genetika razvoja
TRANSCRIPT
Genetika razvoja
Svake 3,5 min u svijetu se rodi beba sa kongenitalnom malformacijom
Svake godine oko 150.000 beba sa ozbiljnim poremećajima
Učestalost 1 beba na 20 rođenih – u vašoj polulaciji bit će barem 1 beba sa malformacijama
Nekoliko tisuća različitih kongenitalnih malformacija – nekima znamo uzrok, nekima ne
Kongenitalna malformacija je abnormalnost strukture tijela, funkcije ili metabolizma koja je dovoljno ozbiljna da zahtjeva brigu liječnika
Uzroci kongenitalnih malformacija
Možete li reći koja od ovih žena je trudna?
Većina žena sazna za trudnoću tek mjesec dana nakon začeća
Upravo u tom periodu događaju se kritične promjene u razvoju bebe
“Niti rođenje, niti udaja / ženidba, niti smrt nisu najvažniji trenuci u životu. Najvažniji trenutak života je gastrulacija”.
Lewis Wolpert (1996)
Gastrulacija – kritično razdoblje u razvitku – djelovanje teratogenih faktora – poznati teratogeni – alkohol, zračenje, lijekovi, virusi itd
Sve ili ništa Više ili manje
Sve stanice odraslog organizma – potekle od jedne – ista DNA
Za vrijeme razvoja stanice se usmjeravaju pod utjecajem faktora rasta, hormona i ostalih signalnih molekula koje modificiraju kromatin i ekspresiju pojedinih gena.
Sposobnost genoma da odgovori na razvojne signale ključan za diferencijaciju stanica
Pluripotentne stanice – da bi dale diferencirane stanice tkiva – pakiranje genoma u područja koja su dostupna transkripcijskim faktorima ili nisu
Heterokromatin i eukromatin
Različit način pakiranja kromatina
Što je različito u kromatinu koji je aktivan (otvoren), od onog koji nije (zatvoren)?
‘Epi’genetika - ‘na’ ili ‘preko’ genetske informacije kodirane u DNA
U različitim stanicama na istu DNA dolazi drugačija informacija o modeliranju kromatina
1. Metilacija DNA
Epigenetske modifikacije
Najčešće zahvaća citozin Ciljno mjesto metilacije: CpG sekvence
Dodavanje metilne skupine na peti C atom
citozina
Biološka uloga 5mC:
ekspresija gena
prijenos obrasca ekspresije gena na stanice kćeri
Nova baza5- metilcitozin (5mC)
Metilacija DNA i ekspresija gena
Nemetilirane CpG sekvence = aktivni geni
Metilacija sprječava vezivanje transkripcijskih faktora – nema ekspresije
promotor kontrolna regija
aktivni kromatin – acetilirani histoni srži nukleosoma
Acetilacija odstranjuje pozitivan naboj i smanjuje afinitet između histona i DNA
Metilacija DNA i ekspresija gena
Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze
Povećana mobilnost nukleosoma duž DNA
Pristup transkripcijskoj mašineriji
Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze
Metilacija CpG sekvenci + modifikacija histona = inaktivan kromatin
Utišavanje gena – mehanizam
metilirani CpG privlače MeCP2 koji aktivira histonske deacetilaze (HDAC) – deacetilacija histona.
MeCP2 aktivira i histonske metiltransferaze ( SUVh39) koje metiliraju H3-histone na K9 što privlači heterokromatinski protein HP1 koji stabilizira inaktivno stanje heterokromatina.
DNA metiltransferaza
Nemetilirani citozin
Replikacija DNA
Prijenos metilacijskog obrasca ekspresije gena na stanice kćeri
DNA metiltransferaza (Dnmt)
metilira CpG sekvence
Metilacija Metilacija
Ne prepoznaje ga Dnmt
Hemimetilirana DNA
Obrazac metilacije DNA je nasljedan – svi potomci ove stanice imat će isti metilacijski obrazac
Jedan te isti genom može dati više epigenoma
Svaka stanica prenosi svoj epigenom na stanice kćeri
Jednojajčani blizanci naslijede isti set gena, u odrasloj dobi različiti
epigenetske modifikacije – pod utjecajem vanjskih faktora: prehrana, fizička aktivnost, pušenje, način života
Stariji jednojajčani blizanci – značajne razlike u ukupnoj količini i distribuciji 5mC Različite predispozicije bolestima (pokazano na 30 parova blizanaca)Fraga et al. (2005) PNAS July 26, vol. 102 no. 30, 10604–10609
Jednojajčani blizanci – identičan genotip, epigenetski se ne razlikuju u ranom djetinjstvu
Iste epigenetske promjene nastale zbog utjecaja vanjskih faktora djeluju istovremeno na tri generacije
Tri generacije odjednom izložene istim uvjetima okoliša (prehrana, otrovi, hormoni)
Rani razvoj: nakon oplodnje epigenetsko reprogamiranje genoma svake buduće vrste stanica
Nakon oplodnje do blastociste –globalna demetilacija
Sposobnost epigenetskih faktora da odgovore na razvojne signale je istovremeno i temelj njihove osjetljivosti na vanjske faktore
Npr. epigenom se može promijeniti zbog različite prehrane (folna kis, B12), etanola
Nakon blastociste – gastrualcija –globalna de novo metilacija
Mnoge hranjive tvari– donori metilnih skupina – mogu promijeniti epigenom zametka koji se razvija: prehrana majke sa prevelikom ili premalom količinom donora metila može promijeniti ekspresiju gena
Važno u ranom razvoju kad se uspostavlja epigenom buduće jedinke
Što je folat?
• Vodotopivi vitamin B-kompleksa:• Folat
– dolazi prirodno u hrani (apsorbira se 50%)• Folna kiselina
– u obliku vitaminskog suplementa (apsorbira se 100%)
S-adenosyl-methionine
5-methyl-tetrahydro-folate
S-adenosyl-methionine
Zašto je folat važan?
Sudjeluje u biokemijskom putu SAM –donoru metilnih skupina – metilaciji DNA
Miševi i ljudi imaju gen agouti
ljudi: pretilost, proizvodnja inzulina
miš: agouti gen nemetiliran – miš sa žutim krznom, pretio, sklon razvoju dijabetesa i rakaagouti gen metiliran (kao što je u normalnom mišu) krzno smeđe,mršav, vrlo nizak rizik od razvitka bolesti
Primjer:
Pretio žuti miš i mršavi smeđi miš genetički identični
Što može napraviti nedostatak folata u prehrani?
Dva miša istog genotipa iste starosti – majka smeđeg miša dobivala folat u trudnoći, majka žutog ne
Žutu trudnu mišicu hranimo s dodatkom folata – potomstvo smeđe, zdravo
Neuralni žlijeb
Mezoderm uz neuralnu cijev zadeblja i dijeli se u somite – prekursori mišića i kostura
Neuralna cijev zatvorena Čovjek: Neuralna cijev se zatvori do 28. dana trudnoće
Zatvaranje neuralne cijevi kritično – ako se ne zatvori do kraja – spina bifida
Folat – donor metila može sprječiti do 70% slučajeva spine bifide (uč. 1/1000) – uzimanje folata mjesec dana prije začeća i u prvom trimestru trudnoće
• Daily multivitamin use− 400µg folic acid
alkohol inhibira apsorpciju folata
Metabolizam folata poremećen djelovanjem:
pušenje – smanjuje iskorištavanje folata
Ne zaboravimo da postoji i otac!
Pred 40 god. Gladys Friedler: ženke štakora prije trudnoće izložila djelovanju morfija.
Potomci mali, nisu nikad izlagani morfiju - njihovi potomci isto mali
Izložila djelovanju morfija mužjake prije parenja – također utjecaj na potomke
Rezultati odbačeni – kako otac može prenijeti na potomke nešto što nije mutacija?
Otkrivena epigenetika – objašnjeno
Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or from the father
2006. Muški miševi izloženi kokainu (inhalacija) kroz dulje vrijeme, pareni sa zdravim ženkama: potomci nisu mogli zapamtiti gdje je hrana u kavezu (naročito ženski potomci)
Nikakva oštećenja DNA nisu pronađena u spermijima mužjaka
Pamćenje – neuroni –eksprimiraju specifične proteine potrebne za normalnu funkciju
stanice koje nisu neuroni eksprimiraju NRSE (neuron-restrictive silencer element) koji zajedno sa histonskim deacetilazama suprimira gene karakteristične za neuron
Vanjski signali – okoliš može promijeniti epigenetske markere i neuron ne funkcionira kao neuron
Droge (npr. kokain) uzrokuje dugotrajnu adaptaciju stanica mozga temeljenu na promjeni u ekspresiji gena
BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) – faktor rasta aktivan u hipokampusu, korteksu – dijelovi hipokampusu, korteksu – dijelovi mozga ključni za učenje, pamćenje, naročito dugotrajno pamćenje
CREB (cAMP response element-binding) transkripcijski faktor koji se veže na sekvence DNA nazvane CRE (cAMP response elements) regulirajući ekspresiju nizvodnih gena. Geni regulirani CREBom su BDNF i mnogi neuropeptidi
Ne podcjenjujmo epigenetski obrazac majke koji se prenosi na djecu i određuje njihovo ponašanje!
Majke miševa koje su brižne i paze na svoje potomke predale su svoj metilacijski obrazac CNS-u svojih potomaka. Taj se obrazac zadržava do odrasle dobi i prenosi na slijedeću generaciju.
Kad smo kod CNS-a:
Zadržavanje metilacijskog obrasca u odrasloj dobi potvrđuje hipotezu da se obrazac prenosi na stanice potomke
Objašnjava nasljeđivanje “instinkta” - načina ponašanja
Razdoblje prije gastrulacije – pravilo sve ili ništa
Sve ili ništa Više ili manje
Epigenetske modifikacije gena u dva kritična perioda: razvoju gameta preimplantacijskom rastu
Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični metilacijski obrasci u gametama oba spola
Potpomognuta oplodnja – uključuje manipulaciju gametama i preimplantacijskim embrijima
Intrauterini zaostatak u rastuPrerani porodSmanjena porođajna težinaAngelman i Beckwith-Wiedemann sindrom ( 6x veća incidencija nego prirodnim putem)
Children Born After Assisted Reproduction at Greater Risk of Congenital Malformations, ScienceDaily (July,2010)
ICS 26/301 (8.6%)IVF 75/837 (9.0%) ozbiljnih kongenitalnih malformacijaDjeca začeta prirodnim putem 168/4000 (4.2%)
Stimulacija ovarija?Manipulacija i selekcija gameta?Kultivacija embrija?
Zašto povećan rizik od kongenitalnih malformacija nakon potpomognute oplodnje?
Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični metilacijski obrasci u gametama oba spola
Stimulacija ovulacije, ICSI – intervencija prije završene uspostave metilacijskog obrasca u gametama
Priprema oocite i spermija za ICSI:
Odstranjivanje stanica cumulusa uz pomoć hijaluronidaze. Kontrola pod invertnim mikroskopom –postojanje prve polocite – znači oocita u metafazi II.
Svaka oocita se stavlja u kapljicu medija koja okružuje kapljicu medija sa spermijima. Kapljice se prekriju laganim parafinskim uljem i stavljaju na grijani stolić mikroskopa sa mikromanipulatorom.
Za vrijeme injektiranja spermija oocita se pridržava mikropipetom, a drugom mikropipetom se injektira spermij.
Intrauterini zaostatak u rastuPrerani porodSmanjena porođajna težinaAngelman i Beckwith-Wiedemann sindrom
Zašto baš ovakvi poremećaji?
Svi spadaju u poremećaje imprintinga
Što je genomski imprinting?
Čovjek: 100-200 utisnutih genaČovjek: 100-200 utisnutih gena
Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or from the father
Intrauterini zaostatak u rastu, smanjena porođajna težina: poremećaj imprintinga
Kako i zašto je nastao genomski imprinting?
Teorija genetskog konflikta:
Imprinting je nastao kao rezultat različitog interesa majke i oca za rast fetusa in utero
Geni eksprimirani od oca imaju funkciju poticati fetalni rast i omogućiti što bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusašto bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusa
Geni eksprimirani od majke imaju funkciju suprimirati fetalni rast (majka se bori protiv parazita koji raste u njezinom tijelu!)
Jedino prava kombinacija gena ekspirmiranih od oca i majke može uravnotežiti prehranu i potrebe za rast fetusa
Primjeri koji idu u prilog teoriji genetskog konflikta:
IGF2: insulin growth factor II, eksprimiran od oca
potiče fetalni rast
potiče rast placente, omogućuje transport hranjivih tvari
IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke
IGF2 i njegov receptor IGF2R– odgovorni za fetalni rast
IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke
smanjuje količinu slobodnog IGF2
Knockout miševi za IGF2R – povećana placenta, prekomjerni fetalni rast
Knockout miševi za IGF2 – manja placenta, manji potomci
Jedino prava kombinacija ekspresije majčinih i očevih gena može rezultirati normalnim razvojem
U svakoj generaciji imprint suprotnog spola se mora izbrisati i u gametama ustanoviti vlastiti koji odgovara spolu osobe
Nasljeđujemo različiti imprint od oca i majke
Ciklus imprintinga
Disbalans aktivnosti utisnutih gena dovodi do poremećaja imprintinga i bolesti
Bekwith-Wiedemann sindrom
- makroglosia, umbilikalna hernia, velika porođajna težina, hepatomegalija, nefromegalija, visoki % Wilmsovih i drugih embrionalnih tumora – rabdomiosarkom, hepatoblastom
pogođena tkiva – visoka ekspresija Igf2
Nasljeđivanje:
- 15% obiteljsko, autosomno dominanto (11.krom. utisnuta regija)
- 85% sporadičnih slučajeva: - 20 % genetski (pUPD, mutacije)- 60 % epigenetski (poremećaj metilacije)- 20 % nepoznati
Potpomognuta oplodnjaPotpomognuta oplodnja ii BWSBWS
ART/cohort
country referenceRR
6/149 UK Maher et al., 2003x 4
USA DeBaun et al., 200343/65*
x 6
#LOM/#tested
2/2
5/6
#ICSI/#IVF
3/3
5/2
study
retro.
retro.prosp.
RR = relative riskLOM = loss of maternal methylation * overlapping patients
Halliday et al., 2004
6/149 UK Maher et al., 2003x 4
France Gicquel et al., 20036/149 x 3
4/37 Australiax 9
19/341* USA
2/2
6/6
3/3
- Chang et al., 2005
3/3
2/4
1/3
5/5 -
retro.
retro.
retro.caseretro.
8/213 retro. UK Sutcliffe et al., 20068/8
K.H. Ørstavik et al. : Another Case of Imprinting Defect in a Girl with Angelman Syndrome Who Was Conceived by Intracytoplasmic Sperm Injection The American Journal of Human Genetics, Volume 72, Issue 1, 218-219, 2003 Kromosom 15
Angelman regija aktivna u majke, u oca inaktivirana imprintingom
Takav balans daje zdravo dijete
Angelman sindrom će nastati ako iz bilo kojeg razloga majčina regija nije aktivna
IVF – ICSI: djevojčice zadržale očev imprint, izgubile majčinManipulacija gametama? In vitro kultura?
Rješenje problema:
PREIMPLATACIJSKA DIJAGNOSTIKA
Joe Leigh Simpson: Children born after preimplantation genetic diagnosis show no increase in congenital anomalies, Human Reproduction, Vol.25, No.1 pp. 6–8, 2010