Ekspresija genoma

• Održavanje genoma – obuhvata procese koji obezbeđuju organizaciju genoma, replikaciju i njegovu zaštitu

• Osnovni procesi odgovorni za održavanje genoma su:

– Replikacija DNK

– Reparacija DNK

– Rekombinacija

• Ekspresija genoma – obuhvata procese koji omogućavaju da od određnog niza nukleotida u DNK nastanu RNK i proteini koji obavljaju ćelijske funkcije i definišu ćelijski identitet.

• Osnovni procesi odgovorni za ekspresiju genoma su:

– Transkripcija

– Translacija

– Obrada RNK (splajsovanje RNK, editovanje RNK)

Pregled ekspresije genoma kod prokariota i eukariota

• Osnovni procesi odgovorni za ekspresiju genoma prokariota su:

– Transkripcija (sinteza molekula RNK na osnovu informacije sadržane u delu jednog lanca DNK)

– Translacija (sinteza polipeptida prevođenjem informacije sadržane u redosledu nukleotida u iRNK u redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu)

• eukariota:

+ obrada RNK (splajsovanje RNK, editovanje RNK) i transport RNK iz nukleusa u citoplazmu

Zrela iRNK

Prostorni i vremenski odnosi procesa ekspresije

genoma

Posttranslaciona obrada polipeptida

Regulacija ekspresije genoma

• Omogućava da ćelija eksprimira određene gene i određene količine njihovih produkata, u skladu sa svojim trenutnim potrebama

• E. coli će eksprimirati različite grupe gena u zavisnosti od medijuma u kom se gaji

• Višećelijski eukarioti - prostorno i vremenski regulisana ekspresija gena u skladu sa programom razvića (osnova diferencijacije ćelija, odnosno formiranja ćelija koje imaju različitu morfologiju i funkciju)

• Ostvaruje se mehanizmima koji povećavaju ili smanjuju nivo ekspresije pojedinih gena, u zavisnosti od potreba ćelije

Organizacija gena kod prokariota i eukariota

• Transkripcione jedinice prokariota sadrže informaciju prepisanu sa većeg broja gena organizovanih u operone –

omogućuje kordinisanu i brzu sintezu proteina koji zajedno funkcionišu

• Transkripcione jedinice eukariota odgovaraju jednom genu

Transkripcija

• Sinteza molekula RNK na osnovu informacije sadržane u delu jednog lanca DNK

• Enzim - RNK polimeraza

• Transkript - molekul RNK prepisan sa DNK matrice

• Informaciona RNK (iRNK) - RNK kopija protein-kodirajućih

gena

Transkripcija

Sličnosti između transkripcije i replikacije

• Hemijski i enzimski slični procesi - tokom oba procesa vrši se sinteza polinukleotidnog lanca na osnovu informacije sadržane u molekulu DNK

1. Polinukleotidni lanac izgrađen iz ribonukleotida

2. RNK polimeraza katalizuje sintezu RNK i može da započne de novo sintezu

3. Kopira se samo jedan deo lanca DNK

4. Novosintetisana RNK ne ostaje sparena sa DNK matricom (RNK polimeraza izmešta rastući lanac RNK tako da je samo mali broj ribonukleotida sparen sa matricom – veliki broj RNK polimeraza može istovremeno da transkribuje jedan gen)

5. Transkripcijom se selektivno kopiraju određeni delovi genoma koji se umnožavaju nekoliko stotina do hiljadu puta

6. Učestalost grešaka tokom transkripcije je veća u odnosu na replikaciju (10-4)

Razlike između transkripcije i replikacije

Terminologija transkripcije

• Geni mogu da se transkribuju sa oba lanca DNK, ali u okviru

jednog gena uvek samo jedan lanac služi kao matrica

• Lanac DNK koji se transkribuje – matrični (nekodirajući)

lanac. Sekvenca matričnog lanca je komplementarna RNK

molekulu koji se sintetiše

• Lanac DNK koji se NE transkribuje – kodirajući lanac.

Sekvenca kodirajućeg lanca je identična sekvenci sintetisane

RNK (samo je timin zamenjen uracilom)

• RNK se sintetiše u 5’-3’ smeru (matrični lanac se kopira u 3’-

5’ smeru)

• Prema konvenciji, sekvenca kodirajućeg lanca se piše u

smeru 5’-3’

• Mesto početka transkripcije (pozicija +1) -

nukleotid u DNK čijom transkripcijom nastaje

prvi nukleotid u RNK

• Pozicija “-” – pozicije nukleotida u kodirajućem

lancu koje se nalaze uzvodno od +1

• Pozicija “+” - pozicije nukleotida u kodirajućem

lancu koje se nalaze nizvodno od +1

RNK polimeraze

• Primarni enzimi transkripcije

• U svim ćelijama, počev od bakterija do čoveka, RNK polimeraze obavljaju istu funkciju – katalizuju stvaranje fosfodiestarske veze između rNTP

• Prokarioti imaju jednu RNK polimerazu

• Eukarioti imaju 3 različite RNK polimeraze:

– Pol II transkribuje sve protein-kodirajuće gene

– Pol I i Pol III transkribuju RNK-kodirajuće gene:

• Pol I transkribuje gene za prekursore rRNK

• Pol III prepisuje gene za tRNK

RNK polimeraze

RNK polimeraze su multisubjedinični proteini

• Prokarioti: β, β’, 2 α i 1 ώ

• Eukarioti: RPB1 i RPB2 (ortolozi β i β’), RPB3 i RPB11 (ortolozi α) i RPB6 (ortolog ώ)

– Ručice rakovih klešta se sastoje od dve najveće subjedinice

– Aktivno mesto enzima se nalazi u udubljenju između ručica i sastoji se od regiona i ’ (RPB1 i RPB2) subjedinica

– RNK polimeraze sadrže veći broj kanala koji omogućavaju da DNK, RNK i ribonukleozidtrifosfati uđu i izađu iz aktivnog centra

aktivni centar

RNK polimeraze podesećaju na rakova klešta

kanali

• Zajednički mehanizam za dodavanje nukleotida od strane svih polimeraza: – prepoznavanje geometrije ispravno sparenog baznog para

– dodavanje nukleotida na 3’OH kraj rastućeg RNK lanca

– vezivanje dva metalna jona u aktivnom centru

• Visoko-procesivni enzimi

Aktivno mesto RNK polimeraze

Transkripcioni ciklus

Transkripcioni ciklus

Transkripcioni ciklus kod bakterija

RNK polimeraza holoenzim

RNK pol holoenzim = RNK pol + faktor

• Promotor je sekvenca DNK (obično uzvodno od mesta početka transkripcije) za koju se veže RNK polimeraza i inicira transkripciju

Promotori prokariotskih gena

Konsenzusna sekvenca 70 bakterijskih promotora

Konsenzusna sekvenca je verzija sekvenci koja na svakoj mogućoj

poziciji nukleotida ili ak ima najčešći nukleotid odnosno ak nađenu

na toj poziciji u različitim primerima

• Promotori koji imaju sekvencu sličniju konsenzusnoj sekvenci su jači

promotori

• Jačina promotora označava koliki je broj transkripata čija sinteza može biti inicirana sa datog promotora u određenom vremenu i na nju utiču:

– Afinitet RNK polimeraze prema promotoru

– Efikasnost promotora da podrži prelazak u otvoreni kompleks

– Brzina kojom polimeraza može da napusti promotor i krene u elongaciju

• Biološki smisao različite jačine promotora je u tome da neki geni moraju biti eksprimirani na višem nivou u odnosu na druge, i takvi geni obično imaju jake promotore

Šta je jačina promotora?

Promotori prokariotskih gena

Inicijacija transkripcije kod prokariota

1. Formiranje zatvorenog kompleksa

70 faktor prepoznaje promotor i vezuje RNK pol holoenzim za

njega

Interakcije 70 faktora RNK pol sa promotorskim

elementima

Helix-turn-helix motiv

2. Formiranje otvorenog kompleksa - izomerizacija

Struktura RNK holoenzima tokom formiranja

otvorenog kompleksa i abortivne inicijacije

RNK holoenzim u fazi elongacije je procesivna

mašinerija koja sintetiše RNK i vrši proofreading

• RNK pol u toku elongacije vrši i proofreading koristeći dva mehanizma:

– Pirofosforilitička korekcija – aktivno mesto enzima katalizuje reakciju koja je reverezna ugradnji ribonukleotida

– Hidrolitička korekcija – RNK polimeraza se malo vraća unazad i vrši hidrolizu jednog ili više nukleotida na novosintetisanom lancu, otklanjajući i deo sekvnece sa pogrešno sparenim nukleotidom

RNK holoenzim u fazi elongacije je procesivna

mašinerija koja sintetiše RNK i vrši proofreading

• Sekvence DNK koje dovode do disocijacije RNK pol sa matrice i oslobađanja sintetisanog RNK molekula - terminatori.

• Postoje dva tipa terminatora:

– nezavisni terminatori – dovode da terminacje transkripcije bez učešća bilo kojih drugih faktora

– zavisni terminatori - zahtevaju prisustvo proteina poznatog kao faktor

Terminacija transkripcije

Terminacija transkripcije nezavisna od faktora

Terminacija transkripcije zavisna od faktora

http://www.youtube.com/watch?v=WBcS3fKfbxs&featu

re=related

https://www.youtube.com/watch?v=1b-bRVgqof0

Transkripcioni ciklus kod eukariota

• Osnovni promotor za Pol II - minimalni set elemenata DNK neophodnih za tačnu inicijaciju transkripcije pomoću Pol II u in vitro uslovima

DNK sekvence neophodne za inicijaciju transkripcije

• Regulatorni elementi ili regulatorne sekvence - neophodne za efikasnu transkripciju u in vivo uslovima

• Regulatorne elemente specifično prepoznaju transkripcioni regulatori

• Transkripcioni regulatori koji stimulišu transkripciju sa osnovnog promotora su transkripcioni aktivatori, a oni koji je inhibiraju su transkripcioni inhibitori

Regulatorni region

Regulatorni element

U zavisnosti od pozicije u odnosu na osnovni promotor i funkcije

koju obavljaju razlikuju se:

- Susedni (proksimalni) regulatorni elementi

- nalaze se u blizini gena, uzvodno od osnovnog promotora

- utiču na učestalost formiranja preinicijacionog kompleksa

- sa promotorom obezbeđuju bazalnu transkripciju gena (nivo

transkripcije bez specifične regulacije)

-Udaljeni (distalni) regulatorni elementi (pojačivači, prigušivači

i granični elementi)

- nalaze se uzvodno ili nizvodno u odnosu na osnovni

promotor (nekada veoma daleko, a nekada u okviru samog

gena)

- obezbeđuju regulisanu transkripciju gena (odgovaraju na

različite signale, stimulišući ili inhibirajući transkripciju)

• Za efikasnu inicijaciju transkripcije u in vitro uslovima potrebni su opšti transkripcioni faktori – GTFs

• U in vivo uslovima potrebni su i dodatni proteini: medijator, transkripcioni aktivatori, proteini koji regulišu strukturu hromatina

Proteini neophodni za inicijaciju transkripcije

Lanac komunikacije od

aktivatora preko

medijatora do Pol II

predstavlja osnovu

aktivacije transkripcije

kod Eukariota

Inicijacija transkripcije kod eukariota

1. Formiranje preinicijacionog kompleksa

2. Formiranje otvorenog kompleksa

3. Napuštanje promotora

• Opšti transkripcioni faktori zajedno obavljaju funkciju ekvivalentnu funkciji faktora σ prokariota: pomažu RNK polimerazi da se veže za promotor, da otopi DNK oko mesta početka transkripcije, napusti promotor

• Preinicijacioni kompleks – RNK polimeraza i kompletan set GTFs vezanih za promotor i pozicioniranih za inicijaciju transkripcije

• Inicijacija transkripcije kod eukariota

• Formiranje preinicijacionog kompleksa – RNK polimeraza i kompletan set GTFs vezanih za promotor

Inicijacija transkripcije kod eukariota

2. Formiranje otvorenog kompleksa i napuštanje promotora

• Topljenje promotora (uz pomoć energije oslobođene hidrolizom ATP-a koju katalizuju helikazne subjedinice TFIIH

• Abortivna inicijacija

• Napuštanje promotora: hidroliza ATP-a i fosforilacija C-terminalnog domena velike subjedinice Pol II u okviru ponovljenih heptapeptidnih sekvenci

• Elongacija transkripcije, obrada RNK i terminacija transkripcije su međusobno povezani i kordinisani procesi

• Pol II tokom elongacije:

– Sintetiše RNK

– Vrši korekcije

– “Vodi” obradu RNK

• Kada Pol II krene u fazu elongacije ona napušta GTFs i stupa u interakciju sa novim setom proteina:

– Elongacionim faktorima – stimulišu elongaciju, korektivne mehanizme i pomažu regrutovanje enzima za obradu RNK

– Enzimima za obradu RNK

Elongacija transkripcije

Ključnu ulogu u regrutovanju faktora za obradu RNK

ima CTD Pol II

Obrazac fosforilacije CTD Pol II se menja tokom transkripcije i vodi obradu RNK

Kako Pol II transkribuje kroz nukleozome?

FACT (facilitates chromatin trancription) omogućava da transkripcija kroz

nukleozome bude efikasnija i održava integritet hromatina koji se

transkribuje

• Oslobađanje transkripta i disocijacija Pol II sa matrice

• Sintetisna iRNK se oslobađa od Pol II kada se prepiše signal za poliadenilaciju, čime se terminacija transkripcije vezuje za obradu RNK (poliadenilaciju)

• Enzim ne završava transkripciju odmah nakon što se iRNK iseče i doda joj se poli-A rep

• Nastavlja da se kreće po matrici sintetišući drugi RNK molekul koji dostiže dužinu od nekoliko hiljada nukleotida pre nego što se desi terminacija

• Pol II tada disosuje sa matirce, oslobađajući sintetisanu RNK koja odmah biva degradovana

Terminacija transkripcije

Terminacija transkripcije

Promotori i GTFs za Pol I

Promotori i GTFs za Pol III

Transcription occurs along a ____ template forming an

mRNA in the ____ direction.

5' to 3'; 5' to 3'

5' to 3'; 3' to 5'

3' to 5'; 5' to 3'

3' to 5'; 3' to 5'