UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

I I INFORME DE INVESTIGACION

CÓDIGO DEL PROYECTO…………….Palabras claves: Mortalidad - Prodiplosis - Heterorhabditis

I. ASPECTO INFORMATIVOI.0. Título del Proyecto :

Mortalidad de pupas de Prodiplosis longifila Gagné “mosquilla de los brotes” (Díptera Cecidomyiidae), por el parasitismo de Heterorhabditis sp (Nematoda: Rhabditidae) en el cultivo de Lycopersicon esculentum Mill “tomate” en Lambayeque.

2.0. Personal Investigador:2.1. Autor : Dra. Carmen Calderón Arias

Docente Principal del Centro de investigación de la FCCBB Teléfonos: 074-224499- 995702150 Email: Carmen cal_2@hotmail.com

2.2. Colaboradores: María Elena Neyra y Darwin Pérez de la Estación Experimental Agraria “Vista Florida del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) . Lambayeque. Denis Pacheco, alumno de la FCCBB

3.0. Resolución de Aprobación:4.0. Tipo de Investigación:

4.1. De acuerdo al fin que se persigue : Aplicada4.2. De acuerdo al diseño de investigación : Experimental

5.0. Régimen de Investigación:5.2. Orientada

Área : Desarrollo Agrícola.Línea : Sanidad vegetal (Entomología Agrícola)Programa : Prevención, diagnóstico, tratamiento y control de plagas.

6.0. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto: 6.2. Institución: Laboratorio de Ciencias Ambientales de la FCCBB – UNPRG. Laboratorio de la Estación Experimental Agraria “Vista Florida del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA). Lambayeque.

7.0. Duración del Proyecto : 12 meses8.0. Fecha de Inicio : 15 Marzo del 20149.0. Fecha de término : 15 de Marzo del 2015

I.- INTRODUCCION

El cultivo Lycopersicon esculentum Mill “tomate”, es la verdura de mayor consumo en el mundo, con una producción mundial al año que llega a los 130 millones de toneladas. (FAO, 2011)). En años recientes, la demanda de tomate está creciendo aceleradamente no solamente en los países desarrollados sino también en los países emergentes y en vías de desarrollo, porque los valores nutritivos del tomate (minerales, licopeno, entre otros) están llamando la atención del mundo (FAO, 2011).

En el Perú, la producción de tomate está en alrededor de 160 mil t, en una superficie de 5 mil ha. El rendimiento promedio nacional se mantiene en alrededor de 30 t/ ha, pero varía mucho entre regiones: en Ica, por ejemplo, se alcanza rendimientos de 80 t/ha (Ica y Lima concentran cerca del 70% de la producción de tomate).Las mayores zonas de producción de tomate en el Perú son: Lima (Rímac, Chillón, Lurín), La Libertad, Ica, Huaral-Chancay, Barranca, Huacho, Cañete, Arequipa y Lambayeque. El manejo de sus plagas, es de mucha importancia para poder obtener los rendimientos deseados, ya que un descuido en el control de las poblaciones, puede llegar a causar daños económicos irreparables (Valarezo et al., 2003).

Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” (Díptera –Cecidomyiidae), es un insecto plaga que desde sus primer reporte en 1986 fue considerado problema entomológico de cuidado y desde entonces se ha convertido en una limitante para el desarrollo del cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) ya que en muchas zonas, es el principal problema entomológico, pudiendo ocasionar pérdidas hasta del 100% de la producción (Valarezo et al., 2003). Su complejidad es tal, que para su control utilizan indiscriminadamente productos químicos que promueven el alto grado de contaminación del ambiente y de los alimentos, deterioro del equilibrio biológico, desarrollo de resistencia y frecuentemente la pérdida de rentabilidad que induce inclusive al abandono del cultivo (INIAP, 1989).

En el Perú se reporta a Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” desde 1979, afectando frutos de tomate, alfalfa y papa (Díaz,1981). Posteriormente en el valle de Cañete, se observó resistencia por el uso indiscriminado de insecticidas que se utilizaba para el control de “mosca minadora” en papa . A partir de este momento, la “mosquilla de los brotes tomó mucha importancia, y se convirtió en un insecto plaga muy dañino en los cultivos de alfalfa, papa, marigold y espárrago; ubicándose en toda la costa de Tacna a Tumbes ( Bayer, 1995).

Se han realizado diversos estudios sobre Manejo Integrado de esta “mosquilla de los brotes”; sin embargo, debido al uso indiscriminado de

insecticidas, su control aún sigue siendo difícil. Mujica y Cisneros (1997) , señalan, que la protección de los controladores biológicos, debe ser una labor integral y prioritaria dentro de un Programa de Manejo Integrado para Prodiplosis longifila ; indican así mismo, que se deben realizar trabajos orientados a la búsqueda de parasitoides u otros controladores biológicos con posibilidades de crianza masiva, así como a la protección de los enemigos naturales para evitar el uso indiscriminado d de insecticidas de amplio espectro.

Los nemátodos entomopatógenos de las familia Heterorhabditidae podrían constituir una alternativa ecológica importante para el control de Prodiplosis longifila ya que son considerados agentes importantes de control biológico de muchas plagas por varios aspectos: Sus larvas infectivas juveniles del tercer estadio (J3 o IJ) buscan activamente insectos hospederos en el suelo (Dix et al.1991). Son los únicos evolucionados que han desarrollado la capacidad de relacionarse con una bacteria simbionte que mata al hospedero rápidamente. Presentan alta virulencia, facilidad para ser reproducidos masivamente ya sea in vivo e in vitro (Quinteros 2003; CENICAÑA 2004). Atacan a varias especies de los órdenes Thysanura, Coleóptera, Lepidóptera, Orthóptera y Díptera (Kaya & Gaugler 1990).

Los reportes sobre control de Prodiplosis longifila Gagné “mosquilla de los brotes” con los nematodos Heterorhabditis sp ,son escasos . Castillo (2001), en su trabajo sobre Manejo Integrado de Prodiplosis longifila en el cultivo de Asparagus officinalis, en CHAVIMOCHIC- TRUJILLO, reporta a Heterorhabditis parasitando a Prodiplosis lognifila, pero no existen datos consistentes, referente a este trabajo.

En el Departamento de Lambayeque, en la zona de Monsefú, Callanca y Reque se cultiva tomate para abastecer a los mercados de todo el Departamento. Los agricultores realizan hasta 15 aplicaciones por campaña (Calderón, 2010) para el control de plagas en tomate, siendo Prodiplosis longifila Gagné “mosquilla de los brotes” o “caracha” , una de las de mayor importancia económica. El nemátodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. presente, en nuestros campos agrícolas de Lambayeque, podría constituir una alternativa ecológica promisoria para el control de esta plaga por lo que es importante investigar al respecto. Esta problemática , nos llevó a plantearnos la siguiente hipótesis y los siguientes objetivos específicos:

Hipótesis:Heterorhabditis sp (Nematoda: Rhabditida) por su parasitismo, sí produce la mortalidad de pupas de Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” (Díptera –Cecidomyiidae) en el cultivo de Lycopersicon esculentum Mill“tomate” , en

condiciones de laboratorio de la Estación Experimental Agrícola Vista Florida- INIA . Lambayeque.

Objetivos específicos:1.-Recolección de larvas y pupas estaba crianza de Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” (Díptera – Cecidomyiidae) en el cultivo de Lycopersicon esculentum Mill“tomate” para obtener la población de pupas en condiciones de laboratorio de la Estación Experimental Agrícola Vista Florida- INIA. Lambayeque.

2.-Evaluar si la mortalidad de pupas de Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” (Díptera –Cecidomyiidae) son ocasionadas por el parasitismo de Heterorhabditis sp (Nematoda: Rhabditida) en condiciones de laboratorio de la Estación Experimental Agrícola Vista Florida- INIA . Lambayeque.

mejorarlo

II.- MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes del Problema

Desde hace muchos años, se han realizado estudios importantes en todo el mundo utilizando nematodos como una alternativa para reducir el uso de plaguicidas. Lindegren y Vail en 1986, analizaron la susceptibilidad de la mosca de la fruta Ceratitis capitata, D. curcubitae y de la mosca oriental de la fruta D. dorsalis a Steinernema feltiae, en condiciones de laboratorio y encontron una mortalidad de larvas que varió del 92% al 9% para Ceratitis capitata, 85% para D. curcubitae y de 86 % para D. dorsalis. Así mismo, Lindegren et. al. (1990), bajo condiciones de campo encontraron una mortalidad significativa al evaluar el parasitismo causado por S. feltiae en prepupas de Ceratitis capitata usando concentraciones de 5000, 1500, 500 y 150 juveniles infectivos por cm2, teniendo como resultado una CL50 de 38 nematodos / cm2 en un área superficial del suelo.

Hara et al. ( 1993) , investigaron también bajo condiciones de laboratorio con 20 especies de Esteinermatidos y Heterorhabditidos contra la larva de la “mosca minadora”, Liriomyza trifolii (Burgess) Agromyzidae. En los resultados obtuvieron un control que varió de 48 a 98 % donde carpocapsae mostró ser el nematodo más patógeno.Esta forma de control se plantea como una opción para prevenir la resistencia de Liriomyza trifolii a los plaguicidas.

Resultados similares fueron obtenidos por LebecK et al. , (1993), quienes señalan que S. carpocapsae causó el 93.3% de mortalidad de Liriomyza Trifolii, además mencionan que a excepción de la tercera etapa larvaria, en todas las etapas de la plaga, S. carpocapsae fue capaz de reproducirse.

En el Perú debido a la resistencia de las plagas a los plaguicidas se siguen buscando alternativas ecológicas que permitan reducir las pérdidas económicas por los daños ocasionados. Alcázar et. al (2013 ) , han realizado trabajos utilizando nematodos Heterorhabditis indica, resultando patogénico a larvas de mosca minadora Liriomyza huidobrensis en laboratorio, invernadero y campo. Sin embargo es importante conocer también su efecto sobre parasitoides de la mosca minadora. En los estudios realizados en el Centro Internacional de la Papa .Lima se encontró que la la aplicación de nematodos redujo la población de mosca en un 98%, Chysocharis flacilla pudo parasitar larvas de la mosca después de la aplicación de nematodos y la proporción del parasitismo no se vio afectada por la aplicación de nematodos para el control de mosca minadora en papa.

Castillo (2006), en su trabajo sobre Manejo Integrado de Plagas en el cultivo de espárrago registra a Heterorhabditis atacando a la plaga de Prodiplosis lognifila Gagnéen en la Irrigacion de CHAVIMOCHIC de la Libertad, sin embargo en el departamento de Lambayeque no existen registros de control de Prodiplosi lognifilla con Heterorhabditis.

2.2. Base TeóricaLos nemátodos entomopatógenos de las familias Heterorhabditidae y

Steinernematidae son considerados agentes importantes de control biológico por varios aspectos: Sus larvas infectivas juveniles del tercer estadio (J3 o IJ) buscan activamente insectos hospederos en el suelo (Dix et al.1991). Son los únicos evolucionados que han desarrollado la capacidad de relacionarse con una bacteria simbionte que mata al hospedero rápidamente. La bacteria pertenece a la familia Enterobacteriacea y se conocen principalmente dos géneros Xenonorhabdus en asociación con Steinernematidae y Photo-rhabdus con Heterorhabditidae.

Presentan alta virulencia, facilidad para ser reproducidos masivamente ya sea in vivo e in vitro (Quinteros 2003; CENGICAÑA 2004).

Las especies y cepas nativas de Heterorhabditidos y Steinernematidos han sido aisladas del suelo y de insectos infestados en muchas partes del mundo tales como los países de México, Colombia, Estados Unidos y ocho países del continente europeo.

Gonzáles (1998) desarrollaron el método para recuperar nematodos parásitos de insectos de muestras de suelo, con larvas de la polilla mayor de la cera G. mellonella. Los resultados de extensas inspecciones utilizando éste

método, han demostrado que están ampliamente distribuidos y son comunes en todos los continentes (Poinar 1990).

Según, Timper et al.,1988;Kaya y Gaugler,1993; YKaya,1993, los nematodos de las familias Steinernematide y Heterorhabditidae, poseen los atributos de un agente de control biológico “ideal”,teniendo en cuenta que no afectan adversamente a los animales, organismos no objetivos, plantas y tampoco contaminan el ambiente.Por su distribución geográfica, Heterorhabditis es ubicuo y sus especies se encuentran presentes en todo el mundo .Por el rango de hospederos, atacan a varias especies de ordenes Thysanura, Coleóptera, Lepidóptera, Ortóptera y Díptera (Gaugler y Kaya, 1990; Kaya,1990); además, sólo en América Latina alrededor de 100 especies de 11 órdenes de insectos son susceptibles a estos nematodos (Poinar,1979).Las larvas del tercer estadio juvenil constituyen una forma especializada para sobrevivir, dispersarse e invadir al hospedero(Kaya y Gaugler,1993). Estos nematodos pueden ser producidos en masa, aplicados con un equipo convencional, y son también compatibles con el uso de insecticidas químicos (Grewal et al, 2001)

III.- METODOLOGIA.-

La metodología se ha diseñado, de acuerdo a los objetivos trazados en la presente investigación y en esta primera parte del desarrollo del proyecto se ha está cumpliendo con el desarrollo de la metodología del primer objetivo que es:

3.1. Crianza masiva de Prodiplosis longifila “mosquilla de los brotes” (Díptera – Cecidomyiidae) en el cultivo de Lycopersicon esculentum Mill“tomate” para obtener la población de pupas en condiciones de laboratorio de la Estación Experimental Agrícola Vista Florida- INIA. Lambayeque

La crianza de la plaga de Prodiplosis lognifila se está realizando en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Pedro Ruiz Gallo Lambayeque para lo cual se están obteniendo los siguientes resultados:

RESULTADOS.-

Las muestras de larvas de Prodiplosis longifila “caracha” , se colectaron de

diferentes campos de cultivo del distrito de Reque, Lambayeque (Figura 1), siendo

su ubicación geográfica 06°52’00” latitud Sur y 79º49’27” longitud Oeste . Estos

campos, están sembrados con Lycopersicum sculentum “ tomate” (fig: 2), de

donde se han obtenido las larvas para ser transportadas al laboratorio

biotecnología y control integrado de plagas de la Universidad Nacional Pedro

Ruiz Gallo en Lambayeque.

En la figura 3, se presentan los frutos de tomates infestados por larvas de la

caracha , en donde se puede observar el daño ocasionado por este insecto.

Figura 1. Ubicación geográfica de Reque – Lambayeque – Perú

Figura 2. Campo cultivado con Lycopersicon sculentum “ tomate” en Reque, donde se colectaron larvas

de Prodiplosis lognifilia “Caracha”.

Figura 3 a.- Frutos de Lycopersicon sculentum “ tomate” en donde se observan las larvas

de Prodiplosis lognifilia “Caracha”.

. REPRODUCCIÓN DEL NEMÁTODO ENTOMOPATÓGENO Heterorhabditis bacteriophora EN LABORATORIO.

Para la aplicación de los nematodos en campo, se tuvo que realizar

primero, la reproducción de estos NEP en Laboratorio, siendo este el Laboratorio

de crianza de la Estación Experimental Vista Florida del Instituto Nacional de

Innovación Agraria (INIA) - Chiclayo; para lo cual, se inició la producción con la

cepa de Nemátodos Entomopatógenos (NEP) “Santa Rosa”, a la cual llamaremos

“solución madre”, otorgada por SENASA - Lambayeque (originalmente de Huaral-

Lima), siguiendo la metodología de la Figura 6

3.2.1. Técnica in vivo para obtener Nemátodos Entomopatógenos

La Técnica in vivo fue propuesta por Kaya & Stock (1997) que a la vez

se modificó en la presente investigación con referencia a la metodología utilizada

por Casusol & Neira, 2011.

Se colocó en la base de un taper plástico BASA N°5 dos hojas de

papel toalla, con la ayuda de una jeringa hipodérmica de 20 mL, se esparció

uniformemente el 50% de la solución madre (con unos 20,000 NEP) (Figura 7. a);

luego se colocaron 500 larvas del último estadío de Galleria mellonella (brindadas por el Laboratorio de Insectos útiles de la Estación Experimental Vista

Florida INIA-Chiclayo) (Figura 7. b), las mismas que fueron cubiertas por otras 2

hojas de papel toalla y finalmente se esparció el 50% de la solución madre

restante (Figura 7. c).

Finalmente se tapó herméticamente el taper (Figura 7. d) y se

acondicionó a temperatura ambiente (25ºC y 85%HR recomendadas por Kaya

&Stock, 1997); a partir del quinto día se observó la infestación de las larvas de G.

mellonela por NEP de acuerdo al cambio de color de las larvas de cremoso a

color rojo o marrón rojizo. Como se puede observar en la Figura 8, el cambio de

color de Galleria mellonella por la presencia de los Nemátodos Entomopatógenos

(NEP) en su interior.

3.2.2. Método estándar para colectar juveniles infectivos (JI)Después de 11 días las larvas de Galleria mellonella muertas fueron

separados y acondicionados en trampas White (modificadas Casusol & Neira,

2011). Estas trampas consistieron de un taper BASA N°5con un soporte de

plástico en el fondo de éste, sobre el cual se colocó una rejilla de plástico, y

encima de ésta las larvas infestadas por NEP, además se agregó 150 mL de agua

destilada en el fondo del taper. Los juveniles infectivos decantaron en el agua

destilada y fueron colectados para su posterior conteo (Figura 9).

2.3.5.3.1. Multiplicación de los Nematodos Heterorhabditis sp.

Crianza de Galleria mellonellaSe realizará la crianza de Galleria mellonella “Polilla de la cera” con el

propósito de disponer de larvas en las cuales se realizará el aislamiento y multiplicación de los Nemátodos Entomopatógenos (Bedding & Akhurst, 1975; Kaya & Stock, 1997).

Aislamiento y multiplicacion del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp.

Los nematodos aislados están representados por nematodos entomopatógenos nativos del Género Heterorhabditis (Heterorhabditis sp) aislado del Distrito de Reque, Provincia de Chiclayo, Departamento de Lambayeque. Se podrá trabajar con estos nematodos gracias al apoyo de la Ing. María Elena Neyra Espejo y al biólogo Edgar Darwin Pérez Tesén del Instituto Nacional de Innovación Agraria-Estación Experimental Agraria “Vista Florida”-Lambayeque, Perú (INIA-EEA “Vista Florida”).

Las larvas de Galleria mellonella afectadas por el nematodo de género Heterorhabditis se distinguen por presentar una coloración rojiza oscura (Bedding & Akhurst, 1975). Los nematodos seleccionados para la realización del presente trabajo serán producidos en larvas de ultimo instar de Galleria mellonella a 23 °C, luego cada larva afectada por nematodos se lavará con agua destilada y se recuperarán los nematodos en trampas White de acuerdo a la metodología descrita por Kaya & Stock (1997).Los juveniles infectivos serán almacenados en agua con formaldehido al 0.01% a 10 °C durante 5-7 días y un día antes de su inoculación serán aclimatadas a 23 °C.

Cuantificación de Nematodos y Conservación

Para el contaje de los nematodos se utilizará el método de la dilución volumétrica de Lecuona , citado por Mayta, 2008.Se colocará con una micropipeta 10 µl de la suspensión inicial en una placa de Petri (5cm de diámetro) rayada o dividida y se realizará el conteo directo de los nematodos al estereoscopio. Este procedimiento se repetirá tres veces. La concentración de nematodos se determinará mediante la siguiente formula:

Donde:A=V.a/v

A = numero de nematodos en la soluciona = numero de nematodos en la muestraV = volumen de la soluciónv= volumen de la muestra

Respecto al almacenamiento de los nematodos,los juveniles infectivos obtenidos en las trampas White serán vaciados en un vaso de precipitación y luego se agregará agua destilada.Luego los JI concentrados en agua destilada serán absorbidos por esponjas rectangulares y almacenados en bolsas de polietileno.

Figura 3 b.- Frutos de Lycopersicon sculentum “ tomate” en donde se observa el daño

por Prodiplosis lognifilia “Caracha”.

Las larvas colectadas en el campo, posteriormente fueron trasladadas al laboratorio y fueron acondicionadas en jaulas (figura 4), para su posterior recuperación como pupas, que luego transformadas en adultos logren la oviposición.

No se pudo lograr la cópula en laboratorio, quizás porque las condiciones ambientales no fueron las adecuadas, por eso hemos optado por trabajar a

campo abierto en donde reciban directamente los rayos solares, este trabajo se sigue realizando y se presenta en la figura 5

Figura 4 .- Larvas de Prodiplosis lognifilia “Caracha” acondicionadas en el laboratorio

Figura 4 .- Plántulas de Lycopersicon sculentum acondicionadas en campo abierto.

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