evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro

Evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos y de

jugos de diez frutas de interés comercial en Colombia contra cuatro bacterias patógenas

JUANITA CAROLINA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ

Grupo de Investigación en Fitoquímica (GIFUJ)

Grupo de Terapia Celular y molecular

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

BIÓLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGIA

Bogotá D.C.

Diciembre 21 de 2011




APROBADO

INGRID SCHULLER Ph. D. ANDREA FORERO

DECANA ACADEMICA DIRECTORA DE CARRERA




APROBADO

LUIS GONZALO SEQUEDA MSc. ALBA NOEMÍ TÉLLEZ Ph. D.

DIRECTOR JURADO

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y

porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea

en ella el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”

Artículo 23 de la Resuloción No. 13 de Julio de 1846

TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN 1

2. INTRODUCCIÓN 2

3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 3

4. JUSTIFICACIÓN 4

5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 5

6. OBJETIVOS 6

6.1. General 6

6.2. Específicos 6

7. MARCO TEÓRICO 6

7.1. Marco conceptual 6

7.1.1. Interacción Patógeno-Hospedero 6

7.1.2. Fitoquímica 7

7.1.3. Especies Vegetales 7

7.1.3.1. Briófitos 8

7.1.3.2. Angiospermas 9

7.2 Antecedentes de las especies evaluadas 11

7.2.1. Microorganismos patógenos 11

7.2.2. Briófitos 12

7.2.3. Angiospermas 15

8. MATERIALES Y MÉTODOS 16

8.1 Obtención y preparación de muestras y extractos 16

8.1.2. Briófitos 16

8.1.3. Frutas 17

8.2. Evaluación antibacteriana 18

8.2.1. Preparación de materiales y cepas 18

8.2.2. Bioensayo 19

8.2.3. Identificación preliminar de metabolitos secundarios 20

9. RESULTADOS 21

9.1. Especies evaluadas 21

9.2. Bioensayo 21

9.3 Pruebas Químicas Preliminares 25

10. DISCUSIÓN 26

10.1. Briófitos 26

10.2. Frutas 32

10.3. Aspectos generales en discusión 33

11. CONCLUSIONES 36

12. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS 37

13. AGRADECIMIENTOS 38

14. BIBLIOGRAFÍA 39

15. ANEXOS 47

Actividad Antibacteriana de Briófitos y Frutas en Colombia (2011)

1



1. RESUMEN

Plantas, humanos y otros animales están constantemente expuestos a variedad de

microorganismos patógenos que traspasan los mecanismos de defensa causando enfermedades

graves en todo el mundo. Varios antibióticos o productos sintéticos contra patógenos pueden

tener efectos secundarios negativos en los organismos y en el medio ambiente y por esto es de

gran importancia buscar mejores alternativas, como el desarrollo de productos naturales

provenientes de plantas. Este estudio evaluó la actividad antibacteriana (Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas auriginosa y Escherichia coli) de los jugos puros filtrados

de frutas comerciales, que son plantas vasculares ya utilizadas como alimento (piña, mora

silvestre, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo, carambolo, níspero, uva Isabela y agraz), y de

extractos etanólicos de briófitos, dos musgos (Sphagnum sp. y Hypnum sp.) y dos hepáticas

(Metzgeria sp. y Trichocolea sp.), a concentraciones de 1, 10 y 100 mg/ml), que son plantas no

vasculares casi inexploradas en el país y con gran potencial económico; todas las muestras están

en proceso de clasificación taxonómica por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana.

Comparando con los antibióticos ampicilina y clindamicina por el método de difusión en agar

(50μl por pozo), los resultados indican que los jugos de frutos rojos (mora silvestre, arándano,

uva Isabella y agraz) presentaron actividad contra todas las bacterias evaluadas, a excepción del

arándano que solo fue activo para S. aureus y destacándose cualitativamente la actividad del jugo

de mora silvestre. Todos los extractos etanólicos de briófitos presentaron actividad contra todas

las bacterias evaluadas en al menos una concentración (10 y/o 100 mg/ml). Este estudio es el

primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos de Colombia, comprueba la actividad

antibacteriana de frutas comúnmente consumidas en el país y muestra su potencial como fuente

de compuestos antibacteriales, abriendo las puertas al uso de la flora colombiana para el futuro

desarrollo de productos con fines terapéuticos contra bacterias patógenas.

PALABRAS CLAVE

Frutas colombianas, musgos, hepáticas, microorganismos, antibacterial, metabolitos secundarios.


2

2. INTRODUCCIÓN

La interacción entre patógenos y los organismos que coloniza (hospederos) es un juego de

fuerzas de acción-reacción en la que ambos se atacan entre sí, tratando de causar el máximo daño

posible y al mismo tiempo reaccionan con diferentes mecanismos de defensa para evitar verse

perjudicados gravemente en dicha interacción. El éxito de los patógenos radica en sus grandes

ventajas evolutivas (alto recambio generacional, adquisición de genes de resistencia y presión

selectiva) (Trenover 2006) que les permite crear resistencias a los antibióticos, causando fuertes

efectos negativos en su salud de los hospederos (plantas, animales y seres humanos). Por esta

razón es importante desarrollar alternativas de defensa, nuevos productos que combatan

patógenos, no causen efectos secundarios en la salud de los hospederos ni contaminación en el

medio ambiente, y se constituyan como productos naturales con más de un beneficio para los

consumidores, especialmente en la prevención de enfermedades. Esta valiosa alternativa busca la

acción sinérgica y el balance natural de los compuestos para que actúe en defensa contra el

ataque de microorganismos patógenos, afectando su crecimiento y evitando su propagación.

Colombia posee gran diversidad de especies vegetales que contienen una amplia variedad de

moléculas con potencial acción biológica (Pérez 1996). Las frutas, plantas ya comercializadas,

han sido ampliamente estudiadas obteniendo actividad para bacterias y hongos, así como

antioxidantes, sobre células tumorales, entre otros (Paupponen-Pimiä et al. 2005a; Arabshahi-

Delouee & Urooj 2007; Ayachi et al. 2009). Colombia presenta diferentes especies y

cultivariedades, que están expuestas a condiciones ambientales especiales y a gran variedad de

patógenos, lo cual les ha conferido ciertas adaptaciones y resistencias; ofreciendo un potencial de

actividad biológica. Así mismo, dentro de la variedad de flora se encuentra el segundo grupo más

grande de plantas (después de las angiospermas) que son los briófitos. Los briófitos están

compuestos por tres categorías, los musgos, hepáticas y antoceros; son plantas ancestrales, no

vasculares con reproducción sexual por esporas, que han logrado colonizar todos los ambientes,

desde bosques húmedos, selvas tropicales y páramos (donde proliferan en mayor medida) hasta

desiertos y zonas árticas. Los briófitos han sido estudiados en la fitoquímica comprobando su

actividad biológica como antimicrobianos, antioxidantes, antitumorales, antidotales, antipiréticos,

diuréticos y antisépticos, para el tratamiento de quemaduras y heridas, entre otras (Asakawa

2007, 2008), que están ligadas a los sistemas de defensa desarrollados a lo largo de millones de


3

años de evolución y selección natural. Los briófitos presentan características especiales como la

ausencia de sistemas vasculares y cutícula (que protegería ante ataques patógenos), gran

capacidad de absorción, descomposición reducida, textura esponjosa (permite la aireación y

desarrollo de raíces de otras plantas), tolerancias a la desecación y al congelamiento y exhiben

variedad de compuestos químicos (terpenoides, flavonoides, bibenzilos, benzenoides,

fenipropanoides, derivados de ácidos grasos y compuestos con S y N) que evitan el ataque de

fitopatógenos e insectos (Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten & Goffinet 2009; Xie & Lou

2009).

Teniendo en cuenta estos dos grupos de plantas (angiospermas y briófitos), éste estudio evaluó la

actividad antibacteriana de los jugos procesados de diez frutas (piña, mora silvestre, arándano,

pera rosada, ají dulce, corozo, carambolo, níspero, uva y agraz) y cuatro extractos etanólicos de

especies de briófitos, dos musgos (Sphangum sp. y Hypnum sp.) y dos hepáticas (Trichocolea sp.

y Metzgeria sp.) sobre cuatro bacterias indicadoras de actividad biológica (Bacillus sutilis,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli) generando un

conocimiento base para la bioprospección de este grupo de plantas.

3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Existe una amplia variedad de especies de microorganismos patógenos para las personas,

animales y plantas que tienen fuertes repercusiones en la salud y el bienestar de los individuos

afectados, causando la muerte de millones de personas en el mundo y afectando la economía de

sectores agroindustriales, aumentando costos, y reduciendo su producción y calidad (Billing

1987; Merrell1 & Falkow 2004). Se han desarrollado numerosos productos químicos sintéticos

(antibióticos y plaguicidas) para el control de microorganismos patógenos, pero éstos pueden

tener efectos negativos en la salud de los individuos (por su uso o exposición) y en el medio

ambiente; así mismo los microorganismos, por su rápido y constante ciclo de vida, tienen gran

capacidad de adaptación a las condiciones ambientales y sustancias nocivas (antibióticos) y por

ello en poco tiempo desarrollan resistencias a los productos comúnmente utilizados, ocasionando

dificultades en el control y exterminación de plagas, aumentando el número de enfermedades

patógenas difíciles de tratar (Haeker 2002; Rawani et al. 2011).


4

Consecuentemente, es importante el desarrollo de nuevos productos que controlen o inhiban el

crecimiento de los microorganismos (Tenover 2006). Los productos 100% naturales

desarrollados a partir de especies de plantas, son una buena alternativa para el control de

patógenos dado que son amigables con el medio ambiente, no tienen efectos secundarios sobre la

salud de las personas y presentan una mayor gama de compuestos que actúan balanceada y

sinérgicamente como sucede normalmente en la naturaleza (Liu 2004). Por lo tanto, es necesario

realizar estudios de la actividad biológica de especies de plantas con potencial actividad

antimicrobiana, explorando dentro de la amplia gama de posibilidades que brinda la diversidad de

especies vegetales de Colombia.

4. JUSTIFICACIÓN

Diversas enfermedades infecciosas causan la muerte de las personas así como de otros seres

vivos y a pesar de desarrollar productos que combatan éstos patógenos, se crean variedades

resistentes a los fármacos utilizados volviéndose menos susceptibles a ellos, ocasionando

dificultades en su control y exterminación y aumentando el número de enfermedades patógenas

difíciles de tratar (Haeker 2002). La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce la

importancia que tiene la medicina tradicional a partir de plantas, así como el uso y aplicación de

tecnologías para la búsqueda de productos naturales que contribuyan a la lucha contra

enfermedades infecciosas (Shrikumar & Ravi 2007) y en este aspecto, los estudios fitoquímicos

pueden revelar especies de plantas con potencial actividad antimicrobiana. Consecuentemente, el

desarrollo de productos naturales a partir de la gran biodiversidad colombiana brinda un

sinnúmero de posibilidades para el hallazgo y desarrollo de nuevos compuestos y productos

bioactivos.

Los productos naturales presentan ventajas frente a compuestos sintéticos dado que no contienen

ingredientes sintéticos que pueden afectar el organismo, pueden actuar en el organismo de forma

preventiva y/o curativa para más de una afección; así mismo pueden ser productidos de manera

sostenible mediante el desarrollo de técnicas biotecnológicas, disminuyen los procesos de

contaminación por la utilización pesticidas artificiales que afectan negativamente el medio

ambiente, y sus compuestos químicos o metabolitos secundarios presentan la actividad sinérgica

natural, es decir, actúan en conjunto como realmente sucede en la naturaleza y se encuentran en

la combinación balanceada para tener efectos en los patógenos sin causar daño al organismo (Liu


5

2004; Serrano et al. 2006; Walton & Brown 1999); por esto, la evaluación de las fracciones

totales y jugos puros de las especies, puede representar de mejor manera su potencial de

actividad, realizándose en menor tiempo y de manera más sencilla.

Fitoquímicamente en nuestro planeta solo se ha estudiado una pequeña porción de la flora y otros

pocos han sido estudiados en su actividad biológica; así mismo, una sola planta puede presentar

miles de metabolitos secundarios diferentes que pueden ser de gran importancia para el desarrollo

de productos naturales que combatan muchas enfermedades en el mundo (Hostettmann et al.

2008) y, teniendo en cuenta que Colombia es un país megadiverso en especies de plantas, tanto

vasculares como no vasculares, se exhibe una amplia gama de estructuras y sustancias novedosas

que se constituyen como un gran potencial a estudiar, en especial porque el país presenta

condiciones ambientales diferentes y cambiantes en las diferentes regiones, lo cual puede

significar una mayor variedad de compuestos con potencial actividad biológica; por consiguiente,

es importante evaluar las especies vegetales del país en cuanto a su composición química y

actividad biológica (Hostettmann et al. 2008).

De esta manera, entre toda la riqueza de especies vegetales, encontramos especies de interés

económico como las frutas que son ya utilizadas como productos alimenticios, así como

presentamos a los briofitos (musgos y hepáticas) que es un grupo de plantas no vasculares

prácticamente inexploradas a nivel fitoquímico en el país y que presentan gran potencial

económico y aplicación en diversos usos industriales como en farmacología y medicina (Glime

2007). Por ello, éste trabajo busca evaluar la actividad antibacteriana de especies de frutas y

briófitos sobre microorganismos patógenos e indicadores de actividad biológica para un futuro

desarrollo de productos naturales que combatan la acción de los patógenos y evite o disminuya el

efecto que tienen en la salud de los individuos afectados.

5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál es la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de cuatro especies de briófitos y

de los jugos de diez frutas?


6

6. OBJETIVOS

6.1. GENERAL

Evaluar la actividad antibacteriana de cuatro extractos etanólicos de briófitos (musgos y

hepáticas) y de diez jugos de frutas comerciales contra cuatro bacterias patógenas.

6.2. ESPECÍFICOS

- Evaluar la actividad antibacterial de los extractos etanólicos de dos musgos (Sphagnum sp. y

Hypnum sp.) y dos hepáticas (Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) sobre el crecimiento de

B.subtilis, S. aureus, P. aeruginosa y E. coli.

- Evaluar la actividad antibacterial de los jugos de diez frutas (piña, mora silvestre, arándano,

pera rosada, ají, corozo, carambolo, níspero, agraz y uva) de interés comercial sobre el

crecimiento de B.subtilis, S. aureus, P. aeruginosa y E. coli.

- Identificar preliminarmente las familias de metabolitos secundarios presentes en las

sustancias o extractos con actividad antibacteriana.

7. MARCO TEÓRICO

7.1. Marco conceptual

7.1.1. Interacción Patógeno-Hospedero

Los organismos están expuestos a factores abióticos (i.e. luz, temperatura, humedad) que generan

condiciones de estrés y a factores bióticos como microorganismos patógenos (bacterias, hongos,

virus) que ocasionan enfermedades infecciosas a plantas, animales y seres humanos (hospederos)

(Martínez et al. 2000). Las enfermedades infecciosas en las plantas causan alteraciones en su

desarrollo normal dado que afectan sus funciones vitales, generando necrosis, atrofiamientos,

malformaciones y otras afecciones que pueden dar lugar a la muerte de toda la planta (Martínez

et al. 2000). Así mismo, los animales y seres humanos pueden verse gravemente afectados por

enfermedades dadas por microorganismos, afectando la función normal de los tejidos, órganos o

en general del organismo al que ataque, causando la muerte de muchas personas en el mundo

(Botero & Resterpo 2003; Mandell et al. 2006). Patógenos y hospederos están en constante


7

interacción, en un juego de acción-reacción donde cada uno busca su propio beneficio,

manteniendo y creando nuevas estrategias para defenderse y atacar al oponente.

La interacción comienza con el ataque del patógeno al hospedero (de manera sutil causando

enfermedades crónicas, o de forma agresiva y frontal usando toxinas o proteínas efectoras)

(Merrell & Faikow 2004). Los microorganismos poseen estrategias para disminuir o suprimir los

mecanismos de defensa de los hospederos (factores de virulencia, adhesinas en la superficie de

las células, secreción de toxinas) logrando parasitarlo (Abramovitch & Martin 2004; Peschel

2002). Por su parte, los hospederos se defienden por medio de su sistema inmune innato y

adaptativo y, por la acción de factores de reconocimiento de cuerpos extraños potencialmente

dañinos (i.e. proteínas de unión, péptidos, defensinas, células T) (Hoffmann et al. 1999), así

como complementando la defensa con la acción de antibióticos o productos químicos sintéticos,

que pueden ser incluso perjudiciales para sí mismos (Liu 2004).

Los patógenos reaccionan ante este ataque gracias a sus grandes ventajas evolutivas (alto

recambio generacional, adquisición de genes de resistencia y presión selectiva) (Trenover 2006),

evitando la respuesta inmune de los hospederos (i.e. por inducción o inhibición de la apoptosis o

citotoxicidad, inhibición de la producción de citoquininas o su sobreproducción, evasión de

anticuerpos, inhibición de la preservación del antígeno o de la fagocitosis) (Merrell & Faikow

2004) y creando resistencias a los antibióticos, ya sea con factores anatómicos como la formación

de biopelículas (Stewart & Costerton 2001) o por mecanismos bioquímicos (inactivación

enzimática del agente animicrobiano, modificación de su sitio de unión reduciendo su afinidad o

alteración de la permeabilidad de las barreras y canales de proteínas de la célula) (Tenover 2006;

Chanda et al 2010), volviendo a atacar a los hospederos y llegando a causar fuertes efectos

negativos en su salud.

Por esto, los seres humanos requieren desarrollar nuevos productos que combatan patógenos; la

exploración de nuevos compuestos de origen vegetal puede contribuir al desarrollo de productos

naturales, de manera que no presenten efectos secundarios perjudiciales para los organismos y sí

inhiban el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. Así mismo, pueden

desarrollarse a partir de los diferentes órganos y estructuras de las plantas (hojas, tallos, frutos y

semillas), productos como alimentos funcionales brindando propiedades curativas de

enfermedades infecciosas, ofreciendo un valor nutricional y proporcionando otro tipo de efectos


8

en el cuerpo como antioxidantes o anticancerígenos, actuando benéficamente y potencializándose

en los organismos que las consumen (Serrano et al. 2006).

7.1.2. Fitoquímica

Para el desarrollo de productos con actividad biológica, la fitoquímica es el área encargada de

estudiar los metabolitos secundarios (MS) extraídos de plantas. Los MS son compuestos

químicos producto del metabolismo secundario de las plantas que varía entre categorías

taxonómicas brindado singularidad a cada especie y, aunque no tienen una función esencial en la

planta, están relacionados con aspectos como sistemas de defensa y reproducción de las especies

(Asakawa 2007; Sanabria 1983).

Los estudios en fitoquímica son extensos dado que es un proceso compuesto por varios pasos

(extracción, fraccionamiento, identificación, dilucidación molecular de los compuestos activos,

pruebas biológicas, clínicas y de toxicidad) que permiten obtener un producto desarrollado y

certificado para la actividad estudiada. Por ello es importante realizar pruebas preliminares y un

screening de varias especies, de manera que este tipo de estudios sirvan como base para la

selección de las especies más prometedoras y dilucidar su potencial de actividad y desarrollarla

posteriormente hasta finalmente ofrecer un producto certificado, habiendo comprobado

científicamente su actividad y realizando ensayos clínicos que permitan tener la certeza de la

confiabilidad, rendimiento y eficacia del producto.

7.1.3. Especies vegetales

La diversidad de especies vegetales en el mundo ofrece una amplia gama de compuestos con

actividad biológica a partir de los cuales se pueden generar productos naturales de uso terapéutico

contra enfermedades. Dichos compuestos son producto de millones de años de selección natural y

por ello naturalmente están perfectamente balanceados de manera que ha resultado ser la

combinación más exitosa evolutivamente, utilizada contra el estrés abiótico y biótico (como

sistema de defensa contra patógenos), así como pueden presentar una acción sinérgica en la que

participan varios compuestos en conjunto, en una o varias actividades (Liu 2004; Xie & Lou

2009).


9

Entre la diversidad de plantas en el mundo, se encuentran los dos grupos más grandes: las

angiospermas (25.000 a 35.000 especies) (Craine et al. 2000; Stevens 2001) y los briófitos (de

14000 a 15000 especies) que se clasifican musgos (8000 especies), hepáticas (6000 especies) y

antoceros (200-300 especies) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Asakawa 2011). Las angiospermas

son plantas vasculares, con flores y frutos, utilizadas comúnmente como alimenticias y

extensamente conocidas en todo el mundo, encontrando gran diversidad de especies en los

trópicos (Pérez 1996). Los briófitos, son plantas no vasculares, poseen esporas como forma de

reproducción sexual y son escasamente conocidas en pocos países respecto a su potencial de unos

económicos. Se observa frecuentemente que animales, insectos y microorganismos patógenos

como las bacterias afectan más a ciertos grupos de angiospermas que a los briófitos quienes rara

vez presentan este tipo de afecciones (Chun & Hong 2009; Sabovljević et al. 2011; Asakawa

2007), a pesar de no poseer barreras anatómicas de defensa como cutícula o espinas (presentes en

angiospermas) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Schaefer & Zrÿd 2001). Por esto se piensa que los

briófitos a lo largo de su evolución han alcanzado un metabolismo químico complejo especial

como fuerte sistema de defensa ante patógenos (Xie & Lou 2009).

7.1.3.1. Briófitos

Los briófitos son un grupo ancestral y cosmopolita (habitan desde zonas boscosas y húmedas,

hasta desiertos y zonas árticas) (Hallingbäck & Hodgetts 2000; Schaefer & Zrÿd 2001), de gran

importancia a nivel ecológico dado que cumplen roles fundamentales en los ecosistemas como

por ejemplo en la regulación del ciclo hídrico, del carbono y de los nutrientes, generan

microclimas, evitan procesos de erosión, participan en la renovación del dosel y en la sucesión,

son sustrato de epífitas y variedad de organismos y son bioindicadoras del estado del medio

ambiente y contaminación (Cornelissen et al. 2007; Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten &

Goffinet 2009).

Así mismo, los briófitos presentan características especiales como gran capacidad de absorción

(especies que absorben hasta tres veces su peso en agua), descomposición reducida, textura

esponjosa (permite la aireación y desarrollo de raíces de otras plantas), tolerancias a la desecación

y al congelamiento y exhiben variedad de compuestos químicos (terpenoides, flavonoides,

bibenzilos, benzenoides, fenipropanoides, derivados de ácidos grasos y compuestos con S y N)

que evitan el ataque de fitopatógenos e insectos (Goffinet & Shaw 2009; Vanderpoorten &


10

Goffinet 2009; Xie and Lou 2009). Existen diferencias de compuestos entre grupos de briófitos;

por ejemplo, los musgos presentan mono y biflavonoides (Veljić et al. 2009) mientras que las

hepáticas presentan principalmente aceites o cuerpos aceitosos como mono, sesqui y

diterpenoirdes lipofílicos, compuestos aromáticos (bibenziles, bis-bibenziles, benzoatos,

cinamatos, fenoles de cadena larga, naftalenos, fatalidos e isocumaricas) y acetogeninas,

responsables de diferentes actividades biológicas y propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu

et al. 2006; Asakawa 2007), todos ellos relacionados con actividades biológicas.

7.1.3.2. Angiospermas

Las angiospermas o plantas vasculares presentan estructuras especiales para la reproducción

sexual como flores y frutos con semillas al interior que generan nuevos organismos al encontrar

las condiciones adecuadas para germinar. Las plantas contienen metabolitos secundarios que

varían en composición y cantidad en los diferentes órganos de la planta (Martínez et al. 2000) y

así mismo presentan diferentes compuestos de interés alimenticio como vitaminas, minerales y

fibras necesarias e importantes en la nutrición, que en conjunto brindan efectos benéficos para los

organismos que las consumen; y por esto la FAO recomienda altas dosis de frutas en la dieta

diaria de las personas, participando en la prevención de enfermedades del corazón, diabetes o

cáncer (Matthews 2006). Por su parte, una de las formas de consumir las frutas es en jugos los

cuales presentan vitaminas, minerales y otros componentes nutritivos; la forma de preparación de

los jugos es a partir de plantas frescas y se procesan triturando el fruto y filtrándolo con una tela o

lienzo (Fonnegra & Jiménez 2006) y de esta manera es posible obtener la totalidad de los

nutrientes presentes en las diferentes frutas.

Entre las diferentes frutas evaluadas se encuentran las bayas (mora, arándano, uva y agraz), las

cuales presentan coloraciones de rojos a violetas, morados y azules oscuros, dados por las

antocianinas (glicósidos de antocianinas), que son el grupo de flavonoides más predominante en

las bayas y tienen la función de absorber en gran medida la luz visible protegiendo al interior del

fruto de radiaciones lumínicas fuertes y evitar su oxidación; a demás de las antocianinas, las

bayas presentan flavonoles, que al ser producto del estímulo lumínico, se acumulan comúnmente

en las superficies externas como la piel (Puupponen-Pimiä et al. 2005b) y por ello varios estudios

muestran que las pieles de bayas poseen alta actividad antimicrobiana (Burdulis et al. 2009;

Puupponen-Pimiä et al. 2005a).


11

Otros compuestos típicamente presentes en las bayas y que están relacionados con la defensa

contra patógenos en la naturaleza son algunos como el complejo de polímeros fenólicos, ácidos

fenólicos, taninos (como las proantocianinas que confieren su sabor amargo) u otros polímeros de

fenoles como los elagitaninos, que pueden actuar como nuevos tipos de antimicrobianos sobre un

amplio rango de microorganismos y superar las resistencias que presenten (Puupponen-Pimiä et

al. 2001, 2005a, 2005b; Nohynek et al. 2006). De esta manera, conociendo la gran variedad de

compuestos químicos presentes en las bayas, los efectos inhibitorios de estas frutas pueden ser

producto de un efecto sinérgico de varios compuestos, en especial del grupo de fenoles, ya sean

solos o combinados con otros compuestos activos (Puupponen-Pimiä et al. 2001) y por ello, la

evaluación de la actividad de jugos evidencia una fuerte actividad con un método más sencillo y

de bajo costo, que puede tener aplicaciones más directas y asequibles para las personas.

7.2. Antecedentes

7.2.1. Microorganismos patógenos

El efecto del los microorganismos patógenos sobre las personas es una problemática importante

dado que afecta su salud produciendo diversas enfermedades infecciosas, así como afecta

fuertemente la economía porque ocasiona pérdidas significativas en cultivos de plantas utilizadas

para el consumo, que deben estar en óptimas condiciones para su comercialización.

No obstante, una parte de los microorganismos son inofensivos e incluso pueden presentar

relaciones benéficas con sus hospederos (i.e. flora intestinal) mientras que en la otra parte de

existe gran variedad de microorganismos que y que al tener la capacidad de dispersarse en el

medio ambiente alcanzan a colonizar los organismos, generando enfermedades epidémicas

(Collins & Lyne 2006) y por ello, el desarrollo de productos contra enfermedades infecciosas es

de gran importancia y son requeridos compuestos con amplio rango de acción sobre la variedad

de microorganismos.

En la naturaleza se encuentran gran cantidad de compuestos químicos generados por el

metabolismo secundario de las plantas, que están relacionados con la defensa ante dichos

patógenos; por ello las plantas brindan potenciales actividades antimicrobianas que pueden

utilizarse para el desarrollo de productos que contribuyan a contrarestar la acción de los

patógenos o a eliminarlos evitando su establecimiento y efectos negativos en los hospederos. Para


12

encontrar especies promisorias para estos fines, la bioprospección de plantas es de gran

importancia y permite seleccionar especies con potencial de actividad.

Teniendo en cuenta que la bioprospección de las plantas y el estudio fitoquímico completo de los

MS y de actividades biológicas, pueden significar años de arduo trabajo para obtener un producto

desarrollado y certificado para la actividad estudiada mediante su uso sostenible, es importante

seleccionar muy bien las especies de interés realizando pruebas preliminares que permitan

obtener una aproximación al conocimiento de la especie, brindando los argumentos necesarios

para estudiarla y comenzar todo un proceso investigativo sobre ella. Así mismo, en el caso

particular de los briófitos, estudiando y dando a conocer el potencial de aplicación y utilidad

económica de musgos y hepáticas, se fortalece su importancia ya no solo ecológica sino también

económica, confiriéndoles mayor interés en planes de conservación de las especies y en

investigación para su exploración biotecnológica para el desarrollo de técnicas de propagación ex

situ y para uso sostenible.

7.2.2. Briófitos

Basándose en la observación de la naturaleza y de los eventos que ocurren en ella, se puede

obtener información clave para el planteamiento de hipótesis y selección de especies a evaluar.

Observaciones constantes en campo muestran que los briófitos rara vez son atacados por

microorganismos patógenos a pesar de que anatómicamente carecen de cutícula (estructura que

protege a las plantas vasculares contra la acción de agentes externos), así como tampoco son

afectados por insectos, caracoles, babosas y otros animales pequeños (Sabovljević et al. 2011;

Asakawa 2007). A partir de esto podría pensarse que los briófitos poseen otros sistemas de

defensa como un metabolismo químico complejo con sustancias tóxicas y metabolitos

secundarios que les permite evitar el ataque de patógenos y animales pequeños (Xie & Lou

2009).

Efectivamente, estudios demuestran que los musgos y hepáticas son una fuente rica de

metabolitos secundarios (MS) (Xie & Lou 2009), que están ligadas a los sistemas de defensa

desarrollados a lo largo de millones de años de evolución y selección natural, presentando

actividad sinérgica entre sus componentes químicos, con un balance natural (Liu 2004). Se han

realizado diversos estudios del metabolismo químico de los briófitos y sus compuestos,


13

encontrando fenoles, terpenoides, alcaloides y otras toxinas importantes en la defensa contra

patógenos (Asakawa 2001; Zinsmeister et al. 1991); musgos y hepáticas poseen gran variedad de

compuestos químicos con actividad biológica, como bencenoides, derivados de ácidos grasos,

flavonoides y terpenoides, que son los principales con actividad antimicrobiana, así como se han

encontrado nuevos compuestos para la ciencia, especialmente en las hepáticas (Xiaowei 2007;

Asakawa 2007; Sabovljević & Sabovljević 2008; Sabovljević et al. 2011). Por esto, es importante

realizar una exploración de varias especies para encontrar compuestos potentes, no tóxicos y de

amplio espectro como fuente de antibióticos, así como nuevos compuestos aún no descritos

(Sabovlević & Sabovlević 2008).

En la medicina tradicional de varios países, los briófitos han sido utilizados en el tratamiento de

enfermedades del hígado, corazón, para problemas digestivos, enfermedades pulmonares,

problemas de piel, inflamación y fiebre, así como también durante las guerras como vendajes y

manera de gasas y algodón, dadas sus características (capacidad de absorción y acción

antimicrobiana), por lo que aún hay actividades biológicas y aplicaciones no comprobadas

científicamente (Glime 2007; Asakawa 2008). Se han estudiado algunas especies, comprobando

su actividad biológica como antimicrobianos, antioxidantes, antitumorales, antidotales,

antipiréticos, diuréticos y antisépticos, para el tratamiento de quemaduras y heridas, entre otros

(Asakawa 2007, 2008). Actualmente, el estudio de los musgos hepáticas y antoceros sigue siendo

un campo de estudio prometedor, en especial en la medicina hacia la búsqueda de compuestos

activos para el desarrollo de fármacos, así como de nuevos compuestos para la ciencia, como

especialmente se han descubierto en las hepáticas (Sabovljević & Sabovljević 2008; Sabovljević

et al. 2011).

A pesar de su gran potencial, la investigación básica en fitoquímica y aplicación biotecnológica

de los briófitos no ha sido tan desarrollada como en las angiospermas (de las cuales se tiene un

amplio conocimiento de la composición química y actividad de varias especies) dado que son

organismos considerados difíciles de estudiar e identificar (por su tamaño y estructuras) y de

limitada obtención en cantidades considerables, dado que presentan baja tasa de crecimiento y su

colecta masiva podría crear problemas de conservación para estas especies tan importantes a

nivel ecológico (Glime 2007; Sabovljević et al.2011; Savaroglu et al. 2011). No obstante, hace

varios años se han desarrollado estudios en varios países; particularmente en Alemania, donde se


14

han utilizado técnicas biotecnológicas para la producción de briófitos en condiciones artificiales o

Briotecnología (como es llamado) y para ello se han desarrollado centros internacionales de

producción masiva de briófitos como The International Moss Stock Center (http://www.moss-

stock-center.org) y Greenovation (http://www.greenovation.com) donde enfocan sus

investigaciones principalmente en Physcomitrella patens. Este musgo es productor de insulina y

es utilizado como modelo biológico, principalmente en estudios moleculares dado que su genoma

completo ha sido secuenciado (Beike et al. 2010). Esto no solo demuestra el gran potencial de los

briófitos sino también que es posible su producción a escala industrial, por medio de cultivos in

vitro y en bioreactores alcanzando una producción masiva con alta eficiencia y en condiciones

asépticas, necesarias en la obtención de proteínas humanas (Decker & Reski 2004; Hohe & Reski

2005).

Particularmente en Colombia, el estudio de los briófitos se ha enfocado más hacia su taxonomía y

ecología, que a su utilización económica aunque existen unos pocos estudios de actividad

biológica. Morantes et al. (2007) evaluaron la actividad de Politrichum juniperinum para Bacillus

subtilis, Micrococus luteus, Escherichia coli, Salmonela sp y Candida albicans, pero esta especie

no presentó actividad para ninguno de los microorganismos, aunque sí se obtuvieron resultados

positivos para las actividades citotóxica y de acción sobre el SNC (mediante el test de Irwin).

Adicionalmente, López et al. (2007) observó actividad antioxidante para Sphagnum sp.,

Leptodontium luteum y Dicranum frigidum, destacándose la actividad de Sphagnum sp. por los

tres métodos evaluados (DPPH, ABTS y FRAP) y por último, Pereañez et al. 2010 encontró

actividad contra el veneno de cobra para la mayoría de las especies evaluadas (Breutelia chysea,

Dicranum frigidum, Leptodontium luteum, Sphagnum recurvum, Sphagnum sp. y Thuidium

peruvianum).

A demás de estos estudios, no se encontraron más investigaciones en fitoquímica de briófitos en

Colombia. Es importante investigar este tipo de plantas en el país, así como de otros grupos como

los líquenes y las algas (que han sido un poco más estudiadas), en especial con las especies de

Colombia dado que se encuentra gran variedad de ambientes, algunos con condiciones

ambientales cambiantes como los ecosistemas de páramo, donde los organismos están adaptados

a estrés biótico y abiótico, y han logrando colonizar, establecerse y proliferar en él exitosamente.

De igual forma, tanto en Colombia como en otros países, el conocimiento de los musgos y


15

hepáticas y sus posibles actividades biológicas sigue siendo insuficiente y, dado que son el

segundo grupo más grande de plantas y presentan una amplia gama de compuestos químicos

producto de la evolución contra factores de estrés biótico y abiótico, queda un gran camino por

recorrer en la búsqueda de compuestos activos y nuevos para la ciencia en este grupo de plantas

(Veljić et al. 2009).

Así mismo, es importante estudiar otro tipo de actividades dado que en diferentes especies de

hepáticas se ha obtenido resultados muy prometedores con características como olores

característicos, sabores (picante y amargo) y en actividades como dermatitis alérgica de contacto,

citotóxica, anti-VIH, inhibidor de la polimerasa del ADN, antifúngica, antialimentaria de

insectos, nematicida, antioxidante, neurotrófica, inhibidora del crecimiento de plantas, como

relajante muscular, contra la obesidad, así como pueden presentar sustancias alelopáticas que

inhiben el establecimiento y crecimiento de otras plantas, entre otros (Asakawa 2011; Michel et

al. 2011).

7.2.3. Angiospermas

Especies de angiospermas en todo el mundo son comúnmente conocidas como alimenticias, en

especial sus frutos y semillas, así como también han sido utilizadas como plantas medicinales

para el tratamiento o prevención de enfermedades (Martínez et al. 2000). Las angiospermas de

Colombia tradicionalmente se han usado como ornamentales, medicinales, alimenticias, para la

elaboración de artesanías por sus fibras y colorantes, entre otros (Pérez 1996; Linares et al.

2008). En la medicina tradicional, las plantas son procesadas de manera sencilla utilizando por

ejemplo infusiones, compresas, ungüentos, macerados, en polvo, jugos y jarabes, entre otros

(Fonnegra & Jiménez 2007), para obtener determinado efecto sobre la enfermedad padecida; no

obstante, es importante comprobar y validar el uso de las plantas, para que sea estable y seguro,

corroborando la ausencia de efectos tóxicos en los organismos que las consumen (Martínez et al.

2000).

Las plantas vasculares son de los grupos más estudiados en fitoquímica encontrando una amplia

variedad de compuestos (i.e. alcaloides, almidones y derivados, compuestos analgésicos,

compuestos aromáticos, saponinas, flavonoides) con actividades biológicas contra plagas de

microorganismos, insectos y malezas, contra enfermedades humanas desarrollándose fármacos o


16

productos naturales en medicina naturista y homeopática, que han sido de gran utilidad para el

mundo (Pérez 1996; Gupta 2008). No obstante, varias especies no han sido estudiadas y

presentan un alto potencial de uso terapéutico y aún más teniendo en cuenta la variedad de

ambientes de Colombia, varias especies de angiospermas, cuyos frutos son utilizados como

alimento tradicionalmente en ciertas comunidades y regiones, estudiando otras aplicaciones

económicas y actividades biológicas, se puede ofrecer un valor agregado a las frutas,

presentándose por ejemplo como alimentos funcionales.

La actividad biológica de las plantas puede no ser dado por un solo compuesto sino por la acción

conjunta de varios de ellos; los cuales varían en calidad y cantidad dependiendo del órgano que

se analice (fruto, semilla, hoja, rallo, raíz), de su estado fenológico y del ambiente en el que se

desarrolle (Martínez et al. 2000; Liu 2004). Por ello, varias especies de frutas de Colombia,

aunque no sean nativas, pueden presentar variaciones en sus componentes y actividades

biológicas dado que son cultivadas en las condiciones ambientales del país siento especies

domesticadas y convirtiéndose en variedades criollas o especies muy adaptadas a dichos

ambientes (Martínez et al. 2000).

Dentro de las especies de frutas evaluadas, particularmente, las bayas han sido ampliamente

estudiadas encontrando actividad mutagénica, antitrombótica, antioxidante, antiinflamatoria y en

la prevención del cáncer; así mismo, han sido exploradas en su composición química dado que

presentan un especial interés como fuente de compuestos antimicrobianos observando actividad

para infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, en el control de patógenos humanos y en la

antiadhesión en el proceso de enfermedades microbianas (Puupponen-Pimiä et al. 2005b).

8. MATERIALES Y MÉTODOS

8.1. Obtención y preparación de muestras y extractos

8.1.2. Briófitos

Los briófitos (Ver Tabla 8 en anexos) fueron seleccionados por los criterios de abundancia y por

observaciones en campo, dado que estas plantas no se observan con infecciones producidas por

patógenos por lo que puede indicar un metabolismo químico complejo con metabolitos

secundarios relacionados con la defensa y protección contra microorganismos y por ello pueden


17

ser fuente de compuestos antimicrobianos (Glime 2007). Así mismo, en una revisión más

detallada de estudios realizados con especies relacionadas filogenéticamente indica que pueden

tener mayor potencial de actividad biológica, como criterio quimiotaxonómico (Hostettmann et

al. 2008).

Las muestras fueron colectadas en el municipio de La Calera, específicamente en la vereda

Buenos Aires Alto, finca La Huerta a una altitud de 2585msnm. El lugar de colecta presenta un

ecosistema de subpáramo con características ambientales favorables (humedad y temperatura)

para una alta diversidad de briófitos. Se tomaron los datos de colecta (lugar, fecha, sustrato) en la

libreta de campo para su posterior identificación, las muestras se secaron durante cuatro días a

temperatura ambiente (para eliminar el contenido de humedad) y bajo luz moderada (para evitar

la degradación de metabolitos termolábiles). Se tomaron pequeñas muestras de cada especie para

tomar los pesos frescos y secos (Tabla 4) y para la identificación taxonómica y almacenamiento

en el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana (HPUJ).

Los briófitos fueron limpiados, eliminando los excesos de tierra y de otras plantas y se trituraron

manualmente. Para la extracción total de los compuestos químicos presentes, los briófitos fueron

puestos en maceración en etanol al 96% durante dos semanas; posteriormente, se retiró el

solvente en un rotaevaporador BÜCHI a 175mbar/hPa de presión y a una temperatura de 40°C

para evitar la pérdida de compuestos termolábiles y se concentró hasta el punto de viscosidad de

jarabe o la tercera parte de su volumen inicial, en una campana de vacío y finalmente se pesaron

los extractos para calcular el porcentaje de rendimiento de extracción de cada muestra (Tabla 4)

(Bilbao 1997).

8.1.2. Frutas

Las frutas fueron obtenidas de diferentes regiones de Colombia (Ver Tabla 8 en anexos), de

lugares o fincas productoras de frutas dado que se evaluaron especies comerciales, a excepción de

la mora silvestre, la cual fue colectada en el mismo lugar que los briófitos. Todas las muestras se

encuentran en proceso de identificación por especialistas del HPUJ (Herbario de la Pontificia

Universidad Javeriana).

Las muestras fueron almacenadas en un congelador a -70°C hasta su procesamiento; cada fruta

fue triturada con un triturador de astas y posteriormente fue filtrada con tela de algodón y con


18

filtros de papel y luego centrifugada por 10 min a 3000 rpm para obtener el jugo puro y filtrado

de cada fruta.

Por otra parte, con el fin de estimar la concentración evaluada de los jugos se calcularon los

sólidos totales. La metodología del cálculo de sólidos fue realizada en base a los métodos

oficiales de AOAC 922.10, para frutas y productos de frutas, el cual consistió en agregar

aproximadamente 1g de cada jugo a un crisol vacío y previamente secado en una cámara de

vacío, luego dejarlo secar en el horno durante cuatro horas a 95°C, se deja enfriar en el desecador

y luego se pesó el crisol con el jugo seco, obteniendo así los valores del peso del jugo, peso del

jugo seco (sin el contenido de humedad) que corresponde a los sólidos totales, el porcentaje de

humedad y m/m (cantidad de líquido y de solutos respectivamente, en relación con la cantidad de

jugo inicial); así mismo, para cada jugo se determinó su densidad por medio de un picnómetro de

5ml y posteriormente, con estos resultados se estimó la concentración evaluada en los pozos para

cada fruta, teniendo en cuenta que a cada pozo se le agregaron 50μl (0.05ml) (Cunniff 1998) (Ver

Tabla 9 en anexos).

8.2. Evaluación antibacteriana

8.2.1. Preparación de materiales y cepas

Las bacterias utilizadas como modelo para evaluar la actividad antibacteriana (Tabla 1) se

obtuvieron del Cepario de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana (CMPUJ) y

fueron escogidas en base al boletín de información técnica de los estándares globales de las

farmacopeas estadounidense, japonesa y europea para productos tropicales, en donde especifica

las bacterias utilizadas como indicadores de la actividad antimicrobiana (BioScreen Testing

2007). Se evaluaron a Bacillus subtilis (se recomienda de manera opcional), Staphylococcus

aureus, Pseudomonas auriginosa y Escherichia coli, cada una con sus códigos del cepario de

procedencia y sus ATCC (American Type Culture Collection).

Tabla 1. Bacterias evaluadas

Bacteria ATCC CMPUJ Tinción Infecciones Hospederos

Bacillus subtilis 6633 75 Gram-

positiva

Alimenticios Plantas

Staphylococcus

aureus

6538 80 Gram-

positiva

Cutáneas, mucosas y de riesgo

vital

Animales

Pseudomonas 9721 55 Gram- Tracto pulmonar, urinario, Plantas,


19

aeruginosa negativa tejidos, heridas animales

Escherichia coli 8739 76 Gram-

negativa

Intestinales y

gastrointestinales

Animales

Los extractos etanólicos de briófitos fueron diluidos en DMSO (Dimetil sulfóxido) puro (dado

que no fueron solubles en agua) ajustándolos a concentraciones de 1, 10 y 100 mg/ml mientras

que, dado que se evaluaron los jugos puros filtrados y centrifugados, , en estado acuoso, se utilizó

como control negativo el agua. Cada muestra a evaluar (briófitos y frutas) fue introducida en

tubos Ependorf (uno para cada bacteria) y se prepararon los materiales por separado para cada

bacteria para evitar contaminación.

8.2.2. Bioensayo

Se evaluaron jugos puros filtrados de frutas y extractos totales de briófitos a diferentes

concentraciones poniendo a prueba su actividad contra cuatro bacterias patógenas (Figura 1). En

tubos de vidrio estériles se agregó 5ml de caldo nutritivo, se sembró en cada uno y por separado

las cuatro bacterias y se dejaron crecer en una incubadora a 35°C durante 24 horas; luego se

realizó otro repique en otro tubo con caldo nutritivo, se puso a incubar en las mismas condiciones

durante 6 horas con el fin de alcanzar su fase exponencial (Cona 2002) y luego se realizó la

prueba de turbidez o de Mc Farland, ajustando con solución salina, cada caldo con bacteria al

patrón de 0.5 de Mcfarland que equivale a 3x108 UFC/ml (McFarland 1907).

Se utilizó la metodología de difusión en pozo para la cual se hicieron pozos de 0.5cm de diámetro

con la ayuda de pipetas pasteur de vidrio estériles. Se utilizó Agar Müller-Hinton agregando 25ml

de medio a cada caja de petri y 0.5ml de caldo nutritivo con bacteria a la concentración de 0.5 de

Mc Farland, anteriormente preparado. Se dejaron solidificar los medios y luego se hicieron los

pozos en cada caja de petri en los cuales se agregaron 50μl de cada extracto, del control positivo

(DMSO para briófitos y agua destilada desionizada para frutas) y del control negativo (ampicilina

a 200 mg/ml y clindamicina a 150 mg/ml). Se realizaron mediciones cada 12 horas hasta las 48h

obteniendo los diámetros de los halos de inhibición de los extractos y controles, y se llevó un

registro fotográfico de cada uno.


20

Figura 1. Diseño experimental de la Prueba Antibacteriana

Se realizaron tres bioensayos como se muestra en la Figura 2. En cada uno se evaluaron varias

especies con el fin de hacer un tamizaje evaluando su capacidad antibacteriana y seleccionando

las especies activas, volviendo a probarlas en el siguiente bioensayo, hasta finalmente realizar de

nuevo un experimento en el que se evaluaron todas las especies que presentaron actividad en

todas las pruebas.


21

Figura 2. Evaluación de la actividad antibacteriana de las especies haciendo un tamizaje de los

jugos de frutas con actividad (Especies activas aparecen en negrilla).

8.2.3. Identificación preliminar de metabolitos secundarios

Se realizaron pruebas químicas preliminares (Tablas 2 y 3) por el método de Wall y

colaboradores (1952) y basándose en Bilbao 1997, a los extractos y jugos que presentaron

actividad antibacteriana, para la obtención preliminar de las principales familias de metabolitos

secundarios.

Tabla 2. Pruebas químicas preliminares para compuestos disueltos en solvente de baja polaridad.

Prueba Compuestos Reacción

Lieberman Buchard Esteroides y esteroles Cambio de color (Rosa, violeta, azúl, verde)

Salkowski Terpenos Cambio de color (Amarillo-rojo)

Baljet Terpenos y esteroles Cambio de color (Amarillo)

Hidroxamato férrico Sesquiterpenolactonas Cambio de color (Café o violeta)

Tabla 3. Pruebas químicas preliminares para compuestos disueltos en solvente de alta polaridad.

Prueba Compuestos Reacción

Shinoda Flavonoides y fenoles Desprendimiento de un gas y cambio de color (naranja-

rojizo)

Cloruro férrico

FeCl3 Flavonoides y fenoles Cambio de color (verde intenso)

Antrona Glicósidos de

flavonoides Formación de anillo

Dragendorff Alcaloides Formación de un precipitado naranja

Espuma Saponinas Formación de espuma por más de 15´

9. RESULTADOS

9.1. Especies evaluadas

Durante la extracción de los compuestos químicos de los briófitos se tuvo en cuenta los pesos,

húmedo y seco, para saber el porcentaje de solutos presentes en relación con la cantidad de agua

inicial que contenía cada muestra; así mismo, se tuvo en cuenta los pesos iniciales de la totalidad

del material vegetal triturado que se maceró y luego el peso del extracto obtenido de él para

calcular el rendimiento de extracción de cada especie, consignando los resultados en la Tabla 4,

en donde se puede observar que Trichocolea sp. e Hypnum sp. son las dos especies que

presentaron un mayor porcentaje de rendimiento de extracción.


22

Por su parte, para las frutas se calcularon los sólidos totales y la densidad de cada jugo lo cual

permitió obtener la concentración a la que fueron evaluados en cada pozo (Ver Tabla 9 en

anexos), a excepción del ají dado que la cantidad de material no era suficiente para calcular la

densidad del jugo, por el método seleccionado.

Tabla 4. Procesamiento de muestras y proceso de extracción etanólica de los compuestos de los

briófitos.

Briófito

Peso húmedo

Peso seco

m/m Peso seco para

maceración Volumen

Etanol Peso Extracto Concentrado

Rendimiento

(g) (g) % (g) (ml) (g) %

Sphagnum sp. 10,15 1,13 11,11 129,90 6900 3,94 3,03

Metzgeria sp. 10,03 1,30 12,97 31,80 1500 1,21 3,80

Trichocolea sp. 10,05 1,14 11,39 28,20 700 1,84 6,52

Hypnum sp. 10,10 1,87 18,53 100,80 3370 5,74 5,70

9.2. Bioensayo

La actividad antibacteriana de extractos etanólicos de briófitos, dos musgos (Sphangum sp. y

Hypnum sp.) y dos hepáticas (Trichocolea sp. y Metzgeria sp.), a las concentraciones de 1, 10 y

100 mg/ml, y de jugos puros de frutas (piña, mora, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo,

carambolo, níspero, uva y agraz), fueron evaluados por el método de difusión en pozos de agar,

contra cuatro bacterias indicadoras de actividad biológica (Bacillus subtilis, Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli). Los resultados de la actividad

antibacteriana de los extractos de briófitos se muestran en la Tabla 5 y de las frutas en la Tabla 6

(destacando en negrilla los de mayor actividad entre las especies evaluadas), observando que las

cuatro especies de briófitos, así como los jugos de mora, arándano, uva y agraz presentaron

actividad contra al menos una de las bacterias, contrario a los jugos de piña, pera rosada, ají,

corozo, carambolo y níspero que no mostraron actividad.

Tabla 5. Actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de cuatro especies de briófitos a

diferentes concentraciones, sobre las cuatro bacterias evaluadas

Zona de Inhibición (mm)

Bacterias

Sustancia Concentración

(mg/ml) B. subtilis S. auerus P. aeruginosa E. coli

Bri

ófi

tos Sphagnum sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0

10 0.0 0.0 0.0 9.0 ± 1.7

100 9.4 ± 0.5 0.0 6.3 ± 4.6 9.3 ± 1.2


23

Metzgeria sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0

10 0.0 0.0 0.0 9.9 ± 0.2

100 9.0 ± 0.0 0.0 7.7 ± 0.6 0.0

Trichocolea sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0

10 9.9 ± 0.2 9.8 ± 0.4 13.0 ± 1.0 0.0

30 10.2 ± 0.2 10.7 ± 1.2 14.3 ± 0.6 0.0

Hypnum sp. 1 0.0 0.0 0.0 0.0

10 13.6 ± 3.4 0.0 3.9 ± 5.3 9.0 ± 1.7

100 16.3 ± 1.2 8.3 ± 0.6 15.7 ± 5.3 11.3 ± 1.5

Anti

bió

tico

Ampicilina 200 36.2 ± 1.0 42.2 ± 0.8 12.5 ± 0.7 23.3 ± 1.4

Clindamicina 150 22.7 ± 0.5 24.6 ± 0.3 0.0 12.2 ± 2.3

Los valores significan ± SD (Desviación Estándar). n = 3 en cada grupo. La actividad antibacteriana fue probada por

el método de difusión en agar con pozos de 5mm y cada pozo con 50μl de la sustancia.

Como controles negativos fueron usados H2Od (para frutas) y DMSO (para briófitos); ninguno de ellos mostró

actividad.

Tabla 6. Actividad antibacteriana de los jugos de diez frutas contra las cuatro bacterias evaluadas

Bacterias

Zona de Inhibición (mm)

Sustancia B. subtilis S. auerus P. aeruginosa E. coli

Fru

tas

Pi 0.0 0.0 0.0 0.0

Mo 11.9 ± 0.5 13.8 ± 1.1 14.3 ± 0.9 15.9 ± 1.8

Ar 0.0 12.0 ± 0.6 0.0 22.0 ± 1.5

Pr 0.0 0.0 0.0 0.0

Aj 0.0 0.0 0.0 0.0

Co 0.0 0.0 0.0 0.0

Cm 0.0 0.0 0.0 0.0

Np 0.0 0.0 0.0 0.0

Uv 9.9 ± 0.2 13.3 ± 1.2 12.4 ± 2.9 10.9 ± 0.9

Ag 10.0 ± 1.0 13.3 ± 1.2 10.3 ± 0.4 12.3 ± 0.7

Anti

bió

tico

Amp 36.2 ± 1.0 42.2 ± 0.8 12.5 ± 0.7 23.3 ± 1.4

Cli 23.2 ± 0.5 24.5 ± 0.2 0.0 13.2 ± 2.3

Los valores significan ± SD (Desviación Estándar). n = 3 en cada grupo. La actividad antibacteriana fue probada por

el método de difusión en agar con pozos de 5mm y cada pozo con 50μl de la sustancia.

Pi – Piña; Mo – Mora; Ar – Arándano; Pr – Pera rosada; Aj – Ají dulce; Co – Corozo; Cm – Carambolo; Np –

Níspero; Uv – Uva; Ag – Agraz.

Controles positivos: Ampicilina (200mg/ml) y Clindamicina (150mg/ml).

Controles negativos: H2Od para las frutas y DMSO puro para los briófitos (ninguno de ellos mostró actividad).


24

Proporcionalmente al número de especies evaluadas, los briófitos fueron más activos que las

frutas dado que el 100% de los briófitos presentaron actividad para al menos una de las bacterias

en mínimo una concentración, mientras que de las diez frutas evaluadas, solo cuatro tuvieron

actividad, para al menos una de las bacterias.

El extracto de briófito que presentó la mayor actividad antibacteriana a las concentraciones

evaluadas fue el de Hypnum sp. para todas las bacterias, donde la menor actividad fue para S.

aureus. Los otros tres extractos de briófitos fueron activos para solo tres de las bacterias. El

extracto de Trichocolea sp. fue el segundo en presentar la mejor actividad y aunque no inhibió el

crecimiento de E. coli, tuvo el halo de inhibición más grande para S. aureus, que parece ser una

cepa muy resistente, dado que ni el extracto de Sphagnum sp. ni el de Metzgeria sp. tuvieron

actividad para esta cepa, aunque sí presentaron, y de forma muy similar, actividad para las otras

tres bacterias, mostrando una fuerte similitud de actividad en ambas especies de briófitos.

En cuanto a las concentraciones de extractos analizadas, ningún extracto de briófito inhibió el

crecimiento bacteriano a concentración de 1 mg/ml, mientras que, a medida que aumentaba la

concentración el halo de inhibición fue mayor, alcanzando la mejor actividad a 100 mg/ml para

todas las especies, a excepción del extracto de Metzgeria sp. el cual presenta actividad a 10

mg/ml, pero no a 100 mg/ml, contradiciendo lo observado.

Así mismo cabe señalar que no hubo diferencias de actividad entre los dos grupos de briófitos,

musgos (Sphagnum sp.e Hypnum sp.) y hepáticas (Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) dado que las

dos especies más activas fueron un musgo (Hypnum sp.) y una hepática (Trichocolea sp.).

Para el caso de los jugos de frutas, los que presentaron actividad fueron los de mora silvestre,

arándano, uva y agraz, destacándose notablemente la actividad de la mora silvestre en su

actividad antibacteriana para todas las bacterias evaluadas, no solo en el diámetro del halo sino

también cualitativamente dado que los halos fueron los más transparentes, claros y definidos, de

todas las especies evaluadas (Anexos, Figura 6). Los extractos de briófitos, aunque presentaron

halos cualitativamente similares o iguales a la mora silvestre, sus diámetros fueron menores para

varias bacterias (Anexos, Figura 5).

Hay que tener en cuenta que solo fueron medidos y tomados como positivos, los halos que se

observaban claramente, transparentes y con límites bien definidos de manera que se pudieran


25

realizar las tres mediciones para cada pozo y sacar el promedio para cada repetición, así como

cabe aclarar que se hicieron repeticiones en tres diferentes cajas de petri y obteniendo los

promedios que son los resultados consignados en las Tablas 5 y 6.

El jugo de mora silvestre fue el de mayor actividad entre las diez frutas evaluadas mostrando el

mayor efecto en E. coli y el menor halo de inhibición para B. subtilis. Los jugos de uva y agraz

también fueron activos para las cuatro bacterias, ambas mostrando el mayor efecto para S. aureus

y el menor para B. subtilis. Por su parte, el jugo de arándano solo presentó actividad para S.

aureus, con un halo de inhibición similar al de las otras frutas con actividad.

No es posible señalar una sola bacteria, así como un solo tipo de bacteria (Grampositivas o

gramnegativas) que haya sido la más sensible a los extractos evaluados, dado que los resultados

dependen más de la especie de planta evaluada que de la bacteria, observando un amplio rango de

acción de los extractos y jugos, para los diferentes tipos de bacterias.

Por último, los controles negativos fueron agua para las frutas y DMSO puro para los briófitos,

dado que en este solvente fueron diluidos hasta alcanzar las concentraciones evaluadas. Ni el

agua, ni el DMSO (a pesar de utilizarlo puro) inhibieron el crecimiento de las bacterias.

Los controles positivos, ampicilina y clindamicina, de forma similar coincidieron en los efectos

sobre cada bacteria, aunque no en el diámetro de inhibición; estos presentaron el mayor efecto en

S. aureus, seguido por S. subtilis, E. coli y por último P. aeruginosa, para la cual el halo de

inhibición fue el más pequeño en ampicilina mientras que la clindamicina no tuvo ni siquiera

actividad, mostrando a P. aeruginosa como la cepa bacteriana más resistente entre todas y

mostrando también el efecto de los extractos de briófitos, mora, uva y agraz, quienes inhibieron

su crecimiento en un diámetro considerable para una cepa tan resistente, la mayoría sobrepasando

el diámetro obtenido para la ampicilina.

9.3. Pruebas químicas preliminares

Tabla 7. Pruebas químicas preliminares de los extractos activos

Prueba Compuestos Mo Ar Uv Ag Sp Hy Me Tr

Lieberman Buchard Esteroides y esteroles - - + + + + + +

Salkowski Terpenos - + + - - - - -

Baljet Terpenos y esteroles + + + - + + - +

Hidroxamato férrico Sesquiterpenolactonas + + + + + + + +


26

Shinoda Flavonoides y fenoles - - - - - - + -

Cloruro férrico FeCl3 Flavonoides y fenoles + + - - - + + +

Antrona Glicósidos + + + + + + + +

Dragendorff Alcaloides - + + + + + - -

Espuma Saponinas - - - - - - - - Positivo (+) y Negativo (-), para la presencia de los compuestos. Mo – Mora; Ar – Arándano; Uv – Uva; Ag – Agraz;

Sph – Sphagnum sp.; Hyp – Hypnum sp.; Met – Metzgeria sp.; Tri – Trichocolea sp.

Las pruebas químicas preliminares indican que los compuestos que se presentan en común para

las sustancias activas son las sesquiterpenlactonas y los glicósidos de flavonoides, así como los

esteroides, esteroles, terpenos, fenoles, flavonoides y alcaloides, presentes en varias de las

sustancias. Por su parte, en ninguna muestra se encontraron saponinas.

10. DISCUSIÓN

La actividad contra las bacterias grampositivas (Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus) y

gramnegativas (Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli) fue evaluada mediante el método

de difusión en pozos de agar, obteniendo resultados positivos para los extractos etanólicos de

musgos (Sphangum sp. y Hypnum sp.), hepáticas (Trichocolea sp. y Metzgeria sp.) (Tabla 5) y

cuatro de los jugos de fruta evaluados (mora, arándano, uva y agraz), contrario a los jugos de las

demás frutas evaluadas (piña, pera rosada, ají dulce, corozo y carambolo) que no presentaron

actividad (Tabla 6).

En este estudio se comprueba que los briófitos tienen alto potencial para el desarrollo de

productos antibacteriales. A pesar de que el estudio fitoquímico de los briófitos ha sido relegado

y se ha prestado más atención a plantas vasculares, los resultados evidencian que los briófitos

pueden tener incluso un mayor potencial que la diversidad de frutas, dado que de las diez

especies de frutas evaluadas, solo los jugos de cuatro especies fueron activas mientras que el

100% de los briófitos presentaron actividad en al menos una concentración.

10.1. Briófitos

Todas las especies de briófitos presentaron actividad contra al menos una de las bacterias,

grampositivas y gramnegativas, en alguna concentración indicando la presencia de agentes

antimicrobianos que brindan un amplio espectro de acción. Las concentraciones activas fueron de

10 y 100 mg/ml (o 30mg/ml para el caso de Trichocolea sp.) mientras que a concentración de


27

1mg/ml ninguna especie inhibió el crecimiento de las bacterias. Los extractos etanólicos que

presentaron mayor actividad fueron los de Hypnum sp. y Trichocolea sp. y así mismo fueron los

que presentaron un mayor rendimiento en la extracción, lo cual es prometedor para la futura

utilización de estas especies.

Este estudio es el primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos colombianos. Morantes y

colaboradores en el 2007 evaluaron la actividad Politrichum juniperinum contra Bacillus subtilis,

Micrococus luteus, Escherichia coli, Salmonela sp y Candida albicans, pero éste musgo no

presentó actividad antibacteriana para ningún microorganismo. Por esto, este primer reporte de

actividad de las especies de musgos y hepáticas colombianas brinda las bases para despertar el

interés en estudiar más estas especies, así como de invertir en ellas puesto que se convierten en

especies con gran potencial económico y con su indudable importancia ecológica en los

ecosistemas. Por medio de este tipo de estudios, se puede potencializar la conservación de los

briófitos, brindándoles una mayor importancia de la que ya presentan naturalmente, y motivando

la realización de estudios en técnicas de propagación ex situ, para su producción a mayor escala y

su conservación fuera de su ambiente natural. Para ello, es necesario implementar técnicas y

nuevas herramientas biotecnológicas que permitan la propagación a gran escala de los briófitos,

haciendo uso sostenible de la biodiversidad, aprovechando nuestros recursos sin afectar

negativamente los ecosistemas y promoviendo su conservación.

El estudio de la actividad antibacteriana, así como en general de la fitoquímica de briófitos en

Colombia, es prácticamente nulo, pese al gran potencial que poseen estas especies evidenciado en

este trabajo, así como en estudios realizados en otros países. Por esto es de gran importancia

investigar sobre estas especies, en especial porque en el país cuenta con una gran cantidad de

ambientes como los ecosistemas de páramo, donde las especies están adaptadas a condiciones de

estrés (tanto de patógenos como de temperatura y luminosidad), logrando no solo establecerse en

estos ambientes, sino también colonizando y proliferando exitosamente en gran parte de él

(Martínez et al. 2000).

Comparando los resultados entre briófitos, no se observa una tendencia en la actividad con

respecto al tipo de briófito, es decir, las hepáticas con respecto a los musgos no presentaron

mayor o menor actividad. En varios estudios, como por ejemplo en el de Russell (2010), se

observa que las hepáticas son mucho más activas que los musgos, dado que 88% de las hepáticas


28

evaluadas mostraron actividad (evidenciando una mejor zona de inhibición) contra solo el 33%

de los musgos activos. No obstante, la tendencia de mayor actividad para especies de hepáticas

no se observó en los resultados obtenidos dado que las especies de mejor actividad fueron el

musgo Hypnum sp. y la hepática Trichocolea sp., mostrando halos de inhibición mucho más

grandes para la mayoría de bacterias evaluadas por lo que para las cuatro especies de briófitos, la

actividad depende más de la especie y de los compuestos que posee, que del tipo de briófito al

que pertenece.

La actividad antimicrobiana de las hepáticas está relacionada con la presencia de cuerpos

aceitosos (no presentes en musgos y antoceros) que contienen terpenoides lipofílicos, compuestos

aromáticos y acetogeninas que son los responsables de diferentes actividades biológicas y

propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu et al. 2006). Principalmente se encuentran

presentes mono, sesqui y diterpenoides lipofílicos, acetogeninas y compuestos aromáticos

(benzoatos, cinamatos, fenoles de cadena larga, naftalenos, isocumarinas, entre otros),

responsables de diferentes actividades biológicas y propiedades medicinales (Douglas 2010; Zhu

et al. 2006; Asakawa 2007). Especialmente en los grupos con la morfología de hepáticas talosas

como Lunularia sp. o Marchantia polymorpha (que ha sido ampliamente estudiada en actividades

biológicas), se destaca la presencia de dichos compuestos aceitosos, así como otras familias como

Pelliaceae y Riccardiaceae, pertenecientes al orden Metzgeriales, que contienen compuestos

aromáticos (bibenzil y bis-bibenciles) (Asakawa 2008; Douglas 2010). Es posible que Metzgeria

sp., que es una hepática talosa del orden Metzgeriales, así como la hepática foliosa evaluada,

Trichocolea sp., posean estos compuestos aceitosos y que estos sean algunos de los causantes de

la actividad biológica observada.

Metzgeria sp. aunque no presentó actividad a las concentraciones de 1 y 10mg/ml (a excepción

con E. coli a concentración de 10mg/ml), en la máxima concentración evaluada (100mg/ml) fue

activa para B. subtilis y E. coli. En esto se observa que el aumento en la concentración del

extracto influye de manera importante y puede ser un factor determinante en la actividad contra

diferentes tipos de bacterias. Esto puede deberse a que los componentes activos de las muestras

están representados en un menor porcentaje y aumentando la concentración de la muestra, así

mismo aumentan dichos compuestos activos, mostrando una mayor inhibición del crecimiento

bacteriano. No obstante, para E. coli, se observa actividad a 10mg/ml pero no a mayor


29

concentración; según lo observado, se formaba un precipitado en el pozo por lo que puede ser

importante tener precaución en filtrar bien las muestras de manera que sea totalmente líquida

lográndose difundir en el medio y actuar sobre las bacterias.

El estudio de las especies de Metzgeria es limitado; no obstante han encontrado actividad

antifúngica para la fracción de CH3Cl de la extracción metanólica (Mishra & Verna 2011),

actividad anitimicrobiana para Metzgeria furcata y, estudios donde muestra que es causante de

alergia al contacto dérmico (aunque sus alérgenos no han sido aislados aún) (Asakawa 2008). Por

ello, el desarrollo de productos a partir de esta hepática debe complementarse con estudios

toxicológicos y clínicos, determinando su dosis y comprobando su actividad.

Por su parte, del género Trichocolea, que es una hepática foliosa, se han investigado algunas

especies (T. hatcheri, T. tomentella y T. mollissima), encontrando compuestos como tomentelina

y dimetiltomentelina las cuales presentan actividad antifúngica y citotóxica, y otros compuestos

como fenileteres y tricocoleina (también con actividad antifúngica) (Perry et al. 1996; Nagashima

et al. 2003; Asakawa 2011; Ludwiczuk & Asakawa 2010). En el estudio de Kwag et al. (2003),

T. hatcheri se evaluó contra B. subtilis, dermatofitos, virus y células leucémicas, encontrando

actividad para todos los organismos evaluados, presentando un halo de inhibición de 1mm para

B. subtilis usando 150mg/disco, lo cual concuerda con los resultados obtenidos, aunque

encontrando en este estudio un mayor halo de inhibición a menor concentración, para la cepa

evaluada (B. subtilis). De igual manera, cabe resaltar que según la literatura varias especies de

Trichocolea presentan compuestos químicos con actividades biológicas y esto es corroborado en

este trabajo, dado que la el extracto de la especie evaluada de Trichocolea presentó actividad para

tres de las bacterias evaluadas (B. subtilis, S. aureus y P. aeruginosa), siendo el segundo mejor

extracto entre las cuatro especies evaluadas

T. hatcheri también fue evaluada por Baek et al. (2004) encontrando un compuesto con actividad

antitumoral, antioxidante y antimicrobiana (contra S. epidermidis MIC 1000μg/ml). Por ello, con

relación a las bacterias evaluadas, se observa que el género Trichocolea presenta actividad contra

especies de Staphylococcus, mostrando la mayor actividad entre las especies de briófitos

evaluadas a ambas concentraciones (10 y 30 mg/ml), seguido por Hypnum sp., mientras que las

otras dos especies de briófitos no fueron activas para S. aureus. Con respecto a P. aeruginosa se

observó que Trichocolea sp. presentó la segunda mejor actividad (después de Hypnum sp.) a las


30

mismas concentraciones que para S. aureus. No obstante, el extracto de ésta hepática foliosa no

fue activo contra E. coli y tampoco se encontraron estudios donde sí se observara inhibición para

esta bacteria.

Por su parte, las especies de musgos, ricas en flavonoides poseen gran actividad antimicrobiana y

los musgos en general se caracterizan por presentar biflavoides (a diferencia de las hepáticas) y

monoflavonoides (Veljić et al. 2009). De los extractos de musgos evaluados (Sphagnum sp. y

Hypnum sp.), aunque ambos fueron activos para al menos una de las bacterias, Hypnum sp. fue el

que presentó mayor actividad entre todos los briófitos evaluados lo cual contradice lo esperado.

Se esperaba no solo que las hepáticas fueran las de mayor actividad, sino también que, entre los

dos musgos evaluados, Sphagnum sp. fuera el que tuviera mayor actividad, dado que este musgo

es de los géneros más estudiados y utilizados a nivel económico (Glime 2007) y varios artículos

presentan a las especies de Sphagnum como potenciales fuentes de compuestos de actividad

biológica por su demostrada actividad antimicrobiana para varias de sus especies (Asakawa 2011;

Mellegård et al. 2009). Esto muestra la importancia de hacer este tipo de estudios base, para

varias especies y confirmar o rebatir los supuestos establecidos anteriormente. No obstante, se

sugiere evaluar la concentración y fraccionamiento del extracto con el fin de observar si hay un

aumento en la actividad, así como variaciones en el tiempo de exposición (medición del halo de

inhibición a diferentes horas) de manera que permita observar un aumento de dicha actividad.

Por último, y siendo el más importante, el musgo Hypnum sp. se presenta como el briófito más

activo entre todas las especies evaluadas, dado que no solo inhibió el crecimiento de todas las

bacterias sino también mostró las zonas de inhibición en promedio más grandes (en especial a

concentración de 100mg/ml), comparadas con las otras especies (a excepción de S. aureus para la

cual tuvo mayor actividad Trichocolea sp.). Las especies de Hpnum han mostrado actividad

antibacterial y antifúngica para diferentes modelos bacterianos (Glime 2007). En el estudio de

Veljić et al. (2009) la actividad de Hypnum cupressiforme contra B. subtilis y S. epidermitis

mostró sactividad antibacterial a concentración de 20 mg/ml; esto es confirmado por este estudio

para Hypnum sp., a una menor concentración de 10mg/ml. En el estudio de Veljić et al. (2009)

también cabe resaltar que con la evaluación de H. cupressiforme se observó una diferencia en

actividad respecto al tipo de bacteria, mostrando mayor actividad contra gramnegativas que

contra grampositivas; no obstante, en el presente trabajo, Hypnum sp. presentó actividad para


31

todas las bacterias (sin diferencia entre grampositivas y gramnegativas) a concentraciones de 10 y

100m/ml (a excepción de S. auerus donde solo fue activa para la concentración de 100mg/ml).

Así mismo, Savaroglu et al. 2011 evaluó a H. cupressiforme e H. impones en actividad

antibacteriana, obteniendo resultados positivos especialmente para B. subtilis y P. aeruginosa en

diferentes solventes (metanol, éter de petróleo, metanol-agua, coloroformo y acetona). Se han

descrito compuestos como biflavonoides en H. cupressiforme (hypnofenoles e

hypnumbiflavonas) (Xiaowie 2007), antraquinonas, terpenoides, flavonoides y alcaloides en H.

cupressiforme y H. imponens (Savaroglu et al. 2011), que pueden participar en la actividad

biológica observada en éste género.

Por último, se observó que P. aeruginosa es una cepa muy resistente ya que la actividad de los

antibióticos utilizados fue baja (12.5mm para Ampicilina) o nula (para Clindamicina); a pesar de

que en otros estudios como en Sabovljević et al. (2010) la ampicilina tubo actividad de 21 mm

para P. aeruginosa a concentración de 0.1 – 2 mg/ml y en Elibol et al. (2011) a una

concentración de 0.01μg/ml, ambos por el método de difusión en disco. Esto indica que la cepa

de P. aeruginosa evaluada era resistente a los antibióticos evaluados, en especial a la

clindamicina y por ello, este estudio muestra que las especies de briófitos tienen gran actividad

antibacteriana, aún en cepas como P. aeruginosa, ya que todas las especies de briófitos fueron

activas contra esta bacteria en al menos una concentración (destacándose Hypnum sp. a 100

mg/ml).

Este estudio, siendo el primer reporte de actividad antibacteriana de briófitos colombianos, brinda

las bases que demuestran la actividad antibacteriana de musgos y hepáticas de Colombia y su

gran potencial en otro tipo de actividades. Por ello, la elección de implementar nuevas

herramientas biotecnológicas para la producción a mayor escala de especies de briófitos, puede

ser fuente de resultados prometedores logrando hacer uso sostenible de la biodiversidad del país.

El desarrollo en técnicas y estrategias de su producción artificial o in vitro, por ejemplo por

medio de bioreactores que permiten una producción masiva (Beike et al. 2010), pueden ser una

herramienta muy útil para el aprovechamiento de estas plantas, sin afectar negativamente los

ecosistemas.


32

10.2. Frutas

Dentro de las frutas evaluadas, se observa una clara tendencia de actividad antibacteriana por

parte de los jugos provenientes de frutos rojos o bayas (como son agrupados en varios estudios),

cuyas coloraciones, relacionadas con antocianinas (glicósidos de antocianinas), que son el grupo

de flavonoides más predominante en las bayas (Puupponen-Pimiä et al. 2005b) y pueden indicar

actividad antioxidante que puede ser aprovechada para la prevención del cáncer (Stoner et al.

2008), así como también pueden estar relacionadas con un sistema de defensa externo ante

enfermedades infecciosas (Heinonen 2007), en especial en la piel, que es la que debe resisitir en

mayor medida a la radiación lumínica y al ataque de patógenos. A excepción del corozo, que

también presenta coloraciones rojizas, todos los jugos de bayas presentaron actividad, lo cual está

ampliamente documentado para varias especies de bayas, de las cuales se han estudiado sus

compuestos fenólicos a los que se les atribuyen varias actividades biológicas (Häkkinen 2000;

Nohynek et al. 2006; Puupponen-Pimia et al. 2001, 2005a, 2005b).

Algunos compuestos presentes en las bayas son algunos como flavonoles (producto de estímulos

lumínicos originándose principalmente en las superficies del fruto), ácidos fenólicos, taninos

(como las proantocianinas que confieren su sabor amargo), polímeros de fenoles (elagitaninos),

que pueden ser los causantes de la actividad antibacteriana observada en el experimento,

actuando sobre un amplio rango de microorganismos y superando las resistencias que presenten

(Puupponen-Pimiä et al. 2001, 2005a, 2005b; Nohynek et al. 2006).

Cabe resaltar que la actividad sobre las bacterias puede no estar solo determinada por la anatomía

de las bacterias sino por otros factores que podrían estar dados por los extractos y jugos

evaluados, más que por el tipo de bacterias. Puupponen-Pimiä et al. (2005a) muestran que el pH

puede ser un factor influyente en la inhibición del crecimiento bacteriano dado que uno de los

parámetros que determinan el crecimiento de microorganismos en los alimentos es precisamente

su pH; no obstante, el efecto del pH en la muestra varía según la especie de bacteria y los

compuestos fenólicos presentes y, dado que las bayas presentan un pH bajo (2.4-3.5), podría

haber influenciado en la actividad antibacteriana.

Las bayas han sido ampliamente estudiadas encontrando actividad mutagénica, antitrombótica,

antioxidante, antiinflamatoria y en la prevención del cáncer; así mismo, han sido exploradas en su


33

composición química dado que presentan un especial interés como fuente de compuestos

antimicrobianos observando actividad para infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, en el

control de patógenos humanos y en la antiadhesión en el proceso de enfermedades microbianas

(Puupponen-Pimiä et al. 2005b). Los resultados de este estudio corroboran la fuerte actividad de

las bayas, frente a otros tipos de frutas, lo cual puede ser sustentado en que las bayas contienen

más flavonoides que muchos otros vegetales y frutas, en especial antocianinas y flavonoles que se

producen como respuesta a los estímulos lumínicos del ambiente (Puupponen-Pimiä et al. 2005ª,

2005b).

Así mismo, los efectos de las bayas sobre las bacterias pueden ser producto de un efecto sinérgico

de varios compuestos, en especial del grupo de fenoles, ya sean solos o combinados con otros

compuestos activos (Puupponen-Pimiä et al. 2001; Nohynek et al. 2006) y por ello, la evaluación

de la actividad de jugos evidencia una fuerte actividad con un método más sencillo y de bajo

costo (dado que no requiere de solventes ni procesos de extracción de compuestos y

concentración de extractos), y puede tener aplicaciones más directas y asequibles para las

personas que requieran su uso.

Los resultados indican que la inhibición del crecimiento de las bacterias fue muy similar entre los

jugos de bayas con actividad, no obstante, el jugo de mora se destacó cualitativamente para todas

las bacterias, entre las demás bayas, dado que mostró halos de inhibición muy bien definidos,

claros y transparentes, en especial para E. coli. Así mismo, aunque la mora tuvo la menor

actividad para B. subtilis (comparada con las otras bacterias), fue la actividad más alta entre las

demás bayas. La mora, perteneciente al género Rubus de la familia Rosaceae, son ricas en

elagitaninos que le confieren actividad biológica sobre bacterias patógenas (Häkkinen 2000;

Mullen et al. 2002; Rauha et al. 2000).

De igual forma que para los briófitos, las frutas que presentaron actividad tuvieron halos de

inhibición mucho mayores en P. aeruginosa que los mismos antibióticos, demostrando la gran

capacidad antibacteriana de estas especies de bayas.

10.3. Aspectos generales en discusión

Los compuestos químicos de las plantas han sufrido procesos de selección natural a lo largo de

millones de años que les ha permitido sobrevivir en los diferentes ambientes y ante condiciones


34

hostiles; por esto, las plantas presentan un conjunto de compuestos químicos de manera que han

resultado ser la combinación más exitosa evolutivamente y por ello están perfectamente

balanceados (en cuanto a la cantidad de cada compuesto presente en la muestra) y presentan una

acción sinérgica como sistema de defensa contra diversidad de patógenos a los que están

expuestos en su ambiente natural, así como contra condiciones de estrés abiótico (radiación

lumínica y temperatura) (Liu 2004; Xie & Lou 2009). Por esto, con el propósito de mantener esa

acción sinérgica entre los compuestos y su balance natural conservando la totalidad o la mayor

cantidad de compuestos presentes en las muestras, de realizar una evaluación preliminar de la

actividad antibacteriana de las especies y mediante una metodología sencilla y de bajo costo, este

estudio evaluó la actividad de los jugos puros procesados (licuados y centrifugados) de las frutas

y de los extractos totales de musgos y hepáticas, contrario a los procedimientos comúnmente

utilizados en fitoquímica donde utilizan solventes de baja, mediana y alta polaridad para extraer

los MS de las muestras (Bilbao 1997) y obteniendo resultados muy interesantes para la mayoría

de las especies evaluadas. La evaluación de las fracciones totales y de los jugos puros procesados

de las frutas puede presentar ciertas ventajas frente al estudio de las fracciones son solventes de

diferente polaridad dado que no solo se mantiene la totalidad de compuestos químicos y en las

proporciones en que naturalmente se producen, sino que ofrece un amplio espectro de

compuestos y puede tener mejor actividad que con otros solventes, dado que extrae la totalidad

de los compuestos de interés (Douglas 2010). A partir de los resultados se puede decir que

efectivamente el uso de los jugos puros de frutas y extractos totales de los briófitos fue

favorecedor dado que brindó resultados muy interesantes para la mayoría de las especies

evaluadas.

El agua es el solvente universal y el DMSO es utilizado como solvente cuando no es posible

disolver una sustancia en el agua. El DMSO, utilizado para diluir los briófitos, se probó como

control negativo de manera pura. No obstante, se debe tener cuidado con el uso del DMSO puro

dado que en varios estudios muestran que es recomendable usar el DMSO en bajas

concentraciones (alrededor del 1%) debido a que puede presentar efectos tóxicos o acción

terapéutica (Brayton 1986; Ojo et al. 2007). A pesar de esto, no se observó ningún efecto de

DMSO puro sobre el crecimiento bacteriano y por lo tanto, no presentaron efectos sobre las

bacterias analizadas por lo que, es posible que la actividad que mostraron los extractos no fue

alterada. Así mismo, el control negativo utilizado para la evaluación de las frutas fue agua


35

destilada dado que los jugos representan un extracto completo acuoso dado naturalmente por el

contenido de agua de las frutas y, al igual que el DMSO, tampoco afectó el crecimiento

bacteriano.

Las bacterias evaluadas, indicadoras de actividad biológica, permitieron efectivamente dilucidar

las propiedades antibacteriales de las especies de briófitos y frutas. No obstante, no se observó

ningún patrón o diferencia de actividad entre tipos de bacterias (grampositivas y gramnegativas),

a pesar que se esperaría una mayor resistencia por parte de las bacterias gramnegativas, dado que

poseen una capa de lipopolisacáridos que las hace más resistente a la acción de antibióticos,

contrario a las grampositivas que no la presentan quedando más expuestas y susceptibles a la

acción de sustancias antibióticas (Santamarina et al. 1997) y por ello, los antibióticos

generalmente son más activos contra grampositivas que contra gramnegativas (Bodade et al.

2008). Esto muestra que las especies de bayas y briófitos evaluados, presentan una fuerte acción

antibacteriana con un amplio espectro de acción, sobre ambos tipos de bacterias, haciéndolos más

interesantes en su utilización y potencial económico.

Otro aspecto importante a analizar es la diferencia en actividad de especies silvestres, en

contraste con las cultivadas. Podría pensarse que las especies silvestres presentan mejor actividad

que las cultivadas, dado que es posible que los compuestos químicos relacionados con la defensa

ante agentes externos (condiciones ambientales y patógenos) se potencialicen si las especies están

constantemente expuestas a estas condiciones y sea necesario producirlos y utilizarlos

continuamente; contrario a las plantas cultivadas, las cuales se mantienen en condiciones mucho

más favorables y se complementa su defensa con productos contra patógenos. No obstante, el

estudio de Sabovljević et al. (2011) presenta mejores resultados en actividad antifúngica para

briófitos provenientes de cultivos artificiales que para las plantas silvestres. Esto sería aún más

importante que encontrar actividad en las especies obtenidas directamente de su hábitat, dado que

su producción en condiciones artificiales y controladas se promovería, al igual que su

conservación en los ambientes naturales. No obstante, aún falta información sobre este tema,

dado que la producción de metabolitos secundarios puede ser estimulada por la presencia y

acción de patógenos sobre las plantas. Según los resultados obtenidos, las especies silvestres

(musgos, hepáticas y la mora) se destacaron en la actividad antibacteriana, frente a las otras frutas

evaluadas que son cultivariedades comerciales. Sin embargo para poder hacer una afirmación


36

sería interesante evaluar las mismas especies, tanto comerciales como silvestres de cada especie,

comprobando si hay variación en la actividad y si hay diferencias en la composición de MS en

cada muestra.

En cuanto a las pruebas químicas preliminares, por medio de ellas se puede obtener una

aproximación a las principales familias de metabolitos secundarios presentes en las muestras y

que pueden ser los causantes de la actividad mostrada. De acuerdo a los compuestos encontrados

en varios estudios en las especies de briófitos y de las bayas (anteriormente ya mencionados), os

resultados de estas prueas son acordes ya que se encontraron sesquiterpenlactonas y los

glicósidos de flavonoides, asì como esteroides, esteroles, terpenos, fenoles, flavonoides y

alcaloides, que pueden ser los responsables de la actividad antibacteriana. No obstante, esto

brinda una idea general pero es necesario realizar otro tipo de pruebas como espectrofotometrìa

de masas para identificar los compuestos presentes, de una manera más segura y confiable. Así

mismo, dado que las pruebas para los jugos se realizaron tomando el jugo tal cual como fue

probada su actividad (el jugo completo), el agua presente pudo haber interferido en las reacciones

y por ende en los resultados por lo que es recomendable realizar las pruebas con el jugo

liofilizado o seco, y luego podría compararse ambos resultados para observar sí el agua interfiere

en dichas reacciones.

11. CONCLUSIONES

Los briófitos y bayas tienen un gran potencial económico como productos antibacteriales y

medicamentos contra bacterias patógenas. A parte de las plantas vasculares o fanerógamas, las

plantas no vasculares o criptógamas (Briofitos) también poseen actividad antibacteriana, e

incluso en mayor proporción que las frutas, mostrándose como fuente de productos

antimicrobianos. Este estudio confirmó la actividad antibacteriana de cuatro especies de briófitos

(Sphagnum sp, Hypnum sp. Metzgeria sp. y Trichocolea sp.) y de cuatro angiospermas (mora

silvestre, arándano, uva y agraz) obtenidas de diferentes regiones de Colombia, presentándose

como posibles fuentes de alimentos funcionales y como (mora silvestre, arándano, uva y

agraz)candidatos para medicamentos o preservantes alimenticios.


37

12. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS

Se recomienda tener en cuenta otras metodologías de extracción, incluir fraccionamiento de las

muestras con diferentes solventes y hacer un estudio bioguiado, evaluando su actividad mediante

otro tipo de pruebas antimicrobianas (microdilución o evaluación por discos), en especial para

confirmar o rectificar la ausencia de actividad de los jugos de fruta que no inhibieron el

crecimiento de las bacterias. Por medio de la identificación de los MS presentes en las fracciones

activas se puede saber qué moléculas son las responsables de la actividad y mediante pruebas in

vitro podría comprobarse su acción sinérgica contra el crecimiento bacteriano. Así mismo,

pueden evaluarse los extractos y jugos frente a otros microorganismos (hongos, virus u otras

bacterias) con el fin de observar el rango de actividad biológica de las especies evaluadas, así

como también evaluar otras actividades biológicas (i.e. anticancerígenas y antioxidantes).

Finalmente, con el fin de obtener un producto certificado y validado, es recomendable pasar a

estudios preclínicos y clínicos, evaluar la toxicidad de las muestras y las dosis recomendables

para su uso como fármacos.

A futuro, también es importante estudiar el mecanismo de acción de los MS sobre las células

microbianas, para evaluar y analizar qué factores son los determinantes en el efecto negativo

contra las células bacterianas. Así mismo, a partir del estudio de especies taxonómicamente

cercanas, se pueden seleccionar las especies con mayor potencial e interés de estudio.

Otro aspecto de gran importancia, es la obtención masiva de las especies para la producción de

extractos. En el caso de las frutas comerciales, ya existen las técnicas agronómicas y

metodologías que permiten obtener cantidades significativas del material vegetal. Sin embargo, la

obtención a gran escala de los briófitos es difícil dado que en el país no se han desarrollado ni

aplicado las técnicas para la producción masiva de briófitos. No obstante, centros internacionales

de producción masiva de briófitos muestran las técnicas que pueden usarse para generar grandes

cantidades del material, en condiciones artificiales y sin afectar los ecosistemas, como por

ejemplo el cultivo in vitro y el uso de bioreactores para mayor producción.

De esta manera, el proceso de bioprospección de especies vegetales es bastante amplio pero

prometedor y este tipo de estudios brinda las bases para la selección de las especies más

promisorias dentro de la gran diversidad de especies vegetales de Colombia.


38

13. AGRADECIMIENTOS

A Luis Gonzalo Sequeda, por su apoyo, confianza, dedicación y entusiasmo en el proceso de

realización del trabajo de grado, a Noemí Téllez por sus aportes en el proceso de evaluación y en

especial a los integrantes y funcionarios de los Grupos de Investigación en Fitoquímica (GIPUJ)

y Grupo de Terapia Celular y Molecular, de la Pontificia Universidad Javeriana, por su apoyo y

colaboración.

14. BIBLIOGRAFÍA

Abramovitch RB, Martin GB. 2004. Strategies used by bacterial pathogens to suppress plant

defenses. Curr. Opin. Plant Biol. 7:356–64

Stevens P F. 2001 onwards. Angiosperm Phylogeny Website. Version 9, June 2008 [and more or

less continuously updated since]." will do. http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/.

Arabshahi-Delouee S, Urooj A. 2007. Application of Phenolic Extracts from Selected Plants in

Fruit Juice. International Journal of Food Properties 10:479–88.

Asakawa Y. 2001. Recent advances in phytochemistry of bryophytes-acetogenins, terpePanoids

and bis(bibenzil)s from select Japanese, Taiwanese, New Zealand, Argentinean and European

liverworts. Phytochemestry 56: 297-312

Asakawa Y. 2007. Biologically active compounds form bryophytes. Pure appl. Chem. 79(4):

557-80

Asakawa Y. 2008. Liverworts – potential source of medicinal compounds. Current

Pharmaceutical Design 14: 3067-88.

Asakawa Y. 2011. Bryophytes: chemical diversity, synthesis and biotechnology. A review.

Flavour and Fragrance Journal. Wileyonlinelibrary. DOI 10.1002/ffj.2060

Ayachi A, Alloui N, Bennoune O, Yakhlef G, Daas Amiour S, Bouzid W, Djemai Zoughlache S,

Boudjellal K, Abdessemed H. 2009. Antibacterial Activity of Some Fruits; Berries and Medicinal

Herb Extracts Agains Poultry Strains of Salmonella. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci.

6(1):12-15


39

Baek SH, Oh HJ, Lim JA, Chun HJ, Lee HO, Ahn JW, Perry NB, Kim HM. 2004. Biological

Activities of Methyl-4-[[(2E)-3,7-dimethyl-2,6-octadienyl] oxy)-3-hydroxybenzoate. Bull.

Korean Chem. Soc. 25 (2):195-97.

Beike AK, Decker EL, Frank W, Lang D, Vervliet-Scheebaum M, Zimmer AD, Reski R. 2010.

Applied bryology - bryotechnology. Tropical Bryology 31:22–32.

Bilbao M. 1997. Análisis fitoquímico preliminar: química de productos naturales. Armenia:

Universidad del Quindío. 183p.

Billing E. 1987. Bacteria as Plant Pathogens. Van Nostrand Reinhold (UK) Co. Ltd. Inglaterra.

79p.

BioScreen Testing Services Inc. 2007. Technical Information Bulletin. Antimicrobial

Preservative Effectiveness Testing Global Pharmacopoeia Standards for Tropical Products.

F.D.A. Registered. California State Certified. D.E.A. Registered. ISO Certified. Disponible en:

www.bioscreen.com

Bodade RG, Borkar PS, Saiful Arfeen MD, Khobragade CN. 2008. In vitro Screening of

bryophytes for antimicrobial activity. J. Med. Plants 7(4):23-28.

Botero D. Restrepo M. 2003. Parasitosis Humanas. Cuarta Edición. Corporación para

Investigaciones Biológicas (CIB). 506p.

Brayton CF. 1986. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet 76: 61–90.

Burdulis D, Sarkinas A, Jasutiene I, Stackevicene E, Nikolajevas L, Janulis V. 2009.

Comparative study of anthocyanin composition, antimicrobial and antioxidant activity in bilberry

(Vaccinium myrtillus L.) and blueberry (Vaccinium corymbosum L.) fruits. Acta Pol. Pharm

66:399–408

Chanda S, Baravalia Y, Kaneria M, Rakholiya K. 2010. Fruit and vegetable peels – strong natural

source of antimicrobics. En: Méndez-Vilas A. Current Research, Technology and Education

Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Formatex.


40

Chun X, Hong L. 2009. Secondary metabolites in bryophytes: an ecological aspect. Chemistry &

Biodiversity 6(3): 303-12

Collins CH & Lyne PM. 2006. Métodos Microbiológicos. Editorial Acribia S.A. España. 524p.

Cona E. 2002. Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de difusión en

agar. Rev Chil Infect 19(2): S77-81.

Cornelissen J., Lang S., Soudzilovskaia N., During H. 2007. Comparative Cryptogam Ecology: A

Review of Bryophyte and Lichen Traits that Drive Biogeochemistry. Annals of Botany 99:987–

1001

Craine PR. Friis EM. Pedersen KR. The origins and early diversification of Angiosperms. En Gee

H. 2000. Shaking the tree: readings from Nature in the history of life. University of Chicago

Press. 411p.

Cunniff P. 1998. Official Methods of Analysis of AOAC international. Volume II. AOAC

International. Gaitherburg, Maryland, EE.UU. Chapter 37, p. 5.

Decker, E.L., R. Reski. 2004. The moss bioreactor. Curr. Opinion Plant Biol. 7: 166-70.

Douglas M. 2010. Antibiotic Activity of Extracts from some Bryophytes in South Western

British Columbia. MSJA 2: 9-14

Elibol B, Ezer T, Kara R, Yuvalı C, Colak E. 2011. Antifungal and antibacterial effects of some

acrocarpic mosses. Afr. J. Biotechnol. 10(6): 986-89.

Fonnegra R, Jiménez SL. 2006. Plantas medicinales aprobadas en Colombia. Segunda Edición.

Editorial Universidad de Antioquia. Colombia. 368p.

Glime J. 2007. Bryophyte Ecology. Ebook sponsored by Michigan Technological University and

the International Association of Bryologists. Accessed on September 2011 at

<http://www.bryoecol.mtu.edu/>.

Goffinet B. & Shaw J. 2009. Byophyte Biology. Second Edition. Cambridge University Press.

New York. 565p.


41

Gupta MP. 2008. Plantas medicinales iberoamericanas. Programa iberoamericano de ciencia y

tecnología,. Cyted., Convenio Andrés Bello Centro de investigaciones farmacognósticas de la

Flora panameña. Panamá. 1003p.

Häkkinen S. 2000. Flavonols and phenolic acids in berries and berry products. Ph.D. thesis,

University of Kuopio, Finland

Hallingbäck T, Hodgetts N. (compilers) 2000. Mosses, Liverworts, and Hornworts. Status Survey

and Conservation Action Plan for Bryophytes. IUCN/SSC Bryophyte Specialist Group. IUCN,

Gland, Switzerland and Cambridge, UK. 106p.

Hacker, J., Kaper, J.B. (Eds). 2002. Pathogenicity islands and the evolution of pathogenic

microbes. Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Germany.

Heinonen M. 2007. Antioxidant activity and antimicrobial effect of berry phenolicssa Finnish

perspective. Mol. Nutr. Food Res 51:684–691.

Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA Jr, Ezekowitz RAB. 1999. Phylogenetic perspectives in

innate immunity. Science 284(13):13–18

Hohe A. & Reski R. 2002. Optimisation of a bioreactor culture of the moss Physcomitrella

patens for mass production of protoplasts. Plant Science 163:69-74.

Hostettmann K, Gupta MP, Marston A, Ferreira E. 2008. Manual de Estrategias para

Aislamiento de Productos Naturales Bioactivos. Programa Iberoamericano de Ciencia y

Tecnología. Cyted; Convenio Andrés Bello, Bogotá. 120 p.

Kwag JS, Oh HJ, Lee HO, Perry NB, Baek SH. 2003. Screening for Biological Activity of Crude

Extracts from Medicinal plants. Journal of Dental Hygiene Science 3(2): 67-70

Linnares EL., Galeano G., García N., Figueroa Y. 2008. Fibras vegetales empleadas en

artesanías en Colombia. Artesanías de Colombia S.A. Ministerio de Comercio, Industria y

Turismo. Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de

Colombia.


42

Liu RH. 2004. Potential Synergy of Phytochemicals in Cancer Prevention: Mechanism of Action.

J Nutr 134: 3479S-85S.

López P., Rojano B., Echeverry T. 2007. Actividad antioxidante en musgos. Scientia et Technica

Año XIII (33): 23-26

Ludwiczuk, A. and Y. Asakawa. 2010. Chemosystematics of selected liverworts collected in

Borneo. Tropical Bryology 31:33–42.

Mandell GL, Benett JE, Dolin R. 2006. Enfermedades Infecciosas. Sexta Edición. Volumen 2.

ElSevier. 2591p.

Matthews KR. 2006. Microbiología de las frutas y las verduras frescas. Editorial Acribia S.A.

España. 228p.

Martínez JV. Bernal HY & Cáceres A. 2000. Fundamentos de Agrotecnología de Cultivo de

Plantas. Medicinales Iberoamericanas. Convenio Andrés Bello, Subprograma X CYTED. 524p.

McFarland J. 1907. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in

suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J. Am. Med. Assoc. 49:

1176-78.

Mellegård H, Stalheim T, Hormazabal V, Granum PE, Hardy SP. 2009. Antibacterial activity of

sphagnum acid and other phenolic compounds found in Sphagnum papillosum against food-borne

bacteria. Let Appl Microb 49:85–90

Merrell DS, Falkow S. 2004. Frontal and stealth attack strategies in microbial pathogenesis.

Nature 430: 250–56.

Michel P, Burritt DJ, Lee WG. 2011. Bryophytes display allelopathic interactions with tree

species in native forest ecosystems. Oikos 120: 1272–80

Mishra R, Verma DL. 2011. Antifungal Activity of Some Rare Himalayan Bryophytes. Research

Journal of Pharmacy and Technology 4(3): 474

Morantes J., Prieto C., Linares E., Rincón J., Aristizabal F. 2007. Análisis fitoquímico y de

actividad biológica del musgo Polytrichum juniperinum. Rev. Acad. Colomb. Cienc. 31(121)


43

Mullen W, Stewart AJ, Lean MEJ, Gardner P, Duthie GG, Crozier A. 2002. Effect of freezing

and storage on the phenolics, ellagitannins, flavonoids and antioxidant capacity of red

raspberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:5197-201.

Nagashima, F., M. Murakami, S. Takaoka, and Y. Asakawa. 2003. ent-Isopimarane-type

diterpenoids from the New Zealand liverwort Trichocolea mollissima. Phytochemistry 64:1319-

25

Nohynek LJ, Alakomi HL, Kahkonen MP, Heinonen M, Helander IM, Oksman-Caldentey KM,

et al. 2006. Berry phenolics: antimicrobial properties and mechanisms of action against severe

human pathogens. Nutr Cancer 54:18–32.

Ojoo OO, Ajayia O and Anibijuwon I. 2007.Antibacterial potency of methanol extracts of lower

plants. Journal of Zhejiang University Sciences, 8:189-91.

Pereanez, J.A., T. Lobo-Echeverri, B. Rojano, L. Vargas, M. Fernandez, C.A. Gaviria and V.

Nunez, 2010. Correlation of the inhibitory activity of phospholipase A2 snake venom and the

antioxidant activity of Colombian plant extracts. Braz. J. Pharmacog. 20:910-16.

Pérez E. 1996. Plantas Útiles de Colombia. Edición de Centenario. 5ª. Edición. 831p.

Perry NB, Foster LM, Lorimer SD, May BCH, Weavers RT, Toyota M, Nakaishi E, Asakawa Y.

1996. Isoprenyl Phenyl Ethers from Liverworts of the Genus Trichocolea: Cytotoxic Activity,

Structural Corrections, and Synthesis. J. Nat. Prod. 59(8):729–33

Peschel A. 2002. How do bacteria resist human antimicrobial peptides? TRENDS in

Microbiology 10(4): 179-86.

Puupponen-Pimiä R, Nohyne L, Meier C, Kähkönen M, Heinonen M, Hopia A, Oksman-

Caldentey K-M. 2001. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. Journal of

Applied Microbiology 90:494–507.

Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Alakomi HL, Oksman-Caldentey KM. 2005a. Bioactive berry

compounds—novel tools against human pathogens (mini-review). Appl Microbiol Biotechnol

67:8–18


44

Puupponen-Pimia R, Nohynek L, Alakomi HL, Oksman- Caldentey KM. 2005b. The action of

berry phenolics against human intestinal pathogens. Biofactors 23: 243-51

Rahua J, Remes S, Hinonen M, Hopia A, Kähkönnen M, Kujala R, Pihloja K, Vuorela P. 2000.

Antimicrobial effects of finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic

compounds. International Journal Food Microbiology 56(3):3-12

Rawani A, Pal S, Chandra G. 2011. Evaluation of antimicrobial properties of four plant extracts

against human pathogens. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine S71-S75

Russell MD. 2010. Antibiotic activity of extracts from some Bryophytes in South Western British

Columbia. M.S.J.A. 2:9-14.

Sabovljević A, Sabovljević M. 2008. Bryophytes, a source of bioactive and new compounds. In:

J.N. Govil JN, Singh VK (eds.). Phytopharmacology and Therapeutic Values IV, Series ―Recent

Progress in Medicinal Plants‖. - Studium Press LLC, U.S.A. p. 9.

Sabovljević A., Soković M., Glamočlija J., Cirić A., Vujicić M., Pejin B., Sabovljević M. 2010.

Comparison of extract bio-activities of in-situ and in vitro grown selected bryophyte species.

African Journal of Microbiology Research 4(9): 808-12

Sabovljević, A, Soković M, Glamočlija J, Cirić A, Vujicić M, Pejin B, Sabovljevic M. 2011. Bio-

activities of extracts from some axenically farmed and naturally grown bryophytes. J. Med.

Plants Res. 5: 656-71

Sanabria A.1983. Análisis fitoquímico preliminar. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.

Santamarina MP, García FJ, Roselló J. 1997. Biología y Botánica. Tomo II. Editorial Universidad

Politécnica de Valencia. Colección: Libro Docente. Reproval S.L. 367p.

Savaroglu F, Semra I, Cansu F-I. 2011. Savaroglu et al. An evaluation of the antimicrobial

activity of some Turkish mosses Journal of Medicinal Plants Research 5(14): 3286-92

Schaefer D, Zrÿd J. 2001. The Moss Physcomitrella patens, Now and Then. Plant Physiology

127:1430–38


45

Serrano MED, López ML, Espuñes T del RS 2006. Componentes bioactivos de alimentos

funcionales de origen vegetal. Rev Mex Ciênc Farm 37: 58-68.

Shrikumar S, Ravi TK. 2007. Approaches towards Development and Promotion of Herbal Drugs.

Pharmacognosy Reviews 1(1): 180-84

Stewart PS, Costerton JW. 2001. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet 358: 135-38

Stoner GD, Wang L-S, Casto BC. 2008. Laboratory and clinical studies of cancer

chemoprevention by antioxidants in berries. Carcinogenesis 29:1665–74.

Tenover FC. 2006. Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria. The American Journal

of Medicine 119(6A): S3–S10

Vanderpoorten A. & Goffinet B. 2009. Introduction to Bryophytes. Cambridge University Press.

New York. 303p.

Veljić M, Đurić A, Soković M, Ćirić A, Glamočlija J, Marin PD. 2009. Antimicrobial activity of

methanol extracts of Fontinalis antipyretica, Hypnum cupressiforme and Ctenidium molluscum.

Arch. Biol. Sci. 61: 225-29.

Wall M, Eddy R, Mcclennan M, Klump M. 1952. Detection and estimation of steroidal

sapogenins in plant tissue. Analytical Chemistry 24(8): 1337-4.

Walton NJ, Brown DE. 1999. Chemicals from Plants, Perspectives on Plant Secondary Products.

Imperial College Press y World Scientific Publishing. London. 425p.

Xiaowei G. 2007. Chemistry of bryophytes. A Doctoral Thesis. Disponible en:

https://scholarbank.nus.edu.sg/bitstream/handle/10635/13172/CHEMISTRY%20OF%20BRYOP

HYTES-final%20version.pdf?sequence=1.

Xie CF, Lou HX. 2009. Secondary Metabolites in Bryophytes: An Ecological Aspect. Chemistry

Biodiversity 9:303-12.

Zhu RL, Wang D, Xu L, Shi RP, Wang J, Zheng M. 2006. Antibacterial activity in extracts of

some bryophytes from China and Mongolia. Journal of the Hattori Botanical Laboratory

100:603–15.


46

Zinsmeister H, Berckert H, Eicher T. 1991. Bryophytes, a source of biologically active, naturally

occurring material? Angewandte Chemie International Edition in English 30: 130-47


47

14. ANEXOS

Tabla 8. Especies evaluadas

Fruta Nombre científico Familia Comercial / Silvestre

Departamento Municipio Vereda Colecta

Piña Ananas comosus Bromeliaceae Comercial Santander Giron Choca Agosto 3 de 2011

Arandano Vaccnium myrtillus Ericaceae Comercial Cundinamarca Chía Ocatí Junio 17 de 2011

Pera rosada PIT* PIT* Silvestre Cordoba San Carlos Arroyo grande Junio 23 de 2011

Ají dulce PIT* PIT* Silvestre Cordoba Cereté Lorito Junio 23 de 2011

Corozo Bactris minor Arecaceae Silvestre Cordoba Montería Pueblo seco Junio 23 de 2011

Carambolo Averrhoa carambola Oxiladaceae Comercial Valle La Unión - Agosto 15 de 2011

Níspero Manilkara sp. Sapotaceae Comercial Cordoba Cereté El retiro de los indios Junio 23 de 2011

Uva Vitis labrusca Vitaceae Comercial Valle del cauca La Unión - Agosto 15 de 2011

Agraz Vaccinium meridionale

Ericaceae Comercial Boyacá San Miguel - Junio 17 de 2011

Mora Rubus sp. Rubiaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011

Musgo 1 Sphagnum sp. Sphagnaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011

Musgo 2 Hypnum amabile Hypnaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011

Hepática 1 Metzgeria sp. Metzgeriaceae Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011

Hepática 2 Trichocolea sp. Trichocoleaceae

Silvestre Cundinamarca La Calera Buenos Aires Alto Julio 27 de 2011

*En proceso de Identificación taxonómica por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana (HPUJ)


48

Tabla 9. Parámetros físico-químicos de los jugos de fruta evaluados

Peso Crisol Vacio (g)

Peso Crisol con Jugo (g)

Peso final Seco (g)

Peso Jugo (g)

Peso Agua (g)

Solidos totales (g)

% Sólidos (% m/m)

% Humedad

Densidad (g/ml)

Concentración/pozo (mg/ml)

Piña 13.2472 14.3329 13.8383 1.0857 0.4946 0.5911 54.44 45.56 1.3186 1.21

Mora silvestre 13.3879 14.4596 13.4383 1.0717 1.0213 0.0504 4.70 95.30 1.2881 13.70

Arándano 13.2536 14.1081 13.3706 0.8545 0.7375 0.117 13.69 86.31 1.2805 4.68

Pera rosada 12.1863 13.6246 12.2767 1.4383 1.3479 0.0904 6.29 93.71 1.2803 10.18

Ají dulce 13.6235 14.2414 13.7309 0.6179 0.5105 0.1074 17.38 82.62 - -

Corozo 13.5595 15.8380 14.1110 2.2785 1.727 0.5515 24.20 75.80 1.2713 2.63

Carambolo 13.2568 15.8819 13.5115 2.6251 2.3704 0.2547 9.70 90.30 1.3023 6.71

Níspero 13.1208 14.6222 13.4478 1.5014 1.1744 0.327 21.78 78.22 1.3779 3.16

Agraz 13.6777 15.781 13.9603 2.1033 1.8207 0.2826 13.44 86.56 1.3211 4.92

Uva Isabella 13.1216 14.9984 13.3412 1.8768 1.6572 0.2196 11.70 88.30 1.0622 4.54


50

Figura 3. Briófitos evaluados: los musgos Sphagnum sp. y Hypnum sp. y las hepáticas Metzgeria

sp. y Trichocolea sp.


51


52

Figura 4. Frutas evaluadas: Piña, mora silvestre, arándano, pera rosada, ají dulce, corozo, uva

Isabella, agraz, carambolo y níspero costeño.

Figura 5. Resultados de las pruebas antimicrobianas para los cuatro briófitos (a las dos

concentraciones activas) contra algunas de las bacterias evaluadas. Control negativo DMSO puro

y control positivo Clindamicina.


53

Figura 6. Resultados de las pruebas antimicrobianas para las cuatro bayas con actividad

antibacteriana (mora silvestre, arándano, agraz y uva Isabella), contra algunas de las bacterias

evaluadas. Control negativo agua y control positivo Clindamicina.

evaluación de la actividad antibacteriana de cuatro

Documents