PERCOBAAN IV
Judul : Pemisahan Pigmen dari Tanaman
Tujuan : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai
1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan.
2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar.
3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan
menggunakan KLT dan kromatografi kolom
Hari/tanggal : Selasa / 5 April 2011
Tempat : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin
I. DASAR TEORI
1.1 Daun dan Pigmen Tanaman
Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang,
umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi
cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun
biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi
menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai
organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada
daun.
Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen)
antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun
klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan
strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut
dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil
yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah
adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini
bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua
jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.
1
Gambar 1. Struktur klorofil a
Gambar 2. Struktur klorofil b
Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem
ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan
10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non
polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten
juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua
struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya
adalah sebagai berikut.
2
Gambar 3. Struktur α-karoten
Gambar 4. Struktur β-karoten
Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan
xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih
larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten.
Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil
memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah
sebagai berikut.
Gambar 5. Struktur xantofil
Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna
merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi
pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap
daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara
bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan
metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.
3
Gambar 6. Struktur umum antosianin
1.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-
komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase,
yakni fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen
diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi).
Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan
kromatografi kolom, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT).
Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi
pada kedua fase cair dan padat.
Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan
kromatografi kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi
fase stasioner (padat atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung
dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase
gerak). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen
dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara
fase gerak dan fase diam (stationer).
Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari
campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika
gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur
yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral
raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel
mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.
4
Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada
permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat
polar. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar, maka pada saat
campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama
tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang)
polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat.
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat
dibedakan menjadi dua, yaitu :
1) Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal”
bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non
polar.
2) Kromatografi fase terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar,
sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel
harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari
silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain
itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi
(larutan melewati kolom) dalam kolom.
Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas,
plastik atau nilon. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter
dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran
untuk mengatur laju alir eluen. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya
digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Sorben yang
digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang, magnesium silikat,
alumina, silika gel, kalsium sulfat dan serbuk selulosa. Berikut ini beberapa
golongan solutnya misalnya alkana, alkena, aromatis, eter, ester, keton, aldehid
dan alkohol.
5
6
Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom :
Gambar 7. Bagan kolom kromatografi
Gambar 8. Kolom berisi sampel
7
Gambar 9. Proses pemisahan pigmen tanaman
Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara
kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara
kromatografi kolom berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT)
fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa
dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 – 0,125 mm
dilapiskan pada kaca, lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending).
Pada prakteknya, sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke
dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Ketika eluen sudah mencapai batas
pada plat yang telah dibuat sebelumnya, plat diangkat dan dikeringkan. Setelah
8
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap
individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan
pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis.
Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada
kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang
karakteristik dan reprodusibel.
Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT).
Gambar 10. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT)
Gambar 11. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT
9
Gambar 12. Perbandingan untuk perhitungan Rf
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih
murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang
digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan
setiap saat secara cepat.
Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :
Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending),
atau dengan cara elusi 2 dimensi.
Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
1.3 Beberapa Jenis Tumbuhan
a) Daun Puring (Codiaeum variegatum)
Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan
populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun
yang sangat bervariasi. Beragam kultival telah
dikembangkan dengan variasi warna hijau, kuning, jingga,
merah, ungu, serta campurannya. Bentuk daunnya
10
bermacam-macam, memanjang, oval, tapi bergelombang helainya terputus-putus
dan sebagainya.
Secara botani, puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Ciri
yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan
lengket, yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae.
b) Daun sirih hijau (Piper crocatum)
Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk
dalam family piperaceae, yang tumbuh merambat
dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai
yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta
penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan
mengkilap. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa
fitokimia yakni alkaloid, saponin, tannin dan flavonoid.
Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk
menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan
dalam bentuk segar, maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih hijau dapat
menyembuhkan berbagai jenis penyakit, seperti diabetes, hepatitis, batu ginjal dan
sebagainya. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir, namun beraroma lebih wangi
dibandingkan dengan sirih hijau.
Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan, namun masih juga
mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Warna hijau pada daun
berasal dari kandungan klorofil. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan
dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam
fotosintesis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten, xantofil
dan antosianin.
c) Daun seledri (Apium graveolens)
Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang
biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Beberapa
negara termasuk Jepang, Cina dan Korea
11
mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan makanan. Di Indonesia
tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk
menyedapkan sup atau sebagai lalapan. Penggunaan seledri paling lengkap adalah
di Eropa: daun, tangkai daun, buah, dan umbinya semua dimanfaatkan.
Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa
aroma utama. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan
B (0,1 - 0,7%), serta senyawa golongan fenol. Komponen lainnya apiin,
isokuersitrin, furanokumarin, serta isoimperatorin. Kandungan asam lemak utama
adalah asam petroselin (40-60%). Daun dan tangkai daun mengandung steroid
seperti stigmasterol dan sitosterol.
d) Daun kemangi (Ocimum sanctum)
Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang
paling rendah. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan
tanaman semusim, daun berukuran kecil dengan helaian
daun yang tipis. Selain itu, daun kemangi hanya tersusun
dari selapis jaringan palisade, mesofil. Khususnya
jaringan palisade yang mengandung klorofil. Umur daun,
morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman
merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil.
e) Daun katuk (Sauropus androgynus)
Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar
kalsium yang tinggi. Kandungan vitamin C pada daun
katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu
biji. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat
merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti
progesteron, estradiol, terstosteron, glukokortikoid) dan
senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin,
prostasiklin, tromboksan, lipoksin dan leukotrien).
Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu
pengeringan, kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau.
12
Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Daun ini
kaya akan vitamin K, selain itu pro-vitamin A ( β-karoten), B dan C. Mineral yang
dikandungnya adalah kalsium (hingga 2,8 %), besi, kalium, fosfor dan
magnesium.
f) Daun singkong (Manihot utilisima L)
Daun singkong memiliki kandungan klorofil a
dan klorofil b yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa
kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi
cahaya lebih efisien, sehingga laju fotosintesisnya juga
lebih tinggi. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam
proses fotosintesis. Klorofil b berfungsi sebagai antena
fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian
ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan
diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan
untuk proses reduksi dalam fotosintesis.
g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica)
Kangkung memiliki kandungan klorofil yang
relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Hal
ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar,
tidak hanya pada organ daun saja namun juga
dijumpai pada bagian batang. Hal ini menyebabkan
laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak
efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.
h) Daun bayam (Amaranthus spp)
Kandungan besi pada bayam relatif lebih
tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan
penyusun sitokrom, protein yang terlibat dalam proses
fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia.
13
Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju
fotosintesisnya juga tinggi.
i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb)
Daun pandan mengandung klorofil yang sangat
tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami.
Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin
cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam
menangkap energi radiasi cahaya.
II. ALAT DAN BAHAN
2.1 Alat yang digunakan
1. Kolom kaca : 9 buah
2. Gelas ukur 10 ml : 9 buah
3. Corong biasa : 9 buah
4. Batang pengaduk : 9 buah
5. Gelas kimia 250 ml : 9 buah
6. Tabung reaksi : 36 buah
7. Rak tabung reaksi : 9 buah
8. Pipet tetes : 9 buah
9. Lumpang dan alu : 9 buah
10. Statif dan klem : 9 buah
11. Cawan porselin : 9 buah
12. Bunsen + kaki tiga + kain kasa : 9 buah
2.2 Bahan yang digunakan
1. Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong,
kangkung, bayam, dan pandan.
2. Etanol
14
3. Glass wool
4. Sebuk Al2O3 ( alumina )
5. Kertas saring
6. Petroleum eter
7. Kloroform
8. Metanol
III. PROSEDUR KERJA
3
3.3
3.4
3.5
3.1 Ekstraksi Sampel
1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.
2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata.
3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.
4. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai
larutan tinggal setengah mL.
3.2 Pembuatan Kromatografi Kolom
1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm
yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.
2. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.
3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.
4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol.
5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm
sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara
sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara).
15
6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan
alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll.
3.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan
1. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut
etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3).
2. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan
kepolarannya yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Jika
permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.
3. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung
reaksi yang bersih.
4. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom
kaca.
1.2.3.4.
IV. HASIL PENGAMATAN
No. Perlakuan Hasil Pengamatan1.
2.
3.
4. 5.
6.
7.
Menggerus sampel daun + 20 ml etanolMenyaring campuran
Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanolAl2O3 + 25 ml etanolMemasukkan adonan alumina + glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampelMendiamkan sampai larutan sampel menetesMenambahkan petroleum eter
Campuran
Filtrat: larutan hijau tuaResidu: ampas daunTinggi glass wool 1 cm
Glass wool dan etanol dalam kolomAdonan alumina, campuran
Larutan sampel menyebar dan menetes
16
8. Sampel yang digunakan:A. Daun singkong:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
B. Daun Pandan: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
C. Daun Bayam: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
D. Daun Kemangi: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
E. Daun Puring: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
F. Daun Kangkung: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
G. Daun Sirih:
larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning
larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan hijau muda
larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua
larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning
larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda
larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening
larutan kuning bening larutan kuning tua
17
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
H. Daun Katuk: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
I. Daun Seledri: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol
larutan kuning larutan kuning
larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua
larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua
V. ANALISIS DATA
Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel
daun, yaitu daun Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung,
bayam, dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut
yaitu petroleum eter, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masing-
masing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT
untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut.
5.1 Ekstraksi Sampel Daun
Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu
mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Penumbukan ini bertujuan
menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut
dalam pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan
untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat
terekstrak. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian
besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten dan xantofil memiliki sifat
diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan
18
pelarut semipolar. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena
enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi
antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan
berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut.
Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida
Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung
pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan
etanol ini, selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula.
19
5.2 Penyiapan Kolom Kromatografi
Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang
dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga
terbentuk bubur alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina
mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH
akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase
diam akan lebih homogen. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil
mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus
bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses
pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran
noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT.
Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase
diamnya, karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu,
sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll,
hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun
dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat
menahan alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.
Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga
diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga
diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat
tersaring. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan
setelah selesai, kran kolom ditutup.
5.3 Pemisahan Pigmen Tanaman
Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di
masukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan
membuka krannya. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai
bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung
dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar
dari kolom berubah. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel.
Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil
20
yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada
kromatografi kolom secara berurutan.
Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita
misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum eter kita
masukkan ke dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya
dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar
paling pertama, berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Ini
dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah
senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih
polar daripada klorofil, akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil
karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Untuk itulah
digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu
kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan
catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula seterusnya digunakan
pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti
xantofil.
Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun
adalah :
21
Gambar struktur klorofil a
22
Gambar struktur klorofil b
Gambar struktur α-karoten
Gambar struktur β-karoten
zzz
Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen
dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar
yaitu klorofil, karoten, baru kemudian xantofil. Walaupun demikian belum dapat
dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung, apakah dalam
petroleum eter, kloroform, etanol atau metanol.
a. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I
dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening.
Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform, etanol dan metanol
menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Warna hijau yang dihasilkan
menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil
merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut.
Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum
eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat
dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar
namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur
daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b
(larutan berwarna hijau muda).
b. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai
dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak
dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan
23
Gambar struktur antosianin
perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter
berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah
klorofil.
Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen
karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi
kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini
berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan
literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.
Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung
xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol
dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna
kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan
pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang
bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
c. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I
dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Pada
tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua.
Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan
pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna
hijau. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri
mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau
dengan semua pelarut.
Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum
eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat
dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar
namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur
daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b
(larutan berwarna hijau muda).
24
d. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong
Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Untuk pelarut
petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya
pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak
warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Klorofil
merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah
larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pelarut etanol menghasilkan
ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten.
Meskipun karoten bersifat nonpolar, tetapi kepolarannya agak rendah sehingga
dapat larut dalam etanol. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna
kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil.
Untuk uji KLT, harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen
tersebut lebih larut dalam eluennya. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang
kecil, artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Karena pelarut
yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar, maka bila harga Rf kecil,
larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar, dan sebaliknya
apabila harga Rf besar, komponen yang terkandung bersifat lebih polar.
Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap
metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Harga Rf karoten
terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform, dan
harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil.
e. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam
Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai
pelarutnya. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan
hijau. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil,
dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten
dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. Pigmen xantofil
dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol.
f. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk
25
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai
dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak
dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan
perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter
berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah
klorofil.
Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen
karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi
kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini
berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan
literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.
Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung
xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol
dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna
kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan
pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang
bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
g. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan
Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan, untuk fraksi yang
larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat
diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut
bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan
kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau.
Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil
(C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan
karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal
ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang
berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar
sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.
26
h. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau
Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan
literatur yang ada, ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan
kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan
diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua.
Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom
adalah klotofil, xantofil dan karoten. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non
polar, namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat
keluar daripada klorofil. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter,
sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. Sedangkan xantofil
yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan
metanol.
i. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung
Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Pada tabung I dan
II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau
lebih tua. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan
berwarna hijau muda. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol
menghasilkan warna hijau kekuningan. Warna hijau yang dihasilkan
menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil
merupakan senyawa yang berwarna hijau. Sedangkan warna hijau kekuningan
menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna
hijau kekuningan.
Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan
stukturnya adalah senyawa nonpolar. Oleh karena itu, klorofil dapat larut dalam
pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Sesuai dengan
literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau
tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Sedangkan karoten merupakan
senyawa yang dapat larut dalam etanol.
27
28
Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap
sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut :
No.Sampel Daun
Petroleum eter
Kloroform Etanol Metanol
1.2.3.4.5.6.7.8.9.
SingkongPandanBayam
KemangiPuring
KangkungSirihKatukSeledri
KlorofilKlorofilKlorofilKlorofilXantofil KlorofilXantofilKlorofilKlorofil
KlorofilKlorofilKlorofilKarotenKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofil
KarotenKarotenKlorofilKaroten KlorofilKarotenXantofilKlorofilKlorofil
XantofilKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofil
Untuk uji KLT, menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing
komponen adalah sebagai berikut :
- Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil; Rf = 0,75
- Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten; Rf = 0,756
- Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767
- Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767
VI. KESIMPULAN
1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel
tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu
etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun.
2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa
Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter, kloroform, metanol dan
etanol.
3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun
masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan
adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.
29
4. Berdasarkan percobaan, daun singkong dan kemangi mengandung pigmen
klorofil, karoten, xantofil. Daun pandan dan kangkung mengandung
pigmen klorofil dan karoten. Daun bayam, katuk dan seledri mengandung
pigmen klorofil. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil.
Daun sirih mengandung pigmen xantofil.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Anwar, Chairil, Bambang Purwono, harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta : Depdikbud.
Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya.
Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.
Tim Dosen Kimia Organik. 2010. Panduan Praktikum Kimia Organik II. FKIP Banjarmasin : UNLAM. (Tidak dipublikasikan).
30
VIII. LAMPIRAN
8.1 Pertanyaan dan Jawaban
1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di
dalam kolom ?
2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan
jelaskan mengapa terjadi demikian ?
3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang
diinginkan ?
Jawaban
1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom
karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan
penyerap), sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna).
Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di
KLT.
2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal
ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga
petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul
dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan
kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan
klorofil dan petroleum benzen. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya
adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen
xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam
alkohol.
3. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang
diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen
yang muncul yaitu karoten, xantofil dan klorofil. Namun proses pemisahannya
kurang sempurna, hal ini mungkin dikarenakan:
a. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam.
b. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu
tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.
31
c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan
waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan
berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena
mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan
ada fraksi yang tercampur.
32
8.2 Flow Chart
A. Ekstraksi Sampel
N/B: * Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong,
kangkung, bayam, dan pandan
33
10-15 lembar daun contoh*
Filtrat
Campuran
Residu
Lumatan daun contoh + etanol
Pelarut Larutan pekat
- Melumatkan dalam lumpang
- Menambahkan beberapa mL etanol
- Mengaduk sampai merata
- Menyaring melalui corong biasa dengan
kertas saring
- Memekatkan dengan alat rotavapor
sampai cairan tinggal beberapa mL
B. Pembuatan Kromatografi Kolom
34
Glass wool
Glass wool + Etanol
Campuran I
Al2O3 + etanol
Adonan alumina
- Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm,
hingga setinggi 1 cm
- Menuangkannya melalui corong dan
memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi
10 cm
- Membuat adonan
Campuran 1 + adonan
Campuran II
- Memasukkan adonan melalui corong ke dalam
kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetuk-
ngetuk dan keran dalam keadaan terbuka
C. Pemisahan Pigmen dari Tanaman
NB :
- Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai
(etanol)
35
Campuran II + etanol
- Mengelusi kembali, kemudian menutup keran
Campuran III + glass wool
- Memasukkan
- Membuka keran
Campuran IV + etanol
- Membuka keran
- Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai
terjadi kira-kira 20 tetes per menit, sampai permukaan
pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3)
Campuran V + larutan contoh
- Memasukkan setinggi 1 cm
Campuran VI + pelarut
- Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara
bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum
benzen, kloroform, etanol dan metanol), jika permukaan
sampel telah mendekati permukaan penyerap
- Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan
beberapa tabung reaksi yang bersih
- Memisahkan berdasarkan warnanya
- Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna
telah keluar dari kolom
Larutan berwarna
LAMPIRANFOTO – FOTO PERCOBAAN
36
Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun puring pada KK
Gambar 19. Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK
Gambar 20. Sampel ekstrak daun andong pada KK
37
