genų veiklos reguliavimas

BAKTERIJŲ BAKTERIJŲ

IR EUKARIOTŲ IR EUKARIOTŲ

GENŲ VEIKLOS GENŲ VEIKLOS REGULIACIJAREGULIACIJA

6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA

Genų veiklos reguliacija reiškia, kad, esant skirtingoms sąlygoms, genų ekspresijos intensyvumas gali skirtis

Nereguliuojami genai vadinami esminiais (constitutive) Jų ekspresijos lygis iš esmės yra pastovus Dažniausiai esminiai genai koduoja baltymus, būtinus

organizmui išgyventi Genų reguliacijos pranašumas yra tas, kad

reguliuojamų genų koduojami baltymai gaminami tik tada, kada to reikia

6-2

6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA

Genų reguliacija yra svarbi tokiems ląstelėje vykstantiems procesams, kaip Metabolizmas Atsakas į aplinkos stresą Ląstelių dalijimasis

Reguliacija gali vykti bet kuriame genų ekspresijos etape. Todėl bakterijose ji gali būti: Transkripcinė Transliacinė Potransliacinė

6-3

Dažniausiai genų ekspresija bakterijose reguliuojama transkripcijos lygmenyje

RNR sintezės laipsnis gali būti padidintas arba sumažintas

Transkripcinėje reguliacijoje dalyvauja dviejų pagrindinių tipų reguliaciniai baltymai Represoriai Jungiasi prie DNR ir nuslopina transkripciją Aktyvatoriai Jungiasi prie DNR ir skatina transkripciją

Transkripcinė reguliacija, vykdoma represorių, vadinama neigiama kontrole

Transkripcinė reguliacija, vykdoma aktyvatorių, vadinama teigiama kontrole

6.2. TRANSKRIPCINĖ REGULIACIJA

6-4

Mažos efektorių molekulės taip pat veikia transkripcinę reguliaciją

Tačiau jos jungiasi prie reguliuojančių baltymų, o ne tiesiogiai prie DNR

Kai kada mažos efektorių molekulės gali sustiprinti transkripciją

Tokios molekulės vadinamos induktoriais Induktoriai veikia dviem būdais

Prisijungia prie aktyvatorių ir paskatina juos jungtis prie DNR Prisijungia prie represorių ir neleidžia jiems jungtis prie DNR

Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami indukuojamais

Kitais atvejais mažos efektorių molekulės gali slopinti transkripciją

Korepresoriai jungiasi prie represorių ir skatina juos jungtis prie DNR Inhibitoriai jungiasi prie aktyvatorių ir neleidžia jiems prisijungti prie

DNR Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami represuojamais

6-5

6-6

Reguliuojantys baltymai turi dvi prisijungimo vietas

Vieną mažai efektoriaus molekulei

Kitą - DNRb) Baltymas represorius, korepresoriaus molekulė, represuojamas genas

a) Baltymas represorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas

6-7

c) Baltymas aktyvatorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas

d) Baltymas aktyvatorius, inhibitoriaus molekulė, represuojamas genas

Operonas yra reguliacinis genomo vienetas, sudarytas iš kelių struktūrinių genų, kontroliuojamų vieno promotoriaus Jis koduoja policistroninę mRNR, turinčią dviejų ar

daugiau struktūrinių genų koduojančias sekas Jis leidžia bakterijai koordinuotai reguliuoti grupę genų,

kurie koduoja baltymus, atliekančius panašias funkcijas

Operoną sudaro keletas įvairių sričių Promotorius; operatorius; struktūriniai genai;

terminatorius

lac operonas

6-8

6-9

lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai 1. Tikrasis lac operonas

a. DNR elementai Promotorius Jungiasi RNR polimerazė Operatorius Jungiasi lac baltymas represorius CAP vieta Jungiasi katabolizmą aktyvinantis baltymas (CAP -

Catabolite Activator Protein) b. Struktūriniai genai

lacZ Koduoja -galaktozidazę Fermentiškai skaido laktozę ir jos analogus Verčia laktozę į alolaktozę (izomerą)

lacY Koduoja laktozės permeazę Membraninis baltymas, reikalingas laktozės transportui į ląstelę

lacA Koduoja transacetilazę Kovalentiškai modifikuoja laktozę ir jos analogus Funkcinė paskirtis kol kas neaiški

6-10

2. lacI genas Nėra lac operono sudedamoji dalis

Turi savo promotorių (i promotorių)

Vyksta palyginti neintensyvi, tačiau pastovi ekspresija

Koduoja lac represorių

lac represoriaus baltymas funkcionuoja kaip tetrameras

lac operono represijai reikia labai nedidelio represoriaus baltymo kiekio

Vienoje ląstelėje paprastai randama dešimt tetramerinių represoriaus baltymų

lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai

6-11

Laktozės permeazės ir -galaktozidazės funkcijos bakterijų ląstelėse

lac operoną transkripciškai gali reguliuoti 1. Represoriaus baltymas 2. Aktyvatoriaus baltymas

Pirmuoju atveju veikia indukuojamas neigiamos kontrolės mechanizmas Jame dalyvauja lac represoriaus baltymas Induktorius yra alolaktozė

Ji prisijungia prie lac represoriaus ir jį inaktyvina

lac operoną reguliuoja baltymas represorius

6-12

6-13Todėl nėra ir alolaktozės

RNR pol negali pasiekti

promotoriaus

lac operonas represuotas

a) Aplinkoje laktozės nėra

Pastovi ekspresija

lac represorius jungiasi prie operono ir

inhibuoja transkripciją

6-14

Represoriaus konformacija pakinta

Kažkiek jos pavirsta į alolaktozę

Jis daugiau nebegali jungtis prie operatoriaus

lac operonas indukuotas

b) Aplinkoje yra laktozės

6-15

lac operono indukcijos ir represijos ciklas

Represorius nepilnai inhibuoja transkripciją

Todėl sintetinami labai maži fermentų kiekiai

Į ląstelę patenka nedidelis kiekis laktozės, kurią -galaktozidazė

verčia į alolaktozę. Represorius atsikabina nuo

operatoriaus

Sintetinami lac operono baltymai. Tai skatina

efektyvų laktozės metabolizmą

Laktozės ištekliai išsenka. Alolaktozės kiekis sumažėja.

Represoriaus baltymas jungiasi prie operatoriaus

Dauguma baltymų, dalyvaujančių laktozės įsisavinime, degraduoja

Detalūs genetiniai ir kristalografiniai tyrimai parodė, kad lac represoriaus prisijungimas yra sudėtingesnis procesas, nei manyta anksčiau

Iš viso buvo nustatytos trys operatoriaus vietos O1 Tuoj pat už promotoriaus

O2 Pasroviui lacZ koduojančioje srityje

O3 Šiek tiek prieš srovę CAP vietos atžvilgiu

lac operonas turi tris operatoriaus vietas lac represoriui prisijungti

6-16

6-17Trijų lac operatoriaus vietų nustatymas

Represijos laipsnis 1,300 kartų

Taigi, transkripcijos lygis yra 1/1,300 palyginus su lygiu, kai

terpėje yra laktozės

Represijos nėra

t.y.: pastovi ekspresija

Šie rezultatai patvirtina hipotezę, kad efektyvi represija vyksta tada, kai lac represorius jungiasi prie dviejų iš trijų operatorių Jis gali jungtis prie O1 ir O2 , arba prie O1 ir O3,

tačiau ne prie O2 ir O3

Jei trūksta O2 arba O3, maksimali ekspresija nėra pasiekiama

lac represoriaus prisijungimas prie dviejų operatoriaus vietų reikalauja DNR kilpos susiformavimo DNR kilpa suartina operatorių vietas

Tai palengvina represoriaus baltymo prisijungimą

6-18

6-19

Kiekvienas represoriaus

dimeras jungiasi prie vieno

operatoriaus

Kiekvienas represoriaus

dimeras jungiasi prie vieno

operatoriaus

DNR kilpų, kurias suformuoja prisijungdamas lac represorius, konfigūracija

lac operonas gali būti transkripciškai reguliuojamas ir kitu būdu, kuris vadinamas katabolitų represija

Jei aplinkoje yra tiek laktozės, tiek ir gliukozės, E. coli pradžioje naudoja gliukozę, o katabolitų represija

neleidžia naudoti laktozę. Kai gliukozės atsargos išsenka, katabolitų represija

susilpnėja ir vyksta lac operono ekspresija

lac operoną taip pat reguliuoja ir baltymas aktyvatorius

6-20

Pati gliukozė nėra ta maža efektoriaus molekulė, reguliuojanti lac operono veiklą katabolitų represijos būdu.

Šiame genetinės reguliacijos būde dalyvauja maža molekulė, vadinama cikline AMP (cAMP) Ją iš ATP gamina fermentas adenililciklazė

cAMP jungiasi prie baltymo aktyvatoriaus, vadinamo CAP (Catabolite Activator Protein)


6-21

cAMP-CAP kompleksas vykdo indukuojamą teigiamą genetinę kontrolę cAMP-CAP kompleksas jungiasi prie CAP vietos, esančios

netoli lac promotoriaus, ir skatina transkripciją

Esant gliukozės fermentas adenililciklazė inhibuojamas Tai sumažina cAMP kiekį ląstelėje

Todėl cAMP nebeprisijungia prie CAP Transcripcijos intensyvumas krenta


6-22

6-23

(b) Ląstelėje yra laktozės, bet ne cAMP

a) Ląstelėje yra cAMP ir laktozės

6-24

c) Ląstelėje yra cAMP, bet ne laktozės

d) Ląstelėje nėra nei cAMP, nei laktozės

trp operonas dalyvauja aminorūgšties triptofano biosintezėje

Genai trpE, trpD, trpC, trpB ir trpA koduoja fermentus, dalyvaujančius triptofano biosintezėje

Genai trpR ir trpL dalyvauja reguliacijoje trpR Koduoja trp represoriaus baltymą

Dalyvauja represijoje trpL Koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu”

Dalyvauja procese, vadinamame ateniuacija

trp operonas

6-25

6-26

trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp represoriaus baltymui

Negali prisijungti prie operatoriaus

vietos

RNR pol gali prisijungti prie promotoriaus

a) Mažai triptofano, vyksta viso operono transkripcija

6-27


b) Daug triptofano, vyksta operono represija

6-28


Kitas reguliacijos mechanizmmas

c) Daug triptofano, vyksta ateniuacija

Ateniuacija vyksta bakterijose dėl to, kad jose transkripcija ir transliacija gali vykti vienu metu

Vykstant ateniuacijai transkripcija prasideda, tačiau ji nutrūksta dar nepasigaminus pilnai mRNR

Tokiai terminacijai vykti yra svarbus DNR segmentas, vadinamas ateniuatoriumi (silpnintuvu)

trp operone transkripcija sustoja netoli po trpL srities Toiu būdu ateniuacija sustabdo tolesnę triptofano biosintezę

trp operono segmentas, esantis iš karto pasroviui nuo operatoriaus vietos yra esminis ateniuacijai vykti

Pirmasis trp operono genas yra trpL Jis koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu”

6-29

6-30trpL mRNR seka, gaunama ateniuacijos metu

Dėka šių dviejų kodonų yra nustatoma, ar yra pakankamai

triptofano transliacijai vykti

Paskui 3-4 kilpą seka U seka

2-a sritis yra komplementari 1-ai ir 3-iai sritims 3-ia sritis yra komplementari 2-ai ir 4-ai sritims

Todėl gali susidaryti keletas “smeigtuko galvučių”

Ji veikia kaip vidinis (nuo nepriklausomas)

terminatorius

“Smeigtuko galvutės” formavimasis tarp 3-4 sričių priverčia RNR pol pabaigti transkripciją trpL geno pabaigoje

3-4 “smeigtuko galvutės” susidarymas priklauso nuo trpL mRNR transliacijos

Galimi trys variantai 1. Transliacijos nėra 2. Ląstelėje triptofano mažai 3. Ląstelėje triptofano daug

6-31

6-32

“Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai nuo transliacijos sąlygų

Nevyksta vienalaikė transliacija ir transkripcija

Gaunama stabiliausia mRNR forma

Transkripcija sustoja iš karto už trpL geno

a) Transliacijos nėra

6-33


Nepakankamas tRNRtrp kiekis

1-a sritis blokuojama

Struktūra tarp 3-4 sričių nesusidaro

RNR pol transkribuoja likusią operono dalį

b) Ląstelėje triptofano mažai, susidaro struktūra tarp 2-3 sričių

6-34


Pakankamas tRNRtrp kiekis

trpL mRNR transliacija vyksta iki stop kodono

2-oji sritis negali sudaryti bazių porų su jokia kita sritimi

Susiformuoja “smeigtuko galvutė “

tarp 3-4 sričių

Transkripcija sustoja

RNR polimerazė sustoja

c) Ląstelėje triptofano daug, susidaro struktūra tarp 3-4 sričių

Daugelio operonų tyrimai išryškino bendrąsias indukcinės ir represinės reguliacijos ypatybes

Operonai, dalyvaujantys katabolizme (t.y., medžiagų skaidyme), dažniausiai yra indukuojami

Medžiaga, kuri turi būti skaidoma (arba susiję junginiai), yra induktoriai

Operonai, dalyvaujantys anabolizme (t.y., medžiagų biosintezėje) dažniausiai yra represuojami

Inhibitorius arba korepresorius yra maža molekulė, kuri yra operono produktas

Indukcinė ir represinė reguliacija

6-35

Bakterijų genų reguliacija dažniausiai vyksta transkripcijos lygmenyje Tačiau taip pat yra nemažai pavyzdžių tokios reguliacijos,

kuri vyksta vėlesnėse genų ekspresijos stadijose

Pavyzdžiui, genų ekspresijos reguliacija taip pat gali būti: transliacinė potransliacinė

6.3. TRANSLIACINĖ IR POTRANSLIACINĖ REGULIACIJA

6-36

Kai kurių bakterinių genų mRNR transliacija yra reguliuojama prisijungiant baltymams

Transliaciniai reguliaciniai baltymai atpažįsta sekas, esančias mRNR

Daugeliu atveju tokie baltymai inhibuoja transliaciją Jie vadinami transliaciniais represoriais

Transliacinė reguliacija

6-37

Transliaciniai represoriai inhibuoja transliaciją vienu iš dviejų būdų:

1. Prisijungdami šalia Shine-Dalgarno sekos ir/ar starto kodono

Tai steriškai trukdo ribosomoms inicijuoti transliaciją

2. Prisitvirtindami už Shine-Dalgarno sekos/starto kodono ribų

Jie stabilizuoja antrinę mRNR struktūrą taip, kad nevyktų iniciacija

Transliacinė represija taip pat aptinkama eukariotuose


6-38

Antrasis transliacinės reguliacijos būdas yra antiprasminės (antisense) RNR sintezė Tai yra RNR grandinė, kuri komplementari mRNR

Tokiu būdu yra reguliuojamas E.coli genas, atsakingas už osmoreguliaciją - sugebėjimą kontroliuoti vandens kiekį ląstelėje

E. coli baltymas ompF yra svarbus osmoreguliacijai Jį koduoja ompF genas (outer membrane protein F) OmpF baltymas yra sintetinamas esant žemam osmoziniam slėgiui

Esant aukštam osmoziniam slėgiui jo sintezė sumažėja


6-39

6-40

Už ompF geno inhibiciją esant aukštam osmoziniam slėgiui yra atsakingas kitas genas, vadinamas micF

micF RNR nekoduoja baltymo Tačiau ji yra komplementari geno ompF mRNR

Todėl ji vadinama antiprasmine RNR

Jos transliacija blokuojama

Įprastas metabolizmo fermentų aktyvumo reguliacijos būdas yra grįžtamojo ryšio (feedback) inhibicija

Galutinis metabolizmo kelio produktas gali inhibuoti fermentą, veikiantį ankstyvosiose kelio stadijose

Potransliacinė reguliacija

6-41

6-42

Jei 3-io produkto koncentracija pasidaro didelė,

jis jungiasi prie 1-o fermento, taip inhibuodamas jo gebėjimą

paversti 1-ą substratą 1-u produktu

Fermentas 1 yra alosterinis fermentas, turintis dvi skirtingas prisijungimo vietas

Katalitinę vietą jungiasi substratas

Reguliacinę vietą jungiasi galutinis produktas

Kita baltymų funkcijos kontrolės strategija yra jų struktūros kovalentinė modifikacija

Kai kurios modifikacijos yra negrįžtamos Proteolitinis perdirbimas Prostetinių grupių, karbohidratų ar lipidų prijungimas

Kitos modifikacijos yra grįžtamos ir baltymų funkciją paveikia laikinai Fosforilinimas (–PO4)

Acetilinimas (–COCH3)

Metilinimas (–CH3)

Potransliacinė reguliacija

6-43

6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA

Eukariotų organizmai gauna daug naudos iš genų veiklos reguliavimo

Pavyzdžiui: Jie gali reaguoti į maisto prieinamumo pokyčius Jie gali reaguoti į aplinkos stresus

Augalų ir gyvūnų daugialąstiškumas ir sudėtingesnė ląstelės struktūra taip pat reikalauja ir žymiai didesnės ir įvairesnės genų ekspresijos

6-44


Genų reguliacija būtina užtikrinant: 1. Taisyklingą genų ekspresiją įvairių vystymosi

stadijų metu Kai kurių genų ekspresija vyksta tik embrione, tuo tarpu

kitų – tik suaugusiame organizme 2. Skirtumus tarp skirtingų ląstelių tipų

Nervų ir raumenų ląstelės atrodo tokios skirtingos tik dėl to, kad skiriasi jų genų reguliacija (o ne DNR sekos)

6-45


Eukariotų genų ekspresija reguliuojama šiuose lygmenyse: Transkripcijos

Reguliaciniai transkripcijos veiksniai gali indukuoti arba inhibuoti transkripciją

Chromatino kompaktizacijos laipsnis veikia transkripciją DNR metilinimas (dažniausiai) inhibuoja transkripciją

RNR brendimo Alternatyvus splaisingas keičia egzonų pasirinkimą RNR redagavimas pakeičia bazių sekas mRNR

Transliacijos Iniciacijos faktorių veikla gali būti modifikuojama fosforilinant Transliaciją gali reguliuoti baltymai, prisijungiantys prie mRNR 5’ galo mRNR stabilumas gali keistis dėl prisijungiančių baltymų

Potransliaciniame Baltymų funkcija gali būti modifikuojama grįžtamojo ryšio inhibicijos būdu

bei kovalentinės modifikacijos būdais

6-46

Transkripcijos faktoriai yra baltymai, veikiantys RNR polimerazės sugebėjimą transkribuoti tam tikrą geną

Skiriami dviejų pagrindinių tipų transkripcijos faktoriai Bendrieji transkripcijos faktoriai

Reikalingi RNR pol prisijungti prie pagrindinio promotoriaus ir perėjimui prie elongacijos

Būtini bazinei transkripcijai Reguliaciniai transkripcijos faktoriai

Reguliuoja šalia esančių genų transkripciją Daro įtaką RNR pol sugebėjimui pradėti tam tikro geno transkripciją

6.5. REGULIACINIAI TRANSKRIPCIJOS FAKTORIAI

6-47

Reguliaciniai transkripcijos faktoriai atpažįsta reguliacinius cis elementus, išsidėsčiusius šalia pagrindinio promotoriaus Šios sekos vadinamos atsako, kontrolės arba

reguliaciniais elementais

Susijusio geno transkripciją veikia baltymai (reguliaciniai transkripcijos faktoriai), prisijungiantys prie šių elementų Reguliaciniai baltymai, skatinantys transkripciją, vadinami

aktyvatoriais Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama enhanseriu (stiprintuvu)

Reguliaciniai baltymai, slopinantys transkripciją, vadinami represoriais

Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama sailenseriu (duslintuvu)

6-48

6-49

a) Genų aktyvacija

b) Genų represija

Transkripcijos faktorių baltymai turi regionus, vadinamus domenais, atliekančius specifines funkcijas Vienas domenas gali būti jungimosi su DNR vieta Kitas domenas gali būti jungimosi su efektoriaus

molekulėmis vieta Motyvas yra domenas ar jo dalis, kurio(s) struktūra

yra labai panaši daugelyje skirtingų baltymų

Reguliacinių transkripcijos faktorių struktūrinės ypatybės

6-50

6-51

Atpažinimo spiralės atpažįsta ir sudaro kontaktus su bazių sekomis palei DNR didįjį griovelį

Vienas iš transkripcijos faktorių prisijungimo prie DNR būdų yra vandenilinių jungčių sudarymas tarp

spiralės ir DNR bazių

a) Spiralės-posūkio-spiralės(helix-turn-helix) motyvas

b) Spiralės-kilpos-spiralės(helix-loop-helix) motyvas Spiralės-kilpos-spiralės motyvai

gali dalyvauti baltymų dimerizacijoje

Homodimerus suformuoja du identiški transkripcijos faktoriai;

Heterodimerus suformuoja du skirtingi transkripcijos faktoriai

6-52

Sudarytas iš vienos spiralės ir dviejų klosčių, palaikomų kartu cinko metalo jonų (Zn++)

Dvi spiralės, susipynusios dėl leucino

motyvų

Besikaitaliojančios leucino liekanos abiejuose baltymuose sąveikauja, dėl

ko vyksta baltymo dimerizacija

c) Cinko “pirštelių” (zinc fingers)motyvas

d) Leucino “užtrauktuko” (leucine zipper)motyvas

Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie enhanserio padidina transkripcijos laipsnį (nuo 10 iki 1000 kartų)

Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie sailenserio sumažina transkripcijos laipsnį

Daugelis reguliacinių elementų yra nepriklausomi nuo orientacijos arba dvikrypčiai

Jie gali funkcionuoti tiek pirmyn, tiek ir atgal Dauguma reguliacinių elementų yra išsidėstę kelių šimtų

nukleotidų atstumu “prieš srovę” nuo promotoriaus Tačiau kai kurie randami ir kitur

Už keleto tūkstančių nukleotidų Pasroviui nuo promotoriaus Netgi intronuose!

Enhanseriai ir sailenseriai

6-53

Dauguma reguliacinių transkripcijos faktorių tiesiogiai nesijungia su RNR polimeraze

Reguliacinių transkripcijos faktorių poveikį RNR polimerazei perduoda du ląstelėje dažnai aptinkami baltymų kompleksai

1. TFIID

2. Mediatorius

TFIID ir mediatorius

6-54

6-55

Bendrasis transkripcijos faktorius, kuris jungiasi prie

TATA dėžutės

Pritraukia RNR polimerazę prie promotoriaus

Transkripcijos aktyvatorius pritraukia TFIID prie promotoriaus ir/ar aktyvina jo funkciją

Taigi, vyksta transkripcijos aktyvacija

Transkripcijos represorius inhibuoja TFIID prisijungimą prie promotoriaus arba slopina jo funkciją

Vyksta transkripcijos represija

a) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir TFIID

6-56

Transkripcijos aktyvatorius stimuliuoja mediatoriaus funkciją

Šis leidžia RNR pol suformuoti preiniciacijos kompleksą

Po to prasideda transkripcijos elongacijos fazė

Transkripcijos represorius slopina mediatoriaus funkciją

Transkripcija stabdoma

STOP

b) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir mediatorius

Reguliacinių transkripcijos faktorių funkcijai gali turėti įtakos:

1. Efektoriaus molekulės prisijungimas

2. Baltymų tarpusavio sąveika

3. Kovalentinė modifikacija

Kaip reguliuojami reguliaciniai transkripcijos faktoriai?

6-57

6-58

Transkripcijos faktorius dabar gali prisijungti prie

DNR

Homodimerų ir heterodimerų formavimasis

a) Efektoriaus molekulės (pvz., hormono) prisijungimas

b) Baltymų tarpusavio sąveika

c) Potransliacinė modifikacija, pvz., fosforilinimas

Chromatino struktūros pokyčiai atsiranda dėl DNR struktūros pokyčių ir/ar dėl chromatino kompaktiškumo pokyčių

Tokie pokyčiai gali būti 1. Genų amplifikacija 2. Genų pertvarkymai 3. DNR metilinimas 4. Chromatino glaudinimas

6.6. CHROMATINO STRUKTŪROS POKYČIAI

6-59

Retai taikomi genų ekspresijos reguliavimo būdai

Įprastiniai genų ekspresijos reguliavimo būdai

Genų amplifikacija yra retai naudojamas genų veiklos reguliavimo mechanizmas Dėl amplifikacijos labai padaugėja tam

tikrų genų kopijų rRNR genų amplifikacija Xenopus laevis

ovocituose Kai kurių genų amplifikacija vėžinėse

ląstelėse Susiformuoja žiedinės molekulės,

sudarančios smulkias acentromerines chromosomas, vadinamas mažosiomis taškinėmis chromosomomis (double minutes; dmin)

6-60

Genų pertvarkymai stebimi tam tikrais specifiniais atvejais

Pavyzdžiui, vyksta imunoglobulinų genų pertvarkymai, užtikrinantys skirtingų antikūnų baltymų kodavimą.

Erdvinė chromatino struktūra yra svarbus genų ekspresijos reguliavimo mechanizmas

Chromatinas yra labai dinamiška struktūra, kurios konformacija keičiasi ir įgyja vieną iš dviejų galimų būvių Uždara konformacija

Chromatinas labai kompaktiškas Transkripcija labai apsunkinta arba iš viso neįmanoma

Atvira konformacija Chromatinas stipriai dekondensuotas Gali vykti transkripcija

Chromatino struktūra

6-61

Chromatino supakavimo laipsnio kitimai eukariotų chromosomose vyksta interfazėje Vykstant genų aktyvacijai uždaras chromatinas turi virsti

atviru chromatinu Tik tada gali vykti transkripcija

6-62

Pavyzdys gali būti varliagyvių ovocitų chromosomos

Chromosoma nesuformuoja 30 nm siūlo

Vietoje to susidaro daug dekondensuotų radialinių kilpų

Tai yra tos DNR sritys, kurių genai aktyviai transkribuojami

Šios chromosomos pavadintos lempų šepečiais (lampbrush chromosomes)

Jos primena šepetėlius, kadaise naudotus žibalinėms lempoms valyti nuo suodžių

Globino genų ekspresija vyksta retikuliocituose Tačiau individualių šios genų šeimos narių ekspresija

vyksta skirtingomis vystymosi stadijomis Pavyzdžiui:

-globinas Suaugusiame organizme -globinas Vaisiuje

Kai kurie žmogaus globino genai yra išsidėstę 11-oje chromosomoje šalia vienas kito

Globino genų ekspresija

6-63

Talasemija yra vieno ar daugiau globino genų ekspresijos defektas

Įdomu, kad kai kurių talasemija sergančių pacientų organizmai nesugeba sintetinti globino, nors ir turi normalų jo geną

6-64

Šio tipo talasemija atsiranda dėl DNR delecijos, įvykusios prieš srovę nuo globino geno

globino genas yra sveikas Tačiau jis yra išjungtas

DNR segmentų delecijos, randamos skirtingose žmonių populiacijose

6-65

Prieš srovę nuo globino geno buvo nustatyta DNR sritis, būtina globino geno ekspresijai

Ši sritis pavadinta lokuso kontrolės regionu (locus control region - LCR)

Ji padeda reguliuoti chromatino konformaciją

Jos trūksta kai kurių pacientų, sergančių talasemija, DNR

Dabar genus gali pasiekti RNR pol ir transkripcijos

faktoriai

Šalia chromatino supakavimo laipsnio, kita chromatino struktūrinė ypatybė, turinti įtakos genų veiklai, yra nukleosomų padėtis

Chromatine nukleosomos dažniausiai yra išsidėstę ant DNR maždaug vienodais intervalais Tačiau nukleosomų padėtis chromatine gali keistis, kai

vyksta geno ekspresija Jų padėtis nesikeičia genuose, kurie neaktyvūs, pvz., esantys

kituose audiniuose

Globino genų ekspresija

6-66

6-67

Nukleosomos padėties pokyčiai aktyvuojantis globino genui

Išsidėstę reguliariais intervalais nuo -3000 iki + 1,500

Išsidėstymo reguliarumo sutrikimas intervale nuo -500 iki + 200

a) Nukleosomų išsidėstymas fibroblastų globino gene, kurio ekspresija nevyksta

b) Nukleosomų išsidėstymas retikuliocitų globino gene, kurio ekspresija yra intensyvi

Chromatino struktūra yra keičiama dviem įprastiniais būdais

1. Histonų kovalentinė modifikacija

2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros pertvarkymas

Chromatino struktūros pertvarkymas (remodeling)

6-68

1. Kovalentinė histonų modifikacija Histonų polipeptidų galai yra modifikuojami įvairiais

būdais Tai gali būti acetilinimas; fosforilinimas; metilinimas

6-69

Prikabina acetilo grupes; taip susilpninamos histonų ir

DNR sąveikos

Pašalina acetilo grupes; sąveikos atsistato

a) Histonų acetilinimas

6-70

SWI/SNF šeimos baltymai

Akronimai nurodo, kokie pokyčiai stebimi mielėse, jei fermentai

neveiklūs

SWI mutantai nesugeba atlikti poravimosi tipo perjungimo

(switching) SNF mutantai nefermentuoja

sacharozės (sucrose non-fermenters)

Šie pokyčiai gali žymiai paveikti genų ekspresijąb) Chromatino struktūros pertvarkymas

2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros pertvarkymas ATP energija yra naudojama nukleosomų struktūrai pakeisti.

Tada DNR lengviau gali pasiekti transkripcijos baltymai

Svarbi tranckripcijos aktyvatorių funkcija yra pritraukti anksčiau paminėtus baltymus prie promotoriaus

Gerai ištyrinėtas pavyzdys yra mielių genas, dalyvaujantis poravimosi procese

Mielės gali būti a ir poravimosi tipo

Persijungimą iš vieno tipo į kitą koduoja genas HO

Chromatino struktūros pertvarkymas (remodeling)

6-71

6-72

SWI pavadinimas kilęs nuo “switching”

SAGA yra akronimas nuo Spt/Ada/GCN5/Acetyltransferase

Histonų acetiltransferazė gali transkripciškai reguliuoti genų veiklą

6-73

SBP yra akronimas nuo “mating type switching cell

cycle box protein”

RNR polimerazė

Atvira konformacija leidžia prisijungti prie enhanserio

antram transkripcijos aktyvatoriui (SBP)

Šis antrasis transkripcijos aktyvatorius pritraukia RNR polimerazę ir bendruosius transkripcijos faktorius prie promotoriaus.

Tai inicijuoja transkripciją

DNR metilinimas yra chromatino struktūros pokytis, nutildantis genų ekspresiją

Jis būdingas daugeliui, tačiau ne visoms eukariotų rūšims Mielių ir drozofilos DNR yra mažai metilinta Stuburinių ir augalų DNR yra ženkliai metilinta

Žinduolių DNR yra metilinta ~ 2 iki 7%

DNR metilinimas

6-74

6-75

(arba DNR metilazė) CH3

CH3

CH3

Tik viena grandinė metilinta

Abidvi grandinės metilintos

a) Citozino metilinimas

b) Nemetilinta

c) Hemimetilinta

d) Pilnai metilinta

DNR metilinimas paprastai inhibuoja eukariotų genų transkripciją Ypač, jei metilinimas vyksta promotoriaus srityje

Daugelis stuburinių ir augalų genų šalia savo promotorių turi CpG sąleles Šių CpG sąlelių ilgis yra 1,000 - 2,000 nukleotidų

Namų ruošos (housekeeping) genų CpG sąlelės yra nemetilintos Šių genų ekspresija vyksta daugelio audinių ląstelėse

Specifinių audinių genų ekspresija gali būti nutildyta metilinant CpG sąleles

6-76

6-77Transkripcinis nutildymas metilinant DNR

Transkripcijos aktyvatoriai jungiasi

prie nemetilintos DNR

Tai inhibuoja transkripcijos iniciaciją

a) Metilinimas inhibuoja transkripcijos aktyvatorių prisijungimą

Metilinimas

Metilo grupės blokuoja transkripcijos aktyvatoriausprisijungimą prieenhanserio

6-78Transkripcinis nutildymas metilinant DNR

b) metil-CpG surišantis baltymas pritraukia kitus baltymus, kuriekompaktizuoja chromatiną

Metil-cpG surišantis baltymasprisitvirtina prie metilintosCpG sąlelės

Metil-CpG surišantis baltymaspritraukia kitus baltymus, tokius kaip histonų deacetilazė, kurie pertvarko chromatiną į uždarą konformaciją

Metilintos DNR sekos yra paveldimos ląstelėms dalijantis

Po replikacijos tik viena DNR grandinė yra metilinta (hemimetilinta DNR). Tai inicijuoja kitos DNR grandinės metilinimą

DNR metilinimas yra paveldimas

6-79

CH3

CH3

CH3

CH3 Hemimetilinta DNR

DNR metilazė verčia hemimetilintą DNR į

pilnai metilintą

Tai labai veiksmingas, tačiau ir įprastas įvykis, vykstantis žinduolių ir

augalų ląstelėse

CH3

CH3CH3CH3

Einamasis metilinimas

6-80

DNR replikacija

Metilinimas de novo

Retas labai reguliuojamas įvykis

6-81

DNR metilinimas gali veikti ne tik pavienių genų, tačiau ir visų chromosomų transkripciją

Metilinant DNR yra inaktyvinama žinduolių viena X chromosoma

X chromosomos inaktyvinimas vyksta atsitiktinai. Todėl jei X chromosomoje esantis genas yra heterozigotinėje būsenoje ir koduoja morfologinį požymį, tokios atsitiktinės inaktyvacijos pasekmės yra matomos fenotipiškai

Pavyzdys yra kačių kailio spalva

Calico Tortoiseshell

Eukariotų organizmuose gana įprasta genų ekspresiją reguliuoti ir RNR lygmenyje

Galimi įvairūs tokios reguliacijos būdai Alternatyvus splaisingas RNR redagavimas RNR stabilumo keitimas RNR interferencija

6.7. RNR BRENDIMO IR TRANSLIACIJOS REGULIACIJA

6-82

Introninei eukariotų genų struktūrai labai svarbų biologinį pranašumą suteikia reiškinys, vadinamas alternatyviu splaisingu

Alternatyvus splaisingas reiškia, kad pre-mRNR splaisingas gali vykti daugiau negu vienu būdu Daugeliu atveju tai sukuria dvi alternatyvias versijas

baltymo, turinčio panašią funkciją Taip yra dėl to, kad daugelis jų aminorūgščių sekų yra identiškoas

Tačiau susidarančio sekų skirtumo pakanka, kad kiekvienas baltymas pasižymmėtų tik jam būdingomis savybėmis

Alternatyvus splaisingas

6-83

Splaisingo ir alternatyvaus splaisingo laipsnis labai nevienodas skirtingų rūšių organizmuose

Kepimo mielės turi maždaug 6,000 genų ~ 300 (t.y., 5%) koduoja mRNR, kurių splaisingas vyksta

Tik keletui iš šių 300 genų būdingas alternatyvus splaisingas

Žmogus turi ~ 35,000 genų Daugumos šių genų mRNR būdingas splaisingas

Manoma, kad ne mažiau kaip vienas trečdaliui būdingas alternatyvus spaisingas

Pastaba: Kai kurių mRNR alternatyvus splaisingas vyksta taip, kad yra pagaminama dešimtys ar net šimtai skirtingų mRNR


6-84

Alternatyvus splaisingas nėra atsitiktinis reiškinys Specifiniai splaisingo būdai ląstelėje yra reguliuojami

Šioje reguliacijoje dalyvauja baltymai, vadinami splaisingo faktoriais Jie svarbūs pasirenkant splaisingo vietas

Vienas iš splaisingo faktorių pavyzdžių yra SR baltymai Jų terminaliniame C gale yra domenas, turintis daug serino

(S) ir arginino (R) Šie baltymai dalyvauja baltymų tarpusavio atpažinimo procesuose

Jų terminaliniame N gale yra prisijungimo prie RNR domenas


6-85

Splaisosoma atpažįsta 5’ ir 3’ splaisingo vietas ir pašalina įsiterpusį introną

Splaisingo faktoriai moduliuoja splaisosomos sugebėjima atpažinti ir pasirinkti splaisingo vietas

Tai gali vykti dviem būdais 1. Kai kurie splaisingo faktoriai inhibuoja splaisosomos

sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo represoriai)

2. Kai kurie splaisingo faktoriai sustiprina splaisosomos sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo enhanseriai)

6-86


6-87

Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui

a) Splaisingo represoriai

6-88

Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui

b) Splaisingo enhanseriai

RNR redagavimas reiškia nukleotidų sekos pakeitimą RNR molekulėje Gali būti tam tikrų bazių pašalinimas arba įterpimas į

seką Arba vienos bazės virtimas (konversija) kita

RNR redagavimo pasekmės mRNR yra įvairios Starto arba stop kodonų sukūrimas Koduojančios sekos pasikeitimas

RNR redagavimas

6-89

RNR redagavimas pirmiausia buvo aptiktas tripanosomose

Šiame procese dalyvauja RNA gidas (guide)

RNR gidas gali nurodyti vieno ar daugiau uracilų įterpimą ar pašalinimą iš RNR

RNR redagavimas

6-90

6-91

3’ galai turi uracilų seką

Pirmiausia, 5’ inkaras jungiasi su

redaguojama RNR

Kerpa redaguojamą RNR tam tikroje vietoje

5’ galas (inkaras) yra komplementarus

redaguojamai mRNR

RNR gido 3’ galas patraukiamas nuo

redaguojamos RNR

Įterpia uracilus Pašalina uracilus

Sujungia dvi RNR dalis

Labiau paplitęs RNR redagavimo mechanizmas yra vienos bazės vertimas kita Dažniausiai tai daroma deamininant bazę

6-92

Transliacijos metu atpažįstamas kaip

guaninas

RNR redagavimo pavyzdžiai

Organizmas Redagavimo tipas Aptinkamas

Tripanosomos Uracilo nukleotidų įterpimas, retkarčiais - pašalinimas

Daugelyje mitochondrijų mRNR

Sausumos augalai C konversija į U Daugelyje mitochondrijų ir chloroplastų mRNR, tRNR ir rRNR

Gleivūnai C įterpimas Daugelyje mitochondrijų mRNR

Žinduoliai C konversija į U Apolipoproteino B mRNR

A konversija į I Glutamato receptoriaus mRNR, daugelyje tRNR

Drozofila A konversija į I Kalcio ir natrio kanalų baltymų mRNR

6-93

Eukariotų mRNR stabilumas yra labai įvairus Gali būti nuo kelių minučių iki keleto dienų

mRNR stabilumas gali būti reguliuojamas taip, kad jos gyvenimo pusamžis sutrumpėtų arba pailgėtų Tai stipriai veikia mRNR koncentraciją ląstelėje

Kaip pasekmė, kinta gaminamo baltymo kiekis (geno ekspreijos laipsnis)

mRNR stabilumą veikia šie veiksniai 1. poliA uodegos ilgis 2. Destabilizuojantys elementai

mRNR stabilumas

6-94

1. poliA uodegos ilgis Dauguma naujai sintetintų mRNR turi maždaug 200

nukleotidų ilgio poliA uodegą Ją atpažįsta su poliA susirišantis baltymas (polyA

binding protein), Kuris susiriša su poliA uodega ir padidina stabilumą

Senstant mRNR jos poliA uodega trumpėja dėl ląstelėje esančių nukleazių veiklos

Su poliA susirišantis baltymas daugiau negali susirišti, jei poliA uodega trumpesnė nei 10-30 adenozinų

Tokia mRNR grandinė suskaidoma egzo- ir endonukleazių

6-95

2. Destabilizuojantys elementai Randami trumpai gyvenančiose mRNR Šie elementai gali būti randami bet kurioje mRNR vietoje

Tačiau labiausiai įprasta jų buvimo vieta - 3’ gale tarp stop kodono ir poliA uodegos

6-96

3’-untranslated region5’-untranslated region

AU-rich element

Atpažįsta ir psisijungia ląstelės baltymai

Šie baltymai veikia mRNR degradaciją

Dvigrandininė RNR gali nutildyti tam tikrų genų ekspresiją Šis atradimas buvo padarytas tiriant augalus ir nematodę

Caenorhabditis elegans

Naudojant klonavimo metodus į augalų genomą galima įterpti klonuotus genus Kai yra įterpiama daug klonuoto geno kopijų, geno

ekspresija gana dažnai yra nutildoma Tai gali vykti dėl dvigrandininės RNR formavimosi

Dvigrandininė RNR ir genų nutildymas (silencing)

6-97

6-98

Genų insercijos, galinčios sukelti dvigrandininės RNR susidarymą

Transkripcija vyksta nuo abiejų promotorių

Todėl transkribuojama tiek prasminė, tiek koduojanti matricinė grandinės

Dėl to susidaro komplementarios RNR, formuojančios dvigrandininę struktūrą

Šis įvykis nutildo klonuoto geno ekspresiją

Įrodymai, kad mRNR degraduoja dėl dvigrandininės grandinės susidarymo, buvo gauti tiriant C. elegans Antiprasminės RNR injekcija į ovocitus nutildo geno

ekspresiją Netikėtai pasirodė, kad dvigrandininės RNR injekcija tai daro 10

kartų efektyviau

Šis reiškinys buvo pavadintas RNR interferencija (RNAi)


6-99

6-100

Ląstelėje esanti mRNR yra sukarpoma endonukleazių, esančių komplekse

Trumpa RNR iš antiprasminės grandinės

Geno, koduojančio šią mRNR, ekspresija

nutildoma

RNR interferencija yra plačiai aptinkama eukariotuose

Manoma, kad RNRi 1. Yra kovos su kai kuriais virusais būdas

Ypač su turinčiais dvigrandininės RNR genomą

2. Svarbi nutildant kai kuriuos transpozabilius elementus Kai kurie šių elementų gamina dvigrandininę RNR kaip tarpinį

transpozicijos proceso produktą


6-101

Ląstelės fundamentiniai procesai dažnai reguliuojami moduliuojant transliacijos iniciacijos faktorius

Esant tam tikroms sąlygoms ląstelei yra naudinga sustabdyti baltymų sintezę Virusinių infekcijų atveju

Tada virusas negali gaminti virusinių baltymų Badaujant

Ląstelė taupo resursus

Iniciacijos faktoriai ir transliacijos laipsnis

6-103

Nustatyta, kad eukariotų transliaciją veikia iniciacijos faktorių fosforilinimas Pagrindiniai iniciacijos faktoriai, kontroliuojantys

transliacijos iniciaciją yra eIF2 ir eIF4F

Šių dviejų faktorių fosforilinimas duoda priešingus rezultatus eIF2 fosforilinimas transliaciją slopina eIF4F fosforilinimas transliaciją skatina

6-104

6-105

Reikalingas skatinti iniciacijos tRNAmet jungimąsi

prie 40S subvieneto

eIF4F naudoja kitą transliacijos reguliavimo kelią Jis reguliuoja mRNR prisijungimą prie ribosominio

iniciacijos komplekso

Fosforilinimas eIF4F aktyvina

Fosforilinimą stimuliuoja signalinės molekulės, skatinančios ląstelių proliferaciją

Pavyzdžiui, augimo faktoriai ir insulinas

Fosforilinimą mažina šiluminis šokas ir virusinės infekcijos

6-106

genų veiklos reguliavimas

Education