UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

Facultad de Ingeniería Ambiental

INFORME DE LABORATORIO N° 5:

Acción bacteriostática selectiva de cristal violeta y acción oligodinámica de los metales pesados

DOCENTE: Jorge Tello Cebreros

MICROBIOLOGÍA SANITARIA 1

ALUMNA: Alarcón Olivera Ambar Tiffany

Lima-Abril 2015LABORATORIO N° 5

OBJETIVOS

-Observar el efecto del cristal violeta ,en diferentes concentraciones ,sobre el crecimiento de microorganismos.-Observar el efecto de la acción oligodinámica de metales pesados ,sobre el crecimiento de microorganismos.-Reconocer mediante la tinción de Gram ,los tipos de microorganismos afectados por el cristal violeta y la acción de metales pesados

INTRODUCCIÓN

Muchas sustancias químicas son capaces de inhibir o matar a los microorganismos.Van desde elementos metálicos pesados, como la plata y el cobre hasta moléculas orgánicas complejas como los compuestos de amonio cuaternario. Las diversas sustancias ejercen su efecto antimicrobiano por diferentes caminos y sobre diferentes grupos de organismos. También varían los efectos que tienen sobre las superficies o los materiales sobre los que se aplican; algunos son compatibles, mientras que otros son destructores. Debido a estas y otras variables, es necesario saber el comportamiento de un agente químico antes de utilizarlo para una aplicación práctica determinada. En el siguiente laboratorio se realizan los procedimientos para caracterizar el cristal violeta y la acción del metal pesado, usados para controlar poblaciones microbianas; vamos a describir sus modos de acción y a indicar sus aplicaciones prácticas.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Características de un desinfectante ideal:

Ningún agente químico antimicrobiano es el mejor para todas las finalidades,Esto no es sorprendente a la vista de la vaiedad de condiciones bajo las que los agentes pueden ser utilizados,las diferencias en su modo de acción y los muchos tipos de células microbianas que hay que destruir .Si hubiese un desinfectante ideal debería poseer una formidable colección de características.Nunca será posible encontrar un solo compuesto que reúna todas estas propiedades.Sin embargo,lo que se especifica más adelante es lo que se debe tratar de conseguir cuando se preparan nuevos agentes antimicrobianos y debe considerarse también al hacer la valoración de los desinfectantes para uso en la práctica.

1. Actividad antimicrobiana: la sustancia química a baja concentración deberá tener un amplio espectro de actividad microbiana.

2. Solubilidad: la sustancia deberá ser soluble en agua y otros disolventes.

3. Estabilidad: los cambios de estabilidad deberán ser mínimos en la sustancia y no afectar la condición germicida.

4. No deberá ser toxica al hombre u otros animales: la sustancia deberá ser letal para los microorganismos y no para el hombre u otros animales.

5. Homogeneidad: la preparación deberá ser uniforme en su composición de manear que los ingredientes activos se encuentren en cada aplicación.

6. No deberá reaccionar con material orgánicos extraño: cuando se usan estos desinfectantes en situaciones en las que además de bacterias hay cantidades considerables de material orgánico, muy poco, si no es que nada del desinfectante, estará disponible para actuar contra los microorganismos.

7. Toxicidad para los microorganismos a la temperatura ambiente y a la del cuerpo: para usar el compuesto, no será necesario elevar la temperatura de la existente en el ambiente donde se usara.

8. Capacidad de penetración: a menos que la sustancia pueda penetrar atraves de las superficies, su acción germicida se limitara al sitio de aplicación.

9. No deberá corroer ni teñir: no deberá producir rin u otras alteraciones en los metales o teñir o dañar las telas.

10. Propiedad desodorante: lo ideal es que el desinfectante por si mismo tenga olor agradable o sea inodoro.

11. Capacidad detergente: un desinfectante que a la vez sea detergente (agente limpiador) lograra dos objetivos pues la acción limpiadora aumentara la desinfección.

12. Disponibilidad: el compuesto deberá estar disponible en grandes cantidades y a precio razonables.

Selección de un agente químico antimicrobiano:

Algunos de los factores que deben tenerse en consideración al hacer la selección de un agente químico antimicrobiano para su aplicación práctica son :

1.- Naturaleza del material que se va a tratar.Un agente químico usado para desinfectar utensilios contaminados puede ser muy poco satisfactorio para su aplicación sobre la piel,es decir,puede dañar seriamente las células de los tejidos.En consecuencia,la sustancia seleccionada debe ser compatible con el material al cual se plica.

2.-Tipo de microorganismo. No todos los microorganismos son igualmente susceptibles a la acción inhibidora o mortífera de un agente químico específico.Por ello,debe saberse que el agente seleccionado es efectivo contra el tipo de microorganismos que hay que destruir.Por ejemplo,las esporas son más resistentes que las células vegetativas.Las bacterias Gram-positivas y las Gram-negativas se diferencian en su susceptibilidad; Escherichia coli (Gram-negativa) es mucho más resistente a los desinfectantes cati´pnicos que Staphylococcus aureus (gram positivo).Diferentes cepas de la misma especie varían también en cuanto a su susceptibilidad a un agente antimicrobiano determinado.

3.-Condiciones ambientales. La temperatura ,pH ,tiempo,concentración y presencia de materia orgánica extraña,pueden tener influencia sobre la tasa y la efectividad de la destrucción microbiana.El uso con éxito de un agente antimicrobiano requiere el conocimiento de la influencia de estas condiciones sobre el agente determinado,de manera que pueda ser empleado bajo las condiciones más favorables.

Principales grupos de agentes químicos antimicrobianos.

-Fenol y compuestos fenólicos-Alcoholes-Halógenos y sus compuestos-Metales pesados y sus compuestos-Detergentes-Aldehídos-Quimioesterilizantes gaseosos

GRUPO PRINCIPAL

CARACTERISTICAS

MODO DE ACCION

COMPUESTOS

USO RECOMENDADO

LIMITACIONES

Fenol y compuestos fenólicos

Desnaturalizan las proteínas , dañan la membrana celular

Los derivados (hexilresorcinol)reducen mucho la tensión superficial

Cresoles (más germicidas que el fenol )

Desinfectante general

Efectividad microbiana limitada; irritantes y corrosivas

Alcoholes Desnaturalizan proteínas;agentes deshidratantes;acción detergente

Cuantos más carbonos tiene el alcohol,es más germicida

Metílico (menos bactericida,más tóxico); etílico,propílico

Antisépticos para l apiel ; la concentración del 60 por ciento mata a los virus si no hay materia orgánica extraña

Antiséptico

Halógenos ,Iodo

Halogenación de la tirosina;inactiv enzimas y otras proteínas

Efectivo contra bacterias y esporas

Tintura de iodo (disuelto en alcohol); iodóforos ( + agentes de

Desinfecta la piel

Irritante de las membranas mucosas

superficie)

Cloro (y compuestos)

Se combinan con las proteínas de la membrana celular y con enzimas

El cloro se usa para desinfectar el agua; los compuestos de cloro son más fáciles de usar y tienen muchas aplicaciones

Hipocloritos (higienizan utensilios y equipos ) cloraminas (agentes oxidantes)

Desinfección del agua

Inactivados por la materia orgánica;efectividad dependiente del Ph.sabor olor objetables si no se controlan

Aldehídos Rompen enlaces de hidrógeno;desnaturalizan proteínas

Efectivos contra todos los microorganismos excepto esporas bacterianas

Glutaraldehído

Esterilización de instrumentos,fumigación

Estabilidad limitada; no son esporocidas

Quimioesterilizantes gaseosos

El óxido de etileno alquila compuestos orgánicos; inactiva enzimas

Mata todas las formas de vida

Oxido de etileno

Esterilización de materiales sensibles al calor; instrumentos,equipos grandes y colchones

Inflamable,potencialmente explosivo en forma pura; acción relativamente lenta

Compuestos de amonio cuaternario (detergentes catiónicos)

Desnaturalizan proteínas; dañan la membrana celular

Más germicidas que otros detergentes;más bactericidas contra bacterias Gram.positivas fungicidas.

Cloruro de cetilpiridonio ; Zephiran ; Phemerol

Desinfección de la piel; agentes higienizantes

No son esporocidas

Cristal violeta.El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de pH y colorantes.

Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Cuanto más metilado esté el colorante, su color será de un violeta más oscuro:

Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, y encuentra usos específicos en química y medicina.

Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, y es más oscuro como colorante que 2B.

Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, o específicamente violeta cristal. Es mucho más oscura que la 2B, y aún más oscura que la 6Bk.

Aplicaciones.

El principal uso del violeta de metilo (por volumen bruto usado mundialmente) es el de tintura textil de color púrpura y para dar tonos violeta oscuro en pinturas y tinta de impresión.

El violeta de metilo 2B (llamado sencillamente violeta de metilo) es usado en química como un indicador de pH para probar los intervalos de pH de 0 a 1,0. En el extremo ácido de su intervalo de medición, toma un color amarillo. En el alcalino, se hace violeta azulado. El Violeta de metilo puede ser suministrado como papel de prueba de pH, o puede ser suministrado como cristales puros y disueltos en la muestra a ser probada.

En medicina, el violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. El violeta de genciana destruye células, y es usado en desinfectante de intensidad moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la mayoría de los animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para desinfección de la piel de estos animales.

El violeta de metilo tiene también la habilidad de conectarse al ADN. Por lo tanto, en ciencias biomédicas, es usado para ensayos de viabilidad celular. La conexión al ADN puede también causar rupturas en el proceso de replicación del ADN, el cual puede llevar a mutaciones y cáncer.

Normalmente es formulado para uso como indicador de pH en la variedad de violeta de metilo como una solución de 0,01 a 0,05 % en m/v y en la variedad de violeta de cristal como una solución de 0,02 % en m/v en agua.

En el área de física, por su alta hiperrabilizidad, el violeta-cristal se utiliza como un trazador fluorescente y en experimentos de emisión de efectos de óptica no-lineal. Por ejemplo en la generación del segundo-armónico-óptico. De hecho su estructura multipolar (octupolar) representa una excelente ruta para observar efectos ópticos no-lineales en comparación con los compuestos dipolares.

Estructura.

Propiedades físico-químicas: Fragmentos o polvo verde oscuro o verdoso con brillo metálico y olor muy débil. Es soluble en agua y cloroformo. Es parcialmente soluble en alcohol (1 gramo se disuelve en 10 mL de etanol) y en glicerol (1 gramo se disuelve en 15 mL de glicerol). Es insoluble en éter.

Mecanismo de acción El mecanismo de acción es desconocido.

Espectro de actividad Antiséptico de baja potencia. Activo frente a algunos Gram positivos (especialmente Staphyloccocus spp.) y algunos hongos (Candida spp.). Su actividad es mucho menor en Gram negativos y es totalmente inactivo frente a esporas, virus y bacterias ácido alcohol resistentes. Su actividad se incrementa al aumentar el pH

Metales pesados y sus compuestos :

La mayoría de los metales pesados,bien solos o en ciertos compuestos,son dañinos para los microorganismos.Los más efectivos son el mercurio,la plata y el cobre.

Metales pesados (Acción oligodinámica).Cantidades extremedamente pequeñas de ciertos metales,en particular de plata,pueden ejercer un efecto letal sobre las bacterias;esto se conoce como acción oligodinámica por derivarse de dos palabras griegas:oligos,que significa “pequeño” , y dynamis que significa “poder” .El fenómeno se pone de manifiesto en el laboratorio,colocando un trozo de metal limpio (cobre o plata,moneda) sobre una placa inoculada.Después de la incubación

una zona de inhibición (no hay crecimiento) rodea al metal.La cantidad de metal necesitada para este efecto inhibitorio es extremadamente pequeña,solo unas cuantas partes por millón.

Compuestos de metales pesados.Numerosos compuestos de metales pesados tienen actividad germicida o antiséptica.Los más destacados compuestos antimicrobianos de metales pesados son los de mercurio,plata y cobre.El cloruro mercúrico,que en una época fue un popular desinfectante,ya no se utiliza; sin embargo,varios compuestos orgánicos de mercurio (mertiolato,mercurocromo y metaphen) son utilizados como antisépticos.El nitrato de plata ha sido usado durante mucho tiempo para la prevención de las infecciones gonocócicas de los ojos en los recién nacidos.Los compuestos de cobre son ampliamente utilizados como fungicidas,en la agricultura.Uno de los modos de acción de los metales pesados y de sus compuestos es mediante la desnaturalización de las proteínas.En el caso del cloruro mercúrico,la inhibición va dirigida a enzimas que contienen grupos sulfhidrílicos.

TINCIÓN DE GRAM

Tinción de Gram.Una de las técnicas de tinción diferencial para bacerias,más importante y más ampliamente utilizada,es la tinción de Gram.En este procedimiento la extensión de células previamente fijada se somete a las siguientes soluciones en el orden que se indica: cristal violeta,solución de yodo,alcohol (un agente decolorante) y safranina u otro colorante de contrste adecuado.Las bacterias teñidas por el método de Gram caen dentro de dos grupos.Uno de ellos ,el de las bacterias Gram positivas,conservan el colorante cristal violeta y,por tanto,aparecen de color violeta oscuro.El otro grupo de las bacterias Gram negativas pierden el cristal violeta al ser lavadas con el alcohol y al teñirse con el colorante de contraste safranina,que es rojo,aparecen de color rojo.

¿Por qué el procedimiento de tinción de Gram tiñe de violeta a unas bacterias y de rojo a otras? La respuesta parece hallarse en las diferencias existentes en la estructura química de su superficie.

Soluciones en el orden de su aplicación

REACCION Y ASPECTO DE LAS BACTERIASGram-positivas Gram-negativas

1 Cristal violeta CV Las células se tiñen de violeta Las células se tiñen de violeta2 Solución de iodo I Se forma un complejo CV-I

dentro de las células. Las células continúan violetas

Se forma un complejo CV-I dentro de las células. Las células continúan violetas.

3 Alcohol Las paredes celulares se deshidratan, los poros merman; la permeabilidad de la pared celular y de la membrana disminuye ; el complejo CV-I no puede salir de las células ; las células permanecen color violeta.

Se extraen lípidos de las paredes celulares, los poros se agrandan y el complejo CV-I es eliminado de la célula; las células quedan incoloras.

4 Safranina Las células no se afectan; permanecen de color violeta

Las células toman este colorante y se ponen de color rojo

PROCEDIMIENTO :

Acción bacteriostática selectiva del cristal violeta.Preparar agar nutritivo, en 20 tubos de ensayo (4 para c/grupo), cada tubo con 15 ml de agar nutritivo con la proporción de 23g de Agar por cada 1000ml y calentarlos a más de 45°C.Tomar 3 tubos de ensayo y echar 9ml de agua destilada, a cada tubo, con una pipeta.

Preparar una solución acuosa de cristal violeta de (0.1%) y transferir 1ml de la solución a uno de los tubos con 9 ml de agua. Esto da una dilución de 1:10 000; si de esta última solución preparada, transferimos 1ml al tubo de 9ml de agua destilada, tendremos la dilución de 1:100 000. Similarmente repitiendo el proceso anterior, si transferimos 1 ml a otro tubo de 9ml de agua destilada obtendremos la dilución de 1:1000 000.

Después de llevar autoclave

Transferir 1ml de la dilución 1:10 000 a una placa petri. Transferir 1ml de la dilución 1: 100 000 a otra placa petri. Transferir 1ml de la dilución 1:1000 000 a otra placa petri.

Verter el agar fundido en las tres placas de petri y mezclar bien el colorante con el agar rotando suavemente la placa, para obtener una distribución uniforme del colorante.

Verter el contenido del último tubo de agar en la placa de petri sin colorante. Cuando haya solidificado el agar, invertir las placas y dividir cada una en dos partes iguales parte A y parte B; en estas dos zonas se debe inocular colonias preparadas anteriormente.

Invertir las placas e incubarlas a 37ºC por 48 horas.

Acción oligodinámica de metales pesados:

Lavar la moneda con agua destilada

Colocar la moneda al centro de una placa petri esterilizada.

Se inoculo el tubo con agar una gotita de cultivo del laboratorio de la determinación de calidad del agua.

Verter el agar dentro de la placa de petri que contiene la moneda

Dejar que se solidifique el agar.

Invertir las placas e incubarlas a 37ºC por 48 horas.

RESULTADOS:

Acción selectiva del cristal violeta:

Concentración Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5A B A B A B A B A B

1/10000 + + + + + + + +1/00000 + + + + + + + + + +1/1000000 + + + + + + + + + +Sin colorante + + + + + +

(+) Hay crecimiento(- )No Hay crecimiento*Escherichia coli : Gram negativo*Bacilus : Gram positivo

Grupo Colonia A Colonia BN° 1 Gram (+)

EstreptobacilosGram (+)Estreptobacilos

N° 2 Gram (+)Estafilococos

Gram (+)Cocos x

N° 3 Gram (+)Estafilococos

Gram (+)Estreptobacilos

N° 4 Gram (-)Estafilococos

Gram (+)Cocobacilos

N° 5 Gram (-)cocos x

Gram (-)Estreptococos

Discusión de resultados.

Teniendo en cuenta :

1:10 000 inhibe gram + : inhibe gram - 1:100 000 inhibe gram + : no efecto gram - 1:1000000 no efecto gram + : no efecto gram -

1.- 1:10000 hubo crecimiento en todos los grupos ,no se ejerce función bacteriostática.

2.- 1:100 00 grupo 1 : debió de haber inhibido a las 2 colonias; sin embargo, la tabla de datos muestran crecimiento.grupo 2: debió de haber inhibido a las 2 colonias; sin embargo, la tabla de datos muestran crecimiento.grupo 3: no se inhibió el crecimiento de las colonias, las colonias en este grupo son gram + ,según la concentración ,se debió haber inhibido el crecimiento.grupo 4: la colonia A es gram – (hubo crecimiento ) ,lo cual el cristal violeta para esta concentración no hace surgir efecto, la colonia B es gram + (hubo crecimiento ) ,el cristal violeta debió haber actuado e inhibir el crecimiento.

Grupo 5 : las colonias A y B son gram - (hubo crecimiento ), el cristal violeta a esta concentración no tuvo efecto.

3.- 1 : 1 000 000 en todos los grupos ,donde hay colonias gram + y gram – (hubo crecimiento ) el cristal violeta no tuvo efecto sobre su crecimiento.

4.- sin colorante en los grupos 1,2,4 y 5 hubo crecimiento en todos las placas, sin el cristal violeta las bacterias crecen normalmente.

ACCIÓN OLIGODINÁMICA DE METALES PESADOS

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

GRUPO 1 :

Se observó la zona oligodinámica alrededor de la moneda.La moneda fue acuñada el año 2010.

GRUPO 2:

A diferencia del grupo 1 ,en esta placa se muestra uniformidad ,y el halo de la zona oligodinámica es notorio.El año de la acuñación de la moneda fue 1995 .peso del latón estimado es de 3.50 g.Se presenta la zona de estimulación y la zona de crecimiento normal.

GRUPO 3:

En este grupo se mostró solamente una zona oligodinámica.Las colonias crecieron también alrededor de la moneda.El crecimiento en toda la placa fue de crecimiento normal.

GRUPO 4

Se muestra una zona oligodinámica,donde no hubo crecimiento de bacterias,se observa la zona de estimulación y la zona de crecimiento normal.

OBSERVACIONES

1.-Los resultados de los grupos no concuerdan con la teoría de inhibición y acción bacteriostática del cristal violeta en la mayoría de casos.

2.-En las placas del grupo 3 ,se vertió solamente 1ml del colorante .Se observó una consistencia cremosa al momento de recoger las placas de la incubadora.

2.- Se observa que en las placas hubo crecimiento de bacterias no inoculadas en estrías.

3.-Los resultados del experimento no fueron los esperados,lo que pudo deberse a una incorrecta manipulación de los instrumentos ,no seguir debidamente las indicaciones y no tener cuidado de la contaminación al momento de realizarse el experimento.

CONCLUSIONES

1.-El efecto del cristal violeta a diferentes concentraciones nos muestra que no es eficiente en este experimento ,ya que bacterias gram + y gram - se desarrollaron aún cuando el colorante debió haber actuado. La placa sin colorante muestra el crecimiento de bacterias del mismo modo que una placa con concentraciones diferentes de colorantes.

2.-En todos los grupos se muestra al menos una zona oligodinámica, lo que nos indica que los metales pesados (cobre ,zinc) inhiben el crecimiento de bacterias alrededor de estos.

3.- Mediante la ayuda de la técnica de la tinción de Gram se puede identificar que tipos de bacterias podrían ser inhibidas a diferentes concentraciones de cristal violeta.

RECOMENDACIONES

1.- Verter adecuadamente las concentraciones de cristal violeta sobre la placa Petri ,en caso no hacerlo, no verter la cantidad que resta cuando el agar ya está solidificando.

2.-Al momento de contabilizar el crecimiento de bacterias ,se recomienda contar solo el crecimiento de las bacterias inoculadas en estrías.

3.-Manejar adecuadamente los instrumentos,inocular correctamente y tener en cuenta la higiene al momento de realizar el experimento.

4.-No limpiar las monedas con alcohol para realizar el experimento.

5.-Realizar nuevamente el experimento para obtener resultados lo más acorde a la teoría.

Referencias Bibliográficas.

1.- Michael Madigan,John Martinko,Jack Parker ,Biología de los microorganismos ,Madrid,Editorial Pearson ,2004.

2.-Michael J.Pelczar ,Elementos de Microbiología ,México,Editorial Mc-Graw Hill,1984.

3.- Mª Concepción Casado González,Factores químicos contra microorganismos .[Consulta : 28 abril 2015 ] Disponible en :http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm

4.- Dr.Victor Silva,Control de microorganismos [consulta :28 abril 2015 ] Disponible en :http://clasedecontroldemicrorganismos.blogspot.com/

ANEXOS

COMPOSICIÓN DE LA MONEDA DE DIEZ CÉNTIMOS:

FOTOGRAFÍAS TOMADAS EN LABORATORIO :

ESTREPTOBACILOS GRAM +