DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES POR ANÁLISIS INMUNOLÓGICOS: INMUNODIFUSIÓN EN AGAR GEL (AGID)

PRUEBA DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

Jimena Martínez Málaga 1 1 P.P. Ingeniería Biotecnológica, F. C. F. B. Q. y B.; Campus U.C.S.M. Arequipa, Perú.

RESUMEN

En esta práctica se realizó el diagnóstico de anemia infecciosa equina, mediante la prueba de inmunodifusión en agar gel. Para lo cual se requirió muestra de sangre de caballo y los respectivos reactivos conteniendo el antígeno (Ag) y el antisuero específicos para la enfermedad. No se pretendía obtener resultados positivos, ya que la sangre de los caballos analizados fue extraída de caballos de carrera, por lo que se tiene entendido que son caballos sanos, a los cuales se les realiza análisis constantemente. Por lo que se tuvo como objetivo conocer la prueba e identificar los resultados según el control positivo.

I. INTRODUCCIÓN

La anemia infecciosa equina (AIE) se presenta en todo el mundo. La infección se limita a los équidos. La enfermedad se caracteriza por episodios febriles recurrentes, anemia, pérdida de peso y edema de las partes bajas del cuerpo; tiende a convertirse en una infección asintomática sino se produce la muerte en el curso de los ataques clínicos agudos. Normalmente, el período de incubación es de entre 1 y 3 semanas, pero puede prolongarse hasta 3 meses. En casos agudos, los nódulos linfáticos, el bazo y el hígado se agrandan y se vuelven hiperémicos. Desde el punto de vista histológico, estos órganos están infiltrados con poblaciones de leucocitos inmaduros y de células plasmáticas. Las células de Kupffer, del hígado, generalmente contienen hemosiderina o eritrocitos. Se puede detectar hipertrofia del bazo mediante un examen rectal.

Formas de presentación clínica Un equino infectado puede evidenciar una de las cuatro siguientes formas:

a. Sobreaguda: presentación no frecuente. Es una presentación de infección en la cual el animal muere súbitamente antes de presentar signos clínicos. Solo es detectable posmortem (mediante necropsia y análisis de laboratorio).

b. Aguda: Sus síntomas principales son fiebre alta e intermitente, incremento de la frecuencia del pulso, apatía, incoordinación en algunos casos, mucosas de tonalidad entre roja sucia e ictérica (amarillenta) con hemorragias difusas, edemas subcutáneos, y pérdida de condición corporal pese a conservar el apetito. En esta forma el nivel de virus en sangre es muy alto por lo que podrá ser transmitido más fácilmente a otros caballos como se verá más adelante.

c. Subaguda a crónica: se mantienen los mismos signos clínicos descriptos para la forma aguda pero de una manera más atenuada, pudiendo ocurrir la muerte del animal luego de una corta agudización de los signos. El equino infectado entra y sale de esta forma clínica hacia la forma aguda o crónica de manera cíclica, presentando períodos de normalidad - la forma inaparente - entre episodios. Este comportamiento cíclico, generalmente dilata la consulta profesional y la imprescindible confirmación del laboratorio; si bien la detección de algún síntoma, como la pérdida de peso y la apatía debiera provocar siempre la sospecha. Los equinos que se encuentran en esta etapa tienen generalmente un nivel más moderado de virus circulante pero constituyen igualmente muy buena fuente de virus.

d. Subclínica o inaparente: solo detectable por medio del test de laboratorio aplicado rutinariamente, es otra forma de presentación muy frecuente de la enfermedad. En esta etapa el caballo luce sano y nadie advierte su enfermedad pudiendo mantenerse así gran parte de su vida. Otros en cambio, regresan a la forma subaguda a crónica a causa de estrés, excesivo trabajo, a otras enfermedades o a parasitosis, a ciertas medicaciones como los corticoides o por la reversión del virus a formas más dañinas dentro del propio organismo del equino.

Como conclusión, la forma crónica y la inaparente, con sus «señales» pobres o ausentes, constituyen el verdadero desafío para el control de la enfermedad por constituir el único y verdadero reservorio y fuente de virus para la persistencia de la enfermedad en los rodeos y su propagación territorial.

Transmisión de la enfermedad La AIE no es una enfermedad contagiosa, sino una enfermedad infecciosa transmisible. El uso poco preciso de los términos contagiosa o infecciosa, conduce a veces a un exagerado temor a la infección y a la enfermedad y a la justificación de que todo lo que se haga es en vano. Al contrario de lo que muchas veces se cree, y a excepción de la vía intrauterina, la transmisión del virus no se produce por transmisión directa (contagio) de un animal infectado a otro susceptible o sano. Para que el ingreso del virus a un animal sano se produzca, es indispensable que se vehiculice sangre desde un portador en forma mecánica. Desde esta óptica, puede afirmarse entonces que si se controlaran las vías más comunes de vehiculización, la enfermedad es altamente controlable. Las principales vías de transmisión mecánica a las que referimos son básicamente dos, la transmisión natural producida a través de algunas especies de insectos hematófagos y la que provoca la mano del hombre.

Transmisión natural Se ha comprobado fehacientemente que los distintos tipos de tábanos y moscas «chupadoras» de sangre son transmisores mecánicos del virus. Algunos investigadores citan la probabilidad de que algunas especies de mosquitos lo hagan - en particular los de gran tamaño - pero en menor grado y siempre de manera mecánica. Para que esta forma de transmisión sea posible, es preciso que el acto alimentario del insecto, iniciado sobre un equino portador del virus, quede incompleto por algún motivo (p.e. defensas del animal) debiendo entonces concluir su comida sobre otro equino sano. Según pudo comprobarse, el virus va perdiendo su capacidad infectante en la boca de estos insectos sobreviviendo en ella entre 15 minutos a 4 horas.

Por lo tanto, la probabilidad y el grado de transmisión son altos cuando en una población de equinos se dan simultáneamente estas tres condiciones: 1. Alta carga de tabánidos sobre el lugar (región, época del año, etc.), 2. Distancias estrechas entre los equinos (factor que adquiere mucha importancia en lugares de estabulación o de alta concentración).3. Nivel infectivo suficiente en la sangre de el/los portador/es, que como fuera dicho es muy alto cuando se presentan síntomas clínicos.

Transmisión por el hombre Se afirma que el virus puede sobrevivir varios meses a temperatura ambiente en sangre o suero secos infectados. Esta es la razón para afirmar que involuntariamente la mano del hombre es en muchos casos la principal forma de diseminación, y para ello bastará la presencia de tan solo un portador de virus para iniciar una diseminación masiva dentro de un establecimiento. A nivel rural, entre los elementos de uso común con riesgo cierto de vehiculizar el virus, se citan los frenos, espolines, mordazas, cinchas, sudaderas, rasquetas y demás elementos relacionados al equino, cuando sin una buena higiene y desinfección previa, son compartidos por distintos equinos. Es así como estos enseres tan familiares y conocidos para el hombre de a caballo, se transforman en «armas» sanitariamente peligrosas. Son igualmente considerados de alto riesgo, la omisión de cambio de aguja al efectuar tratamientos, vacunaciones o desparasitaciones colectivas, extracciones de sangre y/o las esterilizaciones o desinfecciones imperfectas de agujas, jeringas, sondas gástricas y todo tipo de instrumentos o material punzo cortante utilizado en maniobras quirúrgicas, odontológicas, terapéuticas (infiltraciones), diagnósticas, de identificación (tatuajes), etc.

Diagnóstico

Clínico La AIE debe estar entre las diferenciales, en casos particulares de caballos que presentan pérdida de peso, edema y fiebre intermitente. También se debe considerar cuando varios caballos padecen fiebre, anemia, edema, debilidad progresiva o pérdida de peso, especialmente cuando se han incorporado nuevos animales a la manada o ha muerto un integrante de la misma.

Diagnóstico diferencial El diagnóstico diferencial incluye otras enfermedades febriles, como la arteritis viral equina, púrpura hemorrágica, leptopirosis, babesiosis, estrongiloidosis o fasciolosis grave, intoxicación con fenotiazina, anemia hemolítica autoinmune y otras enfermedades que causan fiebre, edema y/o anemia.

Análisis de laboratorio Generalmente la AIE se confirma mediante pruebas de serología. Cuando el animal se infecta, se convierte en portador de por vida. Las 2 pruebas serológicas comúnmente utilizadas son la prueba de inmunodifusión en gel de agar (AGID o Coggins) y los ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Los caballos son generalmente seronegativos a la prueba AGID durante las primeras 2-3 semanas después de la

infección; en algunos casos, es posible que no desarrollen anticuerpos hasta después de los 60 días.

Los ELISAs pueden detectar anticuerpos antes que la prueba AGID y son más sensibles, pero es más probable que ocurran falsos positivos. Por ese motivo los resultados positivos por ELISA se confirman con la prueba AGID o con inmunotransferencia (Western blotting). La limitada evidencia experimental sugiere que la producción de anticuerpos puede demorarse en el caso de los burros y las mulas. Las pruebas de transcriptasa reversa de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) también pueden utilizarse para detectar la infección en los caballos. Estas pruebas son importantes para determinar el estado de la infección de los potrillos nacidos de yeguas infectadas, ya que los animales jóvenes pueden presentar anticuerpos maternos hasta los 6-8 meses de edad. Las pruebas de PCR también se pueden utilizar para complementar o confirmar las pruebas serológicas, en particular, cuando existen resultados dudosos, o cuando se sospecha de la existencia de una infección, pero la serología da un resultado negativo o equivocado (por ej. en la etapa temprana, cuando no se han desarrollado los anticuerpos). Además, esta técnica asegura que no se infecten los donantes de sangre y los caballos utilizados para la producción de vacunas o antisueros, no estén infectados. La RT-PCR parece ser un método efectivo de diagnóstico tanto en mulas como en caballos. En general, no se requiere el aislamiento del virus para realizar el diagnóstico, aunque se puede hacer. El VAIE puede encontrarse tanto en el plasma como en los leucocitos sanguíneos durante los episodios febriles; entre estos períodos, este virus está asociado a las células. El aislamiento del virus se realiza en cultivos de leucocito equinos. Como es difícil, cultivar estas células, es posible que esta prueba no se encuentre disponible en todos los laboratorios. La identidad del virus se puede confirmar mediante pruebas de ELISA antígeno- específicas, test de inmunofluorescencia o PCR. Si el estado inmunitario de un equino no se puede determinar mediante el uso de otros métodos, se puede inocular sangre en un caballo susceptible. Los anticuerpos y los signos clínicos en el animal de prueba son controlados por, al menos 45 días.

II. MATERIALES Y MÉTODOS Placas Petri o láminas portaobjetos Agar gel Cortador de agar de 7 celdillas Antígenos y antisueros control Pipetas pasteur Cámara húmeda Fuente de luz para lectura

Preparación del agar gel: Se calentó 100ml de agua pura en un frasco sumergido en baño de agua

hirviendo. Se adicionó 1 a 2 gramos de agar. Se calentó en baño maría por 1 a 2 horas. Se adicionó 50ug de timerosai o azida de sodio (bacteriostato) y se agitó hasta

disolver.

Se filtró a través de una gasa en y se almacenó en recipientes universales.

Gel en placas Petri:

Se licuó el gel almacenado en autoclave a 110°C por 10 minutos. Se llenaron las placas Petri, eliminando las burbujas mediante flameo de la

superficie. Se cubrieron las placas hasta la mitad con la tapa respectiva permitiendo

evaporar y gelificar.

PROCEDIMIENTO Se perforaron 7 celdillas, en 4 partes de la placa, dentro del gel. Removiendo los

trozos de agar. Se marcaron las placas para identificar las muestras. Se dispensó primero el antígeno en el centro de las celdillas, para evitar

contaminación. Luego se adicionó el antisuero en los 3 pocillos intercaladamente y finalmente se incorporó la muestra en los 3 pocillos restantes.

Se dejó las placas a temperatura ambiente.

III. RESULTADOS

No se obtuvieron los resultados esperados. La prueba debería indicar negativo, ya que la muestra fue tomada de caballos de carrera, por lo que son animales sanos y les realizan análisis de sangre continuamente. Sin embargo se deberían ver bandas del control positivo, pero no se llega a observar ninguna banda de precipitación.

Figura 1. Resultados no determinados para la prueba de inmunodifusión en agar de anemia equina.

IV. CONCLUSIONES

Las pruebas de inmunodifusión en gel agar (AGID) y ELISA son pruebas simples y fiables para demostrar la infección por el virus VAIE. Cuando las pruebas ELISA son positivas, deben confirmarse mediante la prueba AGID. Los antígenos para la AIE se pueden preparar a partir de cultivos de tejido infectados mediante la utilización de la tecnología del ADN recombinante.

No existe un tratamiento específico que permita eliminar el virus AIE. La terapia debe ser sintomática, orientada a favorecer la recuperación de la serie roja y acompañada de descanso y cuidados.Debido a que la diseminación de la enfermedad requiere de ciertas condiciones ya mencionadas, es posible realizar su control y aún su erradicación. Para ello se deberá considerar el sacrificio de los caballos enfermos y los serológicamente positivos (infección inaparente) debido a que son portadores dél virus. Controlar el movimiento de todo animal sospechoso o positivo. En áreas donde existan casos clínicos agudos, deberán controlarse además los insectos picadores, extremar el cuidado con todo tipo de instrumental que entre en contacto con animales enfermos (esterilización) y realizar en forma frecuente el aseo y desinfección do las pesebreras.

V. BIBLIOGRAFÍA

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VI. ANEXO: Cuestionario

1. Indique cual es la diferencia con la inmunodifusión radial.

Inmunodifusión en agar gel Inmunodifusión radialLas técnicas AGID disponibles en el mercado utilizan como antígeno la proteína p 26 del core del virus altamente purificada para evitar cualquier reacción con antígenos proteicos no relevantes y evitar reacciones inespecíficas.Las reacciones específicas se indican por las líneas de precipitación entre el antígeno de la AIE y el suero problema en Un gel de agar.

El Ac es incorporado en el gel de agar. El Ag de los pocillos difunde formando “anillos”de precipitación:

2. Explique sobre todos los otros métodos y técnicas por inmunodifusión que existe.

Inmunodifusión simple

Inmunodifusión dobleIDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son iguales, por lo tanto se funden en una banda de

precipitación.

NO IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son distintos, cada uno origina bandas de precipitación independientes que se cruzan.

IDENTIDAD PARCIAL: los dos sistemas antigénicos comparten algún componente (banda que se funde), pero no son iguales (espolón o prolongación).

Inmunodifusión radial simple: difunde sólo uno de los inmunoreactantes (Ag) mientras que el otro (Ac) está disuelto en el gel a concentración constante.

Técnica cuantitativa: el diámetro del anillo de precipitación es proporcional a la concentración inicial del Ag.

Inmunodifusión radial doble: ambos inmunoreactantes (Ag y Ac) difunden radialmente uno hacia el otro. Cuando se forma alcanza la zona de equivalencia se observa una banda de precipitación.Técnica cualitativa: permite analizar sistemas de Ag-Ac sin poder determinar la concentración de los inmunoreactantes.

3. Indique a que se refiere la inmunoelectroforesis y defina en que consiste.

Técnica que combina la electroforesis de proteína y la inmunodifusión doble.Primero las proteínas se separan por electroforesis en gel (usualmente agarosa), luego se hacen visibles por inmunodifusión los anticuerpos específicos. Se produce un arco elíptico específico para cada proteína detectable por el antisuero.

4. Definir a que se refiere y cuál es el fundamento de la inmunoprecipitación en líquido.

Se tiene una solución de anticuerpos a la cual se le añade otra solución de antígenos. En esta se pueden distinguir 3 momentos de la reacción: Efecto prozona: Ausencia de reacción inmune cuando hay altas concentraciones de

Ac. Zona de equivalencia: Todo el Ag y Ac se encuentran formando complejos

macromoleculares insolubles (teoría del retículo). Consecuencias biológicas: sólo se dan determinadas actividades (p.ej. fagocitosis) cuando hay un equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac (en la zona de equivalencia).

Efecto postzona: No hay reacción inmune porque hay deficiencia de anticuerpos para la demanda de antígenos, por lo que se forma poco precipitado.

5. Indique los tipos de inmunoglobulinas que se detecta en la Anemia Infecciosa Equina.

Existe competencia entre IgG e IgG(T) en cuanto a sitios antigénicos internos y posiblemente para los antígenos en la superficie del virión.