practicas de laboratorio de microbiologia

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE

TLAXCALA

FACULTAD DE ODONTOLOGIA

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO

DE BIOQUIMICA GENERAL

Reglas de seguridad en el laboratorio

FACULTAD DE ODONTOLOGIA Página 1

NOMBRE DEL ALUMNO:

____________________________________________

____________________________________________

GRUPO:

_____________________________________

ELABORÓ:M.en C. Gabriela Vargas Oliver

EL ALUMNO:

1. Deberá de lavarse las manos antes de entrar y de salir de

laboratorio.

2. No debe de entrar con alimentos, ni dulces en la boca.

3. Deberá usar bata blanca de manga larga perfectamente

abotonada y planchada en cada práctica.

4. Deberá portar guantes, cubrebocas u otros objetos si el

profesor lo considera necesario.

5. Debe de entrar con el cabello perfectamente recogido, sin

zapatos abiertos (sandalias, huaraches etc.)

6. Deberá depositar la basura correctamente, como lo indicará el

profesor en cada práctica.

7. Debe de traer su manual en cada práctica.

8. Conocerá las medidas de acción para cualquier tipo de

circunstancia que lo amerite.

9. Limpiará la mesa de laboratorio antes y después de la práctica

con alcohol etílico al 70% o con benzal.


PRACTICAS DE

MICROBIOLOGIA

Practica 1: MORFOLOGÍA MICROBIANA Y TINCIÓN DE GRAM

Practica 2: EXUDADO FARÍNGEO

Practica 3: AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DE Streptococcus mutans

Practica 4: CULTIVO ANAEROBIO DE UN ABSCESO PERIODONTAL

Practica No. 1


MORFOLOGÍA MICROBIANA Y TINCIÓN DE GRAM

INTRODUCCION:

Leeuwenhoek observó por primera vez las bacterias en el siglo XVII, y lo hizo con

suspensiones de microorganismos sin teñir y utilizando un microscopio simple. Hasta el

año de 1884 Christian Gram desarrolló un método de tinción que lleva su nombre y que es

de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriología. Ya que la técnica de tinción

revela detalles referentes a la forma y agrupación bacteriana como cualquier otra técnica de

tinción proporciona información sobre propiedades estructurales de las bacterias que

permiten separarlas en dos grandes grupos: gram positivas y gram negativas.

Las bacterias pueden clasificarse morfológicamente en: cocos (diplococos,

estreptococos, estafilococos y sarcina) y bacilos.

Otro grupo de bacterias son las helicoidales, hay dos tipos de estas y son: rígidas y

flexibles. Las especies helicoidales rígidas se presentan en varias familias de

esquizomicetos, y las especies helicoidales flexibles suelen denominarse espiroquetas.

La presentación de cocos en grupos, cadenas o en diplococos dependerá mucho del

medio en donde se encuentre inmerso el cultivo ya que se puede observa mejor su


diplococos

Estreptococos o cadenas

Estafilococos o grupos

agrupación en caldo( Tood Hewitt, BHI) que en medios sólidos (agar sangre de carnero, sal

y manitol, etc), en estos no tenemos buena visibilidad de la agrupación de los cocos para

definir si son estreptococos o estafilococos, sin embargo para este fin existe la prueba de la

catalasa.

La catalasa es una prueba bioquímica presuntiva donde nos indica si es estreptococo

(da negativa) o estafilococo (da positiva).

OBJETIVO:

El alumno realizará la tinción de gram para el conocimiento de las diferentes formas

bacterianas.

MATERIAL:

Colorante cristal violeta.

Lugol

Alcohol cetona

Safranina

Portaobjetos

Mechero

Haza bacteriológica

Agua destilada estéril

Cultivos puros de diferentes bacterias

Aceite de inmersión

Peróxido de hidrógeno

Hisopo estéril

Guantes estériles

Abatelengua

MATERIAL BIOLÓGICO:

Cultivos puros de bacterias


Exudado faríngeo.

METODO:

1. Preparar un extendido fino del material en estudio sobre el portaobjetos y dejarlo

secar al aire.

2. Fijar el material al mechero.

3. Colocar en un soporte para tinción la laminilla.

4. Cubrir con cristal violeta un minuto.

5. Lavar con agua corriente

6. Cubrir con lugol un minuto.

7. Lavar con agua corriente

8. Decolorar con alcohol-cetona.

9. Lavar con agua corriente.

10. Cubrir con safranina 30 seg.

11. Lavar y dejar secar.

12. Montar con aceite de inmersión.

13. Observar al microscopio a 100 X.

DETERMINACIÓN DE CATALASA:

Se coloca una gotita de peróxido de hidrógeno en el portaobjetos y poner con el aza

en punta una pequeña cantidad de colonia bacteriana, inmediatamente observar el burbujeo

o ausencia de este.

Control positivo: Staphylococcus aureus

Control negativo: Streptococus spp

RESULTADOS:

Bacterias gram positivas se tiñen de azul y las bacterias gram negativas se tiñen de rojo.


Catalasa (+): burbujeo

Catalasa (-): ausencia de burbujas

REPORTE:

Cada alumno entregará su práctica con los dibujos correspondientes: dibujará el color y la

forma de las bacterias (cocos, bacilos, espiroquetas, cocobacilos) y el resultado de la

catalasa de la bacteria correspondiente.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de gram?

2. ¿Qué hace el lugol en la tinción de gram?

3. ¿Para qué sirve el aceite de inmersión?

4. ¿fundamento de la prueba de catalasa?

5. Describe brevemente que diferencias encontraste entre las laminillas que observaste.

REFERENCIAS:

.Ross P.W., Holbrook W.P. Microbiología bucal y clínica. Ed. Científica

Murray P.R., Rosentha K.S. Pfaller M.A. 2006. Microbiologia Médica, Madrid

Elsevier.

De la Rosa F., Prieto P.J. 2003. Microbiología en Ciencias de la Salud: conceptos y

aplicaciones. Madrid Elsevier.

Práctica No. 2EXUDADO FARÍNGEO


INTRODUCCION:

Exudado faríngeo

Este cultivo es importante para el diagnóstico de ciertos agentes infecciosos, sobre

todo en encuestas epidemiológicas que nos ayudan a definir el canal endémico de los

microorganismos, entre los más importantes patógenos causantes de procesos infecciosos o

colonizantes del tracto respiratorio podemos citar a: Streptococcus pneumoniae,

Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis,

Haemophilus influenzae, bordetella pertusis, Neisseria meningitidis, S. aureus, el

aislamiento de estos microorganismos debe ser analizado en base a un estudio clínico muy

preciso. Su utilidad es muy limitada, ya que la mayoría de las infecciones en vías

respiratorias bajas son de origen viral.

La presencia de estas bacterias dependerá del tipo de pacientes y edad del mismo

ya que patógenos como H. influenzae y Streptococos pneumoniae se pueden aislar en

pacientes menores de 5 años, provocando infecciones muy severas como meningitis o

neumonía.

Cabe señalar que una tinción de gran en este sitio anatomico del cuerpo humano no

es de importancia clínica ya que es una zona muy rica en flora bacteriana normal, no

tenemos griteríos para determinar si una muestra es indicativa de infección como la que si

se tiene con un exudado cervicovaginal.

OBJETIVO:


1.- El alumno aprenderá a tomar y sembrar, una muestra de exudado faríngeo, para el

conocimiento colonial de las bacterias de flora normal.

MATERIAL:

1 placa de agar sangre de carnero (5%)

1 placa de agar sal y manitol

1 placa de gelosa chocolate

1 tubo con medio de transporte stuart.

kit de tinción de gram

100 ml de solución salina estéril

1 propipeta

1 hisopo estéril.

1 abatelenguas estéril.

1 Haza bacteriológica

1 mechero

1 portaobjetos


peroxido de hidrogeno.

incubadora

Centrifuga


1 microscopio

METODO:


TOMA DE MUESTRA

1. Presentarse en ayunas, sin lavarse los dientes.

2. Colocar al paciente en una silla con la cabeza hacia arriba, e indicándole que abra la

boca y saque la lengua.

3. Con un abatelenguas estéril se hace presión hacia abajo en la lengua y con un

hisopo se talla la superficie de la faringe amígdalas y en caso de ulceración del

fondo del saco faríngeo.

4. Se coloca el hisopo en el medio de transporte stuart.

5. Se inoculan las placas de agar sangre de carnero, sal y manitol en zona estéril con

el hisopo del medio de transporte.

6. Sembrar por estría cruzada.

7. Incubar a 35-37°C por 24 hrs.

8. Revisar placas y hacer tinción de gram.

9. Revisa hemolisis de las colonias:

Colonias -hemolíticas, pequeñas, blancas o grises son presuntivas de

estreptococos.

Colonias -hemolíticas, grandes, blancas o amarillas son presuntivas de

estafilococos.

REPORTE:

El alumno entregará los resultados de la morfología colonial de la bacterias que

crecieron en el exudado faríngeo, hemolisis, gram y catalasa de las colonias.

CUESTIONARIO


1. ¿Qué bacterias forman parte de la microflora bacteriana en farínge?

2. ¿Cómo se observa la hemolisis beta en el agar sangre de carnero?

3. ¿Por qué es importante identificar cocos gram positivos en la garganta?

4. ¿Qué tipo de infecciones produce: Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes, Neiserria meningitidis, klebsiella pneumoniae, Streptococcus

pneumoniae y Haemophillus influenzae?

REFERENCIAS

Thouraya Ben-Hamouda, Thierry Foulon, Afef Ben-Cheikh-Masmoudi,Che´ dlia Fendri,

Omrane Belhadj and Kamel Ben-Mahrez. 2003. Molecular epidemiology of an outbreak of

multiresistant Klebsiella pneumoniae in a Tunisian neonatal ward. J MED MICROBIOL

52: 427-433.

Tomoyo Ueyama, Yuichi Kurono, Komei Shirabe, Masazumi Takeshita, and Goro Mogi.

1995. High Incidence of Haemophilus influenzae in Nasopharyngeal Secretions and Middle

Ear Effusions as Detected by PCR . J CLIN MICROBIOL 33: 1835–1838.

Práctica No. 3


AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DE Streptococcus mutans

INTRODUCCION:

La caries dental es una de las infecciones más comunes en la cavidad oral de los

humanos, siendo las bacterias orales como el grupo mutans, el más implicado en la caries

dental, formado por siete especies: S. mutans, S. sobrinus, S. downei, S. rattus, S. cricetus,

S. ferus y S. macacae, siendo los dos primeros asociados a caries dental. El grupo mutans

posee los antígenos a, b, c, d, f y g, denominados cariotipos donde S. mutans es el cariotipo

“c” y S. sobrinus “e”, algunos cariotipos como el “d” no se ha aislado en humanos. En

Estados Unidos el cariotipo “c” es el mas aislado seguido por el “e”, mientras que en Brasil

el cariotipo “c” se presenta en el 65% y el “e” en el 35% de casos de caries dental, otros

países como en Europa se encuentra el 50% del “c” y del “e”. En México no existen datos

epidemiológicos de que cariotipos sean los mas prevalentes.

S. mutans ha mostrado ser más prevalente que S. sobrinus en muestras de placa

dental, sin embargo varios estudios epidemiológicos han mostrado que la presencia de S.

sobrinus es más asociada con pacientes con un alto grado de caries dental. S. mutans ha

mostrado ser más prevalente que S. sobrinus en muestras de placa dental, sin embargo

varios estudios epidemiológicos han mostrado que la presencia de S. sobrinus es más

asociada en pacientes con un alto grado de caries dental. Estudios realizados usando

métodos como genotipificacion o fenotipificación, sugieren que las mamas son la principal

fuente de infección de S. mutans o S. sobrinus para los niños.

OBJETIVOS:

1.- El alumno aislará y conocerá el crecimiento característico de S. mutans, en saliva.

2.- Cuantificará la cantidad de S. mutans en saliva.

MATERIAL:

1 placa de agar mitis salivarius (1% bacitracina)

kit de tinción de gram

1 tubo de vidrio 13X 100 mm estéril con tapón de algodón.


1 jarra de anaerobiosis

100 ml de solución salina estéril

1 propipeta

1 sobre para producir anaerobiosis.

1 Haza bacteriológica

1 mechero

1 portaobjetos


Peróxido de hidrogeno.

Incubadora

Centrifuga clínica


3 tubos con tapón de rosca estériles o 3 microtubos estériles

3 pipetas estériles de 10 ml o 6 micropipetas estériles azules

Micropipeta de 100 – 1000 l

1 microscopio

METODOS:

TOMA DE MUESTRA:

La toma de muestra será de un integrante del equipo, y este debe de presentarse con lavado

de dientes dos horas antes, sin haber ingerido alimento durante este tiempo.

CULTIVO DE S. mutans.

1. Se toma una muestra de saliva no estimulada, recolectando la mayor cantidad

posible (no menor a 2 ml) en un tubo de ensaye previamente esterilizado y

etiquetado para evitar la contaminación de las muestras.

2. Clarificación: Las muestras se centrifugan a 2500 rpm por 5 min para

clarificarlas.

3. Diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) Se realizan diluciones de las muestras por duplicado

con solución salina estéril y se siembran 20l de cada dilución también por


duplicado en Agar-Mitis-Salivarius-Bacitracina para el crecimiento de S. mutans.

La siembra es por goteo no hacer estría.

Sembrar 20 l cada dilución en una placa de agar mitis salivarius

4. Crecimiento y conteo de colonias. Las placas se incuban en un sistema de

anaerobiosis (jarra Gas-Pack) a 37ºC por 48 horas, se cuentan las colonias

presuntivas de S. mutans considerando las colonias adherentes, de color azul-

grisáceo, con bordes irregulares, apariencia de vidrio esmerilado, opacas a

contraluz y de consistencia dura. Una vez identificadas las colonias presuntivas de

S. mutans se conservaron en caldo Todd-Hewit a 4ºC.

5. Tomar una colonia presuntiva realizar tinción de gram y catalasa.

CONTROL DE CALIDAD:

Se usaran las cepas testigo de S. mutans GS5 y LM7.

RESULTADOS:


Dilución 10 -1

Poner 900 l de solución salina estéril + 100 l de saliva

Dilución 10 -2

Poner 900 l de solución salina estéril + 100 l del tubo 1

Dilución 10 -1

Poner 900 l de solución salina estéril + 100 l del tubo 2

Tomar 100 l de esta muestra

Colocar 100 l de saliva

1 2 3

Dilución 10-1

Dilución 10-3

Dilución 10-2

Las colonias de S. mutans aparecen de forma dura de color azul grisáceo y

con una gotita alrededor de ella que es la dextrana y son catalasa

neagativos, cocos gran positivos.

Las cuentas son por diluciones es decir se deben de multiplicar el resultado

por 1000 que es el factor de dilución

REPORTE:

El alumno entregará los resultados de la morfología colonial de la bacterias y la cuenta

de UFC de S. mutans.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué muestras puedes emplear para aislar S. mutans?

2. ¿Qué característica tienen las colonias de S. mutans en el agar mitis salivarius?

3. Menciona los factores de virulencia de S. mutans

REFERENCIAS

1.- Nogueira R.D., Alves A.C., Napimoga M.H., Smith D.J. y Mattos –Graner R.O.

2005. Characterization of Salivary Inmunoglobulin A Responses in Children Heavily

Exponed to the Oral Bacterium Streptococcus mutans: Influence of Specific Antigen

Recognition in Infection. Infec and Inm. 73: 5675-5684.

2.- Henrique N.M., Hofling J.F., Inez K.M., Umeko K.R. y Bruno G. R. 2005.

Transmission, diversity and virulence factors of Streptococcus mutans genotypes.J Oral

Scien. 47: 59-64.


3.- Tanzer J.M., Livingston J., Thompson M.A. 2001. The Microbiology of Primary

Dental Caries in Humans.J dent Educ. 65: 1028-1036.

4.- Becker M.R., Paster B.J., Leys E.J., Moeschberger M.L., Kenyon S.G., Galvin J.,

Boches S.K., Dewhirst F. y Griffen A. 2002. Molecular Analysis of Bacterial Species

Associated with Childhood Caries. J. Clin Microbiol. 40: 1001-1009.

5.- Kuramitsu H. y Wang B. 2006. Virulence properties of cariogenic bacteria. BMC

oral Health. 6(supl): 511.

6.-Okada M., Soda Y., Hayashi F., Doi T., Suzuki J., Miura K. Y Kozai K.

2005.Longitudinal Study of dental caries incidente associated with Streptococcus

mutans and Streptococcus sobrinus in pre-school children. J Med Microbiol. 54:661-

665.

Práctica No. 4


CULTIVO ANAEROBIO DE UN ABSESO PERIODONTAL

INTRODUCCION:

Para el estudio de las bacterias anaerobias, la selección de la muestra debe

efectuarse estrictamente y solo se aceptaran para su estudio: secreciones bronquiales

(obtenidas por punción trans-traqueal), sangre, liquido cefalorraquídeo, abscesos (punción),

y biopsias de tejidos normalmente estériles. Existen algunos datos que nos indican la

posible presencia de una bacteria anaerobia en la muestra: olor fétido, presencia de gas o

gránulos en los tejidos, localización de la infección en la proximidad de una membrana

mucosa, coloración negra, etc.

Teniendo en cuenta la tolerancia al oxigeno las bacterias anaerobias se clasifican en:

Anaerobias estrictas: Crecen en atmósferas con una tensión de oxígeno inferior a 0.5%.

Anaerobias aerotolerantes: Toleran el oxígeno hasta un 8% pero son incapaces de

utilizarlo para su metabolismo. La tolerancia al oxígeno de éstas bacterias está dada por la

presencia de enzimas superoxido dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa que catalizan la

conversión de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno menos tóxico y a oxígeno

molecular.

Anaerobios Facultativos: No necesitan oxígeno para su desarrollo normal, pero si está

presente lo pueden utilizar metabolicamente, es decir que crecen bajo condiciones tanto

aeróbicas como anaeróbicas utilizando el oxígeno como aceptor final de electrones.

Microaerofilicas: Crecen en presencia de tensiones de oxigeno mínimas y lo metabolizan

utilizándolo como aceptor final de electrones. Necesitan atmósfera de CO2.

FUENTES DE INFECCION

Las Bacterias anaerobias están ampliamente distribuidas en la naturaleza. Podemos

diferenciar dos clases de fuentes:

* FUENTES EXOGENAS:


- El suelo, agua (Lagos, sedimento de ríos, océanos, aguas cloacales) Alimentos y Tracto

gastrointestinal de animales.

* FUENTES ENDOGENAS: Cuando se encuentran en el ser humano formando parte de

la flora normal en piel y mucosas. En algunos lugares superan a los aerobios en una

proporción de 1:1000. Las fuentes más importantes son:

a) CAVIDAD ORAL: En la boca existe una flora polimicrobiana muy compleja ligada a la

variabilidad de las condiciones existentes en el interior de la misma como son:

1.-El potencial redox en los diferentes espacios como pliegues bucales, superficie de la

lengua, surcos gingivales, espacios periodontales.

2.- Presencia de placa bacteriana: Entre más antigua es la placa mejores son las condiciones

de anaerobiosis.

3.- Edad: A los pocos días del nacimiento hay temprana implantación de Lactobacilos y

Streptococcus, posteriormente Staphylococcus y Veillonelas. A los 6 meses de edad

encontramos Actinomyces, Nocardias, Fusobacterias. Podemos mencionar como

anaerobios componentes de la flora normal de cavidad oral y Tracto Respiratorio Superior

los siguientes géneros:

Peptostreptococcus, Veillonella, Propionibacterium, Clostridium, Actinomyces,

Eubacterium, Prevotella, Bacteroides, Fusobacterium.

MATERIAL:

1 jeringa estéril de insulina

Portaobjetos

Placa de agar sangre hemina menadiona

Medio tioglicolato

Haza bacteriológíca

Jarra gaspak

Sobre de anaerobiosis

Kit de tinción de gran


METODO:

1. Tomar la muestra con una jeringa estéril el exudado del absceso e inmediatamente

tapar la jeringa y colocar parte de la muestra en el medio tioglicolato.

2. La otra parte del exudado sembrarlo inmediatamente en gelosa sangre de carnero

con hemina menadiona en estría cruzada.

3. Incubar a 37 °C en anaerobiosis el tubo y la placa durante 24 hrs.

4. Revisar el cultivo y morfología colonial del crecimiento.

RESULTADOS

Observar el crecimiento de las colonias, escribir las características de las

colonias observadas (hemolisis ) y compararlas con los datos proporcionados

por el profesor.

REFERENCIAS:

Neringa Skučaitė, Vytautė Pečiulienė1, Vita Mačiulskienė. 2009.Microbial

infection and its control in cases of symptomatic apical periodontitis: a review.

Medicina (Kaunas), 45(5):343-350.

Christina O. Igboin, Ann L. Griffen, and Eugene J. LeysI. 2009. Porphyromonas

gingivalis Strain Diversity. J Clin Microbiol. 47: 3073–3081.

D. Robertson1 and A. J. Smith. 2009. The microbiology of the acute dental abscess.

J Med Microbiol (2009) 58:155–162.

Dorita Preza, Ingar Olsen, Tiril Willumsen, Bjørn Grinde, and Bruce J. Paster.

2009. Diversity and site-specificity of the oral microflora in the elderly. Eur J Clin

Microbiol Infect Dis. 28(9): 1033.

A.K.L. Wan, W.K. Seow, D.M. Purdie, P.S. Bird, L.J. Walsh and D.I. Tudehope A.

2003. Longitudinal Study of Streptococcus mutans Colonization in Infants after

Tooth Eruption J Dent Res 82(7):504-508.


PRACTICAS DE

BIOQUIMICA

PRACTICA 1: Bioelementos

PRACTICA 2: Identificación de carbohidratos

PRACTICA 3: Determinación de pH en saliva y otras sustancias.

PRACTICA 4: Determinación cualitativa de la amilasa salival.

PRACTICA 5: Propiedades físicas de los lípidos.

Práctica No.1

BIOELEMENTOS

INTRODUCCION:

Los bioelementos son elementos químicos que constituyen a los seres vivos. Se clasifican

en:

A. Bioelementos primarios: C,H,O,N, P y S,


B. Bioelementos secundarios: Na, K, Ca, Mg y Cl

C. Oligoelementos: a) indispensables: Mn, Fe, Co, Cu, Zn.

b) variables: B, Al, V, Mo, I , Si.

Los bioelementos primarios son abundantes en los seres vivos y esto se debe a que

representan ciertas características que los hacen idóneos para formar las moléculas de los

seres vivos.

Los bioelementos se unen entre sí para formar moléculas que llamaremos:

BIOMOLECULAS.

Las biomoléculas de los seres vivos son:

INORGÁNICAS ORGÁNICAS

Agua

CO2

Sales minerales

o Carbohidratos

o Lípidos

o Proteínas

o Ácidos nucleícos

OBJETIVO:

El alumno reconocerá ciertos bioelementos en diferentes materiales organicos .

MATERIAL:

Hojas frescas

5 gr Carne de pollo

Uñas

Cabello

Mechero bunsen

Tubos de ensayo


Trozos de carbón

METODOS:

EXPERIMENTO 1

1. En un tubo de ensaye coloca hojas frescas

2. Calienta el tubo en el mechero hasta el desprendimiento de vapores.

3. Observa y contesta:

¿Qué observas?

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

¿Qué sustancia observas en las paredes del tubo de prueba?

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

¿Qué elementos constituyen dicha sustancia?

__________________________________________________________________

¿Que estas demostrando con esta actividad?

__________________________________________________________________

_EXPERIMENTO 2

1. En otro tubo pon el trozo de carne y calienta hasta que desprenda vapores.

2. Observa y contesta:

¿Qué observas?

___________________________________________________________________

¿Qué sustancia esta en las paredes del tubo?

___________________________________________________________________

¿Qué se está demostrando con este experimento?

_________________________________________________________________________

EXPERIMENTO 3

1.- En un tubo de ensaye coloque la uña y sométalo al calor hasta el desprendimiento de

calor.


2.- Abanique los vapores para percibir el olor (no oler directamente).

Observe y conteste:

a) A que se asemeja el olor de las uñas quemadas

__________________________________________________________________

b) Dicho olor es característico de que elementos:

___________________________________________________________________

c) ¿Que se demuestra con este experimento?

___________________________________________________________________

REALIZAR LO MISMO CON EL CABELLO

CONCLUSIONES:

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

______________________________

REFERENCIAS:

Pacheco Leal D. Bioquimica: estructural y aplicada a la medicina. Ed. IPN.

Hicks Gomez J. J., (2007), Bioquimica, México: McGraw Hill.


Práctica No 2

IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

INTRODUCCIÓN:


Los carbohidratos, hidratos de carbono, glúcidos o azúcares nos aportan abundante

energía y son muy abundantes en la naturaleza. Son aldehídos o cetonas polihidroxiladas

en su conformación química.

Los carbohidratos se clasifican en monosacáriso, disacáridos, oligosacáridos y

polisacáridos.

Siendo los polisacáridos y oligosacaridos hidrolizados para producir monosacáridos.

Los carbohidratos que dan resultados positivos con las soluciones de Tollens Benedict o

Fehling se conocen como azucares reductores y todos los carbohidratos que contienen un

grupo hemiacetal dan pruebas positivas y se les conoce como azúcares no reductores..

Fundamento de la prueba de Fehling: si el carbohidrato es reductor se oxidará dando

lugar a la reducción del sulfato de cobre (II), de color azul a óxido de cobre(I) de color

rojo- ladrillo.

Fundamento de la prueba de lugol: la coloración producida por el lugol se debe a

que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es por tanto una

verdadera reacción química sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las

propiedades físicas de esta molécula apareciendo la coloración azul violeta. Este método se

usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de reactivo de

lugol toma un color azul violeta característico.

OBJETIVOS:

Identificar azucares reductores con la reacción de fehling .

Identificar la presencia de un polisacárido por medio de la reacción de lugol

MATERIALES:

Tubos de ensayo

Gradilla


Pinzas moss

Vaso de precipitado

Mechero o parrilla eléctrica

Tripie

Tela de asbesto

Parafilm

REACTIVOS

Glucosa

Galactosa

Maltosa

Manosa

Lactosa

Sacarosa

Almidon

Reactivos de fehling A y B

Lugol

HCl diluido al 10%

Bicarbonato

Papa y /o arroz

METODO:

Identificación de azucares reductores

1.- Colocar 7 tubos de ensayo en una gradilla y numerarlos del 1 al 7.

2.- Medir 1 ml de solución de glucosa y colocar en el tubo 1 hacer lo mismo con los demás

carbohidratos y ponerlos en los tubos 2,3…..respectivamente, como se observa en la tabla I:

Tabla 1

No. de tubo 1 2 3 4 5 6 7

Glucosa al 1% 1 mlManosa al 1% 1mlGalactosa al 1% 1ml


Maltosa al 1% 1 mlLactosa al 1% 1 ml Sacarosa al 1% 1 mlAlmidon al 1% 1 mlReactivo de fehling A 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotasReactivode Fehling B 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas

3.- Cuando se le agregan las gotas del reactivo de Fehling (A y B) el liquido del tubo de

ensayo adquirirá un fuerte color azul, agitar.

4.- Calentar los tubos a baño maria o directamente en un mechero.

5.- La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo-

6.- La reacción será negativa si la muestra queda azul o cambia a un tono azul-verdoso.

RESULTADOS:

Observe el resultado y anote sus observaciones.

Escriba en la tabla (+) si es positiva o negativo(-)

Carbohidrato Prueba de Fehling Azúcar reductor

Glucosa

Manosa

Galactosa

Maltosa

Lactosa

Sacarosa

Almidón

Identificación de polisacáridos (reacción del lugol)

1.- Colocar 7 tubos de ensayo en una gradilla y numerarlos del 1 al 9.

2.- Medir 3 ml de solución de glucosa y colocar en el tubo No. 1 hacer lo mismo con la

manosa y todas las soluciones de carbohidratos.

3.- Añadir dos gotas de lugol como se indica en la tabla 2.

No. De tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9


Glucosa al 1% 1ml

Manosa al 1% 1 ml

Galactosa al 1% 1 ml

Maltosa al 1% 1ml

Lactosa al 1% 1 ml

Sacarosa al 1% 1 ml

Almidon al 1% 1 ml

Solución de papa 1 ml

Solución de arroz 1 ml

Lugol 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas

RESULTADOS:

Prueba positiva: la solución se torna de color azul -violeta

Escriba en la tabla de resultados (+) o (-)

No. De tubo Presencia de color azul –violetaEs polisacárido

Si o NoGlucosa al 1%Manosa al 1%Galactosa al 1%Maltosa al 1%Lactosa al 1%Sacarosa al 1%Almidon al 1%Solución de papaSolución de arroz

CUESTIONARIO:

1. Escribe la formula de la sacarosa y maltosa, define si son azúcares reductores o no


2. ¿Qué diferencia hay entre el almidón lactosa y glucosa?

3. Da ejemplos de otros polisacáridos

4. ¿Porque la sacarosa se disuelve en agua y el almidón no?

REFERENCIAS:

Baynes J. W., 2006, Bioquímica Médica, 2ª Edicion,Madrid: Elsevier .



Práctica No. 3


DETERMINACIÓN DE pH DE SALIVA Y OTRAS SUSTANCIAS

INTRODUCCION:

ACIDO: es una sustancia o solución donadora de iones hidrógeno, tienen una

concentración de iones hidrógeno mayor que el agua por lo tanto su pH será menor que 7.

BASE: es una sustancia o solución receptora de iones hidrógeno, tienen una

concentración de iones hidrógeno menor que el agua por lo tanto su pH será mayor que 7.

pH: es la concentración de iones hidrógeno(H+), y se dice que es la homeostasis del

ion H+ en el organismo. El pH de algunos liquidos biológicos se muestran en la tabla 1.

Liquido pHPlasma sanguíneo 7.4Liquido intersticial 7.4Liquido intracelular 5.5-6.9Jugo gástrico 1.5-4Leche humana 7.4Saliva 6.4-7Orina 5-8

La neutralidad del plasma y otros líquidos contribuyen al buen funcionamiento

celular. Debe de hacer un equilibrio entre la producción de iones H+ y OH-.

Cambios mínimos de pH representan variaciones notables en la concentración de

iones Hidronio (ejemplo: de un pH 7.4 a pH 7.1), el equilibrio de pH es por medio de

amortiguadores biológicos como:

1. Sistema bicarbonato/acido carbónico que actúa principalmente en el espacio

extracelular.

2. El sistema de fosfatos, es importante en el espacio intracelular sobre todo en

eritrocitos y células tubulares del riñón.

3. Sistema de las proteínas: actúan predominantemente a nivel tisular aunque

también lo hacen en el plasma.

Desequilibrio acido-base: cuando por cualquier circunstancia otológica el pH de la sangre

sale del valor normal, se pueden producir acidosis (descenso de pH sanguíneo ) o alcalosis

(aumento de pH sanguíneo). Estos cambios se deben a la concentración plasmática del

bicarbonato y son de tipo metabólico.


Causas de acidosis: diarrea, insuficiencia tubular renal, obstrucción del tracto urinario,

ayuno prolongado, ingestión de alcohol metílico, anestesia general, sobredosis de sedantes,

paro cardiaco, neumonía prolongada, etc.

Causas de alcalosis: vómito, consumo de diuréticos de mercurio, ingestión de etanol,

ansiedad, histeria, fiebre, tumor, septicemia, etc.

La saliva es un liquido biológico que se encarga de mantenera el pH en la mucosa

oral, ayuda a proteger al esmalte con la regulación del pH, también neutraliza el medio

ácido producido tras las comidas, si se produce un pH pacido se provoca la

desmineralización del esmalte, mientras que si se produce un pH básico se acumula sarro.

OBJETIVOS:

El alumno conocerá dos métodos de determinación de pH en saliva y otras sustancias.

Medir el pH de saliva y otras sustancias

MATERIAL:

Potenciómetro

Vasos de precipitado

Agitador de vidrio

Pizetas

Papel absorbente (sanitas)

Tiras reactivas de pH

REACTIVOS:

Solución buffer pH 7.0


Saliva

plasma

leche

vinagre

jugo de limón

refresco de cola

limpiador domestico

METODO:

1. En un vaso de precipitado colocar el buffer pH 7.0

2. Colocar el electrodo en agua destilada concectar el potenciómetro

3. Secar con papel absorbente el electrodo

4. Colocar el elecrtrodo dentro del vaso de precipitado con buffer pH 7.0 y ajustar a

7.0

5. Enjuagar el electrodo con agua destilada secar.

6. Colocar el electrodo seco en las diferentes soluciones y anotar la lectura.

7. Medir el pH de las soluciones con tiras reactivas de pH.

8. Comparar el color con la carta de colores y determinar el pH.

MUESTRA pH MEDIDO CON POTENCIOMETRO

pH CON TIRAS REACTIVAS

Jugo de limón

Vinagre

Saliva

Plasma

Leche

Refresco de cola

Limpiador doméstico

CUESTIONARIO


1. ¿Qué es el pH?

2. En todas las sustancias se puede medir el pH

3. ¿Cómo está relacionada la acidez y la alcalinidad con el pH?

4. ¿Cuál es el pH de la sangre

5. ¿Cuáles son los principales amortiguadores en el organismo para mantener el pH?

6. ¿Qué es acidosis metabolice y respiratoria

7. ¿Qué es alcalosis metabólica y respiratoria

8. ¿Cuáles son los mecanismos compensadores para la acidosis y alcalosis metabolica

y respiratoria?

REFERENCIAS:


Práctica No. 4


PRUEBA CUALITATIVA DE AMILASA SALIVAL

INTRODUCCION:

En la mayoría de los laboratorios de diagnostico utilizan sangre para realizar los

análisis que nos proporcionarán el diagnostico del paciente, sin embargo, la saliva es un

fluido que ofrece algunas ventajas como: el no necesitar procedimientos invasivos, no se

necesita un equipo especializado para adquirirla. La saliva en otros países como en Estados

Unidos se utiliza para hacer diagnósticos en niños y adultos mayores.

La saliva es un producto de las glándulas salivales y puede ser recolectada de las

glándulas parótidas mientras que en las glándulas submandibulares, sublingual y glándulas

salivales menores, es difícil esta recolección.

La saliva ha sido importante su análisis para detectar algunas patologías en las

glándulas (infección u obstrucción) y también algunos desordenes sistémicos.

La saliva entera o saliva mezclada, es la que se encuentra en cavidad bucal y que al

ser secretada por las glándulas se ha combinado con: secreciones nasales, secreciones

bronquiales, restos de comida, fluido gingival crevicular, productos de microorganismos

orales, suero y derivados de sangre, células epiteliales de descamación.

La saliva puede ser recolectada de dos formas:

Estimulada: se usa un trozo de parafina o estimulo psicológico.

No estimulada: se recolecta la saliva que en ese momento tiene el paciente.

La saliva tiene diferentes funciones como: lubricación, antimicrobiana, amortiguadora,

limpieza, remineralización, digestión, sabor, etc.

Los componentes de la saliva son: enzimas, agua, proteínas, fosfatos, carbonatos,

inmunoglobulinas, etc.

OBJETIVO:

Identificar la presencia de amilasa salival por medio de la hidrólisis del almidón.


MATERIAL:

Tubos de ensaye

REACTIVOS:

Lugol

Solución de almidón al 2%

METODO:

A) Recolección de la saliva

1.- Enjuagarse perfectamente bien la boca

2.- Recolectar aproximadamente 4 ml de saliva en un tubo de ensaye.

Tubo 1 4 ml de saliva 2 ml de almidón

Esperar 10 minutos

Agregar 2 gotas de

lugol

Tubo 2 2 ml de almidón Agregar 2 gotas de

lugol

RESULTADO:

Anotar el cambio de color e interpretar los resultados.

CUESTIONATIO:

1. ¿Cuál es la composición de la saliva?

2. ¿Qué glándulas secretan la saliva y donde están localizadas?

3. ¿Qué es la amilasa salival?

4. En que partes del sistema digestivo se hidrolizan los carbohidratos

5. ¿Qué tipo de carbohidrato es el almidón?

6. ¿Qué función tienen el hígado y el páncreas en la digestión?


REFERENCIAS:

Eliaz Kaufman and Ira B. Lamster. 2002. The diagnostic applications of saliva: a

Review. Crit. Rev. Oral Biol. 13: 197-212.

M. Lenander-Lumikari and V. Loimaranta. 2000. Saliva and Dental Caries. Adv.

Dent. Res. 14: 40-47.

W.M. Edgar and S.M. Higham 1995. Role of Saliva in Caries Models. Adv. Dent.

Res. 9: 235-238.

Práctica No. 5

LÍPIDOS

INTRODUCCIÓN:


Los lípidos son un grupo heterogéneo de biomoléculas los cuales tienen las

siguientes propiedades:

a) Solubilidad: son insolubles en agua y solubles en disolventes no polares (orgánicos)

como el cloroformo, acetona, tetracloruro de carbono, hexano,etc.

b) Estructura química: tiene función de un ester y al ser hidrolizados forman alcoholes

y acidos grasos.(aunque hay algunas excepciones)

c) Asimilación: los lípidos son asimilados (digeridos) por los seres vivos, siendo la

diferencia con respecto a los aceites minerales, los cuales no los pueden digerir los

humanos.

Funciones de los lípidos:

Forman parte de los componentes celulares, también son parte del tejido adiposo

siendo amortiguadores y aislantes térmicos.

Proporcionan energía al cuerpo humano en un 40% de las calorías son aportados

por ellos.

Sirven para transportar sustancias liposolubles en sangre.

Clasificación de los lípidos: (tabla1)

TABLA 1

1.- Lípidos

simples

1.1 Acilgliceroles (están formados por glicerol y acidos grasos)

1.2 Ceras


2.- Lípidos

complejos

2.1Fosfolipidos

2.2 Glucolípidos

2.3 Sulfolípidos

2.4 Lipoproteínas

3.- Grupo

miscelaneo

3.1Terpenos y terpenoides

3.2Esteroles y esteroides

3.3Eicosanoides

Los ácidos grasos forman parte de los lípidos simples, estos pueden ser saturados e

insaturados. Los ácidos grasos esenciales son ácidos grasos poliinsaturados (linoleido y

linolénico), estos no pueden ser sintetizados por los organismos superiores y deben de ser

administrados en la dieta, la carencia de estos puede producir alteraciones fisiológicas que

pueden llegar a provocar la muerte.

Los ácidos grasos al combinarse con sales (álcalis) forman jabones, y

Se caracterizan estos jabones por ser potentes agentes tensoactivos.

OBJETIVOS:

1. Realizar la saponificación de una grasa para obtener jabon.

2. Observar la solubilidad de los lípidos.

MATERIAL:

Tubos de ensayo

gradilla

pinzas moss

Varillas de fidrio

Mechero o parrilla eléctrica

Tripie


Tela de asbesto

Vasos de precipitados

Pipetas

Parafilm

REACTIVOS

Solución de NaOH al 20%

Éter, cloroformo o acetona

4 ml Aceite de oliva(o cualquier aceite vegetal)

METODOS:

Saponificación

1. Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de aceite y 2 ml de NaOH al 20%.

2. Agitar enérgicamente y colocar el tubo a baño maría de 20 a 30 min.

3. Pasado este tiempo se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que

contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia

semisólida que es el jabón formado y una superior lipidica de aceite inalterado.

Solubilidad

1. Poner 2 ml de aceite en dos tubos de ensayo.

2. Añadir a uno de ellos 2 ml de agua y al otro 2 ml de éter y otro disolvente orgánico,

agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.

3. Observar los resultados

CONCLUSIONES

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CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son las diferencias entre un aceite y las grasas?


2. Escriba la reacción de saponificación

3. ¿Qué enzima hidroliza las grasas en el aparato digestivo?}

4. ¿Porque los lípidos son insolubles en agua?

5. ¿Qué es una emulsión?

REFERENCIAS:

Baynes J. W., 2006, Bioquímica Médica, 2ª Edicion,Madrid: Elsevier .




practicas de laboratorio de microbiologia

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