en el estado de durango, mxico, la elaboracin de mezcal se...

INFORME FINAL DEL PROYECTO “Estandarización de un método para la caracterización molecular por medio de marcadores ISTR de la diversidad del

Complejo Agave durangensis “, CLAVE SIP 20070192, RESPONSABLE NORMA ALMARAZ ABARCA

RESUMEN

Dada la importancia que ha tomado recientemente Agave durangensis para la

elaboración de mezcal en el Estado de Durango y la problemática existente en torno a

la pérdida de variabilidad genética de sus poblaciones naturales causada por la

recolección indiscriminada de plantas, la problemática taxonómica con respecto a su

delimitación taxonómica, y a la necesidad de contar con técnicas que permitan

autentificar el origen botánico de la planta de agave utilizada en la elaboración de

mezcal como una medida del control de calidad y como un parámetro para sustentar la

denominación de origen de esa bebida, en este trabajo se estandarizó un método

molecular basado en marcadores ISTR, que puede ser utilizado para detectar la

variabilidad genética, para discriminar entre especies de Agave, y para determinar el

origen botánico de las piñas para la elaboración de mezcal.

ESTADO DEL ARTE

En el Estado de Durango, México, la elaboración de mezcal se realiza principalmente

con plantas de agave que son recolectadas de sus poblaciones naturales.

Recientemente se ha incrementado la demanda de agave para la elaboración de esa

bebida. Esto ha provocado una sobreexplotación indiscriminada del recurso, ya que no

se conoce con exactitud la especie de agave que se colecta, ni el número de especies

de este recurso que pueden ser utilizadas para la elaboración de mezcal, de tal

manera que se habla de un complejo, el complejo Agave durangensis (Valenzuela-

Ruíz y cols., 2003). Esa sobreexplotación está provocando la pérdida de la variabilidad

intra e interpoblacional de este recurso en el Estado.

La caracterización genética de las poblaciones contribuye a la conservación de los

recursos naturales proporcionando herramientas que describen la diversidad genética

y un marco teórico para entender los cambios evolutivos y la variación de los patrones

genéticos de las poblaciones naturales (Sosa, 2001).

Las técnicas moleculares actuales permiten visualizar variaciones en el ADN que

pueden ser útiles para la caracterización genética de las poblaciones, para la

delimitación e identificación de especies y para establecer filogenias (Nyffeler, 2002;

Good-Avila y cols., 2006).

Recientemente la caracterización molecular de los recursos vegetales se ha convertido

en un elemento importante para la certificación o denominación de origen de los

propios recursos (especie o variedad de planta) y del o los productos que se generan

de su procesamiento para cumplir con los estándares nacionales e internacionales de

control de calidad (Deguilloux y cols., 2004).

La visualización de caracteres moleculares actualmente representa un elemento

esencial en todos los aspectos involucrados en el mejoramiento genético de recursos

vegetales, facilitando la identificación de los genes responsables de los caracteres

deseados y el manejo de los programas de mejoramiento (Dreher y cols., 2003; Celis y

cols., 2004).

En la actualidad existe una gama muy amplia de técnicas moleculares que pueden

utilizarse en el estudio de la diversidad vegetal. Esas técnicas difieren en la

sensibilidad para resolver diferencias genéticas, en el tipo de datos que generan y en

los niveles taxonómicos en que pueden ser aplicadas (Karp y cols., 1996).

La técnica de detección de polimorfismo asociado a la inserción de retrotransposones

en el genoma, basada en marcadores ISTR (Inverse Sequence Tagged Repeat) ha

sido utilizada con éxito en estudios sobre la diversidad en Agave fourcroydes (Infante y

cols., 2003) y Agave tequilana (Torres-Morán y cols., 2005).

Sin embargo, para poder realizar estudios moleculares es necesario contar con

métodos de aislamiento de ADN que permitan obtenerlo en cantidad y calidad

adecuadas. A pesar del gran número de métodos que es posible encontrar en la

bibliografía se sigue considerando que el problema de la extracción del ADN es aún un

aspecto importante en el campo de la biología molecular vegetal (Csail y cols., 1998) y

se continúa trabajando en el desarrollo de métodos de aislamiento específicos y

novedosos como el desarrollado por Manen y cols. (2005) en el que utilizan una

mezcla de enzimas degradadoras de carbohidratos obtenida de Trichoderma

longibrachiatum Rifai mantenida en cultivo.

Previo a cualquier estudio sobre marcadores moleculares, es un requisito

indispensable contar con métodos de aislamiento de material genético que permitan

obtener ADN en cantidad y calidad adecuadas. Los análsis moleculares de especies

vegetales actualmente se pueden considerar como un requisito en estudios con fines

taxonómicos, filogenéticos y evolutivos. Para poder realizar esos análisis es

indispensable contar con métodos que permitan obtener ADN en cantidad y calidad

adecuadas para que éste pueda ser sometido a fraccionamiento por medio de enzimas

de restricción o a amplificación por medio de PCR. Algunos autores han sugerido que

un solo método de extracción de ADN puede ser adecuado para una gama amplia y

diversa de especies vegetales (Doyle y Doyle, 1987; Palmer, 1988; Guillemaut y

Marechal-Drouard, 1992). Lo mismo ha sido afirmado por diferentes empresas que

ofertan kits para el aislamiento, en general, de ADN vegetal (por ejemplo los kits que

vende Promega). Sin embargo, existen autores que afirman que algunas especies

vegetales requieren condiciones muy específicas en alguno o algunos de los pasos del

proceso de aislamiento de ADN (Almaraz-Abarca, 1994; De la Cruz y cols., 1997; Csail

y cols., 1998).

A pesar de la existencia de paquetes comerciales con los que, de acuerdo al

fabricante, se garantiza la obtención de ADN a partir de especies de muy diversos

grupos, en muchos laboratorios de investigación se prefiere estandarizar sus propios

métodos según las especies a trabajar, porque la calidad y la cantidad del ADN

obtenido con los paquetes comerciales no siempre son las adecuadas. Existen

diferentes métodos para la extracción de ADN a partir de plantas, cada uno con

diferentes eficiencias. Algunos de ellos son muy complicados y prolongados y

requieren utilizar dos solventes orgánicos muy tóxicos como el fenol y el cloroformo

(Palmer, 1988) para la purificación del ADN; otros como el desarrollado por Herrmann

(1982) además del uso de esos solventes orgánicos requiere de un paso largo de

diálisis para el mismo fin. Otros métodos, extremadamente largos y complicados como

el de Rogers y Bendich (1992) utilizan ultracentrifugación en gradientes de cloruro de

cesio (ScCl) durante periodos largos, de 12 a 16 horas; la utilización de bromuro de

etidio (EtBr) para localizar las fracciones de ADN al iluminar los tubos del gradiente

con luz ultravioleta; y pasos igualmente largos de diálisis para eliminar de las muestras

de ADN residuos de ScCl y de EtBr.

En 1984, Saghai-Maroof y col. desarrollaron un método de aislamiento de ADN mucho

más accesible en términos de tiempo, de trabajo y de recursos, y que partía de

cantidades pequeñas de tejido vegetal. Ese método usaba el detergente catiónico

bromuro de hexadeciltrimetiamonio (CTAB) a concentraciones altas, para el paso de

lísis de las células vegetales, en sustitución del detergente más comúnmente usado

dodecil sulfato de sodio (SDS). A partir de la aparición de este método, prácticamente

todos los métodos desarrollados posteriormente utilizan el CTAB como detergente

para la lisis de las células vegetales, debido a que éste precipita los ácidos nucleicos

como sales insolubles de CTAB en soluciones de cloruro de sodio diluidas sin

precipitar proteínas contaminantes, lo que a su vez disminuye el riesgo de degradación

del material genómico.

En algunas especies o estadíos fisiológicos es difícil el aislamiento del ADN tal como

está recomendado en los protocolos. Tal es el caso de plantas maduras porque

contienen grandes cantidades de polisacaridos y de compuestos fenólicos que son

difíciles de separar del ADN (Cheng y col., 1997; Tibbits y cols., 2006; Cota-Sánchez y

cols., 2006). Obtener ADN puro en cantidades adecuadas es el cuello de botella de

muchos estudios moleculares.

Los agaves son una fuente importante de carbohidratos y compuestos secundarios

tales como saponinas y compuestos fenólicos (Williams, 1975), los cuales hacen de la

extracción del ADN puro un proceso particularmente difícil. Algunas especies de

Agave para las que se han desarrollado métodos de aislamiento de ADN para la

caracterización molecular con fines taxonómicos y de determinación de la variabilidad

genética son Agave fourcroydes (Infante y cols., 2003) y Agave tequilana (Torres-

Morán y cols., 2005).

Todos los métodos de aislamiento de ADN comprenden en general, tres etapas. La

primera comprende la homogeneización de los tejidos a partir de los cuales se aislará

el material genético. La segunda, comprende la lísis de las células de los tejidos

homogeneizados; el objetivo de esta etapa es liberar las moléculas de ADN contenidas

dentro de los organelos (núcleo, mitocondria y cloroplasto, en el caso de las plantas).

La tercera contempla la purificación de las moléculas de ADN para separarlo de

compuestos contaminantes que puedan interferir con los análisis moleculares para los

cuales se aísla el ADN.

En la etapa de homogeneización se debe considerar a) la selección del material

vegetal (tipo de tejido), del cual se va a obtener el ADN, b) la edad de la planta, si

plantas adultas con hojas completamente desarrolladas o bien, plántulas, de pocos

días de edad, las cuales contienen menos compuestos del metabolismo secundario

(Bookjans y cols., 1984; Jones, 1988; Mourad y Polacco, 1989), y c) pretratamientos,

de duración variable, de etiolación, durante los cuales se consume la mayor parte del

almidón almacenado en los tejidos vegetales e interrumpe la síntesis de compuestos

secundarios (Taiz y Zeiger, 1991), todos los cuales son sustancias contaminantes en

el proceso de aislamiento de ADN.

El objetivo de la homogeneización es la disgregación de las células que forman los

tejidos. Durante esta etapa también puede ocurrir la ruptura celular, por lo que la

composición química del medio o regulador es muy importante, ya que éste debe

contener sustancias que inhiban la actividad de nucleasas liberadas durante la ruptura

celular que pudieran degradar el material genético (Herrmann, 1982). Las sustancias

inhibidoras de nucleasas más comúnmente usadas son la sal disódica del

etilendinitrilotetracetato (EDTA-Na), el cual quela cationes divalentes como el Mg++,

con lo que se inactivan las ADNasas liberadas durante la ruptura celular al secuestrar

a su cofactor (Herrmann, 1982); y el ß-mercaptoetanol, el cual es un agente

antioxidante y que desnaturaliza las proteínas al romper los puentes disulfuro que se

forman entre los aminoácidos que contienen azufre de una enzima y altera la

conformación estructural y por lo tanto su actividad (Gordon, 1975).

Otro elemento que puede ser agregado al medio de homogeneización es una

sustancia, como la polivinilpirrolidona (PVP) y el polietilenglicol (PEG 4000), que

forman complejos con polifenoles a través de enlaces de hidrógeno, y los remueve de

manera efectiva del homogeneizado (John, 1992).

Para algunos autores la etapa de lisis es la más crítica en el proceso de aislamiento

del ADN. Este paso está influenciado, entre otros factores, por la fuerza iónica del

medio o regulador, la temperatura y la calidad y cantidad del detergente usado para

lisar las membranas celulares (Herrmann, 1982; Milligan, 1989). Los detergentes más

ampliamente utilizados son el dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsarcosilato de

sodio (sarcosilo), el tritón 100 (Herrmann, 1982), y el bromuro de

hexadeciltrimetilamonio o cetiltrimetilamonio o CTAB (Bellamy y Ralph, 1968; Milligan

1989; Doyle y cols., 1990).

El CTAB, el detergente usado en los dos métodos evaluados en este estudio, es un

detergente catiónico que precipita los ácidos nucléicos como sales insolubles de CTAB

en soluciones de NaCl diluidas sin precipitar impurezas de alto peso molecular como

las nucleasas y los polisacáridos (Bellamy y Ralph, 1968). Sin embargo, en algunas

ocaciones, los polisacaridos pueden coprecipitar con el ADN es especies vegetales

muy recalcitrantes y entonces es recomendable buscar fuentes de tejido diferentes al

foliar, tales como cotiledones o embriones (Rogers y Bendich, 1992). Algunas

preparaciones proteolíticas tales como la Pronasa, preparada a partir del hongo

Streptomyces griseus, y la Proteinasa K, también pueden ser utilizadas como agentes

de lisis; sin embargo, su acción se considera incompleta (Milligan, 1989).

La purificación de las preparaciones de ácidos nucleicos tiene por objetivo eliminar

contaminantes de proteínas y polisacáridos, principalmente, que hayan coprecipitado

con el ADN en la etapa de lisis. Los primeros métodos utilizaron la ultracentifugación

en gradientes de CsCl (Sambrook y col., 1989), sin embargo, aunque este es un

método muy efectivo es también muy largo y caro. Los solventes orgánicos, tales

como el fenol y/o el cloroformo han representado una alternativa adecuada y más

accesible en términos de tiempo, trabajo y costo. Estos solventes favorecen la

disociación entre proteínas y ácidos nucleicos que se encuentran en solución acuosa,

por lo que su acción es desproteinizante (Wallace, 1987)

En este estudio se estandarizó un método, basado en la detección de la variabilidad

generada por elementos retrotransposables (marcadores ISTR), que permitirá realizar

la caracterización molecular del Complejo Agave durangensis en el Estado de

Durango. La caracterización molecular de este Complejo podrá contribuir a determinar

a) los niveles de variabilidad genética, las estructuras genéticas intrapoblacionales, la

distribución de la diversidad genética interpoblacional; b) delimitar el número de

especies que forman el complejo; c) caracterizar molecularmente líneas productoras

deseables, considerando caracteres químicos como concentración de azúcares y de

fenoles con función antioxidante (determinados por HPLC) y caracteres fisiológicos

como resistencia a enfermedades y plagas; y d) proporcionar marcadores útiles para

fundamentar la certificación de origen. Con esto se pretende contribuir al

establecimiento de las acciones necesarias para la conservación y aprovechamiento

sostenible de este recurso natural.

OBJETIVO

Estandarizar un método, basado en la variabilidad generada por elementos

retrotransposables (marcadores ISTR), que permita realizar la caracterización

molecular del Complejo Agave durangensis en el Estado de Durango para estimar la

diversidad de taxa que forman este Complejo.

MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal

Se utilizaron con fines comparativos, hojas y raíces de plántulas obtenidas de semillas

germinadas de Agave durangensis. Las semillas se colectaron en el municipio de

Nombre de Dios, Dgo. en Septiembre de 2004. La identificación botánica de las

plantas de Agave se realizó con base en sus características morfológicas. Las

plántulas se mantienen vivas en el laboratorio de Biotecnología del CIIDIR-IPN-Dgo.

Aislamiento de ADN total

Se probaron dos métodos para la extracción de ADN de Agave durangensis, el de

Doyle y Doyle (1987), el cual de acuerdo a los propios autores permite obtener ADN

en cantidad y calidad adecuadas para el análisis molecular de una gama muy amplia

de especies vegetales; y el Infante y col. (2006), el cual funciona adecuadamente para

Agave cocui. Estos métodos se siguieron inicialmente, lo más fielmente posible según

los recursos disponibles y después se evaluaron pretratamientos o se hicieron

modificaciones en alguno de los pasos. A continuación se describen los dos métodos,

los pretratamientos y modificaciones, en los casos que corresponda, que se

implementaron para evaluar las condiciones que permitieran obtener ADN de Agave

durangensis, posible de amplificar por PCR.

Se evaluó la cantidad y la calidad del ADN total de plántulas de Agave durangensis

obtenido por el protocolo propuesto por Doyle y Doyle (1987), evaluando los siguientes

parámetros: el tipo de tejido (hojas o raíces), tiempo de etiolación (de 5 a 36 días), y la

condición de homogeneización de los tejidos vegetales (en nitrógeno líquido y en

regulador de aislamiento a 65 °C). Los resultados obtenidos se compararon con los

generados utilizando el protocolo de aislamiento de ADN propuesto por Infante y cols.

(2006), evaluando la adición al protocolo original, de un paso de lavado de ADN con

cloroformo. Ambos protocolos utilizan el detergente CTAB para solubilizar y lisar las

membranas celulares de las células vegetales, sin embargo se distinguen por una

serie de factores que se pueden apreciar después de la descripción de cada uno de

ellos. El protocolo de Doyle y Doyle (1987) se describe a continuación.

1. Precalentar de 5-7.5 ml de regulador de aislamiento de CTAB (CTAB al 3%.

NaCl 1.4M, 2-mercaptoetanol al 0.2%, EDTA 20 mM, Tris-HCl 1000mM) en

tubo de centrifuga de vidrio de 30 ml, a 60ºC en un baño de agua.

2. Macerar tejido fresco, 0.5-1.0 g, en regulador de aislamiento de CTAB a 60ºC

en un mortero precalentado.

3. Incubar la muestra a 60ºC durante 60 min. Con agitación suave ocasional.

4. Extractar una vez en cloroformo-isoamilalcohol (24:1) mezclando suave pero a

través de toda la muestra.

5. Centrifugar en rotor de libre cupo, a temperatura ambiente para concentrar la

fase, a 5000 rpm, durante 15 min.

6. Remover la fase acuosa con una pipeta de boca ancha, transferirla a un tubo

de centrifuga de vidrio limpio adicionar 2/3 de volumen de isopropanol frío,

agitar suavemente para precipitar los ácidos nucleicos. Dejar en congelación

24 hrs.

7. Centrifugar a 2500 rpm durante 2 min. Suavemente verter tanto sobrenadante

como sea posible sin perder la pastilla que es floja y difusa. Adicionar buffer de

lavado directamente a la pastilla y agitar suavemente para resuspender los

ácidos nucleicos. Dejar lavando un mínimo de 20 min.

8. Desechar sobrenadante cuidadosamente y permita secar la pastilla

brevemente a temperatura ambiente.

9. Resuspender los ácidos nucleicos en 200 µl de TE.

El protocolo de Infante y cols. (2006) se describe a continuación:

1. Pesar 0.2 g de tejido fresco.

2. Macerar con nitrógeno líquido.

3. Agregar 200 uL de Buffer A (CTAB, 2% (p/v); Tris HCl, 100 mM; EDTA, 20 mM;

NaCl, 1.4 M; PVP 40, 4% (p/v); Ácido ascórbico 0.1% (p/v) y B-

Mercaptoetanol, 10 mM.), 600 uL de Buffer B (Tris HCl, 100 mM; EDTA, 50

mM; NaCl, 100 mM y B-Mercaptoetanol, 10 mM.) y 67 uL de Dodecil Sulfato de

Sodio (SDS) al 20%.

4. Agitar en vortex e incubar a 65° C durante 30 min, Dejar enfriar.

5. Agregar 300 uL de Acetato de potasio 5M frio.

6. Centrifugar a 12300 RPM 15 min.

7. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y agregar 0.5V de isopropanol frio e

incubar por 20 min en hielo.


9. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla con 500 uL de Etanol 70%. Dejar

secar.

10. Resuspender en 600 uL de regulador TE (Tris Base, 10 mM; EDTA, 1 mM) y

posteriormente agregar 60 uL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) con Ácido acetico

glacial y 660 uL de isopropanol frío. Incubar en hielo 20 min.


12. Repetir dos veces los pasos 9, 10 y 11.

13. Resuspender en 50 uL de TE.

La modificación evaluada a este segundo protocolo fue la adición de un paso de

lavado con un volumen equivalente de cloroformo entre el paso 6 y 7, y en seguida

uno de centrifugación a 12300 rpm, durante 10 minutos a temperatura ambiente y

eliminar el paso 12 del protocolo de Infante y cols. (2006).

Evaluación espectrométrica de la cantidad del ADN obtenido

La cantidad de ADN obtenido en cada análisis se cuantificó de acuerdo a lo descrito

por Sambrook y cols. (1989) y considerando, de acuerdo a esos mismos autores, que:

1A = 50 ng/µl de ADN de doble hebra (Fórmula 1)

Donde A = absorbancia

1. Tomar 4 uL del ADN obtenido y diluirlo en 496 uL de agua destilada (dilución 1/125).

2. Calibrar el espectrofotómetro a 260 usando como blanco agua destilada.

3. Registrar el valor de A260 de cada muestra y calcular de acuerdo a la fórmula 1 y el

factor de dilución, la concentración de ADN correspondiente.

4. Calibrar el espectrofotómetro a 280 usando como blanco agua destilada.

5. Cuantificar cada una de las muestras.

3.4 Evaluación espectrométrica de la pureza del ADN obtenido

Para cada muestra de ADN obtenida y resuspendida en TE se determinó, de acuerdo

a Towner (1991) y Sambrook y col. (1989), su valor de absorbancia a 240 nm y 280

nm para estimar la pureza con respecto a la presencia de carbohidratos y proteínas,

respectivamente; considerando que las soluciones de ADN cuya proporción A260/A240

tiene valores entre 1.7 y 2.0 y cuya proporción A260/A280 tiene valores mayor de 1.8,

tienen niveles suficientemente bajos de carbohidratos y proteínas, respectivamente,

para ser utilizado en la técnica de PCR.

Estimación del tamaño molecular y de la integridad del ADN obtenido

Las estimaciones del tamaño molecular de la integridad de las muestras de ADN se

realizaron por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo a lo descrito por

Andrews (1994). El ADN de alto peso molecular tiene una migración electroforética

muy baja en un gel de agarosa al 0.8% y una muestra de ADN lo suficientemente

íntegro, presentará un fondo muy tenue de color (backgrown) a lo largo de su carril

después de un análisis electroforético. Tanto tamaño molecular como integridad de las

muestras de ADN se determinaron en un gel de agarosa al 0.8 %. La preparación de

los geles se realizó de acuerdo a lo descrito en Sambrook y cols. (1989):

1. La agarosa en polvo se adiciona al regulador de electroforesis (TAE: Tris-base

40 mM, pH 8; ácido acético 20 mM; EDTA-Na 2 mM) en la cantidad adecuada

para preparar un gel al 0.8 % y se disuelve en baño María. Es importante

asegurarse que la solución esté completamente disuelta, su apariencia debe

ser homogénea.

2. La solución de agarosa homogénea se deja enfriar, a 55ºC para soluciones

menores al 1% y a 50ºC para concentraciones mayores de 1%.

3. Verter la solución de agarosa en el molde. Coloca el peine en su lugar antes de

verter el gel. No se deben forman burbujas.

4. Una vez solidificado el gel se remueve cuidadosamente el peine. En este paso,

los pozos se pueden llenar con regulador de electroforesis y si es necesario el

gel se envuelve en una bolsa de plástico y se puede mantener en refrigeración

durante uno o dos días.

Tres microlitros de cada muestra de ADN se mezclaron con tres microlitros de

regulador de muestra (Glicerol al 25%, azul de bromofenol al 0.25%, disueltos en

regulador TAE 10X). Los seis microlitros se depositaron dentro de los posillos del gel,

previamente sumergido en TAE 1X dentro de la cámara.

El voltaje utilizado en las electroforesis fue de 70 V. La corriente se detuvo cuando el

regulador de muestra llegó al extremo opuesto del gel.

Los geles fueron teñidos en una solución de bromuro de EtBr (bromuro de etidio), en

una proporción de 1 µl/ml, a partir de una solución stock de EtBr (5 mg/ml, en agua

destilada) o con CyberGreen, adicionado junto con las muestras de ADN, en una

proporción uno a uno. El marcador de peso molecular fue tratado de la misma manera

y sometido a electroforesis en el mismo gel que las muestras de ADN.

Amplificación por PCR de las muestras de ADN obtenidas

Para seleccionar qué protocolo de aislamiento de ADN de Agave durangensis permitió

obtener este material genético en cantidad y calidad adecuadas para utilizarse en

análisis moleculares, cada una de las muestras se sometieron a amplificación por

PCR. Las condiciones de amplificación utilizadas fueron las descritas por Infante y

cols. (2006).

Las mezclas de reacción estuvieron formadas por: iniciador F (5’---3’) 0.3 µM, iniciador

B (3’---5’) 0.3 µM, regulador PCR 1X, MgCl 3 mM, ADN 25 ng/µl, Taq polimerasa 1U,

dNTPs 0.25 mM, H2O la necesaria para ajustar a un volumen final de reacción de 20

µl.

Los iniciadores F y B utilizados amplifican, de acuerdo a Infante y cols. (2006)

secuencias de ADN asociadas a elementos transposables del género Agave.

El programa del termociclador empleado también fue el descrito por Infante y cols.

(2006). Este programa comprendió un primer paso de 3 minutos a 95°C; un segundo

paso de 40 ciclos, cada uno comprendiendo 0.3 minutos a 95°C, 1 minuto a 45°C, y 2

minutos a 72°C; y un tercer paso de 10 minutos a 72°C.

Separación de los fragmentos de amplificación

Los fragmentos de amplificación se separaron en geles de poliacrilamida como indican

Infante y cols. (2006). Se prepararon geles de poliacrilamida al 6%, de acuerdo a

Sambrook y col. (1989). Los componentes del gel, para 70 ml, fueron 10.5 ml de una

solución de acrilamida al 40%, 7 ml de regulador TBE (trisma base, ácido bórico,

EDTA) 10X, 32.2 g de urea, 240 µl de APS (persulfato de amonio), y 32 µl de temed.

Como regulador de la cámara se utilizó TBE 1X, se depositaron 8 µl de muestra de

ADN en los posillos. Se aplicaron 65 W durante todo el tiempo de análisis.

Visualización de los fragmentos de amplificación

Dado el tamaño de los fragmentos esperados y la mayor sensibilidad de la tinción con

sales de plata con respecto a otros tipos de tinción, se utilizó la primera vara visualizar

los fragmentos de amplificación de las muestras de ADN de Agave durangensis. Una

vez terminada la electroforesis, los geles se sumergieron en una solución fijadora (100

ml de ácido acético glacial y 900 ml de agua bidestilada) durante 20 minutos, se

lavaron dos veces en agua bidestilada durante 2 minutos, se sumergieron en una

solución de nitrato de plata (1 g de AgNO3, 1.5 ml de una solución de formaldehído al

37% y 1 l de agua bidestilada) durante 30 minutos, se lavaron en agua bidestilada

durante 1 minuto, se sumergieron en una solución reveladora (30 g de carbonato de

calcio, 1.5 ml de una solución de formaldehído al 37%, 200 µl de una solución de

tiosulfato de sodio a una concentración de 10 mg/ml, y 1 l de agua bidestilada) durante

5 minutos, y se lavaron con agua bidestilada durante 2 minutos.

RESULTADOS Cantidad y pureza del ADN obtenido

La determinación de la cantidad de ADN obtenido se realizo por medio de lecturas de

absorbancia a 260 nm, de cada una de las muestras. En la tabla 1 se presentan los

valores de absorbancia a esa longitud de onda y la estimación de la cantidad de ADN

obtenido en las diferentes condiciones evaluadas con el protocolo de Doyle y Doyle

(1987).

Tabla 1. Valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm, 240 nm; valores de las relaciones A260/A280 y A260/A240; y estimación de la concentración de ADN obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987), bajo diferentes condiciones de extracción

Tejido Etiolación

(días)

N2

líquido

*A260 *A240 *A280 **A260/A280 **A260/A240 **ADN mg/ml

Raíz 13 días No 0.037 0.025 0.030 0.018 0.019 0.008 2.536 1.315 193.75

Hoja 13 días No 0.007 0.127 0.002 0.091 0.001 0.062 4.524 2.445 391.75

Raíz 20 días No 0.056 0.076 0.043 0.055 0.029 0.038 1.965 1.341 412.50

Hoja 20 días No 0.046 0.054 0.029 0.034 0.019 0.022 2.437 1.587 312.50

Raíz 28 días No 0.111 0.099 0.072 0.062 0.055 0.054 1.925 1.418 656.25

Hoja 28 días No 0.022 ---- 0.010 --- 0.009 --- 2.440 2.200 137.5

Raíz 29 días Sí 0.157 0.053 0.089 0.018 0.071 0.025 2.165 2.354 656.25

Hoja 29 días Sí 0.052 0.057 0.033 0.033 0.026 0.029 1.982 1.651 340.25

Raíz 36 días No 0.097 0.523 0.066 0.319 0.047 0.254 2.061 1.554 1937.5

Hoja 36 días No 0.125 0.166 0.077 0.092 0.060 0.083 2.041 1.713 909.37

* Valores correspondientes a dos repeticiones, ** Valores promedio

Lo correspondiente para el ADN obtenido con las diferentes condiciones evaluadas

utilizando el protocolo de Infante y cols. (2006) se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm, 240 nm; valores de las relaciones A260/A280 y A260/A240; y estimación de la concentración de ADN obtenido con el protocolo de Infante y cols. (2006) y las modificaciones señaladas en el texto. Modificación A260 A280 A240 *A260/A280 *A260/A240 *ADN

(mg/ml)

R1 R2 R1 R2 R1 R2

Con lavado

adicional con

cloroformo 0.231 0.205 0.118 0.120 0.1360.135 1.832 1.608

1362.5

Sin lavado

adicional con

cloroformo

0.114 0.122

0.099 0.080

0.068 1.00

1.600

0.899

735.50 R1 y R2: repeticiones

* Valores promedio

La forma general de los espectros de absorción entre 200 y 300 nm

y los valores de las relaciones A260/A280 y A280/A240 permiten estimar la pureza del

ADN obtenido.

En las figuras 1 a 21 se presentan los espectros de absorción de cada una de las

muestras de ADN obtenido con el protocolo de aislamiento de Doyle y Doyle (1987) y

bajo las diferentes condiciones evaluadas. En la tabla 1.0 se presentan los valores

correspondientes de absorbancia de las relaciones A260/A280 y A280/A240.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

230 240 250 260 270 280 290 300

Longitud de Onda (nm)

Figura 1. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 5

días de etiolación.

Abso

rban

cia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 2. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 5


Abso

rban

cia

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

238 248 258 268 278 288 298


Figura 5. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 13


Abso

rban

cia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

220 230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 6. Espectro de absorción UV del ADN de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 13


Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

220 230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 7. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 20


Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

220 230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 9. Espectro de absorción UV de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 20


Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

220 230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 11. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de raíz con 28


Abs

orba

ncia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 13. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensisobtenido con el método de Doyle y Doyle (1987) a partir de hoja con 28


Abs

orba

ncia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

220 230 240 250 260 270 280 290 300



días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.

Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

220 230 240 250 260 270 280 290 300



días de etiolación y el tejido macerado con Nitrógeno líquido.A

bsor

banc

ia

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

220 230 240 250 260 270 280 290 300



días de etiolación.A

bsor

banc

ia

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

220 230 240 250 260 270 280 290 300




Abs

orba

ncia

En la figura 22 se presenta el espectro de absorción de una de las muestras de ADN

obtenido con el protocolo de aislamiento de Infante y cols. (2006) y con las

modificaciones evaluadas. En la tabla 2.0 se presentan los valores correspondientes

de absorbancia de las relaciones A260/A280 y A260/A240.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

220 230 240 250 260 270 280 290 300


Figura 22. Espectro de absorción UV del DNA de Agave durangensis obtenido con el método de Infante y cols. (2006) a partir de hoja de plantas adultas y macerado el

tejido con Nitrógeno líquido.

Abs

orba

ncia

Tamaño molecular e integridad del ADN obtenido.

Las apreciaciones del tamaño molecular y de la integridad del ADN se realizaron con

base en los resultados de la electroforesis en geles de agarosa.

Las figuras 23 a 26 muestran los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio para

las muestras de ADN obtenidas con el protocolo de Doyle y Doyle (1987) y la figura 27

muestra las obtenidas con el protocolo de Infante y cols. (2006).

Figura 23. ADN de Agave durangensis, obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987), con 36 días de etiolación. De izquierda a derecha: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz.

Figura 24. ADN de Agave durangensis, obtenido con el protocolo de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, con 36 días de etiolación; carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz, con 13 días de etiolación, carril 4 y 5: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación. De izquierda a derecha, parte inferior: carril 1: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación, carril 2 y 3: ADN obtenido a partir de raíz, con 20 días de etiolación, carril 4 y 5: ADN obtenido a partir de hoja, con 20 días de etiolación.

Figura 25. ADN de Agave durangenisis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de raíz, con 5 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de hoja, con 5 días de etiolación, carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de raíz, con 13 días de etiolación, carril 7: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación. De izquierda a derecha, parte inferior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de hoja, con 13 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de raíz, con 20 días de etiolación y carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de hoja, con 20 días de etiolación.

Figura 26. ADN de Agave durangensis obtenido con el método de Doyle y Doyle (1987). De izquierda a derecha, parte superior: carril 1 y 2: ADN obtenido a partir de raíz, con 28 días de etiolación, carril 3 y 4: ADN obtenido a partir de hoja, con 28 días de etiolación, carril 5 y 6: ADN obtenido a partir de raíz, con 29 días de etiolación y macerado el tejido con Nitrógeno líquido, carril 7 y 8: ADN obtenido a partir de hoja, con 29 días de etiolación y macerado el tejido con Nitrógeno líquido. La parte inferior del gel es repetición de la parte superior.

Figura 27. ADN de Agave durangensis obtenido con el método de Infante y col. (2006). De izquierda a derecha, carriles 1 a 5: ADN obtenido de acuerdo al método sin modificar, carriles 6 a 10: ADN obtenido con el paso adicional de lavado con cloroformo.

Amplificación del ADN obtenido

Los fragmentos de amplificación, visualizados en geles de acrilamida teñidos con sales

de plata, de las muestras de ADN sometidas a análisis de PCR se muestran en la

figura 30.

Figura 31. Fragmentos de amplificación obtenidos a partir del ADN de A. durangensis. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Cantidad y pureza del ADN obtenido

En general, el protocolo de Infante y col. (2006) permite obtener una menor cantidad

de ADN (1362.5 mg/ml) que el de Doyle y Doyle (1987) (1937.5 mg/ml, máximo). Esos

valores corresponden a 6.812 mg/g de tejido y 9.687 mg/g de tejido fresco,

respectivamente; valores que son en ambos casos, superiores a los reportados por

otros autores (Keb-Llanes y cols., 2002) para otras especies de Agavaceae (0.070 a

0.120 mg/g tde tejido fresco).

El periodo de etiolación más largo (36 días), aplicado al protocolo de Doyle y Doyle

(1987), fue la condición de pretratamiento que permitió obtener la mayor cantidad de

ADN (1423.43 mg/ml, en promedio) de Agave durangensis.

Con respecto a los diferentes tipos de tejido utilizados en el protocolo de Doyle y Doyle

(1987), los tejidos de la raíz permiten obtener mayor cantidad de ADN (771.25 mg/ml,

valor promedio de todas las cantidades de ADN obtenidas a partir de este tejido,

independientemente de cualquier otra condición de pretratamiento) que los tejidos de

las hojas (418.27 mg/ml, valor promedio de todas las cantidades de ADN obtenidas a

partir de este tejido, independientemente de cualquier otra condición de

pretratamiento).

Diversos autores (Schuler y Zielinski, 1989, Sambrook y cols., 1989) indican que los

valores de las relaciones A260/A240 y A260/A280 deben caer en el intervalo de 1.7 a 2.0 y

ser mayores a 1.8, respectivamente, para considerar a una muestra de ADN con la

pureza suficiente para ser utilizado en análisis moleculares. De acuerdo a las tablas 1

y 2 de la sección de resultados, todas las muestras de ADN de A. durangensis

obtenidas con el protocolo de Doyle y Doyle (1987) cumplieron con el segundo

requisito (valores de A260/A280 mayores de 1.8), mientras que con el protocolo de

Infante y col. (2006), únicamente la muestras obtenidas con la modificación señalada

enteriormente cumplieron con este requisito, lo que indica que contienen un nivel de

contaminación con proteínas permisible para poder analizarlas con técnicas

moleculares. Sin embargo, el primer requisito, que señala el nivel de contaminación

con carbohidratos, sólo lo cumplen las muestras de ADN obtenidas con el protocolo de

Doyle y Doyle (1987), a partir de tejido foliar, con 36 días de etiolación, y sin utilizar

nitógeno líquido para la homogeneización del tejido.

A pesar de que la mayoría de las muestras de ADN no satisfacieron el requerimiento

de los niveles mínimos de carbohidratos y se presentó cierto grado de degradación,

pudo obtenerse a partir de ellas fragmentos amplificados de secuencias ISTR, como

puede verse en la figura 31. Esto sugiere que los niveles de carbohidratos son menos

críticos que los de proteinas contaminantes de muestras de ADN, para considerar a

estas últimas como suficientemente puras para producir fragmentos de amplificación

ISTR.

CONCLUSIONES

1. El tipo de tejido es un factor importante a considerar para el aislamiento de ADN de

los elementos del complejo Agave durangensis. Los tejidos radiculares representan

una opción recomendable para obtener ADN cualitativa y cuantitativamente adecuado.

2. El pretratamiento de etiolación es un factor importante en la obtención de ADN de A.

durangensis. La cantidad y la calidad del ADN se mejora con la prolongación de este

pretratamiento hasta alcanzar una duración de 36 días.

3. La homogeneización en presencia de nitrógeno líquido no es un factor que

determine la cantidad y calidad del ADN obtenido de A. durangensis.

4.- La modificación al protocolo de Infante y col. (2006), como se describió en este

trabajo, proporciona mejor ADN en términos de cantidad, pureza e integridad, para A.

durangensis.

5. La variabilidad genética de Agave durangensis puedes ser estudiada empleando el

protocolo de aislamiento de ADN de Infante y cols. (2006) modificado en este trabajo,

y los iniciadores de la amplificación in vitro de secuencias ISTR.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Almaraz-Abarca, N. 1994. Estandarización de un método de aislamiento de ADN cloroplástico para ser usado en el estudio del polimorfismo de los fragmentos de restricción. Tesis de maestría. ENCB-IPN. México. Andrews, A. T. 1994. Electrophoresis of nucleic acids. In: Brown, T. A. (Edit.). Essential Molecular Biology. A Practical Approach. IRL Press. Oxford, pp. 89-105. Bellamy, A. R., R. K. Ralph. 1968. Recovery and purification of nucleic acids by means of cetyltrimetilammonium bromide. In: Methods in Enzymology 12, part B. Academic Press. London. Bookjans, G., B. M. Stummann, K. W. Henningse. 1984. Preparation of chloroplast DNA from pea plastids isolated in a medium of high ionic strength. Analytical Biochemistry 141: 244-247 Celis, C. M. Scurrah, S. Cowgill, S. Chumbiauca, J. Green, J. Franco, G. Main, D. Kiezebrinks, R. Visser, H. J. Atkinson. 2004. Environmental biosafety and transgenic potato in a centre of this crops diversity. Nature 432: 222-225. Cheng, F. S., S. K. Brown, N. F. Weeden. 1997. A DNA extraction protocol from various tissues in woody species. Hort Science 32: 921-922. Cota-Sánchez, J. H., K. Remarchuk, K. Ubayasena. 2006. Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue. Plant Molecular Biology Reporter 24: 161-167. Csail, U. M., H. Bastian, R. Brettschneider, S. Gauch, A. Meir, M. Schuarte, F. Scholz, C. Sperisen, B. Vornam, B. Ziegenhagen. 1998. Comparative analysis of different DNA extraction protocols: a fast, universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation and phylogenetic studies. Plant Molecular Biology Reporter 16: 69-86. Deguilloux, M. F., M. H. Pemonge, R. J. Petit. 2004. DNA-based control of oak wood geographic origin in the context of the cooperage industry. Ann. For. Sci. 61: 97-104. De la Cruz, M., F. Ramírez, H. Hernández. 1997. DNA isolation and amplification from Cacti. Plant Molecular Biology Reporter 15: 319-325. Doyle, J. J., J. L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of freshness leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15. Doyle, J. J., J. L. Doyle, A. H. Brown. 1990. Chloroplast DNA polymorphism and phylogeny in the B genome of Glycine subgenus glycine (Leguminosae). American Journal of Botany 77: 772-782.

Dreher, K. M., M. K. Khairallah, J. M. Ribaut, M. Morris. 2003. Money matters (I): Cost of field and laboratory procedures associated with conventional and marker-assisted maize breeding at CIMMYT. Molecular Breeding 11: 221-234. Good-Avila, S. V., V. Souza, B. S. Gaut, L. E. Eguiarte. 2006. Timing and rate of speciation in Agave (Agavaceae). Proceedings of the National Academy of the United States of America 103:9124-9129. Gordon, H. 1975. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida y de almidón. El Manual Moderno. México. Guillemaut, P., L. Marechal-Drouard. 1992. Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive and reliable mathod. Plant Molecular Biology Reporter 10: 60-65. Herrmann, R. G. 1982. The preparation of circular DNA from plastids. In: Methods in Chloroplast Molecular Biology. Elsevier Biomedical Press. Infante, D., G. González, L. Peraza-Echeverría, M. Keb-Llanes. 2003. Asexual genetic variability in Agave fourcroydes. Plant Science 164: 223-230. Infante, D., Celis, C., S. Molina-Moret, N. Almaraz-Abarca, E. A. Delgado-Alvarado, N. Naranjo-Jiménez, J. Herrera-Corral, J. A. Avila-Reyes, M. I. Torres-Morán, M. M. Morales-Rivera. 2006. Apuntes del curso “Utilización de ISTR para identificación de variabilidad en agaves”. CIIDIR-IPN-Dgo. México. John, M. E. 1992. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acid Research 20: 2381. Jones, M. C. 1988. Isolation of wheat chloroplasts and chloroplast DNA. In: Nucleic Acid Techniques. Vol. 4. Humana Press. New Jersey. Karp, A, O. Seberg, M. Buiatti. 1996. Molecular techniques in the Assessment of Botanical Diversity. Annals of Botany 78: 143-149. Keb-Llanes, M., G. González, B. Chi-Manzanero, D. Infante. 2002. A rapid and simple method for small-scale DNA extraction in Agavaceae and other tropical plants. Plant Molecular Biology Reporte 20: 299a-299e. Manen, J. F., O. Sinitsyna, L. Aeschbach, A. V. Markov, A. Sinitsyn. 2005. A fully automatable enzymatic method for DNA extraction from plant tissues. BMC Plant Biology 5: 23. Electronic version: http://www.biomedcentral.com/1471-2229/5/23. Milligan, B. G. 1989. Purification of chloroplast DNA using hexadecyltrimethylammonium bromide. Plant Molecular Biology Reporter 7: 144-149. Mourad, G., M. L. Polacco. 1989. Mini-preparation of highly purified chloroplast DNA from maize. Plant Molecular Biology Reporter 7: 78-84. Nyffeler, R. 2002. Phylogenetic relationships in the cactus faimily (Cactaceae) base don evidence from TRNK/MATK and TRNL/TRNF sequences. American Journal of Botany 89:312-326. Palmer, J. D. 1988. Isolation and structural analysis of chloroplast DNA. In: Selected Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press. USA.

http://www.biomedcentral.com/1471-2229/5/23

Rogers, S. O., A. J. Bendich. 1992. Extraction of DNA from plant tissues. In: Plant Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers. Belgium. Saghai-Maroof, M. A., K. M. Soliman, R. A. Jorgenson, R. W. Allard. 1984. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proceedings of National Academy of Science-USA 81: 8014-8018. Sambrook, J. Fritsch, E. F. Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Volume I. Cold Spring Harbor Laboratory Prees. United States of America. Schuler, M. A., R. E. Zielinski. 1989. Methods in Plant Molecular Biology. Academia Press. Toronto. Sosa, P. 2001. Genes, poblaciones y especies. E: Naturaleza de las Islas Canarias. Ecología y conservación. (Fernández-Palacios, J. M., J. L. Martín, Eds.). Ediciones Turquesa, p. 151-155. Taiz, L., E. Zeiger. 1991. Plant Physiology. Cummings Publishing Company. California. Tibbits, J. F. G., L. J. McManus, A. V. Spokevicius, G. Bossinger. 2006. A rapid method for tissue collection and high throusput isolation of genomic DNA from mature trees. Plant Molecular Biology Reporter 24: 81-91. Torres-Morán, M. I., D. Infante, J. J. Sánchez-González, M. M. Morales-Rivera, A. Santerre. 2005. Diversidad genética en Agave tequilana Weber var. Azúl proveniente de micropropagación. Boletín Nakari 14 (3): edición digital. Towner, P. 1991. Purification of DNA. In: Essential Molecular Biology. A Practical Approach Volume I. (Brown T. A., Ed.). IRL PRESS. Oxford. Pp. 47-68. Valenzuela-Ruíz, J. F., O. H. Velasco-gonzález, M. A. Márquez-Linares. 2003. Desarrollo sustentable del agave mezcalero en Durango. SEP, CIIDIR-IPN-Dgo., SAGDR. México. Wallace, D. M. 1987. Large and small-scale phenol extractions. In: Methods in Enzymology. 152. Academic Press. USA. Williams, Ch. A. 1975. Biosystematics of the monocotyledoneae-flavonoid patterns in leaves of the Liliaceae. Biochemical Systematics and Ecology 3: 229-244.

en el estado de durango, mxico, la elaboracin de mezcal se...

Documents