LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

INTEGRANTES:

JESUS DAVID BAYTER PINEDA OSCAR FIGUEREDOJIMMY EMIRO PINTO

PROFESORA:SANDRA RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESARVALLEDUPAR-CESAR2013

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIETAL

RECUENTO MICROBIANO POR LA TECNICA DE FILTRACION POR MEMBRANA

INTEGRANTES:

JESUS DAVID BAYTER PINEDA OSCAR FIGUEREDOJIMMY EMIRO PINTO

PROFESORA:SANDRA RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESARVALLEDUPAR-CESAR2013

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTALRECUENTO MICROBIANO POR LA TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANAUNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

La filtracin por membrana sirve para la esterilizacin en frio de lquidos o soluciones, por ejemplo de azucares, micronutrientes y en especial de antibiticos y vitaminas termolbiles, las cuales se adicionan a los otros componentes de un medio de cultivo recin esterilizado y a temperaturas de fusin. Igualmente esta tcnica se usa para el control microbiolgico de muestras liquidas, tales como aguas potables o bebidas. Las membranas sintticas poseen poros de tamao definido, 0.22um para levaduras y hongos filamentosos. la cuadricula delineada en la superficie superior de la membrana permite cuantificar el nmero de UFC/volumen liquido filtrado y de acuerdo al medo selectivo utilizado, el cual se transmite a la membrana, se puede cuantificar diversos tipos de bacterias y hongos.OBJETIVOS: Cuantificar coliforme de una muestra de agua potable mediante filtro de membrana Obtener destreza en el manejo del equipo de filtracin por membrana (millipores)

MATERIALES: Muestra liquida (agua potable) 100ml Cajas de Petri con mac konkye o EMB Equipo de filtracin por membrana (millipores)esterilizados Membranas de 0.22um Pinzas para membranas Alcohol 90% Agua estril Bomba de vaco Mechero

FILTRACIN A TRAVS DE MEMBRANA

El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana. Por lo general, estn compuestos de steres de celulosa, tpicamente con poros de 0,45 mm de dimetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Despus se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la prctica, la tcnica de filtracin de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el mtodo de tubos mltiples.

Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rpidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de agua, tambin se utiliza en el anlisis de leche y otros alimentos lquidos.TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALESLa tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo en el cual se capturan en la superficie de una membrana microorganismos cuyo tamao es mayor que el tamao del poro 0.22um esto gracias a una bomba elctrica que ejerce presin diferencial sobre la muestra de agua haciendo que esta se filtre. Los microorganismos de menor tamao que el especfico del poro pasan la membrana o quedan retenidos en su interior. Las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego esta se lleva al medio de cultivo( EMB Y mac conkey).luego es incubado y pasado el tiempo de incubacin se observa el crecimiento y el nmero de unidades formadoras de colonia.VOLUMEN DE AGUA ANALIZADA

El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el nmero de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientacin:Tipos de aguaColiformes totales

Potable de consumo pblico100 ml

Envasadas250 ml

Manantiales15; 60; 100 ml

Lagos, depsitos4; 15; 60; 100 ml

Acometidas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De playas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De ros0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales cloradas0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales sin tratar0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente aadindolas al embudo de filtracin.Para muestras entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30 ml de solucin tamponada estril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar.Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solucin tamponada estril.E.M.B. Agar.Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.FUNDAMENTOEste medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.MAC CONKEY AGAR.Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.FUNDAMENTOEn el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

PROCEDIMIENTO: Trabaje en condiciones aspticas Marque la caja (muestra y tipo de medio) Sumerja aproximadamente 2cm en el recipiente con alcohol y pselas por la llama y deje que arda el alcohol Abra una membrana individual levantando el celofn completamente hacia atrs y sostenga la membrana en el centro Separe la membrana con las pinza y retire el embudo del aparato filtrador, desenroscndolo de la base Sobre la plataforma de la base reinstale el embudo enroscndolo hasta que sienta leve presin Vierta el volumen apropiado y aplique al vaco hasta que el fluido se halla filtrado, cierre al vaci Desensamble nuevamente el aparato y retire con las pinzas estriles la membrana con cuidado de no romperla Coloque la membrana sobre el medio de cultivo con cuidado de no dejar burbujas de aire por debajo de la membrana. Incube en posicin invertida a 35 C/22-24h

ANALISIS:Para este laboratorio trabajamos con una muestra de agua de uno de los baos de las instalaciones de la universidad para los dos tipos de cultivo utilizados (EMB Y mac conkey)Se realiz el debido montaje para el laboratorio con los materiales y las muestras de agua con una cantidad de agua establecida para cada filtracin de 100ml

CONCLUSIONES:

Luego de que se cumpliera el tiempo de incubacin establecido se produjo a observar los microorganismos que pudieron crecer en los distintos tipos de cultivo y esto fue lo que observamos:En el cultivo de EMB pudimos observar que hubo crecimiento en la membrana por parte de la E coli en una cantidad considerable lo cual indica claramente la presencia de este microorganismo en esta muestra de agua.Pero por el contrario en el medio de cultivo con mac conkey no se pudo observar ningn crecimiento en la membrana por parte de ningn microorganismo, al ver esta reaccin llegamos a una conclusin en la que podemos afirmar lo siguiente:Como el nico microorganismo que creci es E coli el cual entra en el grupo de los coliformes fecales o termo tolerantes llamados as debido a que pueden soportar hasta temperaturas de 45C y como solo creci en el medio de cultivo de EMB podemos concluir tambin que este tipo de cultivo entra entre los indicadores fecales en el cual se pueden encontrar microorganismos especficos como salmonella endobacter o E coli que es la que se puede encontrar en un 80 -90%.Mac conkey tambin es un cultivo para determinar coliformes totales y fecales pero con lo visto en el laboratorio destacamos al medio de EMB como un medio especfico para E coli principalmente y por ende pues ms efectivo para el crecimiento de este microorganismos que en el medio con mac conkey.

ANEXOS: (E. coli en agar EMB)Nota: las imgenes originales se extraviaron debido a fallas tcnicas en el dispositivo donde se encontraban almacenadas, por lo que se nos fue imposible anexar en el laboratorio la cantidad de unidades formadoras de colonias en E. coli.

BIBLIOGRAFIA:http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf