1

Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul

CORELATII CLINICE, ANATOMOPATOLOGICE SI MOLECULARE IN VEDEREA STABILIRII UNOR MODELE MATEMATICE UTILE IN PREDICTIA EVOLUTIEI CANCERULUI

DE PROSTATA (faza de executie 2)

RAPORTUL STIINTIFIC SI TEHNIC (RST) IN EXTENSO

SE VA PREZENTA CONFORM URMATOAREI STRUCTURI:

CUPRINS;

1. OBIECTIVELE GENERALE;

2. OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE;

3. REZUMATUL ETAPEI (MAXIM 2 PAGINI);

4. DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA, CU PUNEREA IN EVIDENTA A REZULTATELOR ETAPEI SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR; (SE VOR INDICA REZULTATELE)

5. ANEXE (DOCUMENTATIE DE EXECUTIE, CAIET DE SARCINI, TEME DE PROIECTARE, BULETINE DE INCERCARI, ATESTARI, CERTIFICARI, ETC. DUPA CAZ);

6. CONCLUZII(SE PREZINTA PUNCTUAL)

7. BIBLIOGRAFIE;

Cuvinte cheie: cancer de prostata (CaP), markeri de pronostic, biologie moleculara (BM), consimtamant informat, comisie de etica, antigen specific de prostata (PSA).

2

1. OBIECTIVELE GENERALE;

Dupa cancerul de plaman, cancerul de prostata (CaP) este cea de-a sasea cauza de cancer in lume (cazuri noi) si a treia ca importanta in patologia sexului masculin. Acest tip de cancer ramane o provocare pentru sanatatea publica in ciuda progresului inregistrat in detectie si terapie. Inovatiile si aplicarea biotehnologiei au permis investigarea proceselor biologice in efortul studierii patogenezei la nivel molecular. Numeroase studii au fost dedicate identificarii markerilor de prognostic care diferentiaza formele indolente de cele agresive in cancerul de prostata. In contrast, mult mai putine studii s-au concentrat pe intelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza dezvoltarii prostatei normale si initierii si progresiei cancerului la acest nivel. Scopul acestui proiect il reprezinta identificarea factorilor de risc genetici in cancerul de prostata, propunand o viziune integrativa asupra patogenezei si evolutiei naturale a acestei malignitati, in afara oricarui tratament. Se propune stabilirea unor modele matematice bazate pe rezultatele evaluarii clinice, anatomopatologice si moleculare, raportate la predictia evolutiei si susceptibilitatea familiala in cancerul de prostata prin: analiza IHC a TGF, p53, EGFR, VEGF, AMACR; anomaliile cromozomiale, BRCA1, BRCA2 prin FISH, MLPA, LOH, MSI, si secventiere. Se urmareste initierea unui veritabil trial pentru investigarea cancerului de prostata, precum si stabilirea cerintelor etice, legale si a reglementarilor indispensabile cercetarii medicale care implica subiecti umani, respectand cerintele internationale. Subliniem faptul ca investigatiile precum si modelele matematice ce se vor stabili vizeaza tumora maligna a prostatei depistata si netratata. Identificarea markerilor moleculari proteici utili diagnosticului si prognosticului si analizati prin metoda imunohistochimica (TGF, p53, EGFR, VEGF, p63, AMACR) ar putea in viitor sa inlocuiasca testul clasic PSA. Investigarea markerilor genetici informativi (BRCA1, BRCA2, P53, EGFR) alaturi de anomaliile cromozomiale (Ch 8p) prin utilizarea LOH, MSI, hibridizare in situ, vor putea intra in alcatuirea unui panel de investigatie folositor nu numai prognozarii progresiei si recidivelor, cat si pentru evidentierea susceptibilitatii familiale. Proiectul nostru isi propune de asemeni interpretarea biostatistica a rezultatelor obtinute prin aplicarea de nomograme si modele matematice specifice care sa permita prognozare la nivel individual precum si stabilirea unui algoritm de evaluare a stadiului si prognosticului. Bazandu-ne pe experienta celor mai importante clinici de urologie din Bucuresti (P1, P2 si P3), pe expertiza in diagnostic molecular a partenerilor din sfera cercetarii biologice (CO) si pe aplicabilitatea modelelor statistice si simularilor (P4 si P5), proiectul propune, nu in ultimul rand, stabilirea unei baze de date si un pachet de lucru util medicilor practicieni in abordarea cancerului de prostata. Propunerea noastra de proiect se incadreaza in obiectivele programului 4, directia de cercetare sanatate (4.1). Misiunea proiectului este de integrare a metodelor de investigatie si interventionale bazate pe medicina moleculara si celulara, asociate cancerului de prostata, in scopul de a facilita aplicarea in Romania de strategii profilactice si terapeutice moderne pentru aceasta afectiune a carei incidenta si prevalenta este in crestere. Ne propunem formularea si verificarea de ipoteze precum si elaborarea unor teorii privind carcinogeneza in cancerul de prostata. Urmarim aplicarea tehnologiilor de laborator moderne pe materialele furnizate de cele mai importante clinici de urologie din Bucuresti. Consideram ca fiind un obiectiv important analiza statistica si simulare a modelelor, prin combinarea celor mai importante rezultate furnizate de laboratoare de anatomie patologica si biologie moleculara. Formularea unor algoritmuri si nomograme de prognozare prin utilizarea unor programe comprehensive pentru analizarea datelor, consideram ca reprezinta o noutate internationala prin impactul pe care il pot avea rezultatele obtinute pentru clinicile de urologie.Nu in ultimul rand, identificarea factorilor de risc ai susceptibilitatii familiale in aceasta afectiune maligna, va ajuta in abordarea maladiei de catre medicii practicieni. Scopul urmarit este utilizarea datelor clinice furnizate de fisele medicale, testele de laborator clinic, diagnosticul histopatologic, imunohistochimic si rezultatele furnizate de metodele de biologie moleculara, pentru construirea unor modele matematice de apreciere a prognosticului si evolutiei posibile in cancerul de prostata in afara oricarui tratament. Toate activitatile privind cercetarea

3

medicala avand subiecti umani va fi bine documentata privind cerintele etice, legale si de reglementare respectand normele internationale. Aplicarea metodelor de biologie moleculara (dezechilibre alelice, instabilitatea microsatelitilor, MLPA, hibridizare in situ) va identifica anomaliile celor mai importante gene implicate in cancerul de prostata, sporadic si ereditar. Coroborarea datelor furnizate de metodele utilizate prin metode statistice si de simulare specifice, va ajuta la evidentierea celor mai importanti parametri privind predictia recidivelor, metastazelor si susceptibilitatea familiala.

2. OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE;

In cea de-a doua etapa a proiectului se propune actiunea concertata a tuturor partenerilor in scopul initierii actiunilor de recoltare, arhivare si procesare anatomopatologica si moleculara (CO, P1, P2, P3, P4, P5). De modul in care recoltarea, procesarea, comunicarea intre parteneri si cu subiectii, vor incepe, de acest lucru va depinde soarta proiectului. Se propune selectarea pacientilor din clinicile de urologie si initierea activitatii comisiilor de etica (P1, P2, P3) si initierea unui protocol chirurgical coerent pentru cele 3 clinici de Urologie din Bucuresti, care sumeaza aproape intreaga activitate din sudul tarii. Acest fapt este dificil tanind cont de faptul ca protocoalele chirurgicale difera de la o clinica la alta. Protocolul chirurgical de care se tine cont este cel aplicat numai la cazurile confirmate ca fiind cancer de prostata. In urmatoarea faza, dupa excizia fragmentelor de prostata, materialele sunt procesate in laboratoarele de anatomie patologica/histopatologie si se diagnosticheaza cazurile de cancer de prostata (CO, P1, P2, P3). Subliniem faptul ca diagnosticarea la toate nivelele precum si majoritatea tehnicilor aplicate se bazeaza pe materiale incluse la parafina. Se aplica metoda microdisectiei cu laser pe zonele tinta si se observa implicatiile pentru metodele moleculare in special (CO). In aceasta etapa se construieste panelul de anticorpi necesar analizei tabloului proteinelor celulelor maligne din aceasta patologie. Si in final, rezultatele obtinute la examenul histopatologic sunt procesate de P4 si P5 in vederea obtinerii primelor corelatii si prognoze clinico-patologice ale cancerului de prostata.

3. REZUMATUL ETAPEI (MAXIM 2 PAGINI);

In cea de-a doua etapa a proiectului se propune actiunea concertata a tuturor partenerilor in scopul initierii actiunilor de recoltare, arhivare si procesare anatomopatologica si moleculara (CO, P1, P2, P3, P4, P5). De modul in care recoltarea, procesarea, comunicarea intre parteneri si cu subiectii, vor incepe, de acest lucru va depinde soarta proiectului. Se initiaza colaborarea celor 3 clinici de urologie din Bucuresti pentru a se stabili cel mai bun protocol chirurgical, si cel mai maleabil, facil de adaptat in functie de situatia din sala de operatie. Protocolul chirurgical aplicat este agreat pe plan mondial tocmai pentru suprapozabilitatea rezultatelor in cadrul sesiunilor si comunicarilor stiintifice. Analiza histopatologica a fragmentelor prelevate chirurgical, biopsic sau prin rezectie, este un pas extrem de important caci raportul histopatologic are utilitate in plan diagnostic si terapeutic. Fara un diagnostic histopatologic nu se poate aborda nici o maladie maligna dpdv teraputic si prognostic. Rezultatele examenului histopatologic furnizeaza primele date de analiza statistica si prognostica utile in modelarea matematica. Metoda microdisectiei cu laser pe zonele tinta urmareste utilitatea acesteia in analiza ulterioara mai ales molecular. Fragmentele tinta extrase prin aceasta metoda ofera strict zona de interes, fara ca arii normale histologic sa se amestece sau sa se suprapuna cu ariile tumorale. S-a creionat panelul de anticorpi atotcuprinzator si relevant pentru cancerul de prostata invaziv. Proteina P504S/ AMACR este o enzima identificata ca fiind marker atat tumoral cat si de leziuni precursoar pentru CaP, in timp ce P63 este un marker negativ in CaP prezentand avantajul unei interpretari facile a rezultatelor. Factorul de crestere vascular endotelial (VEGF) este un promotor al neovascularizatiei, in timp ce valoarea predictiva a p53

4

depinde de asocierea cu gradul si stadiul tumoral avansate. Receptorul factorului de crestere epidermal (EGFR) indica o asociere intre activarea acestuia si fenotipul invaziv al tumorii, nu numai in malignitatile prostatei. Toate datele furnizate de examenul histopatologic sunt analizate prin diferitele metode biostatistice care sunt propuse pentru investigare si prognoza.

4. DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA, CU PUNEREA IN EVIDENTA A REZULTATELOR ETAPEI SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR; (SE VOR INDICA REZULTATELE)

Carcinomul prostatic este cel mai comun diagnostic malign necutanat la barbati in USA si in lume (American Cancer Society, 2002;DeMarzo et al., 1999). Mortalitatea in carcinomul prostatic se asociaza cu metastazarea si cu invazia perineurala. Intalegerea mecanismelor carcinomului prostatic si a metastazelor este cheia tratamentului cu succes si a cresterii supravietuirii (Umbas et al., 1997; Yagi and Takeichi, 2000). Antigenul specific prostatic (PSA) in combinatie cu examinarea rectala reprezinta modalitati de screening in carcinomul prostatic. Sensibilitatea si specificitatea markerilor imunohistochimici sunt rar folosite in diagnosticul precoce al carcinomului prostatic. (Gao et al., 1997; Buyuktuncer et al., 2003). Istoria naturala a factorilor de prognostic implicati in carcinomului prostatic este necunoscuta. Parametrii moleculari capabili pentru stabilirea acuratetii, agresivitatii si a potentialului metastatic reprezinta urgenta. (Arisan, 2003). De cand invazia vasculara si evolutia celulelor tumorale din sange reprezinta treapta preliminara in procesul metastazelor, detectarea in sange a celulelor epiteliale prostatice (CPC) poate deveni un marker precoce a invaziei. (Tomita et al., 2000; Mason et al., 2002). Un element important in dezvoltarea si progresia carcinomului prostatic este determinarea anomaliilor in adeziunea celulelor in epiteliul prostatei si a celulelor canceroase. Gena E-cadherin a cromozomului 16q22 codifica glicoproteina 120 kDa apartinand grupului de Ca depinzand adeziunea moleculelor. Aceste molecule implicate in dezvoltarea morfogenezei epiteliului sunt aproape in exclusivitate exprimate in tesuturile epiteliale ale adultului. Legatura intre E-cadherina transmembranara si filamentele de actina este necesara pentru formarea adeziunilor celulare. Deletia genei a-catenina in vitro rezulta inactivarea E-cadherin in carcinomul prostatic. (Nathke et al., 1994). Disfunctia sau mutatia b-catenina poate rezulta in eliberarea celulei (Vleminckx et al., 2001). Pierderea functiei E-cadherin poate juca doua roluri diferite in dezvoltarea si progresia tumorii. Majoritatea studiilor pe E-cadherin si cancer s-au concentrat pe rolul in supresia metastazelor. Pierderea expresiei E-cadherin a fost asociata cu aparitia multor tumori. (Poser et al., 2001; Chen CL et al., 2003). Aceste rezultate sugereaza ca E-cadherin joaca un rol major in supresia invaziei in tumori. Studiile ihc ale prostatei au aratat proportia carcinoame invazive/carcinoame in situ au determinat niveluri aberante ale E-cadherin si/ expresia cateninei (El Hariry et al., 2001). In acest studiu dupa prostatectomie, prostata a fost analizata pentru activitatea E-cadherin si comparata cu scorul Gleason. Glanda prostata embriologic e alcatuita din 5 lobi: 2 laterali, cate unul posterior, mijlociu si anterior. Modelul curent (McNeal) presupune ca exista zonele tranzitionala (5% din volumul prostatei, contine fascicule compacte moderate de muschi neted si ducte mari), zona centrala (25% din volumul prostatei, ducte mari si neregulate, glande complexe cu proliferari papilare, pseudostratificate cu epiteliu inalt cilindric), si zona periferica (70% din vol prostatei, 80% din cancere de prostata, stroma fibromusculara laxa, complexitate glandulara moderata) si in ultimul rand o zona periuretrala. Zonele exterioare (corticala) sunt periferica si centrala (catre baza), zona interna (periuretrala) este de tranzitie.

5

In patologia curenta a prostatei, sunt departamente de urologie in care, de la internare se recolteaza sange si se determina valoarea unui marker deosebit de important in fiziologia prostate Antigenul specific de prostata (PSA). Este o glicoproteina, proteaz-serina legata de kalikreina, produsa de epiteliul secretor, cliveaza si lichefiaza coagulul seminal format dupa ejaculare. Valori > 4 in cancer si 25-30% in hiperplazie, prostatite, infarct, masaj prostatic, cistoscopii, alergatori la maraton. Se recomanda testare anuala la barbati 50+. In dorinta de a creste sensibilitatea valorii si corelarea cu patologia prostatei, au fost create si alte tipuri: densitate PSA/ raport PSA/ volumul glandei; PSA liber/ cel ne-legat de alfa-1-antichimotripsina. Histologic, prostata este alcatuita din: Celule secretorii: dispuse de-a lungul lumenului; sunt pozitive la fosfataza acida de prostata +, PSA +,

vimentina, keratina +, Leu7/ CD57, EMA (80%), CEA (25%). Imunocolorarea pentru CK903 (34 beta E12) este negativa.

Celule bazale: sunt dispuse sub forma unui epiteliu cuboid turtit si celule mucosecretante, nucleoli proeminenti, sunt celule de rezerva (cell stem), pot suferi proces de metaplazie mioepiteliala. Coloratii +: CK903 (34 beta E12/ keratina cu GM mare), p63, receptori androgenici. Coloratii negative: PSA, PAP, proteina S100, actina.

Celule neuroendocrine: neregulat distribuite. Coloratii pozitive: cromogranina A si B, secretogranina II, hormoni peptidici, PSA. Coloratii negative: receptori androgenici.

Hiperplazia benigna a prostatei (HBP, hiperplazia nodulara a prostatei). Reprezinta o crestere a numarului de noduli la nivelul prostatei ce pot comprima uretra si cauza simptome obstructive. Este intalnita la 20% din barbate peste 40 ani, 50% la cei peste 50 ani, 70% la cei peste 60 ani, si 90% la 90 de ani. Cerectarile nu au pus in evidenta corelatii intre histology si simptome (50% din cei cu boala histological au clinic cresterea volumului prostatei, si 50% din acestia au simptome). Nu se recomanda acest diagnostic la fragmentele provenite din biopsii, datorita lipsei corelatiei cu simptomele obstructive; totusi prezenta nodulilor stromali se coreleaza cu cresterea greutatii prostatei (Hum Path 2002;33:796). Din punct de vedere fiziologic, activitatea normala a prostatei necesita testicolele intacte (hormonii sunt testosteron si dihidrotestosteron/ DHT leaga receptorul nuclear al androgenilor in celule stromale si epiteliale, conducand la activarea factorului de crestere). Celulele stromale produc 5 alfa reductaza, enzima ce converteste testosteronul in DHT. Estradiolul are valori crescute la barbatii in varsta si poate creste numarul de receptori androgenici. In HBP cele mai frecvente simptome inregistrate sunt: infectia de tract urinar, obstructia, retentia acuta de urina, hipertrofia vezicii urinare, aparitia de diverticuli. Cercetarile au demonstrate ca HBP nu se asociaza cu carcinomul de prostate, desi acesta din urma se poate dezvolta pe glanda reziduala dupa rezectia trans uretrala a prostatei (TURP). A existat totusi un studiu care a demonstrat tranzitia de la HBP in adenocarcinom, in zona de tranzitie, in anumite circumstante. (Hum Path 2003;34:228) Histopatologic HBP se caracterizeaza, dupa cum arata si numele afectiunii, prin hiperplazia tesutului glandular si stromal cu muguri papilari, proliferari si chiste; se poate asocial cu metaplazie scuamoasa si infarct. Leziunea incepe in jurul uretrei in locul intrarii ductelor ejaculatorii (este zona de tranzitie sau periuretrala). Se caracterizeaza printr-un strat de cellule bazale continuu, diminua tesutul elastic, si rare limfocite in jurul ductilor, fara sa existe infectie. Alte leziuni ce pot insoti HBP sunt: adenoza sclerozanta, hiperplazia asemanatoare celor din fibroadenom si tumora filoda, nodule leiomiomatosi, nodule fibromoxoizi si infarctul. Examenul imunohistochimic este extreme de important si se efectueaza un marker pentru a demonstra continuitatea celuleor bazale, si anume CD 10. O alta leziune extreme de importanta, care poate mima cancerul, sau il poate insoti este neoplazia intraepiteliala prostatica (PIN). S-a descris o varianta de grad scazut si cea de grad inalt. PIN de grad scazut (LGPIN) apare mai ales la subiectii tineri, si se recomanda sa nu fie mentionata pe rapoartele de histopatologie datorita gradului mare de subiectivitate si faptului ca nu se malignizeaza. Microscopic se caracterizeaza printr-o arhitectura mai complexa decat in cazul hiperplaziei, cu celule cu nuclei mariti, rari nucleoli vizibili si celule diploide. PIN de grad inalt (HGPIN) a fost identificata in unele studii in 14% din caurile spitalizate. Daca prezenta sa la prima biopsie indica un risc de cancer de 33%, PIN + la 2 biopsii subsecvente scade riscul la 13%. Studii ample au sustinut faptul ca prezenta leziunii si numarul de fragmente bioptice pot prezice riscul de cancer subsecvent (1 fragment-30%, 3 fragmente-40%, 4+ fragmente-75%), si de asemenea si patternul leziunii, in special cel cribriform/micropapilar. HGPIN nu determina cresterea nivelului seric al PSA (antigen specific de prostata), si identificarea sa pe fragmentele de rezectie ar trebui sa impuna examinarea tuturor fragmentelor pentru izolarea cancerului. Histopatologic se identifica la nivelul ductilor aspect micropapilar/ cribriform , turtit sau in tufe. Citoplasma este bazofila si nucleii mari hipercromatici; sunt situatii cand leziunea este multicentrica. In unele cazuri celulele pot contine pigment, si mucina intralumenal.

6

In aceasta leziune imunohistochimic, celulele bazale sunt + la CK903, p63, CD10, iar cele secretorii + la P504S/AMACR. Diagnosticul diferential este frecvent dificil si se face cu hiperplazia cribriforma cu celule clare si cu glandele veziculelor seminale. Pattern-ul HGPIN poate fi: apocrin, cribriform, turtit/plat, glande spumoase, inversat (tinta de bocanc, Paneth-like, pleomorf, celule in inel cu pecete, celule mici neuroendocrine, si in tufe. Trasaturile histologice ce sugereaza malignitatea sunt: nucleoli proeminenti si marginali si multiplii, secretii mucinoase bazofile, cristaloide in lumene, material amorf eosinofil intralumenal, micronoduli de colagen, glomerulare, invazie perineurala, retractie in fante si invazia grasimii. (Archives 2002;126:554, Archives 1995;119:444, Hum Path 1998;29:543 ). Studii recente au sustinut legaturile moleculare dintre HGPIN si cancerul de prostata (CaP). Cel mai des studiat element al pattern-ului PIN este castigul sau pierderea de diversi cromozomi precum si legatura lor cu alterarile genetice din cancer. Se crede ca acumularile de alterari genetice in celula reprezinta un factor declansator al malignitatii. Regiunea care adaposteste aceste modificari se considera ca codifica gene supresoare, si in PIN. O gena supresoare tumoral este replicarea mutatiei pozitive pentru eroare, care inactiveaza aceste locusuri in cancerul colorectal, si poate fi activa si in cancerul de prostata. Majoritatea studiilor au evidentiat ca alterarile numerice cromozomiale sunt frecvente si in cancer si in PIN (cresteri numerice 7q31, si 8q, pierderi de material in 8p si 10q, 16q, si 18q si multiple copii ale genei c-myc.gradul in care gena c-myce amplificata este proportional cu gradul cancerului. Cu cat nucleii sunt mai apropiati de locul microinvaziei, cu atat semnatura nucleara seamana foarte bine cu aceea a malignitatii. Pe masura ce leziunea PIN progreseaza spre cancer, cromatina devine mai neuniform distribuita. Telomeraza este o ribonucleoproteina responsabila cu sinteza telomerilor. Ea nu se poate detecta in celulele normale, dar se identifica in cancer si PIN, dar si in leziuni benigne insotitoare cancerului. Celulele bazale pot fi identificate, atunci cand exista, cu markerii: 34beta E12/ citocheratina de greutate mare si p63, markeri selectivi pentru celulele bazale, nu pentru cele secretorii. Folosirea celor 2 in coctail este recomandata. P 63 e o proteina nucleara codificata de o gena de pe cr 3q27-29 cu omologie cu p53 (gena supresoare tumorala). S-a demonstrat ca regleaza cresterea si dezvoltarea epiteliului din piele, col uterin, san si tract urogenital. Izotipurile specifice se exprima pe: celule bazale ale epiteliilor pseudostratificate (prostata, bronhii), celule de rezerva ale epiteliilor cilindrice simple (endocol, ducti pancreatici), in celule mioepiteliale (san, glande salivare, glande apocrine /ecrine cutanate), uroteliu si epiteliu scuamos. Utilizarea Ag p63 are aplicatii similare cu CK cu GM mare dar cu avantaje: coloreaza si celulele bazale pe care 34E 12 nu le coloreaza, e mai putin susceptibil la variatii de imunocolorare ce pot apare ca artefact si e usor de interpretat caci are colorare puternica nucleara Markerul P504S/AMACR este sensibil pentru CaP, in special in combinatie cu 34beta E12 ( AJSP 2002;26:1169, Hum Path 2003;34:228). O problema in practica o ridica adenocarcinomul minim de prostate pe biopsie. Reprezinta un focar mai mic de 1 mm pe biopsie si este o mare incercare pentru patolog. Diagnosticul se pune pe prezenta nucleomegaliei, pattern-ului de crestere infiltrativ, secretiilor intralumenale, nucleolilor proeminenti, asocierea cu HGPIN, citoplasma amfofila, nuclei hipercromatici, cristaloide intralumenal. Histologia depinde de gradul Gleason: glande mici sau medii, cribriforme sau infiltrare a unui sir de celule cu necroza si hipercromazie. Transformarea maligna e insotita de pierderea stratului bazal. Glande prea multe, prea mici, prea inghesuite. Cel mai des intalnit aspect este Gleason 3. daca diagnosticul de cancer este evident este usor de elaborate un buletin histopatologic; daca nu sunt indeplinite criteriile histologice de malignitate, se concluzioneaza focar de glande mici atipice suspect pentru malignitate. Cancerul de prostata se gradeaza utilizand sistemul gleason, care se bazeaza pe modelul architectural al glandelor neoplazice. CaP este adesea multifocal si scorul general este suma celor 2 prevalente pattern-uri. In ciuda incercarilor de identificare a semnaturilor genetice ale leziunilor de cancer cu grad scazut sau inalt Gleason, procesul ce duce la diferitele pattern-uri arhitecturale nu e cunoscut. Mai recent, cateva tehnici, ce includ si analiza setului de gene, au fost dezvoltate pentru identificarea genelor nonexprimate care dovedesc functii biologice. Studiile au confirmat rolul central al cailor de semnalizare in CaP. S-a identificat calea crescuta de androgeni in PIN comparabil cu epiteliul benign si calea scazuta in cancer localizat comparabil cu PIN, in cancere cu Gleason mare comparat cu Gleason mic si cancer refractar hormonal metastatic cu cel localizat. Analizele au sugerat ca semnalizarea androgenilor este scazuta in cancerul de prostata metastatic naiv-hormonal comparat cu cel localizat (asa numitele gene supraexprimate (dependente temporal). Unii autori au propusun model in care celulele maligne de tumora localizata devin mai agresive prin selectarea genelor sensibile androgenic subexprimate, conducand la cresterea proliferarii, dediferentierii sau reducerii apoptozei. Intr-un studiu recent autorii au confirmat ca desi genele ce regleaza androgenii sunt subexprimate in cancerele metastatice hormonal-refractare, sunt inca transcrpti majori in celulele maligne. Cancerele metastatice hormono-refractare selecteaza mecanismele pentru mentinerea semnalizarii androgenilor (ex amplificarea sau mutatii ale receptorului androgenic), consistent cu supravietuirea celulelor neoplazice ce necesita o semnalizare androgenica minima.

7

In 1895 croitoreasa doctorului Alfred Warthin i-a spus acestuia ca e convinsa ca va muri de cancer precum alti membri ai familiei sale. Intradevar, a murit tanara de cancer de endometru, si dr warthin a publicat o descriere a familiei sale care includea morti premature de cancere gastrice, endometriale si colorectale. Progrese remarcabile s-au inregistrat prin anii 1960 de lynch, Li si Knudson care au studiat sistematic familiile cu risc. Knudson a elaborat ipoteza celor 2 pasi (two hits) bazandu-se pe o tumora de ochi, rara la copii, retinoblastomul. El a postulat ca prezenta unor gene reglatorii TSG normal implicate in ciclul celular, apoptoza si proliferare intervin si in aceasta afectiune dramatica. Oamenii au in mod normal 2 cpii ale acestor gene, fiecare de la un parinte. Cand apar mutatii mostenite, o copie e afectata. Gena ramasa indemna mentine un control suficient reglator, totusi ar trebui o mutatie sa apara in cealalta copie si sa apara in o singura celula maligna sa fie dobandita. Aceasta ipoteza a fost confirmata 20 de ani mai tarziu cand mutatiile de linie germinala ale genei RB (retinoblastomului) au fost detectate in retinoblastom. Cancerul de prostata ereditar este de obicei definit prin pedigree si si nu s-au identificat ferm gene asociate. Aceasta definitie include: familii cu 3 cazuri de cancer de prostata, prezenta CaP in 3 generatii pe linie materna sau paterna si o aglomerare de 2 rude diagnosticati cu CaP mai devreme de 55 de ani. Aplicarea acestei definitii 3-5% din pacientii cu CaP au maladie ereditara. Aceasta definitie exclude familiile cu susceptibilitate ereditara la caP. Uneltele informaticii au un rol important in descoperirea procesului. Aceasta abordare este disponibila pe un site ONCOMINE (www.oncomine.org) si furnizeaza informatii privitoare la genele de interes. De la primul studiu despre CaP publicat in 2001, s-au evidentiat multe cecetari care au incercat sa raspunda intrebarilor clinice si biologice prin identificarea profilului genelor specificece distinge tesutul normal de cancer, corelarea cu gradul Gleason, prezicerea functiilor tumorilor agrsive, sau prezicerea recurentelor. Istoric vorbind, examinarea histologica si gradul Gleason au fost utilizate sa determine prognosticul, sa ajute la consiliere inainte de tratament si a fost confirmat ca un predictor al evolutiei. Nu surprinzator, profilul genetic se asociaza cu un grad gleason specific care a fost utilizat in predictia gradului scazut sau inalt de CaP. Desi studiile efectuate au consolidat corelatiile dintre scor si gradul si prognosticul caP, corelare intre studii nu au putut valida lista de gene ce reflecta tranzitia histologica a caP. Desi predictia si clasificarea prin scorul gleason sunt utile pentru evolutia bolii, predictia gradului privind activitatea tumorala si evolutia clinica nu este perfecta. Au fost studii care s-au concentrat pe identificarea profilului cancerelor recurente sau agresive, referindu-se la gradul Gleason. Colegiul Patologilor Americani (CAP) a clasificat factorii de prognostic in 3 categorii: Categoria l: factori doveiti a avea importanta prognostica si utilitate in managementul clinic al pacientului. (PSA preoperator, grad histologic/ scor Gleason, stadializare TNM, statusul marginilor chirurgicale). Categoria ll : factorii care intens au fost studiati clinic si biologic, dar a caror importanta ramane sa fie validata prin studii statistice robuste (volum tumoral, tip histologic, ploidie ADN). Categoria lll: alti factori ce nu au fost suficient studiatica sa-si demonstreze valoarea prognostica (invazia perineurala, diferentierea neuroendocrina, densitatea microvascularizatiei, trasaturi nucleare, markeri de proliferare si markeri moleculari precum oncogenele si gene supresoare tumoral). Tabel 1. Markeri cu valoare diagnostic MARKER VALOARE

DIAGNOSTICA MATERIAL FOLOSIT

METODA TINTA

FOSFATAZA ACIDA PROSTATICA

DA/ SI PROGNOSTICA

SER IMUNOLOGICA PROTEINA

ANTIGEN SPECIFIC AL PROSTATEI

DA/ SI PROGNOSTIC

SER/ CELLULE SANGUINE

IMUNOLOGICA /RT-PCR

PROTEINA SAU ARNM

ANTIGEN AL PROSTATEI SPECIFIC DE MEMBRANE

DA/ SI PROGNOSTIC

SER/ CELLULE SANGUINE

IMUNOLOGICA/ RT-PCR

PROTEINA/ ARNM

PEPTIDE PROSTATICA TIP INHIBINA

DA TESUT, SER, URINA IMMUNOLOGIC PROTEINA

PCA-1 DA TESUT, URINA IMMUNOLOGIC PROTEINA PR92 DA SER, LICHID

PROSTATIC IMUNOLOGIC PROTEINA

COMPLEX GLICOPROTEIC ASOCIAT PROSTATEI

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

ANTIGEN AL MUCINEI PROSTATICE

DA TESUT, LICHID PROSTATIC SAU SEMINAL, URINA

IMMUNOLOGIC PROTEINA

GENA 1 INDUCTOARE TUMORALA A CP

DA TESUT NORTHERN BLOT/ RT-PCR

ARNM

8

FACTOR DE LEGARE A IMUNOGLOBULINEI

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

GENA RETINOBLASTOMULUI (RB)

DA TESUT SOUTHERN/ PCR/ IMMUNOLOGIC

AND/ PROTEINA

Tabel 2. Markeri cu valoare prognostica

MARKER VALOARE PROGNOSTICA

MATERIALE FOLOSITE

METODA TINTA

12-LIPOOXIGENAZA DA TESUT RT-PCR/ ISH

PROTEINA

P 53 DA TESUT IMMUNOLOGIC/ PCR

PROTEINA/ AND

INSTABILITATE MICROSATELITA

DA TESUT PCR AND

SINTETAZA ACIZILOR GRASI

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

MARKERI DE PROLIFERARE

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

E-CADHERINA DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA SIAL OLIGOZAHARIDA LEWIS

DA TESUT IMMUNOLOGIC CARBOHIDRAT

MARKERI AI ANGIOGENEZEI

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

DIFERENTIERE NEUROENDOCRINA

DA PLASMA IMMUNOLOGIC PROTEINA

ACTIVITATE DE COAGULARE

DA URINA IMMUNOLOGIC PROTEINA

OSTEOCALCIN DA SER IMMUNOLOGIC PROTEINA PRODUSI DE DEGRADARE AI COLLAGEN TIP I

DA SER/ URINA IMMUNOLOGIC PROTEINA

PROTEINE CE LEAGA FACTORI DE CRESTERE ASEMANATORI INSULINEI

DA SER IMMUNOLOGIC PROTEINA

PROTEINA I (Y) CU MOBILITATE INALTA

DA TESUT ISH ARNM

INHIBITORI DE METALPROTEINAZE

DA TESUT IMMUNOLOGIC PROTEINA

Tabel 3. DIAGNOSTIC HISTOLOGIC IN CAP DIAGNOSTIC HISTOLOGIC

MAJORITATEA SUNT ADENOCARCINOAME DIN ZONA PERIFERICA. MARE POLIMORFISM ARCHITECTURAL SI CITOLOGIC.

ANOMALII ARHITECTURALE CHARACTER INFILTRATIV AL PROLIFERARII TUMORALE. GLANDE MICI, CONTURURI NEREGULATE, DISOCIIND STROMA

FOCAR TUMORAL RAU DELIMITAT SI INFILTRATIV PRINTER STRUCTURILE NORMALE.

SEMNE MAJORE

ANOMALII CITOLOGICE CRESTEREA TALIEI NUCLEULUI SI NUCLEOL VOLUMINOUS (>1/BERGER 1996). MODIFICARI TINCTORILALE CITOPLASMATICE. DISPARITIA STRATULUI DE CELLULE BAZALE (MO SI IHC).

CONTINUT INTRALUMENAL MUCINE ACIDE EOZINOFILE/ BAZOFILE SI CRISTALOIDE (JENSEN, 1980).

SEMNE MINORE

APORTUL IHC

Tabel 4. CAR(scorul=suma

MICRONODULI DE COLLAGEN CU ASPECT GLOMERULOID (EPSTEIN, 1996).

INVAZIE PERINEURALA PARTIALA/ TOTALA. PSA (ANTIGEN SPECIFIC DE PROSTATE) EXPRESIE PERSISTENTA IN CANCERE NEDIFERENTIATE / METASTAZE. CITOKERATINE CU GM MARE- CK5/6, CK7, CK903 (34E12): DISPARITIA STRATULUI DE CELLULE BAZALE.

S-a incercat elaborarea unor reguli ale GRADARII GLEASON (Bostwick, Dundore 1997), ACTERISTICI GRAD GLEASON a doua grade bine reprezentate in tumora)

GRAD 1 PROLIFERARE MONOTONA DE GLANDE SIMPLE TAPETATE DE UN SINGUR STRAT DE CELLULE, CU MUCINE /CRISTALOIDE INTRALUMENAL.

cu toate ca se constata un mare grad de subiectivism in acest fapt:

Un focar minim nu e sinonim cu grad mic si corespunde cel mai des gradului 3. Niciodata pe biopsie nu se da G1. Un focar circumscris e G1. Pentru G2, focarului tumoral I se aplica regula celor 3R: rotund, regulat in talie si regulat in forma. Glande inghesuite (back to back) formeaza G2. A priori, cancerul e G3 (pe biopsii). G3= glande de talie si forme variate. G3= glande tumorale de talie si forme variate, tortuoase si angulare. Fuziunea formeaza G4 Daca tubii tortuosi nu fuzioneaza, nu e G4. Un focar cribriform e apriori G4. Absenta structurilor glandulare e G5. In caz de dubii, scorul se dubleaza.

9

10

FOCARE SITUATE IN ZONA DE TRANZITIE (PORTIUNEA ANTERIOARA A PROSTATEI, GREU ACCESIBILA BIOPSIEI.

GRAD 2 PROLIFERARE DE GLANDE SIMPLE, CU TALII DIFERITE DE GLANDELE NORMALE, SPATIATE DE ARII7 (FOSTER, 1998)

11

Tabel 6. CLASIFICAREA HISTOLOGICALA A TUMORILOR DE PROSTATE (AFIP, 2003) NEOPLASME GLANDULARE ALE PROSTATEI

ADENOCARCINOM ACINAR: VARIANTE: ATROPHIC. PSEUDOHIPERPLAZICA GLANDA SPUMOASA. COLLOID & INEL CU PECETE. ONCOCITIC. LIMFOEPITELIOM-LIKE. SARCOMATOID (CARCINOSARCOM). NEOPLAZIA INTRAEPITELIALA PROSTATICA. ADENOCARCINOM DUCTAL.

CARCINOMA UROTELIAL NEOPLASME SCUAMOASE ALE PROSTATEI CARCINOMA BAZOCELULAR

DIFERENTIERE NEUROENDOCRINA FOCALA IN AK DE PROSTATE TUMORI CARCINOIDE

TUMORI NEUROENDOCRINE ALE PROSTATEI CARCINOMA CU CELULA MICA TUMORI STROMALE CU POTENTIAL MALIGN INCERT SARCOM STROMAL LEIOMIOSARCOM RABDOMIOSARCOM

TUMORI MEZENCHIMALE

ALTELE CHISTADENOM TUMORA WILMS TUMORA RABDOIDA MALIGNA TUMORI CU CELLULE GERMINALE ADENOCARCINOM CU CELULA CLARA MELANOMA PARAGANGLIOM

TUMORI DIVERSE

NEUROBLASTOM TUMORI EPITELIALE ADENOCARCINOM PRIMAR CHISTADENOM TUMORI STROMALE EPITELIALE MIXTE BENIGNE SI MALIGNE

TUMORI DE VEZICULE SEMINALE

TUMORI MEZENCHIMALE TUMORI DIVERSE DE VEZICULE SEMINALE CORIOCARCINOM

Patologia si Stadializarea CaP. s-a admis ca gradarea si stadializarea CaP trebuie sa utilizeze criteriile Gleason. Este necesar sa se utilizeze si trasaturile auxiliare de diagnostic :coloratiile pentru mucine acide/PAS cu pH1, prezenta cristaloidelor, coloratiile IHC/ CK34E12 pentru celulele bazale nu cele secretorii !!! insa diagnosticul nu trebuie sa se bazeze pe o imunoreactie negative) Diagnosticul diferential este extreme de important si in unele cazuri dificil. Grading-ul histologic si stadializarea sunt importante pentru diagnostic dar si prognostic. Stadializarea CaP. Stadiul clinic si patologic sunt acceptate ca fiind indicatori majori de prognosticin prezicerea comportamentului biologic al CaP. CATEGORIILE T1A SI T1B diagnosticate pe rezectii transuretrale de tesut prostatic se refera la pacienti care nu sunt suspectati de CP. Distinctia intre T1a si T1b se bazeaza pe afectarea de catre cancer a tesutului rezecat.

T1a reprezinta tumori cu 5% afectare T1b reprezinta tumori cu 5% afectare, si nivel seric crescut de PSA

Aceste categorii nu se coreleaza patologic la fragmentele provenite de la prostatectomiile radicale. T1c : a fost create pentru a cuprinde acei pacienti cu CP diagnosticati la biopsie dar fra leziuni palpabile/ vizibile prezente la echo. Sunt diagnosticati pe seama PSA seric mare.

12

T2a, T2b, T2c: include leziuni palpabile si vizibile echo. Subcategorizarea in lobi nu este practica anatomopatologic, ci numai clinic (TR). Metodele aplicate pentru determinarea volumului cancerului include morfometrie, grille de estimare si arii estimate, toate necesitind un examen complet histopatologic al glandei. O data confirmata tumora histopatologic, nu mai este necesara subdivizarea acesteia, ci numai scorul Gleason poate da informatii prognostice semnificative. CATEGORIILE T3A SI T3B. Se refera la extensia extracapsulara uni si bilaterala. Semnificatia prognostica a acestei categorii este neclara. In multe rapoarte aceste categorii sunt combinate Categoria T3c. Invazia peretelui muscular al glandelor seminale este un important indicator prognostic negative in evaluarea fragmentelor provenite de la prostatectomii. Utilizarea biopsiei directe pentru identificarea afectarii glandelor seminale inainte de tratament este deosebit de importanta in stadializarea pacientilor cu CP. CATEGORIA T4 Se refera la afectarea macroscopica a structurilor adiacente (vezica urinara, rect, perete pelvian) de CP. Marginile chirurgicale. Afectarea marginilor de rezectie chirurgicala este un predictor important al insuficientei terapeutice si reducerii supravietuirii la pacientii tartati prin prostatectomy. Aceasta categorie nu a fost validate.

Tabel 7. EVALUAREA CRITERIILOR PENTRU DIAGNOSTICUL DE CARCINOM

PREZENTA DE NUCLEOLI EXCENTRICI POATE FI DE AJUTOR POT FI PREZENTI SI LA GLANDE BENIGNE

CITOPLASMA AMFOFILA SUNT SI GLANDE BENIGNE AMFOFILE, DAR AU MAI ALES CITOPLASMA PALIDA, CLARA

INVAZIE PERINEURALA/ GLANDE GLOMERULOIDE/ MICRONODULI DE COLLAGEN

IN ABSENTA LOR (LA PUNCTIE-BIOPSIE) DG= TRASATURI ARHITECTURALE+CITOLOGICE

TRASATURI ARHITECTURALE CRITERIU MAJOR GLANDE MICI CU PATTERN INFILTRATIV, GLANDE CRIBRIFORME, GLANDE PREA MARI/NEREGULATE

NUCLEOL PROEMINENT E CRITERIU SUBIECTIV E RELATIVE UTIL CIND SE COMPARA CU CEL AL GL BENIGNE VECINE

GLANDE TAPETATE DE UN SINGUR RIND CELLULAR

CRITERIU MAJOR

SECRETII MUCINOASE ALBASTRUI, SECRETII AMORFE ROZ, MITOZE, CRISTALOIDE, PINHG ADIACENT, HIPERCROMAZIA NUCLEARA

CRITERII MINORE

Diagnosticul de cancer de prostate se bazeaza pe prezenta a 3 glande cu criteriile de mai

sus/ sau o singura glanda daca satisface criteriile arhitecturale, citologice si alte elemente ale carcinomului.

Istoricul clinic este f important la evaluarea unei biopsii (PSA seric, ECHO transrectal, TR) Nu se poate face distinctie intre glande cribriforme circumscrise in AK Gleason 3si PINHG

cribriform. Se repeat biopsia sau IHC? Nu este mai putin adevarat ca exista asa numitele capcane histologice, a caror prezenta poate face dificila elaborarea diagnosticului histopatologic, facand necesara aplicarea de teste imunohistochimice.

Tabel 8. CAPCANE HISTOLOGICE HIPERPLAZIA ADENOMATOASA ATIPICA HIPERPLAZIA CRIBRIFORMA CU CELLULE CLARE HIEPERPLAZIA DE RESTURI MEZONEFROIDE HIPERPLAZIA DE CELLULE BAZALE

LEZIUNI HIPERPLAZICE

HIPERPLAZIA DE VERU MONTANUM ATROFIA LEZIUNI ATROFICE SI MIXTE HIPERPLAZIE POSTATROFICA

LEZIUNI METAPLAZICE METAPLAZIA NEFROGENICA

13

METAPLAZIA MALPIGHIANA LEZIUNI DISPLAZICE PIN-HG

XANTOM LEZIUNI INFLAMATORIIPROSTATITA GRANULOMATOASA HORMONOTERAPIE MODIFICARI POSTTERAPEUTICE RADIOTERAPIE

METASTAZE LIMFOM GLANDE COWPER GANGLION SIMPATIC

STRUCTURI NORMALE VEZICULE SEMINALE SI CANALE EJACULATORII

Glandele atipice, suspecte pentru malignitate sunt diagnosticate in ~5% din biopsii, datorate maririi nucleiolor, maririi nucleolilor, secretiilor intralumenal, cresterii infiltrative, proliferarii acinilor mici, mucinelor bazofile intralumenal, citoplasmei amfofile, prezentei HGPIN si cristaloidelor (AJCP 1997;108:633, AJSP 1997;21:1489). s-a descries fenomenul de disparitie a cancerului, sau cancer residual minim la prostatectomia radicala, care apare in 3-4% din cazuri (AJSP 1997;21:174, AJSP 1995;19:1002). Majoritatea lesiunilor din cancer apar in zona periferica a glandei, mai rar in zona de tranzitie si aproape de loc in zona centrala. Adenomul (hiperplazia benigna de prostata (HBP) se dezvolta in zona de tranzitie, care se poate mari considerabil in spatele a ceea ce este accesibil macroscopic. Inflamatia din zona de tranzitie se asociaza nodulilor de HBP si atrofiei, iar cea din urma este adesea prezenta in jurul nodulilor de HBP. Inflamatia acuta poate fi proeminenta si in zona periferica si cea de tranzitie, dar este destul de variabila. Inflamatia din zona periferica apare in asociere cu atrofia in majoritatea cazurilor. Desi carcinomul poate implica si zona de tranzitie, leziunile mici de cancer virtual nu apar niciodata izolat, s-a sugerat ca PIN niciodata nu progreseaza spre cancer in aceasta zona. Carcinoamele cu acini mici si mari in zona periferica adesea sunt asociate cu HGPIN, in vreme ce carcinomul din zona de tranzitie tinde sa fie de grad scazut si adesea asociat hiperplaziei adenomatoase atipice sau adenozei, si foarte rar asociat HGPIN. Variatele modele de atrofie a prostate, unele asociate cu PIN si cateodata si cu leziuni de carcinom, sunt prevalente in zona periferica, rare in zona de tranzitie si foarte rare in zona centrala. Histologic majoritatea leziunilor, contin fie infiltrat inflamator acut fie cronic si se asociaza cu epiteliu atrofic sau atrofie epiteliala. Comparativ cu epiteliul normal, exista o fractie ridicata a celulelor care prolifereaza in leziunile de atrofie focala. Si s-a propus termenul de atrofie inflamatorie proliferativa (PIA). In studiile morfologice s-a observat tranzitia intre epiteliul atrofic si adenocarcinom. Desi sunt evidente pentru modificarile genetice somatice in atrofia inflamatorie proliferativa (PIA) si atrofia proliferativa, se pare ca majoritatea acestor leziuni nu adapostesc alterari genetice clonale. Tesut de la pacienti cu HBP care apare in zona de tranzitie, are arii cu numar foarte mare de celule inflamatorii. In aceste zone epiteliul pare atrofic, indicand ca aceste regiuni pot fi considerate PIA ale zonei de tranzitie. Ca sa se determine daca inflamatia este legata de cancerul de prostata independent de simptomele clinice, e crucial sa se compare pattern-urile si extensia inflamatiei pe biopsiile de prostata, la pacienti cu sau fara cancer. Deoarece inflamatia este frcventa pe specimenele de prostata, masuratorile trebuie cuantificate , si necesita fragmente mari. Institutul de sanatate di SUA (NIH) a elaborat un sistem consensual de gradare a inflamatiei prostatei, si se va folosi acest sistem in studiile de caz-control in scopul determinarii daca inflamatia asimptomatica se asociaza cu cancerul pe fragmentele de biopsie recoltate intr-un amplu trial de prevenire a cancerului de prostata (PCPT/ prostate cancer prevention trial). Studiul a incercat sa determine daca inhibitorul de 5 alfa reductaza (finasterida) ar putea reduce prevalenta CaP. CaP chiar in stadii tardive, raspunde la terapia primara de deprivare de androgeni. (chirurgicala sau medicala) cu o rata de raspuns > 80%. Si totusi mai mult de jumatate din aceste cancere progreseaza spre un status hormono-insensibil in 16-18 luni. Elucidarea conversiei de la status hormonal-sensibil la cel insensibil este o problema care inca nu s-a rezolvat. O mai buna intelegere a mecanismelor de rezistenta la terapia hormonala dupa deprivarea androgenica ar putea facilita manipularea clinica a cancerelor refractare hormonal si ar rezulta o supravietuire mai mare. Mecanismele moleculare ce stau la baza progresiei androgen-independente nu sunt bine intelese si datorita materialelor histologice insuficiente in timpul perioadei de progresie a bolii. CaP poate supravietui chiar cu nivele scazute de androgeni, prin supraexprimarea receptorilor androgenici (AR) sau prin cresterea activitatii activitatii 5 alfa reductazei de conversie a testosteronului in dihidrotestosteron. Membrii ai familiei receptorilor factorilor de crestere epidermali (HER1, HER2) pot activa mecanismele independente de ligand ai receptorilor androgenici. Studii recente au aratat ca HER1 si HER2 pot induce fosforilarea AR si expresia

14

genei tinta PSA, posibil pe calea MAP-kinazelor sau calea Akt. Expansiunea clonala a celulelor cu diferentiere neuroendocrina joaca un rol important in dezvoltarea CaP insensibil hormonal. In incercarea de a identifica o posibila cauza virala a CaP, au fost studii care au raportat ca un tip de virus cunoscut ca determina leucemii si sarcoame la animale s-a gasit si in celulele maligne din CaP. Dovezile furnizate precum ca XMRV este prezent in celulele maligne au aratat ca virusul este un gamaretrovirus, un retrovirus simplu izolat prima data in 2006. gamaretrovirusurile determina cancer la animale, dar nu se stia ca fac acest lucru si la oameni. Studiile s-au limitat pana in prezent la tesutul prostatic normal. Retrovirusurile insera o copie a propriului ADN in cromozomii celulelor infectate. O astfel de insertie cateodata apare adiacent unei gene ce regleaza cresterea celulara, intrerupe cresterea normala a celulei, determinand o proliferare rapida celulara, ce poate dezvolta cancer. Acest mecanism al carcinogenezei e urmat in general de gamaretrovirusuri. Un alt studiu a aratat ca susceptibilitatea la infectia cu XMRV nu este crescuta de vreo mutatie genetica, asa cum s-a raportat anterior. Au fost studii care au investigat profilul molecular al CaP cu grad inalt (Gleason 3 / 4) . Cea mai supraexprimata gena a fost Hepsina, o serin-proteaza asemanatoare tripsinei cu domeniu catalitic orientat extracelular. Antigenul membranar specific de prostata este cea de-a doua gena supraexprimata, si astfel s-au identificat 22 de gene supraexprimate si 64 subexprimate, inclusiv loci lor de pe cromozomi. Alte studii au demonstrat ca lungimea totala a tumorii a specimenelor de biopsie este o variabila importanta de prognostic, in stransa legatura cu supravietuirea generala, fata de varsta pacientului, nivelul seric al PSA, scorul Gleason si fractia fragmentelor cu tumora. Masuratoarea necesita un efort extramodest pentru patologi, valori peste 20 mm jucand un rol important la pacientii cu CaP. In aceasta faza s-a analizat un lot de ..... pacienti din cele 3 spitale de urologie partenere in acest proiect. De la P1 au fost 50 pacienti

Examenul histopatologic.

Fragmentele prelevate au fost supuse examenului histopatologic, att cele de la nivelul tumorii ct i ale organelor excizate.

Am efectuat examenul histopatologic pe cele 40 de cazuri puse n lucru. Etapele parcurse au fost urmtoarele:

Recoltarea i fixarea fragmentelor n formol neutru soluie 10% (pH-7) Splare cu ap de robinet Deshidratare prin trecerea fragmentelor prin mai multe bi de alcooluri cu concentraii cresctoare

(700, 900, 850, 1000): pentru clarificare, piesele au fost trecute prin trei bi de benzen pentru eliminarea alcoolului din esut

Impregnarea n parafin topit s-a fcut la cald, n termostat (55-560C) i a fost urmat de includerea n blocuri

Secionarea blocurilor de parafin la microtom a urmrit obinerea unor seciuni de 4-5 microni grosime

Etalarea seciunilor pe lame degresate i tratate cu albumin Mayer a fost urmat de uscarea acestora la termostat (370C)

Deparafinarea lamelor s-a fcut n trei bi de benzen, iar hidratarea n trei bi de alcool etilic, n concentraii descresctoare

Seciunile destinate studiului morfologic au fost colorate: 1. hematoxilin-eozin:n toate cazurile, nucleii i structurile bazofile sunt colorate n albastru violet,

iar citoplasmele n roz-rou 2. tricromul van Gieson: n toate cazurile evideniaz fibrele de colagen n rou 3. albastru alcian la pH-1 n toate cazurile evideniaz mucinele acide n albastru, mucinele neutre

n rou, i cele mixte, acide i neutre n purpuriu deshidratarea lamelor colorate s-a fcut n trei bi de alcool etilic n concentraii cresctoare, iar

clarificarea n trei bi de benzen montarea preparatelor a fost fcut n balsam de Canada, ca mediu anhidru lamele au fost examinate la microscopul Nikon.

Prepararea tesutului prostatic. Prostata imediat obtinuta dupa prostatectomie radicala, si fragmente vor fi detasate dupa disectie sagitala. Sectiunile vor fi colorate cu hematoxilina-eozina pentru a identifica zonele care contin stromal, vezicule seminale, prostata normala, BPH, HGPIN sau adenocarcinom prostatic. Din registrele Departamentului de Anatomie Patologica al Institutului Clinic de Boli Digestive si Transplant Hepatic Fundeni au fost selectate 25 de cazuri diagnosticate cu carcinom prostatic si tratate chirurgical in Clinica de Urologie a Institutului Clinic Fundeni. In baza de date au fost introduse: numele si prenumele pacientilor; varsta; codul numeric personal; numarul foii de observatie; diagnosticul clinic preoperator; tipul interventiei chirurgicale; dimensiunile tumorii; culoarea si consistenta tesutului tumoral; diagnosticul microscopic.

15

Tehnica histologica folosita a fost urmatoarea: I. Tehnica histologic uzual Etapele tehnicii de prelucrare uzual: 1. Orientarea pieselor operatorii 2. Fixarea 3. Includerea in parafin 4. Secionarea 5. Deparafinarea 6. Colorarea 7. Montarea 1. ORIENTAREA PIESELOR OPERATORII s-a realizat cu ajutorul unor instrumente fine si tioase a fost aleasa piesa reprezentativa, coninnd zone cu modificri macroscopice, precum si esuturi de la limita leziunilor, evitnd zonele cu esuturi necrozate si cu zone de hemoragie; fragmentele recoltate au fost sectionate la o grosime de 0,5 cm cu feele netede si paralele s-a pstrat ntreaga piesa de rezecie sub fixator. 2. FIXAREA fixarea are ca prim scop oprirea evoluiei celulelor si esuturilor intr-o stare cat mai apropiata de momentul recoltrii blocarea reaciilor enzimatice si stoparea degenerrii autolitice fixarea s-a facut la temperatura camerei; fixatorii, pentru a ptrunde in esuturi, trebuie sa aib anumite caliti: o presiune osmotica mare, concentraie electrolitica optima (de 24 ori mai mare ca a sngelui), pH acid. durata fixrii variaz cu tipul de fixator utilizat, fiind intre 3 ore si 24 de ore o proprietate importanta a fixatorului utilizat este penetrabilitatea, care depinde att de compoziia chimica a fixatorului, cat si de structura esutului care fixeaz; in general esuturile parenchimatoase sunt penetrate mai repede de fixator in comparaie cu cele conjunctive esuturile fixate in formaldehida sunt relativ dure, elastice si pot fi secionate uor. Fixarea uzual se realizeaz cu formaldehida la temperatura camerei. Metoda este utila si pentru seciunile destinate reaciilor IHC. Fixarea in formaldehida permite pstrarea pieselor pentru perioade ndelungate. Etanolul este util in special pentru identificarea glicogenului si pentru demonstrarea mineralelor (care sunt insolubile in alcool; ex. reacia Perls); fixarea este avantajoasa deoarece faciliteaz penetrarea rapida a fragmentelor tisulare, calitate pentru care se utilizeaz frecvent in fixatori compui. Fixarea este dezavantajoasa, deoarece piesele devin dure si dizolva un numr mare de substraturi. Tetraoxidul de osmiu este cel mai bun fixator citologic si pentru microscopie electronica. INCLUDEREA SI SECTIONAREA Dup recoltare si fixare, specimenele fixate in formol au fost splate cu apa curenta (splarea nu este necesara dup fixatori alcoolici). Pentru a putea fi infiltrate la parafina specimenele sunt supuse procedurilor de deshidratare si clarificare. Procesarea tisulara consta din 3 timpi, care au rolul de extragere a apei si de a o nlocui cu un mediu care se solidifica si permite secionarea. 3. INCLUDEREA - Includerea este procesul care permite infiltrarea specimenelor cu un material semidur, cu punct de topire fix si care poate fi secionat dupa solidificare - cel mai cunoscut mediu de includere este parafina histologica, cu punct de topire 56 grade. - parafina este o mixtura de hidrocarburi solide derivate din petrol, fiind incolora, alba si uneori translucida. Pregatirea blocurilor pentru sectionare: - dupa efectuarea blocului de parafina acesta a fost racit la temperatura camerei - dupa indepartarea barelor metalice, blocul de parafina trebuie sa fie neted, lucios, si usor translucid - blocul de parafina a fost apoi modelat cu un bisturiu ascutit, rezultnd un bloc paralelipipedic sau cubic; - modelarea blocului presupune indepartarea excesului de parafina; - la marginea opusa cutitului se lasa o cantitate mai mare de parafina 4. SECIONAREA este procedura prin care se obin seciunile histologice de diferite grosimi care pot fi atasate pe lame histologice in vederea colorrii fragmentele incluse in parafina se secioneaz cu lame de unice folosina sau cuite de otel inoxidabil unghiul de taiere al cuitului reprezint nclinaia fata de planul seciunii; -se considera ca unghiul optim este de 5-10%. Condiiile secionrii corecte: - grosimea normala a seciunii este de 5 micrometrii, ea variind in funcie de tipurile de esuturi de studiat (ggl-4 micrometrii), pentru a evita suprapunerile nucleare; amiloidul se studiaz la seciuni mai groase de 10 micrometrii - suprafaa blocului va fi paralela cu cuitul Flotatia s-a realizat in baia de ap nclzita sub punctul de topire al parafinei seciunile histologice au rmas in baia de apa pana la ntinderea pe lame / topirea parafinei

16

seciunile histologice s-au separat si s-au lipit pe lame curate, degresate cu alcool sanitar si uscate la termostat timp de 10 min la 56 grade C sau 30 minute la temperatura camerei. 5. DEPARAFINAREA - n bi succesive cu solveni pentru ndeprtarea parafinei. 6. COLORAREA deparafinare i hidratare gradual n alcool i cu ap. colorare 5-10 minute n soluie de hemalaun cltire cu ap distilat pn ce seciunile vireaz n albastru difereniere 5-10 secunde n soluie acid-alcool, n caz de supracolorare a nucleilor cltire cu ap distilat pn ce seciunile devin albastre colorare 10 minute cu soluia de eozin splare 1-5 minute cu ap de robinet deshidratare gradual cu alcool 96 i apoi cu alcool etilic absolut. clarificare n xilen-alcool absolut 1:1 i n final n xilen montare n balsam de Canada 7. MONTAREA - cu lamela ataata pe lama cu seciunea histologica folosind Balsam de Canada.

In cadrul acestei etape ne propunem (P4) sa realizam validarea metodelor de analiza statistica pe datele furnizate de partenerii P1, P2, P3. Aceste date ne dau valori pentru doi parametrii importanti in diagnosticarea bolii si anume scorul Gleason si PSA-ul( prostate specific antigen).

Scorul Gleason se atribuie unui cancer prostatic pe baza aspectului microscopic al celulelor, n functie de gradul lor de diferentiere. Un cancer de prostata cu un scor Gleason ridicat este mai agresiv si are un prognostic mai prost. Sistemul a fost pus la punct de Donald F. Gleason, un anatomopatolog de la Minneapolis Veterans Affairs Hospital, SUA.

Pe o biopsie de tesut prostatic recoltata transrectal sau pe piesa de excizie chirurgicala se vor efectua sectiuni microscopice care vor fi examinate de anatomopatolog. Acesta va conferi un grad pentru tumora cu cel mai apropiat aspect de cel examinat si un alt grad pentru tumora cu urmatorul cel mai apropiat aspect de cel examinat. Primul grad trebuie sa reprezinte aspectul majoritar al cancerului (peste 50% din pattern-ul total observat), iar cel de-al doilea trebuie sa reprezinte aspectul minoritar (sub 50% dar peste 5% din pattern-ul total observat). Cele 2 grade nsumate alcatuiesc scorul Gleason. Unii anatomopatologi atribuie si un al treilea grad, pentru cancerele care prezinta si un pattern tertiar (n general asociat cu o agresivitate mai mare). Astfel, o neoplazie 3+4 cu un grad tertiar 5 este mai agresiva dect una 3+4 fara grad tertiar 5.

Gradul Gleason este cunoscut si ca pattern-ul Gleason, iar scorul Gleason si ca suma Gleason. Gradul Gleason poate avea valori ntre 1 si 5, gradul 5 avnd cel mai prost prognostic. Scorul Gleason poate avea valori ntre 2 si 10, un scor de 10 avnd un prognostic foarte prost. Pentru un scor Gleason 7, o suma 4+3 defineste un cancer mai agresiv dect o suma 3+4. Scorul Gleason 9 este considerat a fi expresia unei neoplazii la fel de agresive ca una cu un scor 10. Interpretarea gradelor Gleason: Gradul 1 - tesutul canceros este foarte asemanator cu tesutul prostatic normal. Glandele sunt mici, bine delimitate si fara spatii largi ntre ele. Gradul 2 - tesutul canceros prezinta glande bine delimitate, dar acestea sunt de dimensiuni mai mari si sunt mai spatiate. Gradul 3 - tesutul canceros prezinta celule mai ntunecate care depasesc structura glandulara si invadeaza tesutul nvecinat. Gradul 4 - tesutul canceros prezinta foate putine glande, iar celulele tumorale invadeaza tesutul invecinat. Gradul 5 - glandele sunt absente. Interpretarea scorului Gleason: Gleason 3+3: tumora cu grad redus (prognostic favorabil) Gleason 3+4 / 3+5: tumora majoritar cu grad redus, dar si cu zone de grad nalt Gleason 4+3 / 5+3: tumora majoritar cu grad nalt, dar si cu zone de grad redus Gleason 4+4 / 4+5 / 5+4 / 5+5: tumora de grad nalt (prognostic infaust)

Fig. 1. Gradul Gleason

Avand in vedere cele prezentate mai sus pe scurt, am tinut cont in analiza datelor de faptul ca desi de exemplu scorul Gleason este 7, el se poate compune din 3+4 sau 4+3 si reprezinta doua lucruri diferite ( vezi 4). PSA (Prostate Specific Antigen) este o substanta fabricata natural de catre prostata. Aceasta substanta este prezenta in sangele tuturor barbatilor. Este un indicator (marker) al activitatii prostatei care se afla printr-o simpla analiza a sangelui. Cand se intampla ceva cu prostata, nivelul PSA din sange creste. Analiza PSA permite deci o evaluare a unei eventuale anomalii in functionarea prostatei.. Valoarea normala a PSA este de 4ng/ml. Datele primite sunt pentru subiecti care au cancer de prostata, ca urmare , valorile PSA sunt mult peste 4ng/ml.( vezi 4). Am realizat aceasta scurta prezentare a variabileleor cu care lucram , pentru a fi mai clar care au fost ratiunile dupa care s-a realizat criteriile de impartire a lotului general in subgrupuri. Aceste criterii tin de valorile scorului Gleason, valorile PSA , si grupe de varsta. 2.Alcatuirea bazei de date Baza de date a fost alcatuita pe baza datelor furnizate de partenerii nostri, medici anatomopatologi, si cuprinde un lot de 100 subiecti. Pentru acestia s-au luat in considerare valori pentru : varsta, scorul Gleason si PSA. In ceea ce priveste scorul Gleason am notat cu GL1 si GL2 cele doua componente ce alcatuiesc acest scor si cu GLT valoarea totala a lui. Am facut acest lucru pentru a putea compara rezultatele noastre cu analize similare prezentate in literatura de specialitate. Toate valorile acestor parametrii sunt valori numerice.

3.Modele i metode statistice utilizate

Pentru a pune in eviden legturile i dependenele existente ntre valorile msurate pentru subiecii ce alctuiesc lotul de studiu prezentat n 2 s-au folosit urmtoarele: analiza statistic descriptiv , regresia simpl, corelaia simpl, corelaia multipl.

a. Analiza statistic descriptiv

Se consider cunoscute formulele de baz ale statisticii descriptive cum sunt cele pentru medie, dispersie, abatere standard, etc. S-au folosit aceste elemente pentru a decide asupra normalitii distribuiei populaiilor studiate.

b.Regresie i corelaie

Relaia dintre dou variabile trebuie privit ca o asociere ntre dou caracteristici, dar ideea poate fi extins pentru a prezice valoarea unei caracteristici prin cunoaterea celeilalte. Pentru aceasta este folosit regresia, deoarece ofer informaii att despre existena relaiei, ct i despre natura acesteia. Corelaia masoar intensitatea relaiei. n cazul regresiei, norul de puncte trebuie s urmeze o distribuie normal cu o varian uniform. Pentru estimare, coeficientul de corelaie necesit condiia ca ambele variabile s urmeze o distribuie normal, dar pentru verificarea ipotezei nule e suficient ca doar una dintre variabile s urmeze o distribuie normal. Dac nici una dintre variabile nu poate urmri o distribuie normal i nici nu poate fi transformat n acest sens, atunci se va utiliza o corelaie de iruri. Conceptele de corelaie i regresie au fost statuate de ctre Sir Francis Galton, matematician i medic, n

17

18

urma cercetrilor sale privind ereditatea. ns teoria corelaiei i a regresiei a fost conceput de ctre Karl Pearson. Corelaia descrie relaia dintre dou date numerice iar msura sa o constituie coeficientul de corelaie (Pearson). El poate fi interpretat ca fiind gradul relativ de imprtiere n jurul liniei de regresie. Acesta poate lua valori ntre -;1 i +1. Punctul -;1 caracterizeaz o relaie perfect liniar negativ, punctul +1 o relaie perfect liniar pozitiv iar punctul 0 lipsa unei relaii liniare ntre cele dou variabile. Corelaia nu ofer o descriere corect a relaiilor dintre variabile atunci cand distribuia uneia este asimetric sau conine valori extreme. n acest caz se va proceda n prealabil la o transformare a variabilelor i anume o transformare n iruri sau o transformare logaritmic. Se indic urmatoarea regul n interpretarea coeficientului de corelaie: intervalele (0; 0,25) respectiv (0; -0,25) relaie slab sau lipsa acesteia; intervalele (0,25; 0,5) respectiv (-0,25; -0,5) indic un anumit grad de relaie, intervalele (0,5; 0,75) respectiv (-0,5; -0,75) o relaie de la moderat la semnificativ iar valorile ce depesc 0,75 sau sunt mai mici de (-0,75) indic o relaie strns. Din cauza marii variabiliti a celor mai multe caracteristici biologice, se consider cazurile de coeficieni ce depesc n valoare absolut 0,95 ca fiind rezultatul unei erori. De asemenea trebuie inut cont i de mrimea eantionului . Menionez c de multe ori se testeaz dac coeficientul respectiv de corelaie este semnificativ statistic lund n considerare volumul eantionului cercetat. Corelaia nu depinde de unitatea de msur pe cnd regresia depinde.

Efectuarea examenului histopatologic a avut drept urmare incadrarea tumorilor colorectale in sistemul international TNM (Tumor Nodes Metastasis) precum si gradarea acestora , stiut fiind faptul ca gradul de diferentiere si stadializarea sunt in stransa legatura cu prognosticul si terapia. CRITERII DE ANALIZA ; Grupa de varsta Tuseu rectal Nr noduli Echo suspect Meta Val PSA Grad tumoral 1, 2, 3 Grad gleason Leziuni asociate PIN asociat Inflamatie Histochimie (albastru alcian) In aceasta etapa am analizat un lot de 50 de pacienti (CO si P1) internati in perioada septembrie 2008-septembrie 2009 al caror diagnostic de certitudine a fost adenocarcinom de prostata . Acest lucru inseamna ca includerea pacientilor in lotul de studiu a fost retroactiva, nu concomitent cu internarea in spital, ci dupa elaborarea diagnosticului de adenocarcinom. Mentionam faptul ca au fost si pacienti la care diagnosticul histopatologic a fost incert in privinta malignitatii, si in consecinta s-a asteptat confirmarea malignitatii. Analiza histopatologica nu a fost elaborata cu fonduri ale proiectului. Repartitia pe grupe de varsta a fost urmatoarea.

Tabel 9. privind repartitia pe grupe de varsta a pacientilor din lot: GRUPA DE VARSTA

(ani) NUMAR

PACIENTI %

41 50 0 0 51 60 9 18% 61 70 10 20%

> 71 31 62%

Repartitia in functie de grupele de varsta

0% 18%

20%62%

41 5051 6061 70> 71

Din cei 50 de pacienti, la 6 dintre ei (12%), diagnosticul a fost in parte pus de examenul scintigrafic care a evidentiat metastaze osoase; astfel in lot exista 6 pacienti la care afectiunea a debutat cu metastaza. Examenele paraclinice si medicale care am considerat ca sunt de un real folos, si se pot face cu mare usurinta sunt tuseul rectal si ecografia simpla. Le-am considerat pozitiv si negativ in functie de datele rezultatelor obtinute in urma testului. Ele au evidentiat urmatoarele rezultate: Tabel 10. privind rezultatele altor investigatii premergatoare biopsiei

EXAMENE NUMAR PACIENTI (N=50)

%

TUSEU RECTAL SUSPECT 33 66% TUSEU RECTAL NEGATIV 17 34% ECHOGRAFIA SUSPECTA 39 78%

ECOGRAFIA FARA SUSPICIUNI

11 22%

PREZENTA DE METASTAZE (scintigrafie)

6 12.2%

19

Rezultatele examinarilor anterioare interventiei chirurgicale

33

1739

116 TUSEU RECTAL

SUSPECTTUSEU RECTALNEGATIVECHOGRAFIASUSPECTAECOGRAFIA FARASUSPICIUNIPREZENTA DEMETASTAZE (scintigrafie)

Nivelul seric al antigenului specific de prostata reprezinta un test extrem de valoros si ofera informatii despre posibilitatea existentei unei suspiciuni privind malignitatile prostatei. Se considera ca valorile normale admise sunt intre 1-4 g/100ml.

De aceea am impartit arbitrar valorile PSA (antigen specific de prostrata) mai mari de 5 .

Tabel 11 VALORILE PSA TOTAL SERIC

(ANTIGEN SPECIFIC DE PROSTATA) g /100ML

NUMAR PACIENTI (N=50)

%

5 10 3 6% 11 20 10 20% 21 30 8 16% 31 40 9 18% 41 50 5 10% 51 60 5 10%

>61 10 20%

20

REPARTITIA CAZURILOR IN FUNCTIE DE VALOAREA PSA SERIC (ng/ml)

6%

20%

16%

18%

10%

10%

20%5 1011 2021 3031 4041 5051 60>61

Pacientii cu metastaze decelate scintigrafic au avut valori PSA > 61, ajungand pana 500 g /100ML. Analiza histotatologica a fragmentelor de parenchim prostatic prelevate prin rezectie sau punctie biopsie au permis elaborarea diagnosticului de adenocarcinom de prostata, gradarea si consemnarea leziunilor asociate. Am considerat ca fiind extrem de importante leziunile de PIN (neoplazie intraepiteliala prostatica ), leziune sabila cu cea de carcinom in situ, si inflamatia, al carei rol in patogenia malignitatilor prostatei este de un real interes in ultimii 5 ani. Celelalte leziuni adenoza si hiperplazia postatrofica le-am inclus datorita faptului ca intra in diagnosticul diferential cu adenocarcinomul de prostata. Tabel 12. privind cele mai frecvente leziuni asociate cancerului remarcate pe specimene:

LEZIUNI ASOCIATE NUMAR PACIENTI (N=50)

%

ADENOZA (HIPERPLAZIA ADENOMATOASA ATIPICA)

9 18%

HIPERPLAZIA POSTATROFICA 4 8% PINHG (NEOPLAZIE INTRAEPITELIALA

PROSTATICA DE GRAD INALT) 7 14%

PROCES INFLAMATOR 5 10% NUMAI LEZIUNI MALIGNE 10 20%

HIPERPLAZIE BENIGNA 15 30%

21

97

5

15

4

10

ADENOZA

HIPERPLAZIAPOSTATROFICAPINHG

PROCES INFLAMATOR

NUMAI LEZIUNIMALIGNEHIPERPLAZIEBENIGNA

Am efectuat o coloratie histochimica speciala, albastru alcian la pH-1 care coloreaza mucinele acide in albastru turcoaz, si care in timp ne-a fost de folos. Tabel 13. privind pozitivitatea histochimica la coloratie albastru alcian pH=1 COLORATIE ALBASTRU ALCIAN PH=

1 NUMAR PACIENTI (N=50) %

ADENOCARCINOM CU HISTOCHIMIE POZITIVA

21 42%

ADENOCARCINOM CU HISTOCHIMIE NEGATIVA

21 42%

ADENOCARCINOM CU HISTOCHIMIE POZITIVA LA ALTE

LEZIUNI INSOTITOARE

8 16%

22

Repartitia cazurilor in functie de aspectul histochimic

42%

42%

16% ADENOCARCINOM CUHISTOCHIMIE POZITIVA

ADENOCARCINOM CUHISTOCHIMIENEGATIVA

ADENOCARCINOM CUHISTOCHIMIE POZITIVALA ALTE LEZIUNIINSOTITOARE

Un pas extrem de important este gradarea Gleason care reprezinta analiza pattern-ului de dispunere a glandelor tumorale (1- 4) , si tipurile de celule (5-10).

Tabel 14. privind repartitia cazurilor in functie de gradul Gleason GRAD GLEASON NUMAR PACIENTI (N=50) %

G1 0 G2 8 16%

G3 23 46% G4 10 20% G5 9 18%

23

08

23

10 9

0

5

10

15

20

25

G1 G2 G3 G4 G5

REPARTITIA CAZURILOR IN FUNCTIE DE GRADAREA GLEASON

NUMAR PACIENTI(N=50)

S-au organizat mai multe trialuri care sa fundamenteze aplicabilitatea unui vaccin in cancerul de prostata deja aparut si confirmat. In mai 2007, la Anaheim simpozionul initiat de FDA (Food and Drug Administration/ Ministerul alimentatiei si medicamentelor din USA) a cerut mai multe dovezi privind eficienta acestui vaccin, Provenge / sipuleucel-T, la pacientii cu cancer de prostata avansat si androgen-independent. Datele furnizate au indicat ca timpul pentru progresia bolii (time to disease progression/ TTP) nu a fost cu nimic imbunatatit, iar supravietuirea a fost furnizata mai mult de sansa, decat de medicament. Acest vaccin care s-a presupus ca va creste raspunsul la chimioterapie prin stimularea raspunsului celulelor T la fosfataza acida a prostatei, a dovedit ca ca nu poate oferi nici un efect antitumoral, masurat prin diversi parametri ca PSA, regresia/stabilizarea metastazelor osoase sau in tesuturi moi, calitatea vietii sau durerea (www.medscape.com/viewarticle). Sunt multi markeri serici care au incercat sa depaseasca limitele PSA, insa niciunul nu ofera date certe privind prognosticul acestei boli. TGF beta care e un factor de crestere reglator si pleiotrop, cu efect pe proliferarea si diferentierea celulara, chemotactism, imunitate umorala si cea mediata celular, precum si angiogeneza, s-a identificat la pacientii cu CaP, ca avand valori foaret mari. Dar rezultatele studiilor au fost disonante; in timp ce unele au dovedit ca acest factor nu face diferenta intre benign si malign, altele au demonstrat ca are valori crescute in boala metastatica. Chiar ca valoarea sa creste simultan cu extinderea bolii sau recurentele. Asocierea cu scorul Gleason este numai in situatia valorilor mari, cand agresivitatea, extensia la organele vecine sunt extreme. Interleukina6 in CaP se pare ca e produsa de celulele neoplazice independente androgenic, stimuland cresterea acestora in timp ce o suprima pe a celor dependente androgenic. Se pare insa ca acest factor da mai multe relatii privind prognosticul si supravietuirea, dar fara incorporare clinica solida. Alfa metil acil-CoA racemaza (AMACR) este o enzima implicata in metabolismul grasimilor, si s-a raportat ca functioneaza independent de androgeni, ca un promor al cresterii in caP. Gena AMACR e supraexprimata in CaP la nivel de ARNm dar si proteicsi este considerata ca un biomarker tisular utilizat in diagnosticul CaP. Numai ca expresia sa a fost inregistrata si in tesuturi normale (adenom) cat si in cancer, sau in alte patologii urologice. Unele studii au sugerat ca acest marker in combinatie cu screening PSA ar fi extrem de util in depistarea bolii . la pacientii cu niveluri intermediare ale PSA (4-10 ng/ml) s-a constatat o mare sensibilitate si specificitate daca s-au analizat si PSA si AMACR de diferentiere a pacientilor cu CaP de ceilalti. In 2008, Colegiul American de Medicina Preventiva a recomandat ca screening-ul cancerului de prostata sa nu fie efectuat pentru ca beneficiile sunt minime. Testele folosite in screening sunt: tuseul rectal, antigenul specific de prostata (PSA) care include PSA total, PSA specific varstei, velocitatea PSA, densitatea PSA si PSA liber. Screeningul nu a dovedit beneficii in privinta morbiditatii si mortalitatii prin CaP. Velocitatea Psa este frecventa schimbarii PSA in timp ar putea creste sensibilitatea screening-ului si ar putea deveni o masura a agresivitatii tumorale. Ambele valori 0.75 si 0.5 ng/ml sunt considerate valori normale privind cresterea anuala a PSA. PSA liber ar putea creste specificitatea screening-ului in CaP dar nefiind un consens al valorii limita pentru acesta, nu se pot valida rezultatele. PSA a fost initial descris in 1971 si purificat in 1979 din lichidilul seminal. Este o glicoproteina cu un singur lant alcatuit din 240 de

24

25

aminoacizi, si cu o GM de 34 kDa. Este membra a familiei de serin-proteaze si are activitate trpsin si chimotrpsinlike. Este sintetizat de celulele epiteliale ale acinilor si ductilor si este constituent normal al lichidului seminal. Gena Psa e localizata pe chr 19 si are 80% homologie cu gena kalicreinei. Pe tesutul adenomului de prostata, PSA este supraexprimat de testosteron, estradiol, LH, FSH si TRH si subexprimat de prolactina. Psa nu mai e considerat un marker specific pentru prostatasi cu toate acestea are cea mai mare specificitate si sensibilitate. Trialuri importante conduse pe pacientii unor clinici de prestigiu (johns Hoipkins hospital, baltimore, USA) in 2005 au incercat, cu ajutorul datelor statistice, sa gaseasca cei mai importanti factori de risc ai mortalitatii specifice CaP, dupa prostatectomie radicala (prostate cancer specific mortality/ PCSM). Astfel, pacientii au beneficiat numai de cura chirurgicala-prostatectomie radicala- fara iradiere adjuvanta sau terapie hormonala pre/post operator, si din cei 5096 de pacienti, dupa 6 ani de urmarire au decedat numai 66 (17%). Unicul test biochimic prin care pacientii au fost monitorizati a fost timpul de dublare a PSA (PSA-DT) si s-a constatat ca reprezinta un factor de risc extrem de fidel (Freedland SJ, Humphreys EB et al. Risk of prostate cancer-specific mortality following biochemical recurrence after radical prostaectomy. JAMA, 2005;294:433-439). Am remarcat studii care au evaluat impactul lungimii tumorii si fractia de fragmente pozitive pe supravietuire. (Vollmer RT. Tumor length in prostate cancer. Am J Clin Pathol. 2008;130(1):77-82.) Plecandu-se de la ideea ca este foarte importanta pentru prognostic cantitatea de material tumoral extras prin biopsie si se poate corela cu volumul tumorii, stadiul, metastazele limfoganglionare, cresterea nivelului seric PSA, s-a incercat coroborarea tuturor acestor factori si posibilitatea ca lungimea tumorii sa fie un indicator concis al prognosticului. Lungimea tumorii a fost considerata suma tuturor fragmentelor excizate la biopsie, masurata in mm. Cele 5 variabile: varsta, PSA seric, scorul Gleason, lungimea si fractia tumorii nu sunt statistic independente, au demonstrat un important impact prognostic iar masurarea lungimii tumorii care implica un effort minim din partea patologului, joaca un rol important mai ales >20mm. Asociatia Americana Urologica (AUA) recomanda ca barbatii peste 50 de ani trebuie sa faca toate aceste teste, dar este nerelevanta la barbatii sub 50 de ani si cei acre au mai multe alte patologii. (Am J Prev Med 2008;34:164-170). Exista asociatii medicale care se declara impotriva screening-ului annual al cancerului de prostata la barbatii de peste 75 de ani, afirmand ca este relevant numai examinarea la 4 ani a acestora. Oricum, nu exista un consens privind depistarea si tratamentul optim al CaP la barbatii mai tineri de 75 de ani. Societatea americana de cancer (American Cancer Society/ ACS) si Asociatia Americana de Urologie (American urological Association/ AUA) recomanda in 2008 ca toti barbatii > 50 de ani sa efectueze dozare PSA si tuseu rectal, annual. Strategiile tratamentului(cand boala e diagnosticata) includ observarea in asteptare/ watchful waiting : observare si tratament paliativ a simptomelor, supraveghere activa: teste de laborator periodice si tratament activ al bolii in progresie, si tratament invaziv :prostatectomie radicala, iradiere externa si brohiterapie. Neoplazia intraepiteliala a prostatei de grad inalt (PINHG) este considerata o leziune premaligna asociata cu un risc crescut de coexistenta cu cancerul sau progresia catre cancer. Istoria sa naturala precum si relevanta clinica sunt controversate. Ca definitie, PIN reprezinta o proliferare anormala si displazie celulara a epiteliului prostatei la nivelul ductilor, ductulilor si acinilor mari, fara existenta invaziei stromale. Nefiind niste criterii stricte de diagnostic si definitie, incidenta acestei leziuni in literatura de specialitate este foarte variabila. Incidenta estimata pe piesele de rezectie este mica, 2.3-4.2%. in schimb pe piesele de prostatectomie radicala incidenta poate fi de la 52.7-100%. Au fost studii care au semnalat la toate cazurile cu CaP si prezenta de focare de PINHG, fundamentand asocierea dintre cele doua leziuni. Multe studii si observatii au aratat ca nu numai prezenta PINHG este un marker important pentru cancerul concurent sau subsecvent, ci si volumul sau. Cresterea gradului PIN este asociata cu rate crescute ale ruperii stratului bazal care apare la 56% de PINHG si este frecvent in acinii adiacenti cancerului. De asemenea s-a observat tranzitia histologica clara dintre PINHG si aria de cancer. Prezenta de glande mici atipice plaseaza pacientul intr-o grupa cu risc mare de cancer subsecvent iar semnificatia asocierii intre HGPIN si glande mici atipice (PINATYP) nu numai ca nu se cunoaste dar este si o grea incercare pentru patologi. Identificarea evenimentelor genetice si moleculare din PINHG a doveditca aceasta leziune este principalul precursor al cancerului, mai putin din punct de vedere patologic, mai mult genetic. Pierderea alelica a chr 8p12-21, pierderea lungimii telomerelor si gastiguri de material genetic la cromozomii 7,8,10 si 12 sunt leziuni existente si in cancer si PIN. Rolul diagnostic al IHC in carcinomul prostatic (P3) Carcinomul prostatic este cea mai frecventa malignitate extra-cutanata si a doua cauza de deces la barbatii din SUA. Acuratetea diagnosticului patologic al acestei tumori maligne este mportanta pentru ingrijirea optima a pacientilor. Chiar daca diagnosticul poate fi pus pe caracteristicile morfologice, cum ar fi patternul cresterii tumorale, atipia nucleara si absenta celulelor bazale, este uneori dificil sa punem un diagnostic corect prin studii histologice de tutina, in mod particular pentru ariile restranse de ADK in biopsiile prostatice. Nu numai ca nu exista o singura caracteristica morfologica caracteristica ADK, dar si multe afectiuni benigne pot mima ADK prostatic. De aceea, aplicarea tehnicilor IHC pentru a distinge ADK prostatic de alte afectiuni benigne si pentru a confirma diagnosticul, devine necesar si de mare ajutor. Diagnosticul IHC al cancerului prostatic depinde de varietatea de markeri pentru ca inca nu s-a descoperit un marker specific si sensibil pentru cancerul prostatic. Acesti markeri de obicei includ cel putin un marker specific pentru celulele bazale si cel specific pentru cancerul de prostata, AMACR (-metil-Coa-racemaza).

Cel mai frecvent folosit marker specific pentru celulele bazale in cancerul prostatic este HMWCK (citokeratina cu greutate moleculara mare) si P63. HMWCK este exprimat la nivelul tuturor celulelor bazale ale prostatei cu marcare IHC circumferentiala intacta la nivelul majoritatii glandelor. Nu exista marcare la nivelul celulelor stramale si luminale. La nivelul unui laborator mare si independent, Kahance et al. a observat ca aplicarea HMWCK a scazut rata diagnosticului atipic de la 8,3% la 0,4%. Imunoreactivitatea pozitiva pentru HMWCK la nivelul glandelor suspecte sau atipice aproape mereu precede diagnosticul de cancer prostatic; totusi reactivitatea negativa trebuie sa fie interpretata cu precautie pentru ca HMWCK este formaldehid-sensibile si pierderea progresiva a imunoreactivitatii poate fi observata in fixarea prelungita in formaldehida. Succesul imunomarcarii necesita identificarea antigenului optim. In plus, pozitivitatea HMWCK este tipic discontinua intr-o varietate de leziuni benigne cum ar fi hiperplazia postatrofica, hipertrofia adenomatoasa atipica si neoplazia intraepiteliala de grad inalt prostatica (PIN). Un marker nou descris pentru celulele bazale, P63, este caracterizat ca fiind un factor nuclear transcriptional care este important pentru reglarea cresterii si dezvoltarii organelor epiteliale, incluzand si glanda prostatica. Prezinta omologie structurala mare cu P53. Expresia P63 este limitata la nivelul celulelor bazale ale glandei prostatice si marcheaza nucleul. Aproape toate cancerele prostatice de grad mic si intermediar sunt negative pentru P63, in timp ce glandele prostatice hiperplaziate si normale prezinta expresia P63 puternica si difuza. AMACR este o enzima cu 382 aminoacizi care joaca un rol important in -oxidarea acizilor grasi cu lanturi ramificate. Folosind PCR (polymerase chain reaction) cantitativa, ARNm al AMACR a fost gasit supraexprimat in aproximativ 60% din cancerele prostatice, si a fost nedetectat sau slab detectat in tesutul normal. In 2001, Jiang et al. au investigat expresia proteinei AMACR folosin tehnici IHC, in 137 de cazuri de cancer prostatic si 70 de cazuri cu afectiuni prostatice benigne. Ei au observat ca marcarea cu AMACR a fost puternica in toate cazurile de cancer prostatic cu marcare citoplasmatica continua, intunecata, difuza sau aspect circumferential, apical, granular. De aceea, AMACR este considerat a fi un marker IHC folositor in carcinomul de prostata. Totusi, din cauza lipsei standardizarii protocoalelor de marcare IHC, criteriilor de interpretare si patternului de marcare heterogen, exista o larga variatie in sensibilitatea si specificitatea imunoreactivitatii AMACR in biopsiile prostatice. In plus, expresia AMACR a fost demonstrata in PIN de grad inalt, hiperplazie adenomatoasa atipica/adenoza si adenom nefrogenic. Asadar, pozitivitatea AMACR trebuie sa fie evaluata cu precautie. Este recomandat ca AMACR sa fie folosita pentru evaluarea zonelor inalt suspecte morfologic la nivelul carora imunoreactivitatea negativa a markerilor pentru celulele bazale nu este suficienta pentru a pune diagnosticul de cancer. In concluzie, IHC joaca un rol important in diagnosticul carcinomului prostatic. IHC ajuta la diferentierea glandelor maligne de leziunile benigne, mai ales la nivelul fragmentelor mici de biopsie cu alterari glandulare morfologice. Microdisectia sectiunilor tisulare(CO) a devenit o tehnica de izolare celulara importanta ce permite separarea unor probe tinta fara contaminarea acestora de catre celulele sau tesutul invecinat. Cu ajutorul micordisectiei cu laser se pot separa celulele tumorale de neoplasmele precanceroase sau de stroma de suport, in scopul utilizarii eficiente a acestora in cadrul investigatiilor ulterioare (Dutton et al., 2003). Pentru izolarea zonelor tinta s-a folosit metoda si aparatura mmiCellCut furnizate de firma Molecular Machines & Industries AG. Principiul metodei: Mmi CellCut este o metoda de a izola, prin analiza la microscop, arii reduse sau chiar celule individuale provenite din sectiuni histologice pentru viitoare analize ale proteinelor, ADN sau ARN. Datorita faptului ca microdisectia cu laser nu implica un contact mecanic cu probele supuse investigatiilor, riscul de contaminare este evitat. Colorarea H&E: Din probele de tesut inghetate se taie la criotom sectiuni de tesut cu o grosime de 8m. In cazul tesutului imparafinat grosimea sectiunilor taiate la microtom este de 5m.

Figura 1. Asamblarea cadrului metalic al membranei pe lama de sticla

In cazul tesutului inghetat, sectiunile proaspat taiate se amplaseaza pe membrana lamelor speciale pentru disectie cu laser (figura 1) si se coloreaza cu hematoxilina-eozina. In schimb, sectiunile obtinute din tesut imparafinat se supun initial unei deparafinari in doua bai de xilen proaspat cate 5 minute. Sectiunile se trec cate

26

15 secunde in 3 bai de etanol de 100%, 95% si 70% si 15 secunde in baie de apa. Se face colorarea cu hematoxilina timp da 20 secunde. Apoi sectiunile sunt introduse pentru 15 secunde in etanol 70%, eozina, 2 bai de cate 15 secunde de etanol 95%, 2 bai de cate 1 minut etanol absolut si in final se lasa sa se usuce la temperatura camerei. Pregatirea lamelor pentru microdisectie: Dupa colorarea H&E a sectiunilor de pe membrana, acestea se acopera cu o lama obisnuita pentru a evita contaminarea (figura 1) si se fixeaza pe suportul microscopului. Manipularea probelor: Sistemul mmi CellCut contine, pe langa microscopul controlat electronic, un laser cu ajutorul caruia se decupeaza portiunile dorite de tesut si un computer cu un software specializat care controleaza operatiunile (figura 2).

Figura 2 Componentele sistemului de microdisectie.

Miscari controlate de computer Laser controlat de software

Folosind software-ul mmi CellCut regiunile de interes sunt selectate fie cu ajutorul mouse-ului fie cu ajutorul

figurilor geometrice predefinite (figura 3).

Figura 3 Selectarea regiunilor de interes ale sectiunilor cu tesut. Pe aceeasi lama se pot selecta mai multe regiuni de interes care vor fi depozitate dupa taierea cu laser pe

acelasi capac aderent special mmi IsolationCap al tuburilor de centrifuga.

27

capac membrana tesut lama

Figura 4 Sistemul de taiere si aderare al tesutului la capacul tubului de centrifuga. laser

Pe acelasi capac pot fi depozitate si fragmente selectate de pe lame diferite. Laserul taie tesutul dar si membrana speciala pe care a fost acesta depozitat anterior, astfel incat, pe capacul colector tesutul e fixat prin intermediul membranei (figura 4). Membrana si capacul adeziv sunt inerte din punct de vedere chimic si nu au nici o influenta asupra proceselor biologice ulterioare. Software-ul controleaza laserul, capturarea de imagini si etapa de scanare a lamelor. Dupa microdisectie, capacul este inchis pentru continuarea extractiei biomoleculelor. Aplicatii: Din moment ce tumorile sunt alcatuite din populatii heterogene de celule aceasta tehnica este necesara pentru a inlesni analiza populatiilor pure de celule tumorale Regiunile izolate priin microdisectie reprezentand portiuni de tesut sau chiar celule izolate deo calitate ridicata, pot fi utilizate in continuare pentru extractia ADN (Emmert-Buck et al., 1996), ARN sau proteine. Extractia ARN este mult mai dificila decat cea a ADN datorita conditiilor speciale si restrictive care trebuie indeplinite si care cresc riscul de esec in acest caz. Cand se manipuleaza probe pentru extractia ARN, ritmul de lucru trebuie sa fie alert, iar mediul trebuie sa fie RNAze free. In acelasi timp toate materialele si solutiile cu care se lucreaza trebuie sa fie RNAze free. De asemenea ARN extras din tesuturi imparafinate are o calitate inferioara comparativ cu cel extras dun tesuturile inghetate sau proaspete. Atat in cazul extractiei ADN cat si in cazul extractiei ARN trebuie folosite kituri speciale pentru extractia acizilor nucleici din cantitati foarte mici de tesut. S-a analizat (P4) o baza de date alcatuita cu o suta de inregistrari continand datele furnizate de la partenii nostrii, medici in spitale. Pentru acesti pacienti ni s-au furnizat valori pentru varsta, scorul Gleason impreuna cu valorile ce-l compun, si PSA. Baza de date a fost alcatuita dupa cum s-a prezentat in 2. S-au realizat selectiii de inregistrari din baza, alcatuindu-se noi grupe, dupa o serie de criterii prin care s-a dorit sa se puna si mai bine in evidenta anumite legaturi intre variabile. In continuare vom prezenta aceste grupe si analiza statistica a datelor ce le compun. Aceasta analiza s-a facut utilizand pachetul de programe de anliza statistica SPSS 15.0. In ceea ce priveste reprezentarile grafice s-a folosit atat SPSS cat si Excel din pachetul MS Office.

a. lot general Din analiza datelor ce alcatuiesc grupul general ( 100 subiecti), rezulta ca este un grup cu o medie de varsta 69,46 (tab.1) , cu o repartitie normala avand in vedere valorile pentru coeficientul Skewness si Kurtosis ( tabel 1),. Acest lucru se poate observa si din graficul frecventelor (fig.1).

Statistics

100 100 100 100 1000 0 0 0 0

69,46 2,80 3,10 5,86 26,60947,805 1,073 1,078 1,658 37,38095

,429 ,210 -,153 -,193 3,518,241 ,241 ,241 ,241 ,241,161 -,449 -,544 -,071 15,469,478 ,478 ,478 ,478 ,478

ValidMissing

N

MeanStd. DeviationSkewnessStd. Error of SkewnessKurtosisStd. Error of Kurtosis

varsta gl1 gl2 glt psa

Tabel 1

28

varsta1009080706050

Freq

uenc

y12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

Mean =69,46Std. Dev. =7,805

N =100

Figura 1 Curba frecventelor pentru varsta

gl16543210

Freq

uenc

y

40

30

20

10

0Mean =2,8

Std. Dev. =1,073N =100

Figura 2 Curba frecventelor pentru gl1 Aceiasi normalitate se poate observa atat pentru scorul Gleason (fig 4), notat glt cat si pentru cele doua valori care-l compun notate gl1 si gl2, in timp ce pentru psa valorile sunt diverse , cu abatere mare si valori mari pentru coeficientul Kurtosis ( fig5).

29

gl26543210

Freq

uenc

y