DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS
1.- INTRODUCCION
En el campo de la micología industrial, se estudia tanto la acción nociva de los hongos
microscópicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los
distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le
campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestras diferencias
considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se
pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y
vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio.
Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de
un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por
su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el limite entre
los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y reproductoras de
micelio de las levaduras.
Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células
independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilíndricas. En
algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un
micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de
verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha
comentado ya, no existe un límite de separación definido entre levaduras y otros hongos que
forman un micelio típico.
Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos forman colonias de aspectos característicos
que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de interés industrial, el modo
habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan reproducción
sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse
solamente por sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la
identificación específica.
2.- OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GENERAL
Determinar e identificar, mohos y levaduras en una muestra sólida de harina de trigo. Mediante
un análisis microbiológico.
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Aplicar todos los conocimientos anteriormente aprendidos para la determinación de los
parámetros en estudio.
Determinar todos los requerimientos básicos necesarios para las determinaciones de los
parámetros en estudio.
Conocer el medio y el modo de trabajo adecuado, para la determinación de mohos y
levaduras en la muestra harina de trigo.
Conocer el medio de cultivo PDA para mohos y levaduras, también las
condiciones de temperatura y tiempo de incubacion.
Diferenciar y reconocer lo que es un moho y una levadura, observar sus características
físicas.
Realizar el recuento de colonias en el medio, PDA.
3.- FUNDAMENTO TEORICO
Mohos y Levaduras
En el campo de la micología industrial, se estudia tanto la acción nociva de los hongos
microscópicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los
distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le
campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestras diferencias
considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se
pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y
vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio.
Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de
un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por
su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el limite entre
los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y reproductoras de
micelio de las levaduras.
Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células
independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilíndricas. En
algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un
micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de
verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha
comentado ya, no existe un límite de separación definido entre levaduras y otros hongos que
forman un micelio típico.
Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos forman colonias de aspectos característicos
que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de interés industrial, el modo
habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan reproducción
sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse
solamente por sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la
identificación específica.
Las levaduras y los mohos crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que
conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin
embargo, en los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que
las bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por la alteración de frutas frescas y
jugos, vegetales, quesos, productos cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos, así como en
los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones
inadecuadas. Además, existe el peliro potencial de producción de micotoxinas por parte de los
mohos.
Ni el hombre ni los animales deben consumir alimentos visiblemente enmohecidos, excepto, por
supuesto, los quesos tales como Roquefort ó Camembert y ciertos salamis que deben sus sabores
especiales a algunos mohos.
Las levaduras crecen más rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras
que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras generalmente crecen tanto en
presencia como en ausencia de oxígeno, aunque con mayor rapidez y hasta poblaciones más
elevadas en presencia de este gas. La fermentación es completamente un proceso anaeróbico. Las
bebidas fermentadas están fuera del marco de esta publicación.
En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse números reducidos de esporas y
células vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado.
Solo cuando el alimento contiene cifras elevadas de levaduras o mohos visibles, el consumidor se
dará cuenta de la alteración. La alteración por levaduras no constituye un peligro para la salud.
Factores de crecimiento de los mohos:
Nutrimentos:
Los mohos, por sus paredes celulares quitinosas duras, obtienen nutrimentos solo por difusión o
por transporte de sustancias solubles y en consecuencia, su nutrición se limita a alimentos
bastantes sencillos. Muchos mohos obtienen carbono y energía de los carbohidratos;
especialmente de la glucosa, pero algunos utilizan alcoholes o ácidos orgánicos. Pueden obtener
también el carbono de las proteínas, y si falta alguna fuente de fácil obtención, lo obtienen de
productos de la digestión de las proteínas. Algunas especies utilizan exclusivamente grasas.
Humedad y presión osmótica:
El medio húmedo facilita el crecimiento de los mohos, pero dichos organismos no necesitan el
mismo grado de humedad que bacterias y levaduras, que requieren un medio prácticamente
hídrico. El crecimiento en materiales secos; pulpas secas, granos, tejidos, cuero curtidos y muebles
ocurre solamente en una atmósfera húmeda. Al añublo o moho aparece en libros o zapatos; por
ejemplo: durante periodos duraderos, húmedos y calurosos en climas en que hay poco sol.
Temperatura:
Algunas especies de hongos crecen a temperaturas menores de 42 ºC o mayores de 42 ºC.
Oxígeno:
Prácticamente todos los mohos son aerobios y necesitan bastante oxígeno. Solamente algunas
especies; la que se emplea en la manufactura del queso Roquefort, crecen satisfactoriamente en
medios con menor tensión de oxígeno. Incluso en este caso, no obstante, se facilita el crecimiento
al picar el queso con alambres para obtener agujeros por el cuajo en maduración.
Cultivo de los Mohos:
Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos generales de cultivo que para las bacterias.
Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriológicos
usuales, a temperaturas que varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen más lentamente que
las bacterias, y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los
mohos.
Si se quiere aislar los mohos, resulta muy práctico usar un medio de cultivo que favorezca su
desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias. Medios ácidos (PH = 5,6) con
concentraciones relativamente elevadas de azúcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben
muchas bacterias.
Morfología de los Mohos:
Puesto que la identificación de los hongos depende en gran parte de características morfológicas
como el tipo y la agrupación de las esporas se deben tomar muchas precauciones al hacer
preparaciones para el examen microscópico. En general, el cultivo en medios líquidos no es
satisfactorio para este propósito. Los cultivos en medios sólidos, sobre todo en placas se pueden
ver con una lupa o con el objetivo seco débil del microscopio, empezando desde el fondo hasta la
parte superior de la placa lo cual nos proporcionará suficiente información para identificar o
precisar el género del moho examinado. Se deben hacer observaciones posteriores tomando con
una aguja o asa una pequeña muestra de micelio en desarrollo, la que se coloca en una gota de
azul algodón lactofenol que esté sobre un portaobjeto y se cubre luego con el cubreobjeto. En una
preparación hecha de esta manera, la hifas deben ser examinadas para ver si hay tabiques,
estructuras de las esporas y otras partes del hongo que son determinantes, sin embargo, una
manipulación de este tipo rompe y desorganiza las estructuras del organismo pues la disposición
característica de la que depende la identificación se pierde y no es posible clasificarlo.
Un método mejor para examinar los hongos es la técnica de cultivos en portaobjeto (microcultivo),
ya que permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo, y el arreglo y acomodo
de sus partes permanecen intactos.
Factores de crecimiento de las levaduras:
Agua:
Las levaduras necesitan un poco más de agua que los mohos, pero menos que las bacterias.
Conviene insistir no obstante, que entre las levaduras hay gran variación; algunas especies crecen
en medio que contienen incluso 40 por 100 de agua, por ejemplo en miel y jaleas o compotas. Los
microorganismos que crecen en soluciones de gran presión osmótica se denominan osmófilos.
PH:
Las levaduras crecen en límites amplios de pH, aunque sus requerimientos son más limitados que
los de los mohos. Muchas especies se multiplican en soluciones con acidez de pH 3 y alcalinidad de
pH 7.5. La reacción óptima suele localizarse entre pH 7.5 y 5.0
Temperatura:
No hay crecimiento a temperaturas superiores a la del congelamiento, ni tampoco a temperaturas
superiores a 47 ºC; las temperaturas máximas para algunas especies son algo menores. La
temperatura más adecuada suele situarse entre 20 y 30 ºC. La incubación a 30 ºC suele ser
satisfactoria
Oxígeno:
Las levaduras fueron los primeros microorganismos en que se encontró crecimiento en un medio
sin oxígeno atmosférico. Pasteur se admiró notablemente de este hecho, y observó que la
utilización anaerobia de azúcar generaba principalmente alcohol y bióxido de carbono, en tanto
que los productos aerobios eran bióxido de carbono y agua. La multiplicación de las levaduras es
más rápida y la cosecha de células es mayor en condiciones aerobias que en anaerobias, en
consecuencia, se necesita abundancia de oxígeno en la elaboración de levadura comercial, pero el
oxígeno se excluye cuando se desea producir alcohol (en la fermentación de cerveza o en la
producción de vino).
Recuentos de Mohos y Levaduras:
Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y aún inferiores, por lo que
generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos.
Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseñados para el recuento de mohos y
levaduras, en los últimos 20 años se han utilizado con eficacia los antibióticos. Entre ellos puede
citarse la penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la oxitetracilina y la
gentamicina. Para fines generales, han sido muy utilizadas la oxitetracilina, que se refiere al a
clorotetracilina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el crecimiento de las
bacterias Gran negativas y es efectiva por ellos en alimentos tales como la carne refrigerada. El
rosa de bengala retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen abundante
micelio aéreo, como Neurospora y Rhizopus. Sin embargo, también inhibe algunas levaduras. La
mejor temperatura de incubación de los cultivos se sitúa alrededor de 22 ºC, y el tiempo de
incubación es de 5 días.
Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello el talo de un moho
que esté muy cargado de espora dará recuentos de placas muchos más altos que otro de tamaño
similar sin esporas
PDA.- El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir
de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosméticos. El Agar Dextrosa y Papa
puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este
medio es recomendado para realizar el recuento colonial. También puede ser utilizado para
promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. La base del medio es
altamente nutritiva y permite la esporulación y la producción de pigmentos en algunos
dermatofitos.
Algunos procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido tartárico al 10 %, para
inhibir el crecimiento bacteriano. La infusión de papa promueve un crecimiento abundante de los
hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante.
4.-MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
REACTIVOS MATERIALES Y EQUIPOS
Muestras: sólida (harina de trigo) Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Agua Peptona Agitador bortex
Agar: PDA 3 tubos de ensayo con sus tapas
Alcohol 4 pipetas de 2 ml
Desinfectante 3 cajas petri
detergente Balanza mecánica
Mechero
Gradilla
Tijeras
Cuchara
Incubadora de 37 ºC
5.- METODOLOGIA
Primeramente se hizo una limpieza general de los mesones con detergente y desinfectante ya que
esto es muy importante además puede interferir en muestro análisis.
También es muy importante que los materiales que se van a utilizar deben estar previamente
esterilizados.
Señalar con un marcador las correspondientes concentraciones:
-2 B
-1 -2 B
Se procedió a pesar 25 gramos demuestra (harina de trigo) este para disolverla
en la solución madre.
Se tubo el cuidado de pesar exactamente los 25 gramos de muestra en la balanza
mecánica.
Agitar la mezcla muy bien para que la solución sea homogénea.
Todo trabajo debe realizarse siempre detrás de un mechero esto para prevenir contaminación a
la muestra a analizar.
Solo una persona debe realizar el trabajo sin la ayuda de nadie.
(Siembra en profundidad)
- Realizamos la primera dilución tomando una pipeta 2 ml de la solución (peptona y
muestra). Colocamos 1 ml al tubo -2, agitamos en el agitador bortex, y el otro 1ml a la
placa -1 de PDA.
- siempre se debe tomar en cuenta que se debe trabajar detrás del mechero y
cada material pasar por la llama del mechero.
- En la segunda dilución con otra pipeta esterilizada tomamos 1ml del tubo
-2. Colocamos, 1ml a la placa -2 de PDA.
Una vez concluidas estas se procedió al vaciado al agar, a este método se le
conoce como siembra en profundidad o en masa. Mezclar perfectamente el
medio e inóculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos circulares
con la placa, a favor y en contra del sentido de las agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al
mismo tiempo que el medio impregne la tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una
superficie hirizontal.
- Cuando se ha solidificado perfectamente el agar, NO se invierten las placas y se intruducen
en la estufa, evitando que se apilen en exceso y que entren en contacto con sus paredes.
Incubar a 25 ºC durante un periodo de 5 a 7 dias.
- Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren colonias aisladas.
6.- DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS
Agar: PDA (-1) Agar: PDA (-2) Agar: PDA (blanco)
Mohos 6 colonias Mohos 3 colonias Mohos 0 colonias
Levaduras 4 colonias Levaduras 0 colonias Levaduras 0 colonias
Mohos y levaduras
Para el recuento de MyL se dejo incubar el PDA a 25ºC se recomienda que el tiempo de incubación
sea de 7 días
Donde se obtuvieron los siguientes resultados:
Parámetro MyL
Medio de cultivo PDA
Tiempo: 7 dias
Dilución UFC
-1 6 mohos + 4 levad.
-2 3 mohos + 0 levad.
B 0 mohos + 0 levad.
El recuento total de mohos y levaduras es de:
No hubo desarrollo sobresaliente de mohos y de levaduras, lo que nos indica que se trata de un
alimento contaminante de M y L, hay bastante discrepancia en los limites máximos control de los
parámetros analizados para la muestra de harina de trigo.
7.- OBSERVACIONES
En la caja petri 10-1 se observo la presencia de 6 mohos que presentan un color verdusco con
negro son de un tamaño muy visible con pelusas a su alrededor, pero hay muchos que aun están
creciendo y 4 levaduras característicos presenta un color cremoso y son lisas.
En la caja petri con la dilución 10-2 donde no se pudo observar levaduras pero se conto la
presencia de 3 mohos concéntricos, circulares, uniformes se ve que presentan pelusas a su
alrededor pero si se los deja mas día para incubar crecerán más cantidad de colonias.
En la caja petri (blanco) se observo ausencia de mohos y levaduras, lo cual es correcto porque es
blanco.
Sin embargo no se hace el invertido de placas para mohos y levaduras porque las esporas saldrían,
contaminando así el medio ambiente.
8.- CONCLUSIONES
Las conclusiones de la práctica realizada son las siguientes:
Es de vital importancia tener conocimientos de preparación de medios de cultivo, técnicas
de asepsia, orden y cuidado en la manipulación de las muestras, los materiales y los
medios de cultivo con los que se trabajara, ya que se debe evitar ante todo el momento de
realizar tanto la preparación de la muestra y la siembra en el medio de cultivo que se de
una contaminación externa por manipulación, pero lo mas importante es saber que
medios y a que temperatura se deben de incubara las muestras.
De igual manera se debe saber que materiales son los que se van a utilizar en cada una de
las determinaciones, desde la dilución, hasta que medios de cultivo son los adecuados
para los parámetros que se tienen que estudiar. En todo caso lo que se debe realizar es
una planeación de cómo es que se va a realizar las determinaciones dado que en el caso
de no realizar un buen pedido o preparación de requerimiento se puede estar en apuros al
momento de realizar las determinaciones, y eso nos puede llevar a que se contamine la
muestra y que se tenga a que volver a empezara realizar la determinación, no cabe dudas
que la preparación previa a los análisis es importante para saber con exactitud que es lo
que se va a realizar.
Logramos determinar e identificar en una muestra solida de harina de trigo, mohos –
levaduras en el Agar de Patata y Dextrosa, para realizar el análisis microbiológico de M y L.
En la determinación de los mohos y levaduras (MyL) el medio que se utilizo es el PDA, se
debe tener cuidado en la temperatura y tiempo de incubación, pero además que se debe
tomar encuenta que la caja petri NO se debe invertir durante la incubación.
las diferencias entre mohos y levaduras son mínimas pero bastante apreciables, por lo que
no hubo mucho problema al distinguirlos, el recuento final nos indico la presencia de
pocos MyL que es muy bueno ya que se trata de un alimento inocuo.
Se hizo un recuento aproximado de mohos y levaduras en el medio PDA
9.- BIBLIOGRAFIA
1. Seeley H y Van Demark P, Microbios en acción, Ediciones Blume, 1ra ed., España 1973.
2. Larrañaga I et all, Control e higiene de los alimentos, McGraw Hill, España 1999.
3. Pascual Anderson R, Microbiología Alimentaria, Ediciones Diaz de Santos, 2da ed., España
2000
10.- CUESTIONARIO
1.- Cuales son las principales estructuras características de las levaduras y hongos?
2.- Cómo se clasifican los mohos y levaduras?
3.- Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causada por los hongos y
tres ejemplos de utilización benéfica.
4.- De que manera influye el pH, la temperatura y la actividad del agua en el crecimiento de
mohos y levaduras?
5.-De acuerdo a la norma boliviana vigente ¿Cuál es el limite máximo permisible para hongos y
levaduras, en la chicha, api morado, yogurt casero, apanado, harina de perro, dar el numero de
norma. ( en caso de no contar con ellos, especifique según su criterio).
6.- Que pruebas bioquímicas se realizara para la caracterización de levaduras?. Mencione las
características bioquímicas de principales levaduras de importancia de salud pública. (por lo
menos tres)
7.- Explicar brevemente como se realiza la prueba bioquímica del auxonograma en placa (las dos
formas)
8.- Como se realiza la identificación de hongos filamentosos (mencione por lo menos tres).
1. Crecimiento permitido según norma para el alimento analizado en su grupo para los
parámetros trabajados.
Al ser un alimento que es nuevo, se debe considerar que no se llego a un acurdo internacional de
cual es el adecuado límite la presencia de R.T.B.A.M. o MyL, pero sin embargo hay algunos países
que se pusieron límites que son los siguientes:
Parámetro Limite máximo
R.T.B.A.M. 5*103.
MyL 1*103.
Observando estos límites podemos afirmar que nuestra muestra analizada es inocua y libre de
riesgo para el consumo, ya que están por debajo estos límites máximos.
2. Medios que se emplean para el análisis de mohos y levaduras.
Existe una variedad grande medios de cultivo especiales para la determinación de mohos y
levaduras entre los más conocidos y comunes son:
PDA, Caldo Triptona Soja (TSB), Agua de Triptona (TW), Solución de Ringer, Solución de Tween,
Agar extracto levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE), agar extracto de levadura, agar extracto de
malta y otros que no son muy utilizados o que en todo caso son particulares para el tipo de
alimento a analizar.
3. Funciones que cumplen los suplementos adicionados al medio empleado para mohos y
levaduras.
El acido tartárico se usa en diversas recetas de cocina donde se conoce como crémor tártaro,
especialmente en repostería y confitería para aumentar la masa y consistencia ya que enriquece la
fermentación de levaduras y mohos, es por ese principio que el acido tartárico tiene la propiedad
de estabilizar el medio PDA que se utilizo para la determinación del recuento de MyL.
Mientras que la oxitetraciclina actúa como un agente selectivo, impidiendo el crecimiento
bacteriano, es decir es un antibiótico que impedirá que se desarrollen bacterias en este medio de
cultivo y así no se contamine tan fácilmente el medio.