten esimerkiksi
heksanaalia, nonanaalia, oktanaalia, 2-oktenaalia sekä 2-heptenaalia. Ketoneista 2-
heptanonia muodostui molemmilla palkokasvinäytteillä, kun taas 3-heptanonia muodostui
vain Kontu-härkäpavulla. Kontu-härkäpapu muodosti ainoaa furaania, 2-pentyylifuraania.
Alkoholeista 1-penten-3-olia muodostui molemmista palkokasvimatriiseista, kun taas 1-
okten-3-olia muodostui vain Kontu-härkäpavulla. Molemmilla palkokasvimatriiseilla
heksanaali ja nonanaali olivat määrällisesti hallitsevimpia haihtuvia yhdisteitä. Lisäksi 2-
pentyylifuraani oli Kontu-härkäpavulla vallitsevassa asemassa määrällisesti. Verrattaessa eri
palkokasvimatriiseja keskenään Kontu-härkäpapu tuotti heksanaalia Haags Blaue-lupiiniin
verrattuna lähes tuplaten. Nonanaalin määrä oli molemmilla palkokasvilla identtinen, kun
-1,0E+06
0,0E+00
1,0E+06
2,0E+06
3,0E+06
4,0E+06
5,0E+06
6,0E+06
Kontu Fatima SSNS Alexia HB
Piik
inpi
nta-
ala
3-heptanoni heksanaali 2-heptanoni heptanaali 2-oktanoni nonanaali oktanaali
64
taas Kontu-härkäpapu tuotti 2-pentyylifuraania ja Haags Blaue-lupiini taas ei. Haihtuvien
yhdisteiden vertailussa palkokasvimatriisien välillä härkäpapu Kontu tuotti selvästi
enemmän heksanaalia sekä 2-pentyylifuraania kuin lupiini Boruta.
Kuva 18. Entsymaattisesti syntyneiden haihtuvien yhdisteiden määrät piikkien pinta-aloina, substraattina
saippuoitu rypsiöljy, rinnakkaisnäytteiden määrä jokaista palkokasvimatriisia kohden n=4, keskiarvo ± 1
keskihajonta. Härkäpapulajikkeena Kontu sekä lupiinilajikkeena Haags Blaue (HB).
Rypsiöljyn sekä saippuoiden rypsiöljyn väliset tulokset haihtuvien yhdisteiden määrissä ja
lukumääräisesti ovat huomattavasti erilaiset. Saippuoinnilla oli siis merkittävä vaikutus
rypsiöljyn toimimiseen substraattina. Lukumäärällisesti saippuoitu rypsiöljy tuotti lähes
kaksinkertaisen määrän erilaisia haihtuvia yhdisteitä kuin pelkkä rypsiöljy. Yhdisteiden
määrissä merkittävin muutos tapahtui heksanaalin määrässä: rypsiöljyyn verrattuna
heksanaalia syntyi saippuoidulla rypsiöljyllä Kontu-härkäpavulla 25-kertainen määrä ja
Haags Blaue-lupiinilla 10-kertainen määrä.
0,0E+00
1,0E+07
2,0E+07
3,0E+07
4,0E+07
5,0E+07
6,0E+07
7,0E+07
Kontu HB
Piik
inpi
nta-
ala
1-penten-3-oli pentanaali heksanaali 2-heksenaali
3-heptanoni 2-heptanoni 2-pentyylifuraani 2-heptenaali
1-okten-3-oli oktanaali 2-oktenaali nonanaali
65
4.3 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden todentaminen vapaiden
rasvahappojen määrittämisellä
Tutkittaessa härkäpapu- ja lupiiniuutteiden kykyä hydrolysoida trilinoleiiniä, uutteita
inkuboitiin lipoksigenaasientsyymin optimiolosuhteissa ja hydrolyysissä vapautuneita
rasvahappoja analysoitiin nestekromatografisesti. Vapaat rasvahapot olisivat retentoituneet
kolonnista ulos ~ 7 min. kohdalla. Näin ei kuitenkaan tapahtunut, joten näytteistä ei pystytty
todentamaan lipaasientsyymin aktiivisuutta vapaiden rasvahappojen havaitsemisena.
Mahdollisuutena voidaan pitää myös rasvahappojen nopeaa reagoimista eteenpäin toisiksi
yhdisteiksi, jolloin havaitsemista ei voida huomata.
4.4 Härkäpavun ja lupiinin entsymaattisessa hapettumisessa muodostuvien
välituotteiden analysointi NP-HPLC-DAD-menetelmällä
Entsymaattisessa hapettumisessa muodostuvien hydroperoksidien analysoinnilla todistetaan
lipoksigenaasientsyymin toimivuutta palkokasvimatriiseissa. Tässä kokeessa inkuboiduista
palkokasvimatriiseista analysoitiin lipoksigenaasientsyymin avulla hapettuvien
rasvahappojen hapettumisreaktioiden tuotteita, hydroperoksideja. Tässä kyseisessä kokeessa
kiinnostuksen kohteena olivat linolihapon 9- ja 13-hydroperoksidit. α-linoleenihapon
tiedetään tuottavan myös muita hydroperoksideja, mitä ei kuitenkaan tässä kokeessa tutkittu.
Hydroperoksidiryhmän paikka molekyylissä vaikutti taas siihen, millaisia haihtuvia
yhdisteitä matriisiin syntyi.
Käytetyissä inkubointiolosuhteissa kaikissa palkokasvimatriiseissa ja näytteissä syntyi
hydroperoksideja. Hydroperoksidien isomeerit sekä niiden piikkien pinta-aloja esitetään
taulukossa 7.
66
Taulukko 7. HPLC-DAD-kokeen tulokset palkokasvimatriiseittain (n=4).
Molemmat palkokasvimatriisit muodostivat hydroperoksideja vallitsevissa olosuhteissa.
Lisäksi tässä kokeessa analysoitujen hydroperoksidien tiedetään olevan linolihapon
entsymaattisen hapettumisen välituotteita.
Koska 9-hydroperoksidien molemmat isomeerit eluoituivat samanaikaisesti, vertailua
yksittäisten 13- ja 9-hydroperoksidien välillä on mahdotonta tehdä Kontu-härkäpavun osalta.
Yleisesti voidaan kuitenkin todeta, että Kontu-härkäpapu tuotti linolihapon toimiessa
substraattina noin kaksinkertaisen määrän 13-hydroperoksideja kuin 9-hydroperoksideja.
Kontu-härkäpavun lipoksigenaasientsyymi tuotti 13-hydroperoksidin trans-cis-isomeeriä
noin neljä kertaa enemmän trans-trans-isomeeriin verrattuna. Kontu-härkäpavulla trans-cis-
13-hydroperoksidia muodostui saman verran kuin kaikkia muita hydroperoksideja yhteensä.
Haags Blaue-lupiinin lipoksigenaasin nähtiin tuottavan linolihaposta vain 13-
hydroperoksidia.
Hydroperoksidi Retentioaika (min) Piikin pinta-ala
Kontu trans-cis-13-OOH ~ 20,65 652969
trans-trans-13-OOH ~ 22,10 132806
trans-cis-9-OOH ~ 23,95 463007
HaagsBlaue trans-cis-13-OOH ~ 21,05 1688297
trans-trans-9-OOH
67
5 POHDINTA
5.1 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasientsyymin pH-optimin ja aktiivisuuden
arviointi
Härkäpavulle ja lupiinille määritetyissä lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden tuloksissa
esiintyi sisäisesti todella vähän vaihtelua rinnakkaisnäytteiden ollessa hyvin samankaltaisia
keskenään kussakin pH-arvossa. Vaihtelua esiintyi näytesarjojen välillä todella vähän.
Tuloksille toistettavuutta toivat rinnakkaisnäytteet, joiden tulokset olivat keskenään hyvin
samankaltaisia. Palkokasvien välillä lipoksigenaasientsyymin aktiivisuustulokset pH:ssa 5
ja 6 eivät poikenneet paljoa, kun taasen pH:ssa 6,8 härkäpavun lipoksigenaasi osoitti
enemmän aktiivisuutta lupiinin lipoksigenaasiin nähden. Tuloksista voidaan yleistävästi
kuitenkin todeta, että härkäpavulla ja lupiinilla on luokan 2 lipoksigenaasientsyymejä (pH-
optimi alueella 6-7). (Maccarone ym. 1994).
Tässä tutkimuksessa härkäpavulle saatu lipoksigenaasientsyymin aktiivisuusoptimi pH-
arvossa ~6 on linjassa Clementen ym. (2000) saamiin tuloksiin härkäpavun
lipoksigenaasientsyymin pH-aktiivisuusoptimin ollessa 5,6-5,8 kahdelle eri lipoksigenaasin
isoentsyymille. Myös Al-Obaidy ja Siddioi (1981) ovat tutkineet härkäpavun
lipoksigenaasientsyymin aktiivisuutta todeten sen olleen korkeimmillaan pH-arvossa ~6,0.
Tätä ennen Eskin ja Henderson (1974) totesivat omassa tutkimuksessaan härkäpavun
lipoksigenaasientsyymin olevan aktiivisimmillaan pH-arvossa ~6,5 mainiten lisäksi
aktiivisuuden olevan mitätöntä pH:ssa 8,2 sekä hyvin pientä pH:ssa 5,2. Lupiinien
lipoksigenaasientsyymien aktiivisuuksista ei ole paljoa kirjallisuustietoa, mutta Gwóźdź ja
Rucińska (2005) totesivat keltalupiinissa lipoksigenaasientsyymin olevan aktiivisimmillaan
pH:ssa ~7,0.
Vaikka saadut lipoksigenaasientsyymin pH-aktiivisuusoptimi-tulokset ovat selkeät ja
erittäin hyvin linjassa aikaisempiin tutkimustuloksiin, pH-arvoja olisi voinut olla muutama
piste lisää tässä tutkimuksessa. Tällä olisi saatu aikaan tietoa riskeistä
lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden laskuun, jos pH-yksikön muutos olisi ollut vaikkapa
vain 0,5-yksikköä suuntaansa.
68
5.2 Haihtuvien yhdisteiden muodostumisen seurannan arviointi ja tunnistus
headspace-kiinteäfaasimikrouutto-kaasukromatografia-massaspektrometrisesti
Haihtuvien yhdisteiden muodostumisen seurannassa HS-SPME-GC-MS-laitteiston
toimintakykyä tarkastettaessa vertailunäytteiden analysointi tuotti selkeän tuloksen:
laitteisto oli jokaisella analyysikerralla toimintakykyinen. Laitteiston suuren käytön vuoksi
SPME-kuidun vaihto ja kunnostus tulee suorittaa muutaman sadan analyysin jälkeen. Tätä
analyysikokonaisuutta suoritettaessa kuitu oli vaihdettu laitteistoon muutaman kerran ja
kunnostettu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viimeisiä uusintanäytteitä analysoitaessa
viimeisen kuidun vaihdon yhteydessä kuitenkin huomattiin selkeät erot edellisiin samojen
näytteiden tuloksiin, vaikka parametrit ja sekvenssit olivat aivan samanlaiset. Tämä selittää
sen, että kuidun vaihdolla ja kunnostuksella on merkitystä tuloksiin sekä toisaalta sen, että
jokainen kuitu on oma yksilönsä. Inaktivoitujen vertailunäytteiden taustat saattoivat
vaikuttaa siihen, miksi joskus havaittiin entsymaattisesti syntyneitä haihtuvia yhdisteitä ja
joskus ei.
Varsinaisten näytteiden analysoinnissa sekä härkäpavulla ja lupiinilla havaittiin
lajikekohtaisia eroja eri haihtuvien yhdisteiden suhteen. Eroavaisuudet koskivat niin
yhdisteiden kirjoa kuin yhdisteiden piikkien pinta-alojen kokoa. Substraattikohtaisia eroja
oli havaittavissa selvästi: yksittäiset rasvahapot (linoli- sekä α-linoleenihappo) tuottivat
laajemman kirjon haihtuvia yhdisteitä kuin esimerkiksi rypsiöljy tai trilinoleiini. Tämä oli
selvästi havaittavissa esimerkiksi linolihapon ja trilinoleiinin toimiessa substraattina.
Linolihapon ja α-linoleenihapon substraattispesifisyys käy ilmi Gigot’n ym. (2010)
artikkelin kuvasta, jossa luetellaan erilaisia ja spesifisiä haihtuvia yhdisteitä edellä
mainituista rasvahapoista. Lajikekohtaista rinnakkaisnäytteiden vaihtelua haihtuvien
yhdisteiden profiilien osalta oli havaittavissa huomattavasti enemmän substraatin
muuttuessa monimutkaisemmaksi. Jotkin tulokset olivat epäselviä tarkasteltaessa
lajikekohtaisesti tiettyjä palkokasveja, koska osassa mittauksia haihtuvia yhdisteitä
havaittiin ja osassa ei. Rypsiöljy oli substraateista huonoin tuottaen kaikista vähiten
haihtuvia yhdisteitä. Tämä selittyy rypsiöljyn lipidien koostumuksella: suurin osa rypsiöljyn
lipideistä esiintyy triasyyliglyseroleina, jotka ovat huonoja substraatteja lipoksigenaasille.
Toisaalta substraattiliuoksessa käytetyn emulgaattorin Tween 20:n määrä saattoi olla
69
riittämätön rypsiöljyn rasvan määrään verrattuna, jolloin emulsion muodostuminen saattoi
olla epätäydellistä.
Haihtuvien yhdisteiden lukumäärää sekä määriä saatiin rypsiöljyn tapauksessa kasvatettua
rypsiöljyn saippuoinnilla, jossa hydrolyysireaktioissa triasyyliglyserolit oli ensin muutettu
glyseroliksi sekä rasvahapon suoloiksi. Saippuoitumisella oli merkittävä vaikutus rypsiöljyn
toimimiseen substraattina, koska saippuoitu rypsiöljy tuotti heksanaalia Kontu-härkäpavulla
25-kertaisen määrän ja Boruta-lupiinilla 10-kertaisen määrän tavalliseen rypsiöljyyn
verrattuna. Koska heksanaalia oli enemmän saatavilla jatkoreaktioita varten, saippuoidun
rypsiöljyn palkokasvikohtaiset haihtuvien yhdisteiden profiilit olivat moninaisempia
tavallisen rypsiöljyn haihtuvien yhdisteiden profiileihin verrattuna.
Palkokasvilajikekohtaisesti tarkasteltaessa saippuoitu rypsiöljy oli parempi substraatti
Kontu-härkäpavulla kuin Boruta-lupiinilla.
Tarkasteltaessa yksittäisiä haihtuvia yhdisteitä heksanaalilla ja sen määrällä oli
substraattikohtaisesti eniten vaihtelua: yksinkertaisen (linolihappo) ja monimutkaisemman
(trilinoleiini) substraatin toimiessa erot olivat 10-kertaisia. Heksanaali havaittiin muutenkin
hyvin dominoivaksi yhdisteeksi näytematriisista riippumatta. Heksanaalin vallitsevuus ja
suuret määrät selittyvät sen toimimisesta alkureaktiotuotteena monien muiden
sekundääristen haihtuvien yhdisteiden muodostumisessa. Linolihapon toimiessa
substraattina heksanaalin määrän odotettiin olevan suurin haihtuvista yhdisteistä, koska
heksanaali on ensisijainen linolihapon 13-hydroperoksidin tuote. Niillä näytteillä, joilla
heksanaalia muodostui eniten, todettiin toteutetussa tutkimuksessa olevan myös laajempi
sekundääristen haihtuvien yhdisteiden kirjo verrattaessa niihin näytteisiin, joissa heksanaalia
muodostui selvästi vähemmän. Heksanaali todettiin myös Jiangin ym. (2016) sekä Oomahin
ym. (2014) tutkimuksissa olevan vallitsevassa asemassa maku- sekä hajuvirheprofiilien
muodostumisessa härkäpavulla.
HS-SPME-GC-MS-tekniikkaa on käytetty lukuisissa tutkimuksissa haihtuvien yhdisteiden
analysointiin palkokasvimatriiseista. Härkäpavun eri lajikkeiden haihtuvia yhdisteitä on
tutkittu mm. Oomahin ym. (2014) toimesta. Kyseisessä tutkimuksessa
palkokasvimatriiseille suoritettiin esikäsittelyinä vain hienonnus, erilaisten
lipidisubstraattien toimintaa ei tutkittu. Tutkimuksessa erilaisista härkäpapulajikkeista
analysoitiin mm. heksanaalia, oktanaalia, 2-heptenaalia, 1-okten-3-olia sekä 2-
70
pentyylifuraania. Vaikka entsymaattista hapettumista härkäpapumatriisissa ei suoranaisesti
tutkittu edellä mainitussa tutkimuksessa, antaa se tukea tulososiossa esitettyihin tuloksiin
palkokasvimatriisien tuottamista aromiprofiileista.
Jiang ym. (2016) ovat tutkineet myös härkäpavun haihtuvia yhdisteitä Kontu-lajikkeella HS-
SPME-GC-MS-menetelmällä. Tässä tutkimuksessa hienonnettua härkäpapujauhoja
suspensoitiin veden ja natriumatsidin seoksessa inkuboiden tunnin ajan, mutta tässäkään
tutkimuksessa ei testattu haihtuvien yhdisteiden muodostumista erilaisilla
lipidisubstraateilla. Edellä mainitussa tutkimuksessa Kontu-härkäpavusta analysoitiin mm.
heksanaalia, 2-heptanonia, 2-pentyylifuraania, 2-metyylifuraania sekä nonanaalia. Näiden
edellä mainittujen haihtuvien yhdisteiden löytyminen tukee myös tulososiossa esitettyjä
tuloksia haihtuvista yhdisteistä härkäpavulla.
5.3 Härkäpavun ja lupiinin lipaasi-entsyymin aktiivisuuden arviointi koeolosuhteissa
Lipaasientsyymin olemassaolosta palkokasvimatriiseissa indikoi vapaiden rasvahappojen
muodostuminen matriisiin hydrolysaatiossa, missä lipaasientsyymi lohkaisee
asyyliglyseroleista vapaita rasvahappoja. Tässä tutkimuksessa valikoiduilla olosuhteilla
(puskurin pH, inkubointiaika, inkubointilämpötila) kummastakaan palkokasvimatriisista ei
havaittu vapaiden rasvahappojen muodostumista tiedetyillä retentioajoilla HPLC-ELSD-
menetelmää apuna käyttäen. Tämä tulos ei välttämättä kerro, etteikö aktiivisuutta olisi.
Rasvahappojen esiintyessä myös anionisissa muodoissa havaittiin koetta tehdessä metanolin
olevan vain vaihtoehtoinen reagenssi entsymaattisen hapettumisreaktion pysäyttämiseksi.
Tästä syystä koe toistettiin täysin samalla tavalla, mutta entsymaattisen hapettumisen
pysäyttämiseksi käytettiin suolahappoa. Tästäkään huolimatta lipaasientsyymin aktiivisuutta
ei havaittu kummallakaan palkokasvimatriisilla. Tästä tehtiin johtopäätös, että kyseisissä
olosuhteissa lipaasientsyymi ei ole aktiivinen tutkituissa palkokasvimatriiseissa. Saatu tulos
on kuitenkin yhteneväinen Dundasin ym. (1978) tutkimuksen kanssa, jossa härkäpavun
lipaasientsyymin aktiivisuus oli suurin pH-arvossa 8,5. Myös Eskin ym. (1981) totesivat
tutkimuksessaan härkäpavun lipaasin olevan aktiivinen pH-alueella 6,5-9 aktiivisuusoptimin
ollessa pH:ssa 8,5. Lupiinin lipaasiaktiivisuuden Hassanien ja Mukherjee (1986) ovat
todenneet olevan suurimmillaan pH:ssa 8,5 auringonkukkaöljyn toimiessa substraattina.
71
Spektrofotometrisesti analysoitaessa lipaasientsyymin aktiivisuutta Yang ym. (2017)
totesivat härkäpavussa sitä olevan, joten tässä pro gradussa tehdyn lipaasin aktiivisuus-
kokeen tulokset valitulla analyysimenetelmällä eivät ole linjassa muilla
analyysimenetelmillä saatuihin tuloksiin.
Härkäpavun ja lupiinin lipaasia on tutkittu erittäin vähän, mutta saadut tulokset
kirjallisuudesta viittaavat molempien edellä mainittujen palkokasvien lipaasien toimivan
hieman emäksisissä pH-arvoissa. Yhtenä vaihtoehtona ja mahdollisena selityksenä vapaiden
rasvahappojen havaitsemattomuudelle on niiden reagoiminen uudelleen ja muuntuminen
joksikin muiksi yhdisteiksi nopeasti.
Elintarvikkeiden ollessa monimutkaisia matriiseja juuri tietyn entsyymin aktiivisuus on
selvästi riippuvainen matriisissa olevien muiden komponenttien kemiallisista sekä
fysikaalisista ominaisuuksista. Prosessoinnin vaikutuksesta esimerkiksi lämpötila kasvaa
matriisissa esimerkiksi lämmitettäessä tai leikkausvoimaa lisättäessä, jolloin tiettyjen
matriisin sisältämien entsyymien aktiivisuudet paranevat. Lisäksi matriisin pH:n sattuessa
tietylle alueelle saattaa entsyymien toiminta käynnistää ja katalysoida matriisissa
monenlaisia aistinvaraisesti heikentäviä kemiallisia reaktiosarjoja. Tarkasteltaessa
palkokasvien osalta aistinvaraisen laadun heikkenemistä ja muodostuvia haihtuvien
yhdisteiden profiileita sekä lipaasilla että lipoksigenaasilla on suuret vaikutukset näihin.
Edellä mainittujen kahden entsyymin olemassaolo palkokasvimatriiseissa nostaa esiin
kysymyksen rajoittavasta tekijästä, minkä eliminoinnilla on taasen merkittävä vaikutus
aistinvaraiseen laatuun palkokasveilla.
5.4 Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasin tuottamien hydroperoksidien arviointi
Rasvahappojen entsymaattista hapettumista voidaan todentaa ja seurata muodostuvien
välituotteiden avulla. Näitä entsymaattisesti lipoksigenaasin katalysoimana
tyydyttymättömistä rasvahapoista hapettumisen avulla muodostuneita välituotteita
kutsutaan hydroperoksideiksi ja kukin rasvahappo muodostaa omanlaisensa
hydroperoksidijakauman hapettuessaan entsymaattisesti. Tämän tutkimuksen osalta
kiinnostusta herättivät varsinkin linolihapon entsymaattisessa hapettumisessa muodostuneet
72
hydroperoksidit ja niiden jatkoreaktiotuotteet johtuen linolihapon käytöstä substraattina.
Tästä kokeesta saatu tulos ei ole kovin vahva johtuen siitä, että koe tehtiin vain yhden kerran.
Yleisesti tiedetään, että kasvien lipoksigenaasientsyymit hapettavat entsymaattisesti
linolihappoa tuottaen vastaavia rasvahapon 13- ja 9-hydroperoksideja. Hydroperoksideista
muodostuu taasen muiden entsyymien, kuten esimerkiksi hydroperoksidilyaasien ja
alkoholidehydrogenaasien avulla haihtuvia yhdisteitä. Tyydyttymättömästä rasvahaposta
riippuen muodostuva haihtuvien yhdisteiden profiili kasvimatriisissa on erilainen johtuen
monenlaisista muodostuvista hydroperoksideista. Esimerkiksi linolihapon toimiessa
substraattina hydroperoksidilyaasin katalysoimana 13-hydroperoksidista muodostuu
heksanaalia ja 9-hydroperoksidista 3-nonenaalia. Vastaavasti α-linoleenihapon toimiessa
substraattina hydroperoksidilyaasin katalysoimana 13-hydroperoksidista muodostuu 3-
heksenaalia ja 9-hydroperoksidista 3,6-nonadienaalia (Grechkin 1998; Noordermeer ym.
2002; Gigot ym. 2010; Velisek 2014).
Kirjallisuusviitteitä härkäpavun ja lupiinin rasvojen entsymaattisessa hapettumisessa
muodostuvien hydroperoksidien analysoinnista ei ollut juurikaan saatavilla. Saaduista
tuloksista voidaan kuitenkin päätellä, mihin suuntaan rasvojen entsymaattisessa
hapettumisessa muodostuvat hydroperoksidit ohjaavat kemiallisia reaktioita haju- ja
makuvirheiden tuotossa kussakin palkokasvimatriisissa.
Tässä kokeessa käytettiin vain linolihappoa substraattina. Muodostuneissa haihtuvien
yhdisteiden profiileissa palkokasvimatriiseilla heksanaalin määrät olivat vallitsevia, joten
rasvahapon 13-hydroperoksidien analysointi palkokasvimatriiseista tukee haihtuvien
yhdisteiden profiileissa todettua heksanaalia ja sen määrää (Gigot ym. 2010; Velisek 2014).
Gigot’n ym. (2010) mukaan linolihapon 9-hydroperoksidista muodostuisi nonenaalin sekä
nonenolin isomeerejä ja koska edellä mainittuja haihtuvia yhdisteitä ei todettu löytyvän
tutkituista palkokasvimatriiseista linolihapon toimiessa substraattina, analysoidut
rasvahappojen 9-hydroperoksidien pienemmät määrät verrattuna 13-hydroperoksidien
määriin tukevat saatuja tuloksia haihtuviin yhdisteisiin liittyen. Koska kemiallisessa
hapettumisessa rasvahappojen 9- ja 13-hydroperoksideja muodostuu suurin piirtein samat
määrät, saadut tulokset hydroperoksidien muodostumisesta viittaavat hapettumisen olevan
entsymaattista (Frankel 2005). Toisaalta hydroperoksidien muuntumisista (hajoaminen,
73
isomeroituminen jne.) johtuen hydroperoksidien jatkoreaktiot ja sitä kautta tiettyjen
haihtuvien yhdisteiden muodostuminen matriisiin ei voi olla täysin varmaa.
Analysoiduista näytteistä Kontu-härkäpapu tuotti tasaisemmin molempia linolihapon
hydroperoksideja (9-OOH, 13-OOH), kun taas Haags Blaue-lupiini tuotti vain 13-
hydroperoksidia. Tästä voidaan päätellä, että Kontu-härkäpavusta voi tämän kokeen
perusteella muodostua monipuolisempi kirjo haihtuvia yhdisteitä, kuin Haags Blaue-
lupiinista johtuen monipuolisemmasta hydroperoksidien kirjosta Kontu-härkäpavulla.
74
6 PÄÄTELMÄT
Tämän maisterin tutkielman pääasiallisena tavoitteena kokeellisessa osassa oli tutkia kahden
palkokasvimatriisin (härkäpapu ja lupiini) lipidejä muokkaavien entsyymien ominaisuuksia
keskittyen erityisesti erilaisista lipidisubstraateista entsymaattisesti muodostuviin haihtuviin
sekundäärisiin hapettumistuotteisiin.
Kokeellisessa osassa oli osatavoitteena optimoida lipoksigenaasientsyymin toiminnan
kannalta inkubaatio-olosuhteet. Inkubaatio-olosuhteiden optimoinnin parametreiksi
valikoitui lipoksigenaasientsyymin optimi-pH sekä inkubaatioseoksen koostumus
substraatin, uutteen ja puskuriliuoksen osalta. Molemmille palkokasveille lipoksigenaasin
optimaalinen pH osoittautui olevan tutkituista pH-arvoista 6. Lipoksigenaasientsyymin
aktiivisuusoptimin määrittämisen jälkeen kaikki kokeet suoritettiin määritetyissä
olosuhteissa.
Kokeellisessa osassa pääasiallisena osatavoitteena oli tutkia haihtuvien yhdisteiden
muodostusta erilaisista lipideistä. Lipideinä käytettiin linolihappoa, α-linoleenihappoa,
linolihapon triglyseridiä (trilinoleiinia), rypsiöljyä sekä saippuoitua rypsiöljyä.
Hapettumistuotteet tunnistettiin HS-SPME-GC-MS-menetelmällä näytteistä retentioaikojen
sekä NIST-kirjastojen avulla. Vertailunäytteestä saatujen tulosten perusteella HS-SPME-
GC-MS-menetelmän tulokset haihtuvien yhdisteiden osalta olivat pääasiassa toistettavia.
HS-SPME-GC-MS-menetelmä soveltui hyvin haihtuvien sekundääristen
hapettumistuotteiden analysointiin palkokasvimatriiseista.
Molemmat palkokasvimatriisit tuottivat erilaisia haihtuvia yhdisteitä erilaisista
lipidisubstraateista. Lajikekohtaisia eroavaisuuksia esiintyi haihtuvien yhdisteiden
muodostuksessa, kun tarkasteltiin eri substraattien toimintaa. Lajikekohtaisesti haihtuvien
yhdisteiden muodostumisessa myös rinnakkaisnäytteiden välillä havaittiin hieman vaihtelua,
minkä johdosta muutamat näytesarjat analysoitiin uudelleen. Haihtuvien yhdisteiden
muodostumisessa ja niiden analysoinnissa havaittiin lipidin yksinkertaisuuden sekä
spesifisyyden olevan haihtuvien yhdisteiden profiilien monimuotoisuuden ja määrien
kannalta parempi: linolihappo, α-linoleenihappo sekä saippuoitu rypsiöljy tuottivat
suurimmat kirjot sekä määrällisesti eniten haihtuvia yhdisteitä verrattuna trilinoleiiniin tai
75
rypsiöljyyn. Pelkkä rypsiöljy todettiin huonoksi substraatiksi johtuen rypsiöljyn lipidien
esiintymisestä pääasiassa triasyyliglyseroleina.
Pienempinä osatavoitteina kokeellisessa osassa oli selvittää, tapahtuiko optimoiduissa
inkubaatio-olosuhteissa palkokasvimatriiseilla myös entsyymaattisen hapettumisketjun
aiempien vaiheiden reaktioita eli lipaasientsyymin aiheuttamaa lipidien hydrolyysiä ja
lipoksigenaasientsyymin aiheuttamaa hydroperoksidien muodostumista. Kummallakaan
palkokasvimatriiseilla ei havaittu lipaasi-entsyymin aktiivisuutta valikoiduilla olosuhteilla
ja valitulla analyysimenetelmällä. Tämä selittynee todennäköisesti sillä, että lipaasi-
entsyymin toiminnan kannalta pH:n puskuriliuoksissa tulisi olla hieman emäksisen puolella.
Tämä osuus kokeellisesta osuudesta tarvitsee lisää tutkimusta, koska tämän osan tutkimus
tässä pro gradussa ei ollut kovin kattava ja tulokset ovat ristiriidassa muihin erilaisilla
analyysimenetelmillä saatuihin tuloksiin. Lisätutkimuksen myötä osattaisiin vastata
kysymykseen lipaasi- ja lipoksigenaasientsyymien rajoittavuudesta palkokasvimatriisien
entsymaattisissa reaktioissa.
Molemmilla palkokasvimatriisilla havaittiin entsymaattisen hapettumisen alkuvaiheessa
muodostuvia välituotteita, hydroperoksideja, mitkä osoittivat ja todistivat entsymaattisen
hapettumisen kemiallista mekanismia palkokasvimatriiseissa. Vaikka tämän kokeen tulos ei
ollut kovin kattava toistojen määrältään, tulokset hydroperoksideista tukivat entsymaattisen
hapettumisen etenemistä tiettyjä kemiallisia reaktioreittejä. Saadut hydroperoksidien
tulokset tukivat myös haihtuvien yhdisteiden tuloksia siltä osin, miksi heksanaalin määrät
olivat niin suuria (johtuen 13-hydroperoksideista) sekä nonenaalin ja nonenolin määrät
hyvin pieniä (tai ei havaittu lainkaan).
Tutkimus tarjosi lisätietoa palkokasvien lipidien entsymaattisesta hapettumisesta tietyissä
olosuhteissa, missä syntyvillä haihtuvilla yhdisteillä on erittäin suuri vaikutus
palkokasvimatriisien aistinvaraiseen laatuun. Koska palkokasvimatriiseissa on useita
lipidien entsymaattiseen hapettumiseen vaikuttavia entsyymejä, olisi hyvä tutkia lisää tässä
tutkimuksessa tutkimattomien entsyymien toimintaa palkokasvimatriiseissa kyseisille
entsyymeille optimaalisimmissa olosuhteissa.
76
7 LÄHDELUETTELO
Al-Obaidy HM, Siddioi AM. 1981. Properties of broad bean lipoxygenase. J Food Sci46(2):622-625.
Axelrod B, Cheesbrough TM, Laakso S. 1981. Lipoxygenase from soybeans. EC 1.13.11.12Linoleate:oxygen oxidoreductase. Methods Enzymol 71(C):441-51.
Belitz H-D, Grosch W, Schieberle P. 2009. Food Chemistry. 4.painos. Springer: Berliini.1070 s.
Ben-Aziz A, Grossman S, Budowski P, Ascarelli I. 1971. Enzymic oxidation of caroteneand linoleate by alfalfa: Properties of active fractions. Phytochemistry 10(8):1823-30.
Boschin G, Arnoldi A. 2011. Legumes are valuable sources of tocopherols. Food Chem127(3):1199-1203.
Brecht JK, Ritenour MA, Haard NF, Chism GW. 2008. Postharvest physiology of edibleplant tissues. Teoksessa: Damodaran S, Parkin KL, Fennema OR. Fennema’s FoodChemistry. 4.painos. Boca Raton: CRC Press. s 975-1050.
Clemente A, Olías R, Olías JM. 2000. Purification and characterization of broad beanlipoxygenase isoenzymes. J Agric Food Chem 48(4):1070-1075.
Damerau A, Kamlang-Ek P, Moisio T, Lampi A-M, Piironen V. 2014. Effect of SPMEextraction conditions and humidity on the release of volatile lipid oxidation products fromspray-dried emulsions. Food Chem 157:1-9.
Damodaran S, Parkin KL, Fennema OR. 2008. Fennema’s Food Chemistry. 4.painos. BocaRaton: CRC Press. 1144 s.
Duc G. 1997. Faba bean (Vicia faba L.). Field Crops Res 53(1-3):99-109.
Duc G, Marget P, Esnault R, Le Guen J, Bastianelli D. 1999. Genetic variability for feedingvalue of faba bean seeds (Vicia faba): Comparative chemical composition of isogenicsinvolving zero-tannin and zero-vicin genes. J Agr Sci 133(2):185-196.
Dundas DGA, Henderson HM, Eskin NAM. 1978. Lipase from Vicia Faba minor. FoodChem 3(3):171-178.
Erbas M, Certel M, Uslu MK. 2005. Some chemical properties of white lupin seeds (Lupinusalbus L.). Food Chem 89(3):341-5.
Elshof MBW, Janssen M, Veldink GA, Vliegenthart JFG. Biocatalytic large-scaleproduction of 13(S)-hydroperoxy-(9Z,11E)-octadeca-9,11-dienoic acid from hydrolysedsafflower oil by a crude soybean-flour extract as lipoxygenase source. Recl. Trav. Chim.Pays-Bas 115(1):499-504.
77
Eskin NAM, Henderson HM. 1974. Lipoxygenase in Vicia faba minor. Phytochemistry13(12):2713-6.
Eskin NAM, Henderson HM, Shambrock DL. 1981. The enzymic deacylation of p-nitrophenyl esters and phosphatidylcholine in vicia faba minor. Food Chem 7(4):249-256.
Farkas DF, Goldblith SA. 1962. Studies on the Kinetics of Lipoxidase Inactivation UsingThermal and Ionizing Energy. J Food Sci 27(3):262-76.
Fauconnier M-L, Marlier M. 1996. An efficient procedure for the production of fatty acidhydroperoxides from hydrolyzed flax seed oil and soybean lipoxygenase. Biotechnol. Tech.10(1):839-844.
Food and Nutrition Board. 2000. Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E,Selenium and Carotenoids. Institute of Medicine. Washington, DC: National Academy ofSciences Press. s. 186-283.
Frankel E.2005. Lipid oxidation. 2.painos. USA: Oily Press. 488 s.
Gardner HW. 1991. Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants.Biochimica et Biophysica Acta 1084(3):221-239.
Gigot C, Ongena M, Fauconnier M-, Wathelet J-, du Jardin P, Thonart P. 2010. Thelipoxygenase metabolic pathway in plants: Potential for industrial production of naturalgreen leaf volatiles. Biotechnol Agron Soc Environ 14(3):451-60.
Gökmen V, Bahçeci S, Acar J. 2002. Characterization of crude lipoxygenase extract fromgreen pea using a modified spectrophotometric method. Eur Food Res Technol 215(1):42-5.
Grechkin A. 1998. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway.Prog Lipid Res 37(5):317-352.
Grela ER, Günter KD. 1995. Fatty acid composition and tocopherol content of some legumeseeds. Anim Feed Sci Technol 52(3-4):325-31.
Hamberg M, Fahlstadius P. 1992. On the specificity of a fatty acid epoxygenase in broadbean (Vicia faba L.). Plant Physiol 99(3):987-95.
Hamberg M, Hamberg G. 1990. Hydroperoxide-dependent epoxidation of unsaturated fattyacids in the broad bean (Vicia faba L.). Arch Biochem Biophys 283(2):409-16.
Hassanien FR, Mukherjee KD. 1986. Isolation of lipase from germinating oilseeds forbiotechnological processes. J of the Amer Oil Chem Soc 63(7):893-897.
Hatanaka A. 1993. The biogeneration of green odour by green leaves. Phytochemistry34(5):1201-18.
Hubert J, Münzbergová Z, Nesvorná M, Poltronieri P, Santino A. 2008. Acaricidal effectsof natural six-carbon and nine-carbon aldehydes on stored-product mites. Exp Appl Acarol44(4):315-21.
78
Huyghe C. 1997. White lupin (Lupinus albus L.). Field Crops Res 53(1-3):147-60.
Jiang Z, Pulkkinen M, Wang Y, Lampi A-M, Stoddard FL, Salovaara H, Piironen V, Sontag-Strohm T. 2016. Faba bean flavour and technological property improvement by thermal pre-treatments. LWT - Food Sci Technol 68295-305.
Khalil AH, Mansour EH. 1995. The effect of cooking, autoclaving and germination on thenutritional quality of faba beans. Food Chem 54(2):177-82.
Kohajdová Z, Karovicová J, Schmidt Š. 2011. Lupin composition and possible use in bakery- A review. Czech J Food Sci 29(3):203-11.
Kuroda H, Kojima H, Kaneda H, Takashio M. 2005. Characterization of 9-fatty acidhydroperoxide lyase-like activity in germinating barley seeds that transforms 9(S)-hydroperoxy-10(E),12(Z)- octadecadienoic acid into 2(E)-nonenal. Biosci BiotechnolBiochem 69(9):1661-8.
Lampi A-M, Damerau A, Li J, Moisio T, Partanen R, Forssell P, Piironen V. 2015. Changesin lipids and volatile compounds of oat flours and extrudates during processing and storage.J of Cereal Sci 62:102-109.
Lindsay RC. 2008. Flavors. Teoksessa: Damodaran S, Parkin KL, Fennema OR. Fennema’sFood Chemistry. 4.painos. Boca Raton: CRC Press. s 639-688.
Lizarazo CI, Lampi A-M, Liu J, Sontag-Strohm T, Piironen V, Stoddard F. 2014. Nutritivequality and protein production from grain legumes in a boreal climate. J Sci Food Agric95:2053-2064.
Maccarone M, van Aarle PGM, Veldink GA, Vliegenthart JFG. 1994. In vitro oxygenationof soybean biomembranes by lipoxygenase-2. Bba 1190(1):164-169.
McClements DJ, Decker EA. 2008. Lipids. Teoksessa: Damodaran S, Parkin KL, FennemaOR. Fennema’s Food Chemistry. 4.painos. Boca Raton: CRC Press. s 155-216.
Matsui K, Ujita C, Fujimoto SH, Wilkinson J, Hiatt B, Knauf V, KajiwaraT, Feussner I.2000. Fatty acid 9- and 13-hydroperoxide lyases from cucumber. FEBS Letters 481(2):183-8.
Matsui K, Minami A, Hornung E, Shibata H, Kishimoto K, Ahnert V, Kindl H, Kajiwara T,Feussner I. 2006. Biosynthesis of fatty acid derived aldehydes is induced upon mechanicalwounding and its products show fungicidal activities in cucumber. Phytochem 67(7):649-657.
Mitsuda H, Yasumoto K, Yamamoto A. 1967. Inhibition of lipoxygenase by saturatedmonohydric alcohols through hydrophobic bondings. Arch Biochem Biophys 118(3):664-9.
Noordermeer MA, Der Goot WV, Van Kooij AJ, Veldsink JW, Veldink GA, VliegenthartJFG. 2002. Development of a biocatalytic process for the production of C6-aldehydes fromvegetable oils by soybean lipoxygenase and recombinant hydroperoxide lyase. J of Agricand Food Chem 50(15):4270-4274.
79
Nuñez A, Foglia TA, Piazza GJ. 1995. Improved method for extraction of hydroperoxidelyase from chorella. Biotech Tech 9(8):613-616.
Oomah BD, Patras A, Rawson A, Narpinder S, Compos-Vega S. 2011. Chemistry of pulses.Teoksessa: Tiwari BK, Gowen A, McKenna B. Pulse Foods: Processing, quality andnutraceutical applications. 1.painos. USA: Academic Press. s 9-55.
Oomah BD, Razafindrainibe M, Drover JC. 2014. Headspace volatile components ofCanadian grown low-tannin faba bean (Vicia faba L.) genotypes. J Sci Food Agric94(3):473-81.
Parkin KL. 2008. Enzymes. Teoksessa: Damodaran S, Parkin KL, Fennema OR. Fennema’sFood Chemistry. 4.painos. Boca Raton: CRC Press. s 331-436.
Rackis JJ, Sessa DJ, Honig DH. 1979. Flavor problems of vegetable food proteins. J Am OilChem Soc 56(3):262-71.
Rodrigo D, Jolie R, Van Loey A, Hendrickx M. 2007. Thermal and high pressure stabilityof tomato lipoxygenase and hydroperoxide lyase. J Food Eng 79(2):423-429.
Rucińska R, Gwóźdź EA. 2005. Influence of lead on membrane permeability andlipoxygenase activity in lupine roots. Biol Plant 49(4):617-619.
Sanz C, Pérez AG. 2010. Plant metabolic pathways and flavor biosynthesis. Teoksessa: HuiYH. Handbook of Fruit and Vegetable Flavors. 1.painos. Hoboken: John Wiley & Sons Inc.s 129-155.
Schaich KM, Fereidoon S, Ying Z, Eskin NAM. 2013. Lipid Oxidation. Teoksessa: EskinNAM, Shahidi F. Biochemistry of Foods. 3.painos. Academic Press. s 419-478.
Sessa DJ. 1979. Biochemical aspects of lipid-derived flavors in legumes. J Agric Food Chem27(2):234-9.
Sessa DJ, Rackis JJ. 1977. Lipid-derived flavors of vegetable food proteins. J Am Oil ChemSoc 54(10):468-73.
Shiojiri K, Ozawa R, Matsui K, Kishimoto K, Kugimiya S, Takabayashi J. 2006. Role of thelipoxygenase/lyase pathway of host-food plants in the host searching behavior of twoparasitoid species, Cotesia glomerata and Cotesia plutellae. J Chem Ecol 32(5):969-79.
Siedow JN. 1991. Plant lipoxygenase: Structure and function. Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol 42(1):145-188.
Srere PA. 1984. Why are enzymes so big? Trends Biochem Sci 9(9):387-90.
Theorell H, Holman RT, Akeson A. 1947. Crystalline lipoxidase. Acta Chem Scand1(6):571-6.
80
Van Os CPA, Rijke-Schilder GPM, Vliegenthart JFG. 1978. 9-LR-linoleyl hydroperoxide, anovel product from the oxygenation of linoleic acid by type-2 lipoxygenases from soybeansand peas. Bioc Biophy Acta 575(3):479-484.
Vara-Ubol S, Chambers E, Chambers DH. 2004. Sensory characteristics of chemicalcompounds potentially associated with beany aroma in foods. J Sens Stud 19(1):15-26.
Velíšek J. 2014. The Chemistry of Food. 1.painos. Wiley-Blackwell. 1124 s.
Vick BA, Zimmerman DC. 1976. Lipoxygenase and hydroperoxide lyase in germinatingwatermelon seedlings. Plant Physilogy 57(1):780-8.
Vick BA, Zimmerman DC. 1987. Pathways of fatty acid hydroperoxide metabolism inspinach leaf chloroplasts. Plant Physiol 85(4):1073-1078.
Whitaker JR. 2002 (1). What enzymes do and why they are highly pecific and efficientcatalysts. Teoksessa: Whitaker JR, Voragen AGJ, Wong DWS. Handbook of FoodEnzymology. 1.painos. New York: Marcel Dekker. s 21-30.
Whitaker JR. 2002 (2). Enzyme-catalyzed reactions: experimental factors that affect rates.Teoksessa: Whitaker JR, Voragen AGJ, Wong DWS. Handbook of Food Enzymology.1.painos. New York: Marcel Dekker. s 31-49.
Wong DWS. 2002. Lipase. Teoksessa: Whitaker JR, Voragen AGJ, Wong DWS. Handbookof Food Enzymology. 1.painos. New York: Marcel Dekker. s 667-680.
Wu Z, Robinson DS, Domoney C, Casey R. 1995. High-performance liquidchromatographic analysis of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by pea (Pisumsativum) seed lipoxygenases. J Agric Food Chem 43(2):337-42.
Wurzenberger M, Grosch W. 1986. Enzymic oxidation of linolenic acid to 1,Z5-octadien-3-ol, Z-2,Z-5-octadien-1-ol and 10-oxo-E-8-decenoic acid by a protein fraction frommushrooms (psalliota bispora). Lipids 21(4):261-6.
Yoshida H, Tomiyama Y, Mizushina Y. 2010. Tocopherol distributions and triacylglycerolmolecular species in broad beans (Vicia faba). Food Sci Technol Res 16(5):409-16.
Yang Z, Piironen V, Lampi A-M. 2017. Lipid-modifying enzymes in oat and faba bean.Food Res Int 100:335-343.
Zhou K, Slavin M, Lutterodt H, Whent M, Eskin NAM, Yu L. 2013. Cereals and legumes.Teoksessa: Eskin NAM, Shahidi F. Biochemistry of Foods. 3.painos. Academic Press…..
Zhuang H, Barth MM, Hildebrand D. 2002. Fatty acid oxidation in plant tissues. Teoksessa:Akoh CC, Min DB. Food Lipids: chemistry, nutrition and biotechnology. 2.painos. s 431-482.
81
LIITTEET
Liite 1. Härkäpavun lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määritysten tulokset.
Näyte Laimennos pH A A (reagenssinollat) A (varsinainen) Aktiivisuus (µmol / (g x min)) Aktiivisuus (µmol / (g x min))keskiarvo
1,1 1:25 4 0,2367 0,1879 0,0487 17,78462711,2 1:25 4 0,2470 0,1881 0,059 21,5460574 19,29406841,3 1:25 4 0,2388 0,0508 18,5515206
2,1 1:25 4 0,2620 0,1919 0,07185 27,38812232,2 1:25 4 0,2578 0,1884 0,06765 25,7871465 26,14291892,3 1:25 4 0,2564 0,06625 25,2534878
3,1 1:25 4 0,2790 0,2023 0,0768 29,09619933,2 1:25 4 0,2751 0,2021 0,0729 27,6186579 29,75288443,3 1:25 4 0,2881 0,0859 32,5437958
1,1 1:25 5 0,6642 0,1957 0,4695 171,4554911,2 1:25 5 0,6201 0,1937 0,4254 155,350726 156,0689281,3 1:25 5 0,5819 0,3872 141,400567
2,1 1:25 5 0,6372 0,2094 0,43375 165,3388732,2 1:25 5 0,6241 0,1975 0,42065 160,345353 162,3148082,3 1:25 5 0,6265 0,42305 161,260197
3,1 1:25 5 0,6441 0,2022 0,44565 168,8375163,2 1:25 5 0,6494 0,1947 0,45095 170,845457 167,7767173,3 1:25 5 0,6304 0,43195 163,647178
1,1 1:25 6 1,1365 0,1122 1,02505 393,6202081,2 1:25 6 1,0896 0,1107 0,97815 375,610562 387,1305911,3 1:25 6 1,1327 1,02125 392,161004
2,1 1:25 6 1,0450 0,1217 0,92405 346,332,2 1:25 6 1,0272 0,1202 0,90625 339,658636 346,8797012,3 1:25 6 1,0672 0,94625 354,650465
3,1 1:20 6 1,0139 0,1224 0,88835 265,2226483,2 1:20 6 1,1629 0,1287 1,03735 309,707564 294,5010873,3 1:20 6 1,1591 1,03355 308,573049
1,1 1:25 6,8 0,6213 0,1264 0,4963 190,5796881,2 1:25 6,8 0,6187 0,1236 0,4937 189,581285 190,0932871,3 1:25 6,8 0,6201 0,4951 190,118887
2,1 1:25 6,8 0,6709 0,1340 0,5409 202,7270142,2 1:25 6,8 0,5045 0,1260 0,3745 140,361003 172,0437362,3 1:25 6,8 0,5917 0,4617 173,043191
3,1 1:20 6,8 0,7490 0,1364 0,615 183,6122353,2 1:20 6,8 0,7549 0,1316 0,6209 185,373718 188,5782243,3 1:20 6,8 0,7930 0,659 196,74872
1,1 1:5 8,5 0,2845 0,2816 0,0047 0,360960921,2 1:5 8,5 0,2839 0,2780 0,0041 0,31488081 0,422401081,3 1:5 8,5 0,2875 0,0077 0,59136151
2,1 1:5 8,5 0,3125 0,2998 0,014 1,049428062,2 1:5 8,5 0,3051 0,2972 0,0066 0,49473037 0,612166372,3 1:5 8,5 0,3024 0,0039 0,29234067
3,1 1:10 8,5 0,2062 0,2011 0,008 1,194225923,2 1:10 8,5 0,2043 0,1953 0,0061 0,91059726 1,174322153,3 1:10 8,5 0,2077 0,0095 1,41814328
82
Liite 2. Lupiinin lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määritysten tulokset.
Näyte Laimennos pH A A (reagenssinollat) A (varsinainen) Aktiivisuus (µmol / (g x min)) Aktiivisuus (µmol / (g x min))keskiarvo
1,1 1:25 5 0,6041 0,1512 0,45165 171,4145831,2 1:25 5 0,6185 0,1537 0,46605 176,879811 173,0212591,3 1:25 5 0,6024 0,44995 170,769383
2,1 1:25 5 0,5646 0,1541 0,41085 158,0824642,2 1:25 5 0,6026 0,1534 0,44885 172,703697 165,0980912,3 1:25 5 0,5813 0,42755 164,508111
3,1 1:25 5 0,6129 0,1624 0,44645 164,6007853,2 1:25 5 0,6017 0,1705 0,43525 160,471478 160,1273693,3 1:25 5 0,5877 0,42125 155,309845
1,1 1:25 6 1,1327 0,0959 1,03485 392,7562961,2 1:25 6 1,1779 0,0998 1,08005 409,911038 399,1576971,3 1:25 6 1,1381 1,04025 394,805757
2,1 1:25 6 1,0531 0,0867 0,9656 371,5332292,2 1:25 6 1,0755 0,0883 0,988 380,152061 367,6342332,3 1:25 6 1,0003 0,9128 351,21741
3,1 1:25 6 1,0580 0,0959 0,9589 353,5349813,2 1:25 6 1,0680 0,1023 0,9689 357,221862 353,4981123,3 1:25 6 1,0477 0,9486 349,737494
1,1 1:25 6,8 0,4250 0,1432 0,2694 102,1042421,2 1:25 6,8 0,4688 0,1680 0,3132 118,704709 118,5278391,3 1:25 6,8 0,5112 0,3556 134,774567
2,1 1:25 6,8 0,3117 0,0925 0,21095 81,16708222,2 1:25 6,8 0,3664 0,1090 0,26565 102,213963 94,96747422,3 1:25 6,8 0,3646 0,26385 101,521378
3,1 1:25 6,8 0,3830 0,1065 0,27725 102,2187653,2 1:25 6,8 0,3642 0,1050 0,25845 95,2874292 97,33979273,3 1:25 6,8 0,3621 0,25635 94,5131843
83
Liite 3. Työssä käytettyjen nestekromatografisten menetelmien eluutio-ohjelmat.
HPLC-ELSD-gradienttien osuudet ajan funktiona.
HPLC-DAD-ajon gradienttien osuudet ajan funktiona.
Gradientti A, %/heptaani + 0,1% etikkahappo B, %/ heptaani + 2% isopropanoli + 0,1% etikkahappo0 min 97 33 min 97 310 min 0 10015 min 97 325 min 97 3
Gradientti A, %/heptaani + 0,1% etikkahappo B, %/ heptaani + 2% isopropanoli + 0,1% etikkahappo0 min 97 33 min 97 310 min 0 10030 min 0 10035 min 97 345 min 97 3
84
Liite 4. Haihtuvien yhdisteiden tulokset inaktivoiduista vertailunäytteistä palkokasvimatriiseittain, n=2.
Haags BlaueKontu 1 Kontu 2 Kontu 3 Fatima 1 Fatima 2 Fatima 3 SSNS 1 SSNS 2 SSNS 3 Alexia 1 Alexia 2 Alexia 3 1 2 3 Boruta 1 Boruta 2
substraattina linolihappo
heksanaali 2801426 2037902 2786109 2443247 1083890 1126409 5217851 4326604 7425859 14178805 8924010 11993141 145537013-heptanoni 398004 240003 534074 440115 202836 180910 558689 671203 760043 1111774 154202 582550 5449372-heptanoni 577409 362414 736805 652148 314826 334632 772132 871045 935945 1308266 154202 496855 539817heptanaali 335476 227348 435471 381137 172890 196424 532248 551687 637590 905757 667312 638885 6689162-pentyylifuraani 1062395 1299636 1605809 1788056 19888591-okten-3-oli 167469 98904 172039 195141 83783 74314 220231 228098 462335 497065 432727 453340 457508oktanaali 112470 97251 170515 190340 69295 93216 215864 216114 341852 489373 939745 342019 356151nonanaali 747713 628717 1251768 1248938 899791 1034235 1160936 934987 2956085 3571479 3492038 2727477 3065809
substraattina linoleenihappo
996664 1276789 841664 399634 511724 266899 561335 660421 2462586 4032181 7639764 6504295 1568752875073 279093
440070 579265 654933 481399 647549 331763 594499 634977 62707 486625 921255 319729 615798615568 802874 859101 618092 852069 494531 812477 917916 155957 584924 1185740 244812 501135292350 448642 463450 360816 620093 241424 634292 278313 764055
350231 738635 1431073305952 339836 393551 341025 373668 258757 378107 365258 212139 488442 204153 394925147220 200502 159277 156330 221163 141951 198041 208345 838201 121393 349970 215487 388933
1127700 1505312 1842693 2058135 1956929 1716135 1909186 2253282 2983291 1775864 3152191 1737015 2685582
substraattina trilinoleiini
1432845 2641488 1733435 707040 1177814 1589594 806604 657558 1260670 1505507 923944 965148 3003188 3041802 12454038 6206055795858 1515885 579819 1057855 932825 524735 1001001 793516 436447 300243 1011243 637684
1084199 1970994 239510 774322 1407881 279602 1251738 742582 338534 1345257 1105999 48324 478756 341315 1049065 63619474105 40304 112442 53974 108101 63328 256070 157009
384832 724803 483453 286144 655549 525513 572759 268566 449785 651912 488903 246709 326966 116334 238318 19977966277 61873 80990 75939 34795 73227 69150 94807 51470 299899 186654
213740 354394 123965 274889 243077 207994 368670 280685 228945 135286 309293 214012224050 307230 679485 129148 264091 817526 257461 174297 626440 312171 217080 350379 246774 203825 357078 276477
substraattina rypsiöljy
1010229 907168 629122 448477 389874 403194 779131 554401 822237 4993547 7980868 1954475 9383528 9681567322932 276036 79640 67416 40575 63461 94315 58529 109546 285025 318227 384098150784 112378 30265 20483 15464 22556 24690 26743 44791 116757 149470 139636448066 385856 118781 93602 79508 91840 98424 109422 144395 154009 382357 116807 326311 397895122106 148053 53854 46516 49167 46111 35418 56066 69370 125563 145916 163117183518 162912 45850 35658 51258 68963 57292 48846 231758 57952 159964 178827 159599 185054
1457236 1275486 418840 471217 825760 810956 799684 500038 1394939 2875836 2304840 2332959
substraattina saippuoitu rypsiöljy
heksanaali 2006719 3826949 14202684 146620483-heptanoni 127437 89414 1225372-heptanoni 103057 216384 227527 2503512-pentyylifuraani 1881231 2766723 12624014 12051690oktanaali 393226 530868 690145 676437nonanaali 7444185 7540632 12277205 11357815
2-heptanoni
heksanaali2-heksenaali3-heptanoni2-heptanoniheptanaali2-pentyylifuraani2-oktanonioktanaalinonanaali
heksanaali3-heptanoni
nonanaali
3-heptanoliheptanaali3-oktanoni2-oktanonioktanaali
heksanaali3-heptanoni2-heptanoniheptanaali2-oktanonioktanaali
85
Liite 5. Eri lipidisubstraateista härkäpapu- ja lupiiniuutteilla inkuboitaessa syntyneiden haihtuvien yhdisteidenHS-SPME-GC-MS-kromatogrammien piikkien pinta-alat.
Kontu
-härkä
papu
Fatim
a-härk
äpapu
SSNS-1
-härkä
papu
Alexia
-härkä
papu
Haags
Blaue
-lupii
niBo
ruta-l
upiin
i
keskia
rvokes
kihajo
ntavai
hteluv
älikes
kiarvo
keskih
ajonta
vaihte
luväli
keskia
rvokes
kihajo
ntavai
hteluv
älikes
kiarvo
keskih
ajonta
vaihte
luväli
keskia
rvokes
kihajo
ntavai
hteluv
älikes
kiarvo
keskih
ajonta
vaihte
luväli
penta
naali
1,03E+
067,3
3E+04
1,53E+
051,2
3E+06
4,85E+
051,0
3E+06
8,72E+
051,0
4E+05
2,33E+
051,6
9E+06
3,47E+
057,4
9E+05
1,31E+
065,0
3E+05
1,14E+
061,7
0E+06
4,50E+
051,0
6E+06
heksa
naali
9,46E+
076,4
0E+06
1,35E+
071,0
6E+08
2,45E+
075,6
7E+07
8,76E+
071,3
1E+07
2,99E+
071,4
0E+08
1,74E+
073,6
9E+07
1,01E+
085,1
2E+07
1,18E+
081,4
8E+08
1,82E+
073,5
7E+07
2-buty
ylifura
ani1,9
4E+05
2,53E+
046,1
8E+04
2,44E+
055,5
5E+04
1,35E+
051,5
4E+05
3,95E+
048,7
7E+04
3,52E+
051,3
0E+05
2,75E+
051,1
9E+05
3,67E+
041,0
2E+05
1,36E+
052,6
1E+04
6,36E+
042-h
eptan
oni
3,18E+
063,1
1E+05
6,49E+
053,6
5E+06
1,43E+
063,1
9E+06
3,09E+
068,3
2E+05
1,96E+
065,4
2E+06
8,31E+
051,9
4E+06
3,55E+
062,8
6E+06
6,18E+
066,4
8E+06
3,91E+
058,4
5E+05
hepta
naali
1,94E+
063,6
8E+05
8,75E+
052,1
0E+06
7,71E+
051,8
1E+06
1,88E+
064,5
6E+05
1,04E+
063,1
8E+06
4,31E+
058,5
1E+05
1,77E+
061,4
5E+06
3,12E+
063,0
2E+06
1,78E+
054,0
7E+05
2-pen
tyylifu
raani
1,67E+
072,2
5E+06
4,64E+
062,0
3E+07
4,54E+
069,3
3E+06
1,29E+
071,3
7E+06
3,34E+
062,4
9E+07
1,99E+
064,4
4E+06
6,54E+
063,5
9E+06
8,64E+
061,2
3E+07
2,61E+
065,7
4E+06
2-hep
tenaal
i1,0
8E+06
3,63E+
057,6
1E+05
1,88E+
064,8
9E+05
1,13E+
061,0
7E+06
1,56E+
053,3
0E+05
2,25E+
062,8
2E+05
6,07E+
059,0
8E+05
1,98E+
055,2
5E+05
7,16E+
051,9
1E+05
4,13E+
051-o
kten-3
-oli
2,18E+
068,1
4E+05
1,93E+
062,1
6E+06
1,26E+
062,9
9E+06
1,53E+
067,5
5E+05
1,79E+
062,6
0E+06
5,24E+
051,1
7E+06
1,67E+
061,0
5E+06
2,30E+
062,2
0E+06
4,07E+
068,2
1E+06
oktana
ali9,3
1E+04
4,93E+
041,1
0E+05
2,49E+
053,0
5E+04
5,94E+
041,8
3E+05
5,85E+
041,4
2E+05
1,58E+
056,7
5E+04
1,56E+
053,5
9E+05
2,76E+
056,2
0E+05
5,26E+
051,2
1E+05
2,67E+
05no
nanaal
i2,5
6E+06
4,55E+
069,2
7E+06
1,82E+
051,0
7E+05
1,51E+
055,0
1E+05
2,21E+
054,8
1E+05
3,36E+
051,7
8E+05
4,20E+
051,0
1E+06
9,16E+
051,8
0E+06
1,16E+
063,6
5E+05
7,87E+
052,4
-nonad
ienaal
i5,3
8E+06
8,86E+
052,0
0E+06
8,50E+
061,2
2E+06
2,70E+
066,5
9E+06
7,76E+
051,7
3E+06
7,63E+
065,3
8E+05
1,17E+
063,9
6E+06
1,91E+
064,5
2E+06
3,72E+
061,2
0E+06
2,73E+
06
Kontu-h
ärkäpa
puFat
ima-hä
rkäpap
uSSN
S-1-hä
rkäpap
uAle
xia-här
käpapu
HaagsB
laue-lu
piini
Boruta
-lupiini
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
keskiar
vokes
kihajo
ntavaih
teluväli
2-etyy
lifuraa
ni2,34
E+05
8,65E+0
41,91
E+05
3,33E+0
52,14
E+05
4,14E+0
51,92
E+05
3,26E+0
46,37
E+04
1,63E+0
51,26
E+05
3,82E+0
51,16
E+05
1,74E+0
43,84
E+04
1,50E+0
53,91
E+04
8,69E+0
41-p
enten-
3-oni
1,48E+0
61,37
E+05
3,19E+0
51,74
E+06
4,81E+0
59,87
E+05
9,99E+0
51,03
E+05
2,24E+0
51,07
E+06
5,27E+0
51,43
E+06
2,02E+0
62,33
E+05
5,61E+0
53,96
E+06
6,68E+0
51,48
E+06
1-pent
en-3-o
li8,65
E+05
1,56E+0
53,58
E+05
9,99E+0
53,57
E+05
7,66E+0
56,17
E+05
1,38E+0
53,34
E+05
5,76E+0
55,47
E+05
1,46E+0
61,47
E+06
1,58E+0
53,73
E+05
3,64E+0
66,53
E+05
1,47E+0
6hek
sanaali
1,36E+0
65,79
E+05
1,20E+0
61,62
E+06
1,21E+0
62,68
E+06
7,77E+0
53,89
E+05
8,52E+0
58,58
E+05
5,75E+0
51,60
E+06
2-heks
enaali
2,33E+0
63,22
E+05
6,98E+0
52,63
E+06
4,15E+0
59,64
E+05
1,43E+0
69,05
E+04
1,74E+0
51,60
E+06
2,28E+0
55,68
E+05
1,36E+0
63,71
E+05
7,80E+0
53-h
eptano
ni3,52
E+04
2,14E+0
52,08
E+04
2-okta
noni
2,65E+0
43,01
E+04
3,16E+0
51,07
E+04
1,27E+0
4okt
anaali
7,63E+0
44,84
E+04
1,06E+0
51,92
E+05
4,34E+0
46,14
E+04
5,44E+0
44,46
E+04
6,31E+0
41,32
E+05
9,53E+0
49,23
E+03
1,31E+0
4non
anaali
2,79E+0
64,97
E+06
1,01E+0
76,29
E+05
2,10E+0
52,97
E+05
4,45E+0
55,55
E+05
4,71E+0
52,76
E+05
3,90E+0
52,66
E+04
3,5-okt
adieen
i-2-oni
1,44E+0
64,46
E+05
9,27E+0
51,65
E+06
7,16E+0
51,48
E+06
1,06E+0
62,39
E+05
5,58E+0
51,03
E+06
4,31E+0
51,11
E+06
1,18E+0
68,00
E+04
1,67E+0
51,58
E+06
7,20E+0
41,75
E+05
HS-
SPM
E-G
C-M
S-tu
loks
etpi
ikki
enpi
nta-
aloi
na,s
ubst
raat
tina
linol
ihap
po,k
eski
hajo
nta
±1.
HS-
SPM
E-G
C-M
S-tu
loks
etpi
ikki
enpi
nta-
aloi
na,s
ubst
raat
tinaα-
linol
eeni
happ
o,ke
skih
ajon
ta±
1.
86
Kontu-h
ärkäpap
uFati
ma-härk
äpapu
SSNS-1-
härkäpa
puAle
xia-härk
äpapu
HaagsB
laue-lup
iiniBor
uta-lupi
ini
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
keskiar
vokes
kihajont
avaiht
eluväli
heksan
aali6,06
E+06
2,64E+0
66,09
E+06
8,02E+0
68,13
E+06
2,24E+0
79,86
E+06
5,37E+0
61,59
E+07
1,41E+0
79,40
E+06
2,30E+0
71,84
E+07
4,60E+0
61,08
E+07
3,68E+0
72,38
E+07
5,39E+0
72-he
ptanoni
2,33E+0
55,30
E+03
7,49E+0
33-he
ptanoli
2,02E+0
51,44
E+05
2,56E+0
53,54
E+05
1,42E+0
53,31
E+05
2,32E+0
51,51
E+05
3,57E+0
52,90
E+05
1,90E+0
53,94
E+05
9,84E+0
46,86
E+04
1,58E+0
53,84
E+05
1,60E+0
53,61
E+05
heptana
ali1,49
E+05
1,58E+0
53,03
E+05
3,64E+0
53,14
E+05
8,09E+0
53,18
E+05
2,18E+0
55,33
E+05
3,36E+0
52,15
E+05
4,73E+0
53,33
E+04
2,27E+0
43,21
E+04
6,31E+0
55,62
E+05
1,10E+0
63-ok
tanoni
4,39E+0
41,57
E+04
2,21E+0
45,00
E+04
6,42E+0
41,22
E+05
2,51E+0
42,03
E+04
4,01E+0
44,07
E+04
1,18E+0
31,67
E+03
4,29E+0
42,84
E+04
4,01E+0
41,50
E+05
5,36E+0
47,58
E+04
2-oktano
ni3,51
E+04
1,38E+0
56,84
E+04
1,37E+0
58,11
E+04
6,20E+0
41,14
E+05
7,93E+0
44,26
E+04
7,88E+0
41,26
E+05
1,81E+0
42,56
E+04
1,55E+0
55,29
E+04
1,30E+0
5okta
naali
9,23E+0
46,41
E+04
9,07E+0
46,41
E+04
6,17E+0
41,30
E+05
7,80E+0
47,66
E+04
1,78E+0
58,86
E+04
8,17E+0
42,12
E+05
5,21E+0
45,86
E+04
8,29E+0
49,44
E+04
4,80E+0
48,56
E+04
Kontu-h
ärkäpap
uFati
ma-härk
äpapu
SSNS-1-
härkäpap
uAlex
ia-härkä
papu
HaagsB
laue-lup
iiniBoru
ta-lupiin
i
keskiarv
okeskih
ajontav
aihteluv
älikesk
iarvoke
skihajon
tavaiht
eluväli
keskiarv
okeskih
ajontav
aihteluv
älikesk
iarvoke
skihajon
tavaiht
eluväli
keskiarv
okeskih
ajontav
aihteluv
älikesk
iarvoke
skihajon
tavaiht
eluväli
heksana
ali2,44
E+061,61
E+063,27
E+061,90
E+068,46
E+051,68
E+062,22
E+067,88
E+051,68
E+062,32
E+061,62
E+063,75
E+063,26
E+062,11
E+064,73
E+063-he
ptanoni
9,62E+04
2,04E+04
2,88E+04
1,34E+05
5,62E+04
1,36E+05
5,04E+04
4,17E+04
1,02E+05
2,06E+05
1,30E+05
3,58E+05
9,88E+04
7,36E+04
1,04E+05
2-heptan
oni4,11
E+047,52
E+031,06
E+045,71
E+042,39
E+045,48
E+043,33
E+041,76
E+043,45
E+046,47
E+045,14
E+041,43
E+052,76
E+043,49
E+044,93
E+04hep
tanaali
9,75E+04
2,99E+04
4,23E+04
1,63E+05
1,07E+05
2,40E+05
1,37E+05
1,18E+05
2,59E+05
1,98E+05
1,48E+05
3,59E+05
8,91E+04
8,51E+04
1,83E+05
2-oktano
ni3,24
E+043,90
E+045,51
E+047,52
E+044,46
E+041,05
E+053,38
E+043,89
E+048,32
E+047,52
E+043,63
E+041,19
E+054,56
E+045,39
E+047,62
E+04okta
naali
4,72E+04
4,07E+02
5,75E+02
1,21E+05
5,89E+04
1,35E+05
7,77E+04
6,64E+04
1,51E+05
1,30E+05
7,39E+04
1,86E+05
7,45E+04
4,80E+04
1,24E+05
nonanaa
li1,02
E+066,35
E+051,27
E+061,14
E+065,36
E+059,80
E+058,40
E+052,87
E+056,68
E+051,81
E+064,77
E+051,17
E+061,66
E+065,25
E+051,22
E+06
HS-
SPM
E-G
C-M
S-tu
loks
etpi
ikki
enpi
nta-
aloi
na,s
ubst
raat
tina
trilin
olei
ini,
kesk
ihaj
onta
±1.
HS-
SPM
E-G
C-M
S-tu
loks
etpi
ikki
enpi
nta-
aloi
na,s
ubst
raat
tina
ryps
iöljy
,kes
kiha
jont
a±
1.
87
HS-SPME-GC-MS tulokset piikkien pinta-aloina, substraattina saippuoitu rypsiöljy, keskihajonta ±1.
Kontu-härkäpapu Haags Blaue-lupiini
keskiarvo keskihajonta vaihteluväli keskiarvo keskihajonta vaihteluväli
1-penten-3-oli 5,40E+05 5,88E+04 1,34E+05 3,51E+06 1,02E+06 2,14E+06pentanaali 5,52E+05 1,42E+05 3,37E+05 3,05E+05 1,81E+05 4,25E+05heksanaali 5,56E+07 1,07E+07 2,47E+07 3,41E+07 1,47E+07 3,18E+072-heksenaali 1,02E+06 1,34E+05 3,00E+053-heptanoni 1,09E+05 2,54E+03 3,60E+032-heptanoni 1,48E+06 3,50E+05 8,40E+05 8,26E+05 3,97E+05 8,33E+052-pentyylifuraani 1,40E+07 1,87E+06 4,17E+062-heptenaali 1,18E+06 3,11E+05 7,07E+05 3,66E+05 9,94E+04 2,43E+051-okten-3-oli 9,40E+05 1,38E+05 2,62E+05oktanaali 4,97E+06 5,06E+05 1,23E+06 3,26E+06 1,04E+06 2,33E+062-oktenaali 6,67E+06 7,79E+05 1,67E+06 4,68E+06 1,01E+06 2,25E+06nonanaali 1,13E+07 9,25E+05 2,18E+06 1,13E+07 4,06E+06 9,35E+06
88
Liite 6. Muutaman erilaisen haihtuvan yhdisteen massaspektrit erilaisista lipidisubstraateista.
Heksanaalin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina linolihappo.
2-pentyylifuraanin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina linolihappo.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
260000
280000
m/z-->
Abundance
Scan 4354 (13.824 min): OM170228_07.D\data.ms56.2
41.2
72.2
100.285.2 207.1191.0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
160000
170000
180000
190000
200000
m/z-->
Abundance
Scan 6306 (19.984 min): OM170228_07.D\data.ms81.2
138.2
53.2
109.2193.0 281.1
89
Heksanaalin massaspektri, Alexia-härkäpapu, substraattina linolihappo.
2-pentyylifuraanin massaspektri, Alexia-härkäpapu, substraattina linolihappo.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
m/z-->
Abundance
Scan 4355 (13.828 min): OM170228_03.D\data.ms41.2 56.2
72.2
85.2 100.2 207.1
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
260000
280000
300000
m/z-->
Abundance
Scan 6305 (19.981 min): OM170228_03.D\data.ms81.2
138.2
53.2
95.267.2 109.2 123.240.2 207.1
90
1-penten-3-onin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
2-heksenaalin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
16000
17000
18000
19000
20000
m/z-->
Abundance
Scan 3033 (9.656 min): OM170307_02.D\data.ms55.2
84.1
41.2 69.1 207.1
35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 1150
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
m/z-->
Abundance
Scan 5163 (16.377 min): OM170307_02.D\data.ms41.2
55.2
69.2
83.2
98.2
109.263.1 77.2 91.249.3
91
1-penten-3-onin massaspektri, Alexia-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
2-heksenaalin massaspektri, Alexia-härkäpapu, substraattina α-linoleenihappo.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
16000
17000
18000
19000
20000
m/z-->
Abundance
Scan 3035 (9.662 min): OM170303_06.D\data.ms55.1
84.2
42.1 206.9
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
7500
8000
8500
9000
9500
10000
10500
11000
11500
12000
12500
13000
m/z-->
Abundance
Scan 5165 (16.384 min): OM170303_06.D\data.ms41.2
69.255.2
83.2
98.2
207.1
92
Heksanaalin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina saippuoitu rypsiöljy.
2-pentyylifuraanin massaspektri, Kontu-härkäpapu, substraattina saippuoitu rypsiöljy.
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
m/z-->
Abundance
Scan 4351 (13.815 min): OM170327_02.D\data.ms56.2
41.2
72.2
100.285.1 207.0
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
160000
170000
180000
190000
200000
m/z-->
Abundance
Scan 6305 (19.981 min): OM170327_02.D\data.ms81.1
138.2
53.2
95.167.2 109.2 123.240.2 193.0 209.1151.1