farmakoloji ve toksikolojide rat modellerifarmakoloji ve toksikolojide rat modelleri farmakoloji ve...

235DERMAN MEDICAL PUBLISHING1

Ender Yarsan, Ramazan Durgut

Farmakoloji ve Toksikolojide Rat Modelleri

Deneysel Çalışmalarda Hayvanların KullanılmasıModern tıbbın gelişmesinde hayvanlar üzerinde yapılan deneysel çalışmaların önemli bir yeri olmuştur. Aynı şekilde deney hayvanları araştırma, test etme ve eğitim ama-cıyla bugün için de geniş ölçekte kullanılmaktadır. Bilimsel amaçla ya da her ne şe-kilde olursa olsun deney hayvanlarının kullanımı rastgele yapılabilecek bir uygula-ma değildir. Deney hayvanları hipotezi bilimsel kurallara göre kurulmuş araştırma-larda ve biyolojik testlerde kullanılan hayvanlardır. Bu terim omurgalı veya omurga-sız olmalarına bakılmaksızın, üzerinde deney yapılabilen tüm hayvanlar için kullanı-lır. Bilimsel kayıtlarda ilk deney hayvanı kullanımına M.Ö. 400 yıllarında yazılan Cor-pus Hippocraticum kitabında rastlanmıştır. O dönemde hayvanlar üzerinde yapılan incelemeler sadece anatomik yapıyı belirlemeye yönelik olmuştur. Deneysel nitelik-teki ilk uygulama Galen tarafından yapılmıştır. Bundan sonra birçok araştırmacı çe-şitli nedenlerle deney için hayvan kullanmıştır. 19. yüzyılda Claude Bernard fizyolojik deneyler için hayvan kullanımının gerektiğini kesin bir dille anlatmıştır. Bundan son-ra deneysel çalışmalar için üretilecek hayvanların standart koşullarda yetiştirilme-si yolları aranmıştır. Günümüzde basit omurgalı hayvanlardan gelişmiş memeli hay-vanlara kadar birçok hayvan türü denek olarak kullanılmaktadır. Fakat omurgasızla-rın kullanımı oldukça sınırlı düzeylerde kalmaktadır. Son yıllarda bazı ilkel omurgalı-ların kullanımında artışlar olsa da halen en fazla tercih edilenler bazı memeli türleri-dir. Kullanımda üst grupları oluşturanlar sınıflandırılırsa, en fazla kullanılanlar sıçan, fare, tavşan ve balık, orta düzeyde kullanılanlar ise domuz, kobay, hamster ve may-mundur. Deney hayvanları çok çeşitli alanlarda kullanılmakla birlikte en fazla sağlık bilimleri alanındaki çalışmalarda kullanılır. Bu hayvanlar sağlık bilimleriyle ilgili araş-tırmalarda olduğu gibi aşılar, ilaçlar ve tıbbi malzemelerle ilgili çok sayıda biyolojik testlerde de kullanılır [1-6].

236 DERMAN MEDICAL PUBLISHING

Farmakoloji ve Toksikolojide Rat Modelleri Farmakoloji ve Toksikolojide Rat Modelleri

2

Bununla birlikte aşağıda belirtilen amaçlardan bir ya da birkaçının geçerli olması du-rumunda hayvanlar üzerinde deney yapılabilir.1.İnsan, hayvan ve bitkilerin hastalıklardan korunması ve/veya hastalıkların önlenme-si. Bunun için ilaçların, maddelerin veya ürünlerin etkinliğinin, emniyetinin, kalitesi-nin ve yapımının test edilmesi,2. İnsan, hayvan ve bitkilerdeki hastalıkların tanısı ve tedavisi, 3. İnsan, hayvan ve bitkilerde fizyolojik koşulların tanısı, belirlenmesi, düzenlenme-si ve modifikasyonu, 4. Çevrenin korunması,5. Eğitim ve alıştırma,6. Adli soruşturma (toksikolojik araştırma)

Bilimsel araştırmanın temel amacı insan sağlığını düzeltme ve/veya devam ettir-medir. Deneysel çalışmalarda zorunlu kalmadıkça hayvan kullanımından sakınılma-lı, araştırmacı bu canlının kullanımı için sağlam, bilimsel gerekçeler göstermelidir. Başka seçeneğin niçin olmadığı açıklanmalıdır. Araştırmacı hedeflerini kesin olarak tanımlamalıdır. Bugün için Avrupa Birliği’nde Deney Hayvanlarının kullanımıyla ilgi-li olarak geçerlilik taşıyan yasa 24 Kasım 1986’da kabul edilen 86/609/EEC sayı-lı direktiftir. Bu direktif 22 Temmuz 2003’te yeniden ele alınarak düzenlenmiş ve 2003/65/EC olarak yayınlanmıştır. Aynı şekilde 1999/575/EC ve 2003/584/EC sayı-lı komisyon kararları da deney hayvanlarının bilimsel ve deneysel çalışmalarda kul-lanımı ile ilgilidir. Uluslar arası ölçekte ise bu yöndeki düzenlemelere esas oluşturan 1996 yılında kabul edilen Guide fort the Care and Use of Laboratory Animals başlık-lı kılavuzdur [7-11]. Hayvanların deneysel tıpta, farmakolojide, farmasötik gelişmelerde, güvenirlik dene-melerinde ve toksikolojik değerlendirmede kullanılmaları güvenilir bir temele dayan-dırılmıştır ve pratik uygulamalar için de zorunludur. Deney hayvanları ayrıca insan-larda pek çok amaç için kullanılacak ve potansiyel risk teşkil eden ve toksik olan sen-tetik kimyasalların belirlenmesinde de oldukça başarılı şekilde kullanılırlar. Yüzyıllar-ca model olarak kullanılan hayvanlar hangi kimyasalların ve çevresel faktörlerin in-sanlara zararlı olduğunu belirlemek için kullanılmışlardır. Deney hayvanlarının erken dönemde kullanılması hakkında yeterli bilgiler yoktur, ancak tarihin erken dönemle-rinde deney hayvanlarının kullanılması ile ilgili kayıtlarda toksikolojik testler için de-ney hayvanlarının seçildiği görülmektedir. Deney hayvanlarının bilimsel çalışmalar-da kullanılmasını açıklayan en erken tanımlamalar Priestley (1792) adlı araştırmacı tarafından gaz çalışmasındaki kullanımdır. Deney hayvanlarının çeşitli etkenler için ilk sistematik kullanılması Orfila (1814) tarafından yayınlanmış; Dubois ve Geiling (1959) adlı araştırmacılar tarafından da gözden geçirilmiştir. Hayvanların potansiyel hastalık etkilerini tahmin amacıyla kullanılması bu dönemden sonra gelişmeye baş-lamıştır [12-16].

Ratların Deneysel Çalışmalarda KullanılmasıNorveç ratı (Rattus Norvegicus) kökenini Asya’dan aldığı düşünülmektedir ve modern uygarlık süresince ekonomik zarar olarak dünyaya yayılmıştır. Ratların, sadece bi-limsel amaçlar için evcilleştirilen ilk hayvan olduğu düşünülmektedir; ve adrenal bez fonksiyonu ile ilgili Fransa’da ilk kez deneysel bir çalışmada kullanılmıştır. Ratlarla er-ken devredeki beslenme, endokrinoloji, fizyoloji ve davranışla ilgili yapılan çalışmalar; memelilerde çeşitli amino asitlerin nutrisyonel kalitesi, vitaminlerin varlığı, ön hipo-

237DERMAN MEDICAL PUBLISHING


3

fiz hormonlarının karakterizasyonu ve sirkadian ritimin varlığı gibi gelişmelere yöne-lik olmuştur. Ratlar biyolojik ve tıbbi araştırmaların hemen hemen her alanında bü-yüklükleri, göreceli olarak yumuşak tabiatlı, yaşam süresi ve gebelik süresinden do-layı seçilen türlerdir. Azalan değişkenlikleri ve istenen belirgin karakteristiklerinden dolayı erken devrede yapılan pek çok araştırmada yetiştirme programları yapılmıştır. Henry Donaldson ve arkadaşlarının Wistar Enstitüsü’ndeki (Philadelphia, Pennsylva-nia, ABD) bu gayretleri belirgin olarak dikkati çekmektedir. Bugün toksikolojide yay-gın olarak kullanılan Wistar, Sprague-Dawley, ve Long Evans gibi rat ırklarının çoğu Wistar hattına uzanmaktadır. Ayrıca Fischer 344 yaygın olarak kullanılan diğer bir rat ırkı olup New York Columbia Üniversitesi’ndeki Crocker Araştırma Enstitüsü’nde ge-liştirilmiştir ve kanser araştırmalarında kullanılmaktadır [2]. İdeal olanı insanlar için kullanılması hedeflenen ürünlerin veya insanların karşı kar-şıya kaldığı durumlarda güvenlik testlerinin insanlar üzerinde yapılmasıdır. İnsanlar-dan elde edilen veriler karışık insan fizyolojisi, hücresel ve biyokimyasal mekanizma-larla ve risk değerlendirme rezervasyonları olmadan doğrudan kullanılabilir. İnsanlar bu amaçlar için kullanılamazlar. Bu nedenle, toksikolojik çalışmalar için uygun türle-rin seçilmesi farmokokinetik karşılaştırmalar ve farklı laboratuvar türlerinde ve in-sanlarda bileşik metabolizma testleri temel alınarak yapılmalıdır. Bu verilerin mevcut olmadığı durumlarda, bu seçimler pratik ve ekonomiye göre yapılır. Ratlar metaboik benzerlikleri, küçük olması, göreceli olarak uysal olmaları, ömürlerinin kısalığı ve ge-belik süresinin kısalığına nedeniyle tercih edilirler. Pek çok fizyolojik benzerlikler ve anatomik karakteristiklerden dolayı ratlar toksiko-lojik çalışmalarda seçilmekle birlikte, bu hayvanlarla yapılan ve dizayn edilen çalış-malarda farklılıkların olabileceği de düşünülmek zorundadır. Ratlar zorunlu olarak bu-rundan nefes alırlar ve bunun gibi inhale edilen test materyalleri nazal filtrasyon ve absorbsiyonla karşı karşıya kalırlar. Ratlarda plesanta dikkati çekecek kadar çok gö-zeneklidir. Bu farklılık verilen test materyallerinin veya fötüsün karşı karşıya kaldığı test materyalinin; fötüsle karşı karşıya kalmasını daha da arttırır. İntestinal mikrof-loranın tümüyle dağılımı ratlarda farklılık göstermektedir, bu durum ise oral yoldan verilen test materyallerinin metabolizmasında farklılığa yol açar. Ratlardaki bu ve di-ğer farklılıklar diğer türlerde mevcut olmayacak şekilde test materyallerinin pozitif toksisiste bulgularına yol açar. Spesifik karakteristikler için yetiştirilen ratlar ile diğer rat ırkları arasında bazı fiz-yolojik farklılıklar görülmektedir. Toksik maddelere karşı farklı rat ırklarının fark-lı cevap vermesi durumu bazı etkenler için bilinmektedir. Tiyoüre, asetamimofen, 7,12-dimethylbenz(a)anthrasen, trimethyltin, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin için bu türden bir durum söz konusudur. Son zamanlarda, araştırma ve yetiştirme programları aynı soydan ve farklı soydan üretilen ratlarda, spesifik hastalık model-leri belirgin kanserojenlerin gelişimine duyarlılık üzerine yoğunlaşmıştır. Hedeflenen amaç için ırk seçildiğinde bu farklılığın düşünülmesi önemlidir [17-19].

Ratların Tespit Edilmesi Küçük hayvanların tespitinde çok sayıda zorluk vardır. Fiziksel hasarın görülmesi ise çiftlik hayvanları, kedi ve köpeklere göre oldukça azdır. Araştırma enstitülerinde ye-tiştirilen küçük kemiriciler ve tavşanlar oldukça sakin hayvanlardır. Uygun tespit tek-nikleri ve yaklaşımlar uygulandığı zaman çok az sorunla karşılaşılır. Laboratuvar hay-vanlarının tespiti kafeste bulunduğu taktirde oldukça basittir. Serbest dolaşan labo-ratuvar hayvanlarının tespiti ise zordur. Eğer bu konuda yeterli deneyim yoksa tes-



4

pit işlemi daha da zorlaşır. Bu nedenle deneyimli bir bakıcının bulundurulması gere-kir. Fare ve ratların zarar görmemesi ve güvenle muayenesi için farklı teknikler kulla-nılmaktadır. Herşeyden önce farenin davranışının anlaşılması uygun tespit ve emni-yetle muayene için iyi bir başlangıç sağlar [1,2,20].

Kuyruktan yakalayarak tespit etme: Fare ve ratlar kuyruktan yakalayarak güven-le tespit edilebilir. Bu teknik fare ve ratların bir kafesten diğerine taşınması ve ge-nel inspeksiyon için oldukça kullanışlıdır. Bu işlemi gerçekleştirirken sakin ve hassas davranmak, kuyruğun orta kısmından yakalayarak kaldırmak kuyruğa zarar verme-mek için gereklidir. Kuyruğun uç kısmından yakalanırsa kuyruk sıyrılabilir veya ani bir hareketle hayvan yere düşebilir. Ayrıca kuyruğun uç kısmından yakalanması muaye-ne eden veya taşıyan kimsenin ısırılmasına yol açar. Kuyruktan tutarken sert ve kes-kin bir alet kullanmamalı, çok gerekli ise tahta forsepsler tercih edilmelidir.

Kavanoz veya tüp tekniği: Bu teknik yeni başlayan araştırmacılar için uygundur. Kavanoz veya tüp hafifçe aşağı eğilir, hayvanların ön tarafına gelecek şekilde ayar-lanabilir. Kavanoz ve tüple taşırken fare veya ratın atlayarak kaçabileceğini unutma-mak gerekir. Bundan dolayı tüpün veya kavanozun ağzı solunumu engellemeyecek şekilde kapatılmalıdır.

İki el tekniği: Önce kuyruğun ortasından tutup fare ve rat kaldırılır. Diğer elle des-teklenir. Hafifçe kuyruk kökünden yakalanır ve diğer elle desteklenerek taşınır. Hay-vanlar sakinleştirilmeden diğer elle desteklenmemelidir.

Boyun derisinden yakalama tekniği: Bu teknik doğru yapılırsa hayvan ve mua-yene eden için uygundur. Farenin geri ve boyun kısmında deri gevşektir. Bu neden-le tekniğin doğru yapılabilmesi için biraz uygulama yapılması gerekir. Fakat pratik kazanıldığında son derece kullanışlıdır. Bu teknik ilk araştırmaya başlandığı dönem-de fare ve ratlarda yaygın olarak kullanılır. Bu teknik veteriner hekimin muayene et-mek için yaygın olarak kullandığı bir yöntemdir. Ayrıca enjeksiyon ve ilaç vermek için de son derece uygundur. Fare ve ratlara sakin yaklaşıldığı zaman savunma veya sal-dırı pozisyonları gözlenmez. Yavaşça el kafese doğru indirilir kuyruğun orta kısmın-dan yakalanır ve bir masa üzerine alınır. Kuyruk hafif gergin tutularak serbest el boy-nun gerisindeki deriyi baş ve işaret parmağı ile gererek sıkıştırır. Dördüncü ve beşin-ci parmakla kuyruk tespit edilir ve avuç içine alınır. Boynun gerisindeki derinin hay-vanın geri dönemeyecek kadar sıkı tutulması gerekir. Bununla birlikte fazla sıkıştırı-lırsa hayvanlar boğulabilir.

Eldiven tekniği: Bazı kişiler ilk kez tespit edilecek fare ve ratlar için kalın eldiven kullanmayı önerir. Bu duruma çoğunlukla gerek duyulmaz. Fare ve ratlar küçük yapılı ve çok ince keskin dişlere sahip olduklarından yine de ısırabilirler. Ayrıca bu yöntem-de fare ve ratların nefes almaları da engellenebilir.

Ratlarda Çalışma DizaynıToksikolojik çalışmaların dizaynı ve süresi Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), Ulus-lararası Harmonizasyon Konsülü (ICH), Çevresel Koruma Ajansı (EPA) ve benzeri ulus-lar arası kuruluşlar tarafından hazırlanan yönergeler ile düzenlenmektedir. Toksiko-lojik çalışmalar her biri klinik denemelere dayanan 3 seri çalışmaya ayrılmaktadır.



5

Klinik çalışmaların başlaması için başlangıç onayı alındıktan sonra takip eden çalış-malar gereklidir. Toksikolojik çalışmalarda doz uzunluğu planlanan klinik denemenin uzunluğuna bağlıdır. 28 gün süreyle kullanılacak olan test bileşikleri başlangıçta iki faz maksimum tolere dozuna ihtiyaç duyar. Başlangıçta tek doz tayin edilir, 5 ve 7 gün süreyle maksimum tolere dozu esas alınarak günlük olarak test bileşiği verilerek ikinci faz takip eder (Tablo 1). Maksimum tolere dozu çalışmasını tamamlamak için takiben 14 veya 28 gün doz tekrarlanmalıdır (Tablo 2, Tablo 3). Erken toksik etkile-

Tablo 1. Ratlarda maksimum tolere edilebilir doz çalışması.

7-Günlük Ağız Yoluyla Uygulama Çalışması

Ana çalışma Toksikokinetik

Faz B Erkek Dişi Erkek Dişi

Kontrol 5 5 - -

Düşük Doz 5 5 9 9

Orta Doz 5 5 9 9

Yüksek Doz 5 5 9 9

Çalışma Dizaynı: Faz A çalışmasında; doz seviyesi MTD bulunana kadar artırılır. MTD seviyesi; mortalitenin görülme-diği, vücut ağırlığının %10 dan fazla azalmadığı ve toksik yönden klinik belirtilerin görülmediği dozdur. Faz B ise hay-vanlara 7 gün süreyle uygulama yapılır bu amaçla tek doz MTD bölünerek doze edilir; sonuçta tekrarlana MTD dozu tahmin edilir,Uygulama yolu / sıklığı: Faz A çalışmasında 1 kez; Faz B çalışmasında ise 7 gün süreyle,Gözlemler: Her iki fazda da dünde 2 kez, Detaylı Klinik Gözlem: Her iki fazda da günlük olarak,Vücut Ağırlığı: Her iki fazda da günlük olarak,Gıda tüketimi: Günlük,Klinik Patoloji (Sadece Faz B): Bütün çalışmalarda; Hematoloji, Klinik kimya, İdrar analizi, Nekropsi (Sadece Faz B): Dokular muhtemel bir histopatolojik muayene için muhafaza edilir,Organ ağırlıkları (Sadece Faz B): Adrenal bezler, beyin, kalp, böbrekler, karaciğer, akciğer, ovaryum (ovidukt ile), hipofiz, prostat, tükrük bezleri, seminal bezler, dalak, paratiroid ile birlikte tiroid bezi, timus, testis, uterus, Toksikokinetik: 1. ve 7. günlerde kan toplanır; Cmax, Tmax, AUC 0-24 ve T1/2 hesaplanır.

Tablo 2. Ratlarda 14 yada 28 günlük tekrarlanan doz çalışmaları.


Erkek Dişi Erkek Dişi

Kontrol (Taşıt madde) 10 10 - -

Düşük doz 10 10 9+3 * 9+3 *

Orta doz 10 10 9+3 * 9+3 *

Yüksek doz 10 10 9+3 * 9+3 *

* 3 ilave hayvan (gruplara göre ilave edilebilecek hayvanlar)Uygulama yolu / sıklığı: İsteğe göre,Gözlemler: Günde 2 kez,Detaylı klinik inceleme: Haftalık,Fonksiyonal Gözlemler: 14. Ve 25. Günlerde öntestler,Vücut ağırlığı: Haftalık,Gıda tüketimi: Haftalık,Göz incelemesi: Bütün gruplarda uygulama yapılmadan önce ve uygulama durdurulduktan sonra,Klinik patoloji: Uygulama sonrasında bütün gruplarda hematoloji, klinik kimya ve idrar analizler,iToksikokinetik: Çalışmanın 1. Gününde ve 14 yada 27. Gününde kan toplanarak toksikokinetik değerlendirme yapılır,Nekropsi: Bütün ana çalışma gruplar, toksikokinetik çalışılan hayvanlar ötanazi edilir ve çalışmadan çıkarılır,Organ ağırlıkları: Adrenal bezler, beyin, kalp, böbrekler, karaciğer, akciğer, ovaryum (ovidukt ile), hipofiz, prostat, tük-rük bezleri, seminal bezler, dalak, paratiroid ile birlikte tiroid bezi, timus, testis, uterus, Preparat hazırlama / Mikroskobik patoloji: Kontrol ve diğer bütün çalışma grubu hayvanlardan ve ölenlerden standart şekilde dokuları alınır; düşük ve orta dozlardakilerden hedef organlar alınır; bütün hayvanlardan büyük lezyonlar de-ğerlendirilir.



6

re yol açmayan dozlar için test bileşiklerinin etkileri bu çalışmalarla değerlendirilme-lidir. Faz iki klinik denemeyi desteklemek amacıyla, uzun dönem subkronik ve kronik toksisite çalışmaları gerçekleştirilmelidir. Subkronik ve kronik toksik çalışmalar uzun süre maruz kalınan periyotları takiben test bileşiklerinin etkilerini değerlendirmek için dizayn edilir. Her bir çalışmadaki toksik doz düzeyleri hedef organı belirlemeye yönelik olmalıdır. Düşük dozlar güvenilirliğin sınırlarını belirleyecek şekilde insanlar-da kullanılan dozların üzerinde olmalıdır ve ideal olanı gözlenemeyen etki düzeylerini tanımlamaya izin vermelidir. Ayrıca faz 2 klinik denemeleri destekleyen subkronik ve kronik toksisite çalışmaları, tekrarlayıcı güvenlik çalışmalarına da ihtiyaç duymakta-dır. Tekrarlayıcı toksisite çalışmaları, kullanılması hedeflenen test bileşiklerinin çocuk doğuracak kadınlara verilmesi veya erkek üreme sistemine etkilerinin araştırılması-na gerek vardır. Bu çalışmalar test bileşiklerinin genel fertilite (Tablo 4) ve reprodük-tif performansa (Tablo 5) potansiyel etkilerini değerlendirmeyi, gelişme toksisitesi (Tablo 6) veya perinatal ve postnatal gelişimi de içermelidir [2,21-25].

İlaçların Uygulama Yollarıİlaçlar ağız yolu, damar içi, deri altı, kas içi ve periton içi yollarla verilebilir. Özel du-rumlarda rektum içi ve intraserebroventriküler yollar da tercih edilebilir. Ancak bu yollarla çok az miktarda ilaç uygulanabilir. İlacın veriliş yolu verilecek ilaç türü, mik-tarı ve formu göz önüne alınarak ayarlanmalıdır. Kasların innervasyonunda herhangi bir problem yoksa, ilaçların verilmesinde uygun yol kas içi olarak verilmesidir. Bunun-la birlikte çok miktarda ilaç uygulanması kasların aşırı gerilmesi ve ağrı oluşmasına yol açar. Verilecek ilacın pH’sı farklı ve solüsyon irkiltici özellikte ise kas içi yol kulla-nılmamalıdır. Bu gibi durumlarda ilacın damar içi verilmesi tercih edilmelidir. Bu tür ilaçlar deri altı verildiklerinde nekroza yol açar ve derinin soyulmasına neden olurlar. Ayrıca bazı ilaç formulasyonlarında Freund adjuvantı ile antijenlerin birleşmesi sonu-cu steril apseler meydana gelir.

Tablo 3. Ratlarda subkronik yada kronik doz çalışmaları.



Kontrol (Taşıt madde) 15 15 - -

Düşük doz 15 15 9+3 * 9+3 *

Orta doz 15 15 9+3 * 9+3 *

Yüksek doz 15 15 9+3 * 9+3 *

* 3 ilave hayvan (gruplara göre ilave edilebilecek hayvanlar)Uygulama yolu / sıklığı: İsteğe göre,Gözlemler: Günde 2 kez,Detaylı klinik inceleme: Haftalık,Fonksiyonal Gözlemler: 14. Ve 25. Günlerde ön testler,Vücut ağırlığı: Haftalık,Gıda tüketimi: Haftalık,Göz incelemesi: Bütün gruplarda uygulana yapılmadan önce ve uygulama durdurulduktan sonra,Klinik patoloji: Uygulama sonrasında bütün gruplarda hematoloji, klinik kimya ve idrar analizleri,Toksikokinetik: Çalışmanın 1. ve 90. Gününde kan toplanarak toksikokinetik değerlendirme yapılır,Nekropsi: Bütün ana çalışma gruplar, toksikokinetik çalışılan hayvanlar ötanazi edilir ve çalışmadan çıkarılır,Organ ağırlıkları: Adrenal bezler, beyin, kalp, böbrekler, karaciğer, akciğer, ovaryum (ovidukt ile), hipofiz, prostat, tük-rük bezleri, seminal bezler, dalak, paratiroid ile birlikte tiroid bezi, timus, testis, uterus, Preparat hazırlama / Mikroskobik patoloji: Kontrol ve diğer bütün çalışma grubu hayvanlardan ve ölenlerden standart şekilde dokuları alınır; düşük ve orta dozlardakilerden hedef organlar alınır; bütün hayvanlardan büyük lezyonlar de-ğerlendirilir.



7

Teorik olarak enjekte edilecek solüsyon-lar steril olmalıdır. Aksi takdirde enfek-siyon oluşumuna yol açar ve ateş yük-selir. Pratik olarak kemiriciler, tavşan, kuş ve diğer memelilerde kontaminas-yondan kaçınmak şartıyla steril olma-yan ilaçlar uygulanabilir. İnsan ve büyük hayvanlarda enjeksiyon yapılırken kulla-nılan asepsi ve antisepsi kurallarına la-boratuvar hayvanlarında nadiren başvu-rulur [1,2,26,27].

Enjeksiyon sayısı: Genel olarak tüm enjeksiyonlar özellikle damar içi enjek-siyonlar yavaş yapılmalı ve herhangi bir aşırı duyarlılık reaksiyonuna karşı hasta dikkatli bir şekilde gözlenmelidir. Ancak sodyum tiyopental gibi bazı anestezik ilaçlar hızlı yapılmalı ve hesaplanan do-zun yarısı hemen verilmelidir. Bu ilaçlar yağda iyi çözündüklerinden anestezinin oluş-ması için etki yerlerine yoğun şekilde ulaştırılmaları gerekir. Enjeksiyon yapılacak iğ-nelerin çapı hayvanın bünyesine, uygulanacak ilacın tabiatına ve yoğunluğuna uygun olmalıdır. İğnenin çapı büyük olursa gerekli doz tam uygulanamaz. Genel olarak akış-

Tablo 4. Ratlarda fertilite ya da erken embriyonik bo-zukluk çalışmaları.

Erkek Dişi

Kontrol (taşıt madde) 25 25

Düşük doz 25 25

Orta doz 25 25

Yüksek doz 25 25

Uygulama yolu / sıklığı: Erkekler 28. Gün başlangıcında, çiftleşmeden önce uygulanır, ötanazi edilene kadar sür-dürülür. Dişiler 14 günde çiftleşmeden önce başlanır ve 7 gün süreyle implantasyon sürezinde devam ettirilir,Gözlemler: Günde 2 kez,Klinik inceleme: Klinik belirtiler gözlenir, çalışma süre-since vücut ağırlığı ve gıda tüketimi kaydedilir, uygu-lamanın başlangıcında dişi hayvanlar östrus siklusu yö-nüyle kontrol edilir,Uterus incelemesi: Gebeliğin 13. gününde anne hayvan-larda inceleme yapılır; gebe uterus ağırlığı ve ovaryum-ların ağırlığı kaydedilir, korpus luteum sayısı ve imp-lantasyonları; dişilerde nekropsi yapılır; üreme organ-ları ve büyük lezyonlar olası mikroskobik inceleme için tespit edilir, Erkeklerin değerlendirilmesi: Dişilerin incelenmesin-den sonra erkekler de ötanazi edilerek nekropsi edilir. Testisler ve epididimis ağırlıkları, sperm parametrele-ri (yoğunluk, motility, morfoloji)incelenir. Üreme organ-ları ve büyük lezyonlar olası mikroskobik inceleme için tespit edilir, İstatistiki analiz: Standart.

Tablo 5. Ratlarda embriyo-Fetal gelişme.

Çiftleştirilmiş Dişiler

Kontrol (taşıt madde) 25

Düşük doz 25

Orta doz 25

Yüksek doz 25

Uygulama yolu / sıklığı: İsteğe göre, gebeliğin 6. Gü-nünde uygulamaya başlanır ve 17. Güne kadar devam edilir, Gözlemler: Günde 2 kez,Klinik inceleme: gebeliğin 6. Gününden 20. Gününe ka-dar günlük,Vücut ağırlığı / gıda tüketimi: Gebeliğin 0, 6, 9, 12, 15, 18 ve 20. Günlerinde,Sezaryen / Nekropsi: Gebeliğin 20. Gününde sezaryen ile doğan yavrular; gebe uterus ağırlığı; toplam korpus luteum sayısı; implantasyonlar, erken ve geç resorbsi-yonlar; canlı ve ölü fötuslar; fötusun cinsiyeti ve ağırlı-ğı; fötusun dış görünümle ilgili anomalileri; bütün fötus-larda visseral ve iskelet anomalileri; anne hayvanlarda nekropsi ile büyük lezyonlar değerlendirilir ve hedef or-ganlar muhafaza edilir.

Tablo 6. Ratlarda karsinojenik çalışmalar.

Ana çalışma 6 aylık periyot


Kontrol (Taşıt madde)

60 60 20 20

Düşük doz 60 60 20 20

Orta doz 60 60 20 20

Yüksek doz 60 60 20 20

Uygulama yolu / sıklığı: İsteğe göre,Gözlemler: Günde 2 kez,Detaylı klinik inceleme: Haftalık,Vücut ağırlığı: İlk 13 hafta haftalık olarak, daha son-ra aylık,Gıda tüketimi: İlk 13 hafta haftalık olarak, daha son-ra aylık ,Göz incelemesi: Bütün gruplarda uygulama yapılmadan önce ve bütün canlılar öncesinde ve sakrifiye edildik-te sonra,Klinik patoloji: Ana uygulama: 6 aylık sürenin sonunda hematoloji; 6 aylık uygulama grubunda: Uygulama dur-duktan sonra bütün hayvanlarda hematoloji, klinik kim-ya, idrar analizi,Nekropsi: Bütün hayvanlarda,Preparat hazırlama / Mikroskobik patoloji: Bütün hay-vanlarda, standart olarak dokular incelenir, bütün par-çalar ve lezyonlar değerlendirilir,İstatistiki analiz: Standart.



8

kanlığı hızlı olan sulu çözeltiler için 25 veya daha küçük numaralı iğneler kullanmak gerekirken, akıcılığı az olan veya yapışkan sıvılar için 21 veya daha büyük numaralı iğnelerin seçilmesi uygundur. Enjeksiyonu zor sıvılar verilirken pistonu geriden kilit-lenebilir özel enjektörlerin seçilmesi önerilmektedir. Bu sayede ilaçlar zorlanma sıra-sında geriye doğru fırlayıp çıkmaz [1,26].

Ağız yoluyla ilaç uygulama: Ağız yoluyla ilaç uygulama, yiyecek ve içecekler ile ya da mide sondasıyla gerçekleştirilebilir. Bazı ilaçlar oldukça lezzetli olduğundan nor-mal yiyecek ve içecekler ile kolayca laboratuvar hayvanlarına uygulanabilir. Hayva-nın tükettiği miktar ölçülerek hayvanın aldığı ve arzulanan uygulamaya ulaşıp ulaş-madığı kontrol edilir. Bu uygulamada verilecek dozun miktarı su ve gıda alınımında-ki değişikliklerden etkilenir.Tadı hoş olmayan maddeler yeterince tüketilemeyeceklerinden mide sondası ile uy-gulanırlar. Ayrıca verilecek miktar zamana bağlı ise bu yol oldukça uygundur. Bu uy-gulama ile ilaç doğrudan mideye verilir. Bu işlem sonda ile besleme olarak da isim-lendirilir. Bu metodun oldukça kolay uygulanması, solüsyonun steril olmasının gerekli olmaması, ilaçların solüsyonlar içinde verilebilmesi ve klinik olarak uygun bir yolun ol-ması avantajları arasında sayılır. Özefagusun hasar görebilmesi, yanlış uygulamaya bağlı aspirasyon pnömonisi gibi istenmedik durumlar ve ilaçların mide bağırsak ka-nalı veya karaciğer tarafından etkisizleştirilmesi ise metodun dezavantajlarıdır. Rat ve kobay için 3-4, fare için 2-3 numaralı polietilen kateterler mide sondası olarak kul-lanılabilir. Sondalama sırasında hayvanlar sıkıca tutulmalı ve sonda hayvanların diş-leri arasından dikkatli bir şekilde uygulanmalıdır. Bu işlem sırasında ağzın, dişlerin ve dilin zarar görmesi engellenmelidir. Önce boğaz bölgesine ilerletilen sonda yutkun-ma sırasında özefagus ve mideye yönlendirilir. Eğer sonda yanlışlıkla trakeaya gider-se hayvanda boğulma ve kusma refleksi başlar. Bu durumda sonda hemen geri çekil-melidir. İlaç veya verilecek materyal uygulandıktan sonra sonda yavaş yavaş çıkarıl-malıdır. Plastik sondalar rat, kobay ve tavşanlar için uygunken fareler için uygun de-ğildir. Ayrıca şuursuz hayvanlar plastik sondaları ısırdıklarından, sıvı veya ilaç verile-ceği zaman metal sondaların tercih edilmesi gerekir. Sondalama sırasında çabalama gözlenirse, hafif bir anestezik ilaç uygulamayı kolaylaştırabilir [1,26,28].

Damar içi enjeksiyon: Damar içi enjeksiyonlar genellikle kuyruk venlerinden yapılır. Rat ve farelerde lateral kuyruk veni gençlerde kolayca görülürken, yaşlı hayvanlarda derinin kalınlaşması ile bazen gözden kaçabilir. Laboratuvar hayvanlarında uygula-madan önce kuyruğun ısıtılması venlerin genişlemesini sağlayacağından önerilir. Fa-relerde ısıtıcı lambalar yeterli olurken, ratların kuyruklarının 40-45°C’lik suya daldı-rılması tavsiye edilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken suyun aşırı sıcak olma-masıdır. Fare ve ratların kuyrukları yeteri derece genişlediğinde uygun tespitin ya-pılacağı yere taşınır. Lateral venlerden biri üste gelecek şekilde kuyruk döndürülür. 25-26 numaralı iğne ve 45 derecelik açı ile venaya girilir. Direncin azalması iğnenin venin içinde olduğunu gösterir. Enjeksiyondan sonra iğnenin girdiği yere pamukla sı-kıca bastırıldıktan sonra iğne geri çekilir [1]. Damar içi ilaç uygulaması, istenilen konsantrasyonda ve hızlı bir şekilde yapılır. Fazla miktarda sıvı bir defada uygulanabilir. Ağrı verici ilaçlar damar içi uygulanabilir. Pra-tik yapmayı gerektirmesi ve araştırmacının laboratuvar hayvanlarına damar içi ilaç uygulayabilecek yetenekte olması bu işlemin dezavantajları olarak kabul edilir. Da-mar içi verilecek ilaç solüsyonu izotonik olmalıdır. Aksi takdirde hemolize yol açar.



9

Süspansiyon tarzındaki ilaçların damar içi yolla verilmesi uygun değildir.

Deri altı yolla ilaç verme: Kıvrımlı deri kaldırılarak ilaç uygulanır. İğnenin vücut du-varlarına paralel tutulması gerekir. İğne deriyi geçtikten sonra iğnenin büyüklüğü ka-dar deri altı yolla ilerletilir. Deri altı uygulama için çoğu hayvanda boyun derisi ter-cih edilir. Deri altı ilaç kullanmanın en önemli avantajı yavaş yolla emilimin gerçek-leşmesidir. Uygulanan teknik oldukça basit olup çoğu araştırıcı tarafından rahatlıkla gerçekleştirilebilir. İlaç miktarı fazla da olabilir. Ancak tahriş edici ilaçlar için uygun bir yol değildir. Deri altı uygulanacak solüsyon steril ve izotonik olmalıdır.

Kas içi enjeksiyon: Laboratuvar hayvanlarında kas içi enjeksiyonlar quadriceps, bi-ceps femoris ve triceps kaslarına yapılır. Biceps femoris kası laboratuvar hayvanla-rında en az rahatsızlığa yol açar. Kasın en şiskin kısmına ilaç uygulanır. Bu kasın pos-terior kısmından enjeksiyon yapılırken siyatik sinirini tahrip etmemeye özen göste-rilmelidir. Quadriceps kaslarına verilecek ilaçlar hayvanlarda daha fazla ağrıya ne-den olur. Enjeksiyonun yavaş yapılması ve az miktarda sıvı verilmesi ağrıyı azaltıla-bilir. Bununla birlikte quadriceps kasları kan damarı ve sinirinin olmaması gibi bazı avantajlara da sahiptir.

Periton içi enjeksiyon: Rat, fare ve kobaylar bir yardımcı tarafından tespit edildik-ten sonra araştırmacı bir elle bacağı tutar ve diğer elle femura paralel olarak iğne-yi karnın geri ¼’lük kısmından periton boşluğuna uygular. İğne karın kaslarını geçtik-ten sonra direnç kaybolur. Penetrasyon oldukça yüzlek olmalı ve karın kaslarını geç-tikten sonra bacağa paralel 1-2 cm ilerledikten sonra enjeksiyon yapılmalıdır. Karnın posterior kısmında bulunan idrar kesesine ve daha ileri giderek karaciğerin anterior kısmına ilaç uygulanmamalıdır. Periton içi uygulamada nadiren komplikasyon şekille-nir. Ratlar genellikle tespit edildiklerinde işerler. Eğer bu durum periton içi enjeksiyon yaparken gözlenirse, enjeksiyon büyük bir olasılıkla idrar kesesine yapılmıştır. Periton içi enjeksiyonun avantajları tekniğin basit ve emilimin de hızlı olmasıdır. Klinik olarak uygun bir yol olmayışı, irritan ajanların verilmesi için kullanışlı olmaması, aseptik tek-nikler gerektirmesi, uygun yapılmayan enjeksiyonların peritonitis oluşturma riski ve tekrarlayan dozların enfeksiyona yol açabilmesi önemli dezavantajlar olarak sayılır.

Örnek Alma Teknikleri ve MuayeneGözlem ve Fiziksel MuayeneRatlar rutin olarak genel sağlık ve test nesnelerini değerlendirmek için gözlemlenir-ler. Akut ve subkronik çalışmalarda, belirgin kan düzeyinde pik yapan test bileşikleri-nin indüklediği kısa dönem farmakolojik değişikliklerin tanımlanması için hayvanlar sıklıkla gözlenmelidir. Akut toksik çalışmalarda spesifik olarak klinik gözlemler mak-simum tolere dozu ortaya çıkarmaya yardım eder. Kronik çalışmalarda, gözlemler tü-mör gelişimini, hayvanlardaki aşırı bulguları tayin etmek için yapılır. Hayvanlar insani nedenlere ötanazi edilebilir ve bu durumda doku kaybı otoliz engellenmelidir. Günlük gözlemler öncelikle sabah daha sonra da öğle vakti hayvanların sağlığını değerlen-dirmek için yapılmalıdır ve olası aşırılıklar tanımlanmalıdır. Bu gözlemlerde; davranış durumu, solunum bulguları ve atılan ürünler not edilmelidir. Bu gözlemleri yaparken hayvanları mümkün mertebe rahatsız etmemeli ve herhangi bir rahatsızlık durumu-nun strese yol açacağı ve hayvan davranışlarını etkileyeceği unutulmamalıdır. Anor-mallik belirlendiğinde hayvanlar daha yakından muayene edilmek için tespit edilme-



10

lidir. Dışkı miktarına özelikle dikkat edilmelidir; çünkü dışkı miktarının azalması su sistem malfonksiyonunun ilk semptomu olabilir. Akut çalışmalarda veya farmakolo-jik etkilerin beklenildiği yerde hayvanlar sürekli kontrol edilmeli veya plazma düzey-leri pik yaptığında ayrıntılı muayene yapılmalıdır. Eksiksiz bir fiziksel muayene haf-talık olarak yapılmalıdır. Her hayvan kafesten alınmalı, muayene masasına yerleşti-rilmeli, solunum, davranış, genel görünüş ve hareket sistemi gözlemlenmelidir. Daha sonra operatör hayvanın doğal deliklerini, deri, tüy örtüsünü muayene etmeli ve ba-caklar ile omuz palpe edilerek tümör varlığı araştırılmalıdır. Herhangi büyüme ve kit-le varlığının izlenmesi (potansiyel tümör oluşturanlarda) kanserojen çalışmalar için esastır. Bir önceki haftaya göre şiddetli kilo kaybı, haftalara göre kiloda azalma veya diğer şiddetli klinik bulguların gözlenilmesi olası ötanazi nedenidir. Vücut ve besle-me kayıpları fiziksel muayenenin bir parçası olarak ölçülür veya ayrı bir fonksiyon de-ğerlendirmesine göre yapılır. Fiziksel muayenenin bir parçası olarak bu operasyonla-rın performansı hayvanın tespitine bağlı veya potansiyel stresleri en aza indirecektir. Operasyonlar kombine edilirse tam fiziksel muayeneler yapılmalı ve bu işlemler sıra-sında acele edilmemelidir [2]. Kan alma tekniği hayvan türüne, ihtiyaç duyulan miktara ve amaca göre değişir. La-boratuvar hayvanlarından kan alma öncelikle hematolojik ve biyokimyasal analizler için gereklidir. Kan hematolojik mayene için EDTA (etilen diamin tetra asetik asit) içeren tüplere alınır. Biyokimyasal analizler kan serumu veya kana heparin ilave edi-lerek elde edilen plazmadan yapılır [1,2].Az miktardaki kan antikoagulantlı kapillar tüplere alınabilir. Eğer kan almadan son-ra hayvanın yaşaması isteniyorsa dolaşımda bulunan kan miktarının %10’undan faz-la kan alınmaması gerekir. Pratikte toplam kanın %30-40’ı alınabiliyorsa da bunun ciddi hipovolemi ve kardiyovasküler yetmezliğe yol açacağı da unutulmamalıdır (Tab-lo 7).Kanın %5-10’u alınıyorsa tekrarlayan örneklerin ciddi sorunlara yol açmaması için 2-3 hafta aralıklarla alınması önerilmektedir. Örnek alma işlemi bir kaç ay devam ederse alyuvar ve hematokrit değerlerin kontrol edilmesi gereklidir. Kan sürme froti-sinde anemi de kontrol edilebilir.Stres ve anestezi, hematolojik ve biyokimyasal parametreleri tamamen değiştirebi-lir. Özellikle hayvanı tespit ederken oluşturulan aşırı stres hematokrit ve akyuvar sa-yısında artışa neden olur. Ayrıca glikoz ve bazı hormonlar da değişebilir. Anestezik ve aneljezikler hematolojik ve biyokimyasal parametreleri değiştirebilmekle birlikte bu durum kontrol ve normal referans değerleri açısından önemli değildir.Tekrarlayan dozlarda örnek almak gerektiği zaman her seferinde damarı delmek ye-rine kalıcı kateter yerleştirilebilir. Kalıcı kanül anestezi uygulamadan yüzlek venle-re yerleştirileceği gibi; anestezi altında derin venlere de sabitleştirilebilir. Bu durum hayvanlara sıkıntı vermeden kolayca kan almaya yardımcı olur.

Tablo 7. Bazı laboratuvar hayvanlarında kan hacmi ve alınabilecek kan örnekleri

Tür Ergin vücut ağırlığı (g) Ortalama erişkin kan volumü (ml)

Kan örneği için alınacak maksimum miktar (ml)

Alınabilecek en yüksek kan hacmi (ml)

Fare 25-40 2.5 0.3 1.2

Rat 300-500 30 2.5 12

Kobay 700-1200 60 5 30

Tavşan 2000-6000 250 50 150

Hamster 85-150 9 0.5 3



11

Tüm türlerde kalıcı katater yerleştirildiği zaman, 30-60 dakika aralıklarla yeniden kontrol edilmelidir. Çünkü bazen ciddi kanamalara neden olabilir. Bu durum kanama-ya duyarlı olan laboratuvar hayvanları için oldukça önemlidir [2].

Kan alma metotlarıKuyruk veni: Bu metot daha çok rat ve farelerde kullanılır. Hayvanlar anestezi edilir, tespit işlemi uygun bir düzenekle veya bir yardımcı tarafından gerçekleştirilir. Kuyruk traş edilir ve antiseptikle temizlenir. Hayvanların kuyrukları ısıtılır veya alkol-ksilol karışımı ile friksiyon yapılır. Farelerde kuyruk venlerinden birine küçük bir ensizyon yapılır. Kan doğrudan tüpe boşaltılır. Aynı teknik ratlarda da uygulanacağı gibi, 23-25 numaralı iğne ile hassas bir şekilde kan alınır. Örnek aldıktan sonra damar üzerine hafif basınç uygulamak genellikle hemostazis için yeterlidir. Az miktarda kan anes-tezi edilmiş fare ve rattan kuyruğun kesilmesi ile de alınabilir. Bu kan doku sıvıları ile kontamine olabileceğinden bu durumdan kaçınmak gerekir [29-35].

Kalpten kan alma: Bu teknikle fare, rat, kobay ve tavşanlardan kan alınabilir. Hay-vanlar anestezi edildikten sonra sırt üstü yatırılır. Sternum palpasyonla belirlenir. Daha sonra bir elin işaret parmağı ile sternum hafif kaldırılır. İğne ile sternumun al-tından vücut duvarına 25-30° açı yapacak şekilde kalbe girilir. Vücut duvarı delin-dikten sonra iğne kalbe doğru yönlendirilir ve hafif şekilde piston geri çekilir. Şırın-ga kanla doluncaya kadar iğne ilerletilir. Bu amaç için 21 veya 23 numaralı iğne ter-cih edilmelidir. Miyokardiumun tekrar tekrar delinmesi hemoraji ve ölüme yol açabi-lir [1,29,32].

İdrar almaLaboratuvar hayvanlarında idrar değişik şekillerde alınır. Bunlardan ilki normal üri-nasyon sırasında, ikincisi üretranın kateterizasyonu, üçüncüsü idrar kesesinin sisto-sentezi ve sonuncusu ise metabolik kafeslerin kullanılmasıyladır. Fare ve ratlar ele alındıkları zaman genellikle idrarlarını yaparlar. Üretranın kateterizasyonu ile idrarın toplanması daha çok tavşanlarda uygundur. Sistosentezde idrar kesesi palpe edil-dikten sonra iğne ile idrar toplanır. Bu teknik çok iri hayvanlar için pratik değildir. Bu teknik küçük kemiriciler için oldukça pratik kabul edilmekle birlikte dışkı ve diğer ma-teryalle kontaminasyon olabilir [1,36].

Dışkı toplamaİri laboratuvar hayvanlarında dışkı örnekleri metabolik kafeste toplanabilir. Ayrıca rektal swabla da dışkı örnekleri toplamak mümkündür. Küçük kemiriciler ise elle tes-pit edildiklerinde genellikle dışkı yaparlar. Kemiriciler ve tavşanlar dışkılarını yedikle-rinden metabolik kafeslerin kullanılması önerilmektedir.

Patolojik DeğerlendirmelerGerek tarlarda gerekse diğer türlerde farmakolojik ve toksikolojik çalışmaların de-ğerlendirilmesinde esas alınan kriterlerden biri de patolojik değerlendirmelerdir [2,22,23,37]. Bu amaçla nekropside alınabilecek doku ve organlar (Tablo 8) ile rat-lardaki klinik biyokimyasal parametreler (Tablo 9) tablolar halinde ifade edilmiştir.



12

MetabolizmaSitokrom P-450 (CYP450 enzimleri) memelilerde en önemli metabolik enzim siste-mini oluşturur ve pek çok familya ve alt tipleri belirlenmiştir. Ratlarda bu enzim gru-bu ilk olarak izole ve karakterize edilmiştir. Gerçekte ratlarda bilinen en eski sitok-rom enzimler P450d olup insanlardakine benzer olduğu gösterilmiştir. CYP1A2 ola-rak isimlendirilen enzim aromatik yapılı tercihen aromatik aminler olarak türlerde ti-pik substratlarla birlikte korunduğu bilinmektedir. Bu yapı 3-methylcholanthrene ola-rak veya poliklorlu bifeniller ile polisiklik aromatik hidrokarbonlar tarafından indük-lenmektedir. Benzer durum CYP2E1 için de geçerlidir; ki bu enzim de tüm türlerde etanol, asetone, metabolize organik çözücüler, nitrozaminler ve pek çok ilaçlarla (pa-rasetamol gibi) indüklenebilir. Sonuç olarak ratlarda karaciğer mikrozomal enzim et-kinliğinde bu iki CYP formu etkilidir [2,38]. Bununla birlikte ratlar CYP3A4 olarak bilinen ve insanlar için oldukça önemli CYP için iyi bir metabolik model değildir. Ratların karaciğerinde oldukça bol bulunan CYP altfamilyası CYP2C’dir, bu enzim insan CYP3A enzimlerinin rolüne sahiptir, aflatok-sin B1’de olduğu gibi sadece dihidropiridinlerin oksidasyonunda değil aynı zamanda ratların 2C enzimleri tarafından gerçekleştirilen steroidlerin hidroksilasyonlarını da destekler. Diğer önemli bir CYP enzimi olan CYP2D6 kinidin ilaç metabolizmasında CYP2D1 olgularında olduğu gibi iyi fonksiyona sahip değildir. Fakat kininin steroizo-meri bu olguda güçlü bir inhibitördür. Ayrıca CYP2D6 substrat markerlerinden biridir, ratlardaki diğer CYP2D enzimi (CYP2D2) tarafından spesifik olarak antitüssif olan dekstrometorfan metabolize edilir. Ratlarda CYP2D1 enzimleri 3-metilcholanthrene ve fenobarbital tarafından indükle-

Tablo 8. Nekropside alınan ve ağırlıkları ölçülen dokular.

Deri Karaciğer a

Meme bezi Pankreas

Lenf düğümleri Dalak a

Tükürük bezleri Böbrek a

Sternum Adrenal bez a

Femur (kemik iliği dahil) İdrar kesesi

Kas Seminal bez

Timus a Prostat a

Trachea Testis a

Akciğer a Ovaryum a

Kalp a Uterus a

Tiroid bezi (parathiroid ile) a Vajina

Dil Beyin

Özefagus Hipofiz bezi a

Mide Spinal kanal

Duodenum Göz

Jejunum Gözyaşı bezi

İleum Anormal durum belirlenen diğer doku ve organlar

Kolon

a Dokular nekropside tartılırlar



13

Tablo 9. Ratlarda klinik biyokimyasal değerler.

Parametre Erkek Dişi

M SD M SD Range

Bilirubim (mg/dl) 0.35 0.02 0.24 0.07 0.00–0.55

Kolesterol (mg/dl) 28.3 10.2 24.7 9.62 10–54

Kreatinin (mg/dl) 0.46 0.13 0.49 0.12 0.20–0.80

Glukoz (mg/dl) 78 14 71 16 50–135

Üre nitrojen (mg/dl) 15.5 4.44 13.8 4.15 5–29

Ürik asit (mg/dl) 1.99 0.25 1.79 0.24 1.20–7.5

Sodyum (mEq/l) 147 2.65 146 2.50 143–156

Potasyum (mEq/l) 5.82 0.11 6.70 0.12 5.40–7

Klor (mEq/l) 102 0.85 101 0.90 100–110

Bikarbonat (mEq/l) 24 3.80 20.8 3.60 12.6-32

Fosfor (mg/dl) 7.56 1.51 8.26 1.14 3.11-11

Kalsiyum (mg/dl) 12.2 0.75 10.6 0.89 7.2-13.9

Magnezyum (mg/dl) 3.12 0.41 2.60 0.21 2.24-3.81

Amilaz 245 32 196 34 128-313

Alkalen fosfotaz (IU/l) 81.4 14.8 93.9 17.3 56.8-128

Alanin transaminaz (IU/l) 25.2 2.05 22.5 2.50 1.5-30.2

Aspartat transaminaz (IU/l) 62.5 8.40 64 6.50 45.7-80.8

Kreatin fosfokinaz (IU/l) 5.60 1.30 6.80 2.40 0.84-11.6

Laktat dehidogenaz (IU/l) 92.5 13.9 90 14.5 61.0-121

Serum total protein (g/dl) 7.61 0.50 7.52 0.32 4.70-8.15

Albumin (g/dl) 3.73 0.53 3.62 0.52 2.70-5.10

Albumin / Globulin 0.96 0.24 0.93 0.25 0.72-1.21

Tablo 10. Ratlarda karaciğerdeki ksenebiyotik enzimler.

Enzim Yoğunluk ya da Etkinliği Değerlendirme

Sitokrom P-450 (mikrozomal) 0.20-1.00 nmol/mg/m10 – 40 nmol/g (yaklaşık)

Kullanılan ratların suş, yaş ve cinsiyetine göre de-ğişir.

Sitokrom b5 (mikrozomal) 0.10-0.40 nmole/mg-m6-17 nmol/g (yaklaşık)

Kullanılan ratların suş, yaş ve cinsiyetine göre de-ğişir; sitokrom p-450 kadar baskın değildir

NADPH: sitokrom P-450 redüktaz (mikrozomal)

75-200 nmol/min/mg-m Yaygın kullanılan suşlarda

MMFO etkinlikleriAminopiren dimetilAnilin hidroksilP-nitroanisol dimetilAril hidrokar hidroksil

2.3-10.0 nmol/min/mg-m

0.3-1.6 nmol/min/mg-m0.3-1.25 nmol/min/mg-m

Doymuş şartlarda tespit edilir. Yaş, cinsiyet ve suş’a göre değişkenlik gösterir.

Epoksit hidrolaz (sitiren oksit ile) Mikrozomal Sistolik

2-12 nmol/min/mg-m30-46 nmol/min/mg-c

Cinsiyet, suş ve yaş ile ilgili farklılıklar

UDP- glukuronil transferaz 1-naftilol 4-nitrofenol

5-40 nmol/min/mg-m15-30 nmol/min/mg-m

Glutasyon S-transferazCDNB4-nitrobenzil klorür

360-1400 nmol/min/mg-c110-380 nmol/min/mg-c



14

nirken, insan CYP2D6 enziminin 3-methylcholanthrene and fenobarbital tarafından indüklenemediği bilinmektedir. Muhtemelen CYP enzim indükleme mekanizmaların-da belirgin farklılıklar vardır. Fenobarbital insan CYP3A, CYP2C ve CYP2B formları-nı indükler.Ksenobiyotik mekanizmalar dikkate alındığında, türler arasındaki farklılıkların nitel olduğu kadar nicel olduğu da akılda tutulmalıdır. Örneğin düşük dozlarda (0.16 gg/kg) benzo(a)pyrene ratların akciğerinde %1,7 oranında toplanırken, hamsterlerde %7,9 oranında toplanmaktadır. Yüksek dozlarda bu oran ratlarda %9,01 ve hamsterler-de %8,04 olmaktadır. Bu durum türlerle ilişkili farklılığa nicel bir örnektir. Düşük doz benzo(a)pyrene tüm türlerde belirgin metabolitler olup tiyoeter (glutathione) konju-gatıdır. Aksine, tiyoeterler yüksek doz benzo(a)pyrene verildiğinde kobaylarda belir-gin olarak kalma eğilimindedir. Fakat glukuroid formasyonunda ratlarda dikkati çe-kecek kadar bir değişim vardır. Bu durum türlerle ilişkili farklılığa daha fazla nitele-yici bir örnektir [38-42]. Türler arasında farklı metabolizma çalışmaları her zaman araştırıcının türlerle ilişkili farklardan doğan zorluğu çözmek zorunda olduğu anlamına gelmez. Sıklıkla faklılık-tan çok, türler arasında mevcut olan daha fazla metabolizma benzerliği seçilmelidir. Tüm türlerde olduğu gibi ratların karaciğeri ksenobiyotik metabolizmanın merkezi-dir. Genel olarak, karaciğerin vücut ağırlığına oranı ratlarda açlık sonrası yaklaşık % 2.5 - %3.2’dir; oran ad libitum durumunda ise yaklaşık % 3.3 - %4.0’dır. Bu değişim glikojen içeriğine bağlıdır. Ratlarda karaciğer ksenobiyotik metabolizmanın pek çok özelliği Tablo 10’da özetlenmiştir.

Deney Hayvanlarına İlaç UygulamaDeney hayvanlarına ilaç uygulama ve hayvanlardan kan veya vücut sıvıları alma sı-rasında en az düzeyde strese yol açılmalıdır. Stres ve ağrı vücudun normal değerleri-ni değiştirdiğinden, yapılacak işlemlerde bilimsel teknikler kullanılmalı ve araştırmacı kendine güvenerek uygulamaları hassas bir şekilde gerçekleştirmelidir [1,2].

İlaç dozlarıİlaçlar tek doz olarak verilebileceği gibi, tekrarlayan uygulamalar şeklinde de verile-bilir. İlaç dozu ayarlamadan ve ilaç verilmeden önce şu soruların cevaplandırılması ve değerlendirilmesi gerekir. - Uygulama ile ne amaçlanmaktadır? İlacın verilmesi ile kısa süreli bir pik devresi mi, yoksa belli bir düzeyde sabit plazma konsantrasyonu mu hedeflenmektedir.- İlacın dozu ne olmalıdır ve verilecek miktar nedir?- İlaç hangi formda (solüsyon, emülsiyon, süspansiyon) olmalıdır? Eğer solüsyon şek-linde verilecekse, hangi çözücüde çözdürülmesi daha uygundur? Ayrıca çözücünün pH’sı ne olmalıdır?- Hangi yolla verilmesi daha uygundur?

Verilecek ilaç hacmiGenel olarak laboratuvar hayvanlarında düşük dozlarda ilaç uygulanmalıdır. Deri altı ve damar içi yollarla da aynı miktar verilebilir Ancak kas içi yolla az miktarda ilaç uy-gulanması daha uygundur. Tablo 11’de laboratuvar çalışmalarında yaygın kullanılan hayvanlar için verilecek miktarlar gösterilmiştir.



15

ÖtanaziÖtanazi işlemi bu konuda eğitim almış kişiler tarafından uygun metotlarla yapılmalı ve bu konuda toplumsal ve etik değerler ile kanuni prosedürde göz önünde bulundu-rulmalıdır. Seçilecek metot hayvanın türü, sayısı ve ölüm sonrası hayvanın kullanılıp kullanılamayacağına göre değişkenlik gösterir. Ötanazi amacıyla hayvanlarda farklı yöntemler kullanılır. Bu amaçla, barbitüratlar, kloralhidrat, magnezyum sülfat, uçucu anestezikler, karbondioksit, karbonmonoksit gibi maddeler ile fiziksel metotlar (ka-faya darbe, servikal dislokasyon, mermi, giyotin gibi) ötanazi için kullanılan [1] yön-temler olmuştur (Tablo 12, Tablo 13).

Kaynaklar1. Durgut R, Yarsan E. Laboratuvar Hayvanları Hastalıkları ve Sağaltım. Medisan Yayın Serisi:66. 2007, Ankara. 2. Gad SC. Animal Models in Toxicology. Taylor and Francis Group, Boca Raton, London, New York. 2007.3. Altuğ T. Hayvan Deneyleri Etiği. Sağlık Bilimlerinde Süreli Yayıncılık. 2009, 53-68. 4. Canadian Council On Animal Care. Guide to the Care and Use of Experimental Animals, Volume 1. 1980.5. Fagen R. Animal Play Behaviour. Oxford University Press. 1981.6. Flecknell PA, Liles JH, Williamson HA. Laboratory Animals. 1990, 24:142-146.

Tablo 11. Laboratuvar hayvanlarında verilecek ilaç dozları ve iğne büyüklüğü

Tür Deri altı Kas içi Periton içi Damar içi

Fare 2-3 ml, 20 numara 0.05 ml, 23 numara 2-3 ml, 21 numara 0.2 ml, 25 numara

Rat 5-10 ml, 20 numara 0.3 ml, 21 numara 5-10 ml, 21 numara 0.5 ml, 23 numara

Hamster 3-4 ml, 20 numara 0.1 ml, 23 numara 3-4 ml, 21 numara 0.3 ml, 25 numara

Kobay 5-10 ml, 20 numara 0.3 ml, 21 numara 10-15 ml, 21 numara 0.5 ml, 23 numara

Tavşan 30-50 ml, 20 numara 0.5-1 ml, 20 numara 50-100 ml, 20 numara 1-5 ml, 21 numara

Tablo 12. Laboratuvar hayvanlarında uygulanabilecek ötanazi yöntemleri

Tür Önerilen Şartlı kabul edilen Not

Tavşan BarbitüratlarUçucu anesteziklerCO, CO2KCl (anestezi ile)

Azot, ArsenikServikal dislokasyon(>1 kg)DekapitasyonKafasına vurma

-

Kemiriciler ve di-ğer küçük hayvan-lar

BarbitüratlarUçucu anesteziklerCO, CO2KCl (anestezi ile) Mikrodalga

MetoksifluranEterAzot, arsenikServikal dislokasyon(<200 g)Dekapitasyon

Mikrodalga için özel sistem gerekir, fare ve ratlarda yük-sek enerji ile 1.3-10 kw.

Tablo 13. Ötanazi için önerilmeyen maddeler

Hava embolisi Bu yöntemde konvülzonlar, opistotonus, gürültü söz konusudur. Eğer uygulanacaksa mutlaka ön-cesinde anestezi yapılmalıdır.

Kafayı kesmek Bir çok tür için önerilmeyen bir yöntemdir.

Yakma Kimyasal ya da ısı ile yakma ötanazi için önerilmemektedir.

Kloralhidrat Kedi, köpek, ve küçük hayvanlar için kullanılır.

Kloroform Hepatotoksik olması ve muhtemelen karsinojen olması nedeniyle uygulayıcı personel için teh-likelidir.

Siyanür Uygulayıcı personel için tehlikelidir ve; ölüm şekli estetik değildir.

Dekompresyon Bir çok nedenle kabul edilemez özelliktedir.

Boğulma Ötanazi yöntemi olarak kabul edilmez.

Kanını akıtma Sadece anestezi ya da sedasyon uygulanan hayvanlarda yapılabilir.



16

7. Fox JG, Cohen JB, Loew FM. Laboratory Animal Medicine. Orlando, Fl, Academic Press, 1984.8. Hu C, Flecknell PA, Liles HJ. Laboratory Animals. 1991, 25:381-388.9. Matfield M. The Animal Rights Threat to Biomedical Research. Biologist 1985, 30:5.10. Rollin BE. Animal Rights And Human Morality Revised Ed Buffalo Ny, Prometheus Books. 1992. 11. Smith JA, Boyd KM. Lives In The Balance: The Ethics Of Using Animals In Biomedical Research Oxford: Oxford Uni-versity Press. 1991.12. Smyth DH. Alternatives To Animal Experiments. Scholar Press/Research Defence Society. 13. Tuffery AA. Laboratory Animals. An Introduction for New Experimenters. John Wuey and Sons. 1987.14. Van Zutphen LFM, Baumans V, Beynen AC. Principles of laboratory animal science. Amsterdam: Elsevier. 1993.15. Williams CSF. Practical Guide to Laboratory Animals. St. Louis, Cv Mosby, 1976.16. Wootton R, Cross G, Wood S, West CD. Laboratory Animals. 1988, 22:217-222.17. Baker HJ, Lindsey JR, Weisbroth SH. The Laboratory Rat. Orlando, Fl, Academic Press, 1979.18. Sharp PE, La Regina MC. The laboratory rat. Boca Raton, FL: CRC Press. 1998. 19. Ufaw. Guidelines On The Handling And Training Of Laboratory and Biological Council, London. 199220. Frazer JFD. The Ufaw Handbook On The Care And Management Of Laboratory Animals, 6th Edition (Poole, Tb Ed.), Longman Scientific And Technical, Harlow. 1987, 753-758. 21. Greaves P, Faccini JM. Rat histopathology: A glossary for use in toxicity and carcinogenicity studies (2nd ed.). New York: Elsevier. 1992.22. Haschek WM, Rousseaux CG. Fundamentals of toxicologic pathology. San Diego, CA:Academic Press.1998. 23. Haschek WM, Rousseaux CG, Wallig MA. Handbook of toxicologic pathology (2nd ed). San Diego, CA: Academic Press. 2002.24. Keplinger ML, Lanier GE, Deichmann WB. Effects of environmental temperature on the acute toxicity of a number of compounds in rats. Toxicol Appl Pharmacol. 1959, 1:156–161.25. Stevens KR, Gallo MA. Practical considerations in the conduct of chronic toxicity studies. In Principles and methods of toxicology, Ed. AW Hayes, 237–250. New York: Raven Press. 26. Bader M, Klinger W. Intragastric and intracardial injections in newborn rats: Methodical investigation. Z Versuchsti-erk. 1974, 16:40–42.27. Wadsworth RM, Ratnasooriya WD. Method for localized and sustained administration of drugs to the vas deferens of rats. J Pharmacol Meth. 1981, 5:313–320.28. Worth HM, Kachmann C, Anderson RC. Intragastric injection for toxicity studies with newborn rats. Toxicol Appl Phar-macol. 1963, 5:719–727.29. Besch EL, Chou BJ. Physiological responses to blood collection methods in rats. Proc Soc Exp Biol Med. 1971, 138:1019–1021.30. Frank P, Schoenhard GL, Burton E. A method for rapid and frequent blood collection from the rat tail vein. J Pharma-col Meth. 1991, 26:233–238.31. Furuhama K, Onodera T. A simple technique for repeated blood collection from the tail vein of the rat. J Toxicol Sci. 1983, 8:161–163.32. Koeslag D, Humphreys AS, Russell JC. A technique for long-term venous cannulation in rats. J Appl Physiol. 1984, 57:1594–1596.33. Upton PK, Morgan DJ. The effect of sampling technique on some blood parameters in the rat. Lab Anim. 1975, 9:85–91.34. Waynforth HB. Experimental and surgical technique in the rat. London: Academic Press. 1980. 35. Winsett OE, Townsend CM, Thompson JC. Rapid and repeated blood sampling in the conscious laboratory rat: A new technique. Am J Physiol. 1985, 249:145–146.36. Khosho FK, Kaufmann RC, Amankwah KS. A simple and efficient method for obtaining urine samples from rats. Lab Anim Sci. 1985, 35:513–514.37. Feldman DB, Seely JC. Necropsy guide: Rodents and the rabbit. Boca Raton, FL: CRC Press. 1988.38. Ariyoshi T, Kazumitsu T, Hamasaki K. Effects of age and sex on microsomal heme oxygenase and cytochrome P-450 content in liver of rats. J Pharm Dyn. 1981, 4:664–669.39. Murray M. Mechanisms of inhibition of cytochrome P-450 mediated drug oxidation. Drug Metab Rev. 1989, 18:55–82.40. Toftgard R, Haaparanta T, Eng L, Haplert J. Rat and liver microsomal cytochrome P-450 isozymes involved in hydroxy-lation of n-hexane. Biochem Pharmacol. 1986, 35:3733–3738.1989.41. Wade AE, Holl JE, Hilliard CC, Molton E, Greene FE. Alteration of drug metabolism in rats and mice by an environment of cedarwood. Pharmacology. 1968, 1:317–328.42. Zuber R, Anzenbacherona E, Anzenbacherona P. Cytochromes P450 and experimental models of drug metabolism. T Cell Mol Med. 2002, 6:189–198.

farmakoloji ve toksikolojide rat modellerifarmakoloji ve toksikolojide rat modelleri farmakoloji ve...

Documents