1

IN SITU HYBRIDISERING (ISH) Metode og analyse i diagnostikk

Kurs i Molekylærpatologi

Oslo Kongressenter

8. Juni 2017

Klaus Beiske

Avd. for patologi, KLM

Oslo Universitetssykehus Radiumhospitalet

ISH Definisjon

ISH • identifiserer nukleotidsekvenser (DNA, RNA)

- av endogen (human) eller eksogen (infeksiøs) opprinnelse

- vha hybridisering av en probe til komplementære målsekvenser

• korrelerer deres lokalisasjon til cellens/vevets morfologi

ISH Anvendelsesområder

Formalinfiksert

parafininnstøpt vev

Benmargsaspirat

Blodprøver

ISH Anvendelsesområder

Parafinsnitt Cytospin

Imprint

Utstryk

ISH Anvendelsesområder

Deteksjon av

* endogene gensekvenser

DNA: - hele kromosomer: antall per kjerne (aneuploidi)

- enkelte gener:

- amplifikasjon

- delesjon

- translokasjon

RNA: - genekspresjon (mRNA)

* eksogene gensekvenser

f. eks. virus (DNA, RNA), bakterier, sopp

ISH Agenda

Prosedyre – fiksering av vev/celler

– forbehandling av vev/celler

– prober

• typer

• merking

– hybridisering

– deteksjon

– kontroller

2

ISH Prosedyre

Fiksering av vev/celler * formål: kombinere maksimal preservasjon av

målsekvensene med optimal morfologi

* typer: best egnet: 4% bufret paraformaldehyd

pH 7.4 i 3-24 timer

mindre egnet: di-aldehyder

- krever mer demaskering

uegnet: syre/tungmetall-holdige fiksativer - kan ødelegge nukleotid- sekvenser * tidspunkt: så raskt som mulig etter prøvetaking

ISH Agenda

Prosedyre – fiksering av vev/celler

– forbehandling av vev/celler

– prober

• typer

• merking

– hybridisering

– deteksjon

– kontroller

ISH Prosedyre

Forbehandling av vev/celler

* montering på poly-L-lysin dekkete objektglass

* demaskering av målsekvenser:

- proteolytiske enzymer (proteinase K, pepsin, trypsin)

- non-ioniske detergenter (Triton X-100, saponin)

- mikrobølgeovn, damptrykk-koking

* postfiksering (paraformaldehyd)

ISH

Prosedyre – fiksering av vev/celler

– forbehandling av vev/celler

– prober • typer

• merking

– hybridisering

– deteksjon

– kontroller

ISH Prosedyre

Merking av prober 1. Radioaktiv (brukes ikke lenger i diagnostikk)

2. Ikke-radioaktiv

Signalmolekyler: • Fluorokromer: FISH (Fluorescens-ISH)

• Organiske kromogener: CISH (Kromogen-ISH)

• Metaller: Metallografisk ISH (Met-ISH) nanogold (1-30 nm) - forsølves/forgulles etter hybridisering (GOLDFISH = gold-facilitated ISH) - gir lysmikroskopisk sortfarging

FISH

3

FISH CISH

© Klaus Beiske, RH

ISH - Prosedyre • Indirekt merking av prober

Målsekvens

Probe

Biotin Digoxigenin FITC

Streptavidin antistoffer

FITC

Enzymer: HRP, AP Gold partikler

FISH

Substrat+chromogen Gold/silver coating

CISH Metallografisk ISH

binds to

ISH

Fordeler/ulemper ved ulike merkeprosedyrer

Fluorokromer Enzym/substrat

Sensitivitet (DNA) 1-5 kb 10 kb

Optisk oppløsning meget god begrenset

(Spatial resolution) 1 kb (linear DNA) ? 20-50 kb (interfase) 1-3 Mb (metafase)

Signalkombinasjon 2 - 12 2

Kvantifisering meget god semikvantitativ

Histologisk korrelasjon begrenset meget god

Holdbarhet begrenset ubegrenset

gain/amplifikasjon amplifikasjon

Best egnet for delesjon

påvisning av translokasjon

av gener

EnzMet (Enzym Metallografisk) ISH

HRP katalyserer

omvandlingen av

Ag+ ioner

til non-ionisk Ag

som deponeres

ved proben

SISH (Silver ISH)

Fordeler: meget sensitiv, god oppløsning, semikvantitativ

Ulemper: foreløpig kun én farge tilgjengelig (sorte partikler)

Metallografisk ISH: amplifisert HER2 i parafinsnitt av mammakarsinom

GOLDFISH konfluerende signaler

EnzMet ISH distinkte signaler

Powell et al, Hum Pathol 2007

4

ISH Agenda

Prosedyre – fiksering av vev/celler

– forbehandling av vev/celler

– prober

• typer

• merking

– hybridisering

– deteksjon

– kontroller

ISH Prosedyre

Hybridisering (1) forbehandlet (demaskert/etterfiksert) vev

* inkuberes med hybridiseringsmiks

(= probe(r), formamid, blokkerende DNA, buffer)

- evtl. prehybridisering med miks uten probe -

* dekkes med dekkglass og forsegles

* DNA målsekvenser (og evtl. proben) denatureres 5-10 min

ved 65-95 C

ISH Prosedyre

ISH Prosedyre

Hybridisering (2) * hybridiseres over natt ved 37-42 C

hybridiseringstemp. vanligvis 12-17 C lavere enn Tm

Tm: temperatur der 50% av probe/målsekvens er dissosiert

avh. av - formamidkons.

- saltkons. i buffer

- % andel C-G sekvenser

- lengde av DNA/RNA tråd

* vaskes med formamid-holdig buffer

alle konsentrasjoner, temperaturer og tider må tilpasses den individuelle proben, målsekvens og vevstype.

ISH Agenda

Prosedyre – fiksering av vev/celler

– forbehandling av vev/celler

– prober

• typer

• merking

– hybridisering

– deteksjon

– kontroller

ISH Prosedyre

Deteksjon avhengig av hvordan proben er merket

* radioaktive prober: autoradiografi (filmemulsion)

* fluorokrom-merkete prober:

fluorescensmikroskop

flow cytometri

* enzym-substrat/gull/sølv-merkete prober:

lysmikroskopi

elektronmikroskopi

5

FISH Deteksjon av fluorokrom-merkete prober

FISH Zeiss Axio Imager.Z2

ISIS analyse software (Metasystems)

ISH

Eksempler

1. Påvisning av eksogene (f. eks. virale) gensekvenser

2. Genekspresjonsanalyse

3. Cytogenetikk

- interfasekjerner

- metafasekromosomer

ISH Eksempler

1. Påvisning av eksogene, virale gensekvenser (1)

* Epstein Barr virus (EBV)

virus-spesifikk mRNA (EBER) påvises

i lymfeknutesvulst hos immunsupprimert individ

(=post-transplantasjons-lymfoproliferativ sykdom)

ISH for viral RNA er mer sensitiv enn

immunhistologi for viralt protein LMP

EBER ISH

6

anti-LMP-1

antistoff

Kombinasjon

av ISH (EBER)

og IHC (CD20)

PTLD monomorf type (lymfom)

ISH Eksempler

1. Påvisning av eksogene, virale gensekvenser (2)

* Human Papilloma Virus (HPV)

eks. på ulik oppløsning av signalene ved - merking med FITC - merking med enzym-substrat (peroksidase-DAB)

bestemmelse (høy-/lav risiko) av virus-stamme

HPV ISH

low risk

7

HPV ISH

low risk

Påvisning av eksogene gensekvenser

Eksempel: HPV

Lavgradig SIL:

mange episomale viruskopier

Cervixcancer:

få integrerte kopier

ISH

Forbedring av sensitivitet • Sensitivitet:

– Konvensjonell ISH: - minst 25 kopier/celle - probelengde 50-100 bp

– In situ PCR: 1 kopi/celle

• In situ (RT) PCR Målsekvens (DNA/RNA) amplifiseres in situ med PCR

PCR produktene påvises vha inkorporering av merkete nukleotider eller vha ISH med merket probe

Fordel: betydelig signalamplifikasjon

Ulemper: teknisk krevende risiko for amplifikasjon av uønskede sekvenser

• Deteksjonsrate for HPV ved cervixcancer – Konvensjonell ISH: 75%

– In situ PCR: >95%

RT in situ PCR

Eksempel: HIV-1 Latent infeksjon: 1 virusgenom/celle integrert i cellens DNA

krever in situ PCR

Aktiv infeksjon: varierende antall RNA transkripter/celle

krever RT in situ PCR

HIV-1 infiserte lymfocytter RT in situ PCR for HIV-1 RNA

Nuovo GJ, Hum Pathol 2007

Påvisning av eksogene gensekvenser

Eksempel: Polyomavirus Nyrebiopsi/urinprøve fra nyre-transplantert pas.

Påvisning av eksogene gensekvenser

Eksempel: Salmonellabakterier

FITC merket EUB338, universal 16s rRNA Bacteria probe

Utstryk Colonslimhinne

8

Påvisning av eksogene gensekvenser

Eksempel: blandet bakterieflora

Materiale fra periapikalt granulom i munnhule

FITC-EUB338 probe

universal 16s rRNA

Cy3-genus-spes.

Streptococcus probe

Simultan deteksjon

Sunde et al, Microbiology 2003

ISH

Eksempler

2. Genekspresjonsanalyse

* malignt lymfom med morfologi som plasmocytom

* ingen immunhistologisk påvisning av immunglobulin

* ekspresjon av kappa- eller lambda mRNA

Kappa mRNA

Lambda mRNA

ISH

Eksempler

3. Interfase cytogenetikk (analyse av cellekjerner)

- kromosomer: antall kopier per kjerne

- enkelte gener: - amplifikasjon - delesjon - translokasjon

9

+12

Kronisk lymfatisk leukemi CEP12/13q14/13q34

Trisomi 12

N

L

CEP12

© Klaus Beiske, RH

Økt kopitall av enkeltgener

© Klaus Beiske, RH

Økt kopitall av enkeltgener

Eksempel: HER2

KREATECH

© Klaus Beiske, RH

Økt kopitall av enkeltgener

Eksempel: HER2

KREATECH

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med konvensjonell FISH på parafinsnitt

HER2/CEN17=0,7 HER2/CEN17=2,6 © Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med konvensjonell FISH på utstryk

FNAC fra

metastatisk

intercostal

lesjon på

dorsal

thorax vegg

10

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med DuoCISH

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 SISH

HER2

HER2

HER2

CEN17

CEN17

CEN17

Ventana-Roche

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 Dual Colour SISH

Ventana-Roche

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 Dual Colour SISH

Ventana-Roche

A: normal

B: HER2 ampl.

C: mono17

D: poly17

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour SISH

HER2/CEN17=9,0 © Klaus Beiske, RH

Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour

ISH

HER2/CEN17=2,7

11

© Klaus Beiske, RH

Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour ISH

HER2/CEN17=0,9 © Klaus Beiske, RH

EGFR

CEN7

EGFR prognostisk status med Dual Colour ISH

Ventana-Roche

Delesjon av enkeltgener

Delesjon av enkeltgener

Eksempel: 1p36.3

Delesjon av enkeltgener prognostisk status av 1p36.3 i neuroblastom

Normal lymfocytt Neuroblastom med del1p36.3 © Klaus Beiske, RH

del11q22-q23 del17p13

17p13/11q22 17p13/11q22

N N

L

L

Delesjon av enkeltgener Eksempel: prognostisk status av 11q22-11q23 og 17p13 i KLL

12

© Klaus Beiske, RH

Halling et al, Hum Pathol 2007

Translokasjonsanalyser: split/break-off prober

Translokasjonsanalyser: split/break-off prober

Probene

• hybridiserer til

områder på hver side

av mål-genet

• segregerer ved

translokasjon

Klaus Beiske, Rikshospitalet

Ewing Sarkom

PNET/Ewing sarkom analyse med EWS/22q12 split/break-off probe

Normale lymfocytter PNET/EWS

cen22q12

tel22q12

cen22q12

tel22q12

22q12 (EWS)-assosierte translokasjoner

Rearrangering av EWS på 22q12

er ikke diagnostisk for ES/PNET!

EWS er bl.a. involvert i translokasjoner ved 4 andre tumores:

► Desmoplastisk rundcellet tumor (DRCT)

t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 95%

► Ekstraskeletalt myksoid chondrosarkom

t(9;22)(q22;q12) EWS-CHN 75%

► Myksoid liposarkom

t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP 5%

► Klarcellet sarkom (mal. melanoma of soft tissue)

t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 ukjent

Alveolært rhabdomyosarkom

13

Rhabdomyosarkom Analyse med 13q14 Split/Break-off probe

embryonalt alveolært 8q24: positiv 14q32.3: positiv

N

Burkitt lymfom Analyse av begge translokasjonspartnere

i t(8;14)(q24;q32) med splitprober

© Klaus Beiske, RH

DuoCISH split probes

DAKO

Superposed signals

may mask each other

Translokasjonsanalyser: fusjonsprober

Translokasjonsanalyser: fusjonsprober

Klaus Beiske, Rikshospitalet

Probene

• hybridiserer til

hvert av

partnergenene

• fusjonerer ved

translokasjon

Mantelcellelymfom t(11;14)(q13;q32)

14

Mantelcellelymfom analyse av t(11;14)(q13;q32) med BCL1/IgH –spesifikke fusjonsprober

Imprint fra lymfeknute Parafinsnitt av imprintet flate

N

FISH analyser ved OUS

ISH

Oppsummering

• ISH er en undersøkelse av feil ved et enkelt gen (amplifikasjoner, delesjoner,

translokasjoner). Bruken av ISH må vurderes opp mot bruken av PCR

• Fordeler med FISH ift PCR:

– Histologisk kontroll sikrer at prøvematerialet er representativt

– I blandete populasjoner kan enkeltceller (subpopulasjoner) analyseres vha morfologisk

kontroll

– Høyere sensitivitet ved påvisning av translokasjoner med variable bruddpunkter

• Ulemper med FISH ift PCR:

– Avlesning krever tid og morfologisk erfaring

– Egner seg derfor ikke til rask analyse av store prøvemengder

• Fordeler med bruk av FISH i forh. Til CISH/SISH:

– bedre optisk oppløsning (små signalmolekyler)

– eksakt kvantifisering mulig

– samtidig anvendelse av multiple prober