pcr-rflp detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile...

12
ORIGINAL ARTICLE PCR-RFLP detection and species identi®cation of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia M. Dendis 1 , R. Horva Âth 1 , J. Micha Âlek 2 , F. Ru Êz Ïic Ïka 3 , M. Grijalva 1 , M. Bartos Ï 4 and J. BenedõÂk 1 1 IFCOR-99, Brno, 2 Department of Pediatrics, Division of Hematooncology, Masaryk University, Brno, 3 Microbiology Institute, Masaryk University and Saint Anna's University Hospital, Brno, and 4 Biovendor Ltd, Brno, Czech Republic Objective To assess the usefulness of polymerase chain reaction (PCR) assays in the diagnosis of fungal infections in immunocompromised patients. Methods A rapid and sensitive PCR-based assay for the detection and identi®cation of fungal pathogens was designed and applicability of this method was investigated in a group of children with cancer and febrile neutropenia (FN). Results The ITS2 sequences and adjacent regions of 40 fungal pathogens were analyzed and primers for detection of all analyzed fungal species were designed. Ampli®cation product length polymorphism (APLP) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) generated genus- or species-speci®c patterns. The sensitivity of the method was approximately three cells of Candida albicans per 1 mL of blood. The results were available within 8 h after sample collection. The method was tested on 53 blood samples and one lung biopsy sample from 24 children with cancer and febrile neutropenia (FN). The PCR assay detected fungal DNA in 25 clinical samples from ten patients. Blood cultures were positive in only ®ve samples, while another two blood-culture negative patients had positive cultures from throat swabs. The remaining 14 patients were both culture- and PCR-negative. Culture-isolated strains matched completely those obtained by PCR± APLP±RFLP identi®cation. The identity of fungal species was con®rmed by direct sequencing of ampli®ed products. Conclusion Our results suggest that PCR±APLP±RFLP assays can be useful in the diagnosis of fungal infections in immunocompromised patients. Keywords Fungal pathogens, febrile neutropenia, PCR assay, APLP, RFLP analysis Accepted 26 December 2002 Clin Microbiol Infect 2003; 9: 1191±1202 INTRODUCTION Invasive fungal infections have become a serious cause of morbidity and mortality in patients trea- ted for leukemia. Candida spp. and Aspergillus spp. now rank among the ten most prominent patho- gens in leukemia patients [1±3]. These infections carry a high mortality rate, ranging from 30 to 60% [1,2]. Disseminated infections caused by Aspergil- lus or Fusarium species have mortality rates close to 100% [2,3]. Early detection and identi®cation of fungal pathogens is essential for targeted antifun- gal therapy and prevention of dissemination of fungal infection. Unfortunately, the identi®cation of fungi by morphologic and radiographic meth- ods may take days or weeks, particularly the identi®cation of molds. These methods are labor- ious, time consuming and often lead to false nega- tive results. If positive results are ®nally obtained, it may be too late to treat the patient. In addition, blood cultures may fail to detect more than 50% of cases of disseminated candidiasis [4] and most ß 2003 Copyright by the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Corresponding author and reprint requests: J. Benedõ Âk, IFCOR-99, Kvenova 60, 656 97 Brno, Czech Republic Tel: 4205 54321 5696 Fax: 4205 54321 1679 E-mail: [email protected]

Upload: independent

Post on 25-Nov-2023

0 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������� �����

���� �� ��������� ��� ������� ������������� �� ������ ��������� ���������� ���� ��� ��� ���� �������� ������ �� � ������ �� ���������� �� ��� �������� �� ��� ���� �� !��� ��" ��� �� !����#��

��������� �� ����������� � ���������� ������ � � ����� �� � �� �����! "����������� # ��� $� � �� ������%�� �����! "��������� ��� &���� '���(� "��������� � ������ �� ���)� ���� � *�� �� �+��, ���%$���

��!����"� - ������ �,� %���%����� � � �������� �,��� ������ � .���/ ������ �� �,������ ��� � �%���� ������� �� �� ���%� � ��� ����� ��������0

#������ ' ����� ��� ��������� ����$���� ����� � � �,� ������� � ��� ������1���� � ��%���� ���, ���� 2�� �������� ��� �������$����� � �,�� ���, � 2�� ������������ �� ��� %� � �,������ 2��, ������ ��� ��$���� ��%�� ����� .�3/0

������� -,� �-&� ��4%����� ��� ��5����� ���� �� � )6 �%���� ���, ���� 2��� �����+����� ������� � � ������� � � ��� �����+�� �%���� ������� 2��� ��������0 '����1���� ��� �%�� �����, � ��� ��,��� .'�*�/ ��� ��������� � �������� �����, � ��� ��,���.��*�/ ��������� ���%�� � �������������1� ��������0 -,� ����������� � �,� ���, � 2������ 7������� �,��� ����� �$������ ��%����� ��� � �* � $� �0 -,� ���%��� 2��� ������$��2��,�� 8 , ����� ������ � ������ �0 -,� ���, � 2�� ������ � 9# $� � ������� ��� ���%�� $� ��� ������ �� � �) �,������ 2��, ������ ��� ��$���� ��%�� ����� .�3/0 -,� �������� �������� �%���� �3' �� �9 �������� ������� �� � ��� ��������0 � � �%��%��� 2���� ������ �� ��� 1�� ������� 2,��� �� �,�� �2 $� ���%��%�� �������� �������� ,��� ������ �%��%��� �� � �,� �� �2�$�0 -,� ��������� �) �������� 2��� $ �, �%��%��� ���������������0 �%��%����� ����� ������� ����,�� � �������� �, �� $������ $� ���:'�*�:��*� ������1���� �0 -,� �������� � �%���� ������� 2�� � �1���� $� ��������4%������ � �����1�� �� �%���0

��������� �%� ���%��� �%����� �,�� ���:'�*�:��*� ������ ��� $� %���%� �� �,������ ��� � �%���� ������� �� �� ���%� � ��� ����� ��������0

$�%�� �� �%���� ���, ���� ��$���� ��%�� ����� ��� ����� '�*� ��*� ��������

�������� �; �����$�� �66�

$��� ���� %� � &�'��� �66#< �= ����:��6�

�����&'����

�������� �%���� ������� �� ,��� $�� �� � ���� %���%�� � � �$����� ��� � ������� �� �������� �������� � � ��%!����0 $������ ���0 ��� (�)��*����� ���0� 2 ���! �� �� �,� ��� � �� �� ������ ���, ����� �� ��%!���� �������� >�:#?0 -,��� ������� ������� � ,��, � ������� ���� ������� �� � #6 � ;6@

>��?0 ������������ ������� �� ��%��� $� (�)��*��+��� � �������, ������� ,���� ������� ����� �� �� � �66@ >�#?0 A���� ������� � ��� ������1���� � ��%���� ���, ���� �� ��������� � � �������� �����%����� �,����� ��� �������� � � ����������� � ��%���� ������� �0 "�� ��%������ �,� ������1���� � � �%��� $� � ��, � ��� ��� ���� ����,�� ���,� �� ��� ��!� ���� � 2��!� ������%����� �,�������1���� � � � ���0 -,��� ���, �� ��� ��$ ��� %� ���� � ��%���� ��� ���� ���� � ����� ��������� ���%���0 �� � ������ ���%��� ��� 1����� $�������� ��� $� � ���� � ����� �,� �������0 �� ������ �$� � �%��%��� ��� ���� � ������ � �� �,�� 96@ ������ � ������������ ����������� >)? ��� � ��

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� ��������

� ����� ����� �%�, � ��� ������� ��4%����= B0 ����CD!�������� E��� �� ;6 ;9; �F �� �+��, ���%$���-��= �)�69 9)#�� 9;�;��7= �)�69 9)#�� �;F�A�����= 5$�����!G��+���0�+

����� � �������� ��������� ��� >9?0 &�� � ����� �������� %������$�� �� ���%� ��1����� ������ ��������>;?0 ��������� ��2 ����� ����� ���� ������ ���,���� �� ���5 � �,������� � ����������0 -,� �������� � � �����1� �%���� ����%��� � �� ����� .�:#�����%��� ������ ������ �� ����/ �%����� �����.��� ����� �3' ,�$����+��� �/ � ��2 ��� � ������ ���� ��,�� ��� �%������� ����������� ������������� >F8?0-,� ���� �%��� � � ����$���� ������� � �

�%���� �3' �� � ��2 ���� ��, ��� ���,� $� � ����������� �,�� �,� �%����� �%��%���$���� ���, ��0-,�� ���� ��� ������� �%������ �%���� ������ ������ $� ������� � � ������� � �������� �����0���%�� �,� �%���� ���, ���� ��� ���� � �����%���� ����� �� ������$��0 -,� ��$ � ��� �3'���������� ���� �� ��� ���������� ������� � � ����$���� ������� � � �%���� ���, ���� >F�:�)?0-,��� ���� �� � ����� �� �%�� ������ � ���������3' ����� �%���$�� � � ������ ���������0 -,������$�� ��4%����� � �������� ��������$�� �������.�-&� ��� �-&�/ ��� �,� ��4%���� � �,� � ����������$�� ������ .3-&/ ���� � ��� %���%� � � �%��,��������� ������1���� � .���%�� �/0-,� �������� ��������$�� ������ � .�-&�/ ���� � ��

H��!�� $� �,� 908& ��� �9& ��3' ����� ���$���%�� � ��� ,��, ��4%���� ��� �����, �����$������� ����� � $� � � ������� ����� ���� ���%� ���%���� ������1���� � ������ ��� �� �,�� ���������%���� >�#�9:�9?0 '����1���� � � �,� �����$���-&� ��4%���� 2��, ������� �������� � �,��,�� ����������� � ������� ����� � ��5�����908& ��� �9& ��3' ����� ��� 2� $ �, $� ��

����� �%���� ������� � �� � ������ ��� ��� �%��,�����%� � ������� ������1���� � >�#�9�;�8�����)?0 &������ ��%���� ,��� �, 2� �,�� �-&� �����,� ��� ��,��� ���I � ��*� �������� $����������� ��������� � �,� ��� �� �%�� 2��, ���������� � ��� �%������� ���,� $� %���%� � � �,� �������1���� � � �%���� ���, ���� >�;���)?0 '��, %�,���� �%�, �� ,��� ��� �������� �,� �������$������ � �,�� ���� ��, �� ������� ������1���� � � �%��%����� ����� �%���� ������� >�;���)?� �� � �,�� ,��� %��� ���:��*� � � �%����������� � ��� ������1���� � �������� �� � �����������������0-,� ��� � �,�� ��%�� 2�� � ������ � �����

��������� ��� �����1� ���, � � � ������� � ���������1���� � � �%���� ���, ���� �������� �� ��������� �������0 J� �����+�� �-&� ��4%����� � )6� ��������� ���, ����� �%��� ��� �������� ����������� ������� � ������ ��� �%���� ������� ��4%�����������0 � � ���%� ��� ������� ������1���� � 2�%����+�� �����, ��� ��������� � �������� �����,� ��� ��,��� �������� � �� 2�� $� ��������4%������ � �,� �����1�� �-&� ���� �0 -,� ��������� �������$����� � �,�� ���, � 2�� �������������� � �� %� � �,������ 2��, ������ ��� ��$������%�� ����� .�3/0

#������( ��& #�)�&(

����� �� ����

' � ������ � � �%���� ������� 2�� %��� �� �,����%�� .-�$�� �/0 ��� ������� 2��� �%�������� � &�$ %��%� ��7�� �� ���� ������ .&�� 1 �����

��� � * .�/ �,������ ��� � �,� $���%����� ��3' ���� � �, 2��� �,�� ���� �� � ��3' ����� ��� ������������� 3-& ��� �-& ��4%����� .�� �>��?/0 .$/ A7������ ��� � �����1���-&� ���� � �, 2��� �,� � ���� �� �������� ��������� � ����� ��� '�*�� ��� ��,��� � .�/ $������ ��%�����.��/ $������ )������� �� ��� .���/��� �����, ���0

���� $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

����� * *����, ��� ��4%���� � ��� ��,��� � �,� �����1�� �-&� ���� �� �� ������ �%���� �������

� �����,���-��.������/ ��,/

�� � ��,��������� 0��1�

)������ ��,���� 0��1�

��2� � ��,����0��1� ������ �� ���0�1�

3�����$������ ��%����� *�88�F #�; #�; )I9�I�;# �3-�9;9F 66# 66) 66� 669

�;�)I�90� 6�8 6�� �� �8�86 �#60�;8$������ ��%�������� '6#99�6

'���8��###� ##� )I9�I�;8 ��#)I�666

$������ ������ *)F��# ##; #8IF�I��� )I);I98I��8 �3-�;;�6$������ ��) �-���� '���8�8# ��� ��� )I��9 �3-�;;#� 6��$������ ��-��� ���� '���8�F; #;# ;8I��9 )I9�I#66 �3-�;;#)$������ )������� �� '���8��� #;) #;) )I9�I#6� �3-�;;##'��F6�#;$������ ���������� '�66���9 �)) �)) )I��I�;I99I�)F 6�9$������ ��'-� *)F�6F )�6 )�6 )I�)I�8�I��� 6#F$������ )���)��� ���*)F�6�

"�6�88 #66 #66 )I)FI9�I��6 �3-�;;�; �#)�6# 6#9 6#� 6## 6#) 668 66F �#�0);�

$������ *�������, ��� '6#��F8 #;8 9I;8I��9 )I9�I�)�I�;# 6#� 6�#$������ �� )������ *)F��� #�9 F6I�)9 )I9�I�9� 66; 6�� 6�F 6#8$������ *��%���� '��;F��#

'����668)�6 ��;I��) )I9�I#)F 66� 6�6 6#�

.������ ,-��� ��������� L�9�)# )69 �88I��F )I9�I8FI�99 �� �8����� � � ���� ��%�� '6�;6�F

'���8�F8#�# �8�I�6) )I9�I�;�I�;� 6��

$�-)� � ���� �� ' �,��� '��;���;'����66#

#;) �9I�;� )I9�I#6� 6)� 6))

���� ���� �������� �����(�)��*����� '����� '668)�; #)� 9I;8I8#I�8; )I9�I���I�9F �� ���68(�)��*����� )���������� �8)#9; #)9 9I;8I8;I�8; )I9�I��9I�9F �� ��996(�)��*����� ��*�� '�6F88�9 #)# F#I89I�89 )I9�I��)I�9; �� ��##6 66�(�)��*����� '�,�*���� '�6F88�� #)� 9I�8I;8I8)I�9F )I9�I��#I�9; �� �AF#F(�)��*����� ������� '-"�#;8) #99 9I��I;8I�9I�98 )I9�I�#)I�98 6�9 6)�/���������, ���-� *���, '�6#))9� ##� 9I�FI;8I8#I�9; )I98I���I�99 �� �86#)/���������, *�-�� '����, '�6#))9# ##� 9I�FI;8I8#I�9; )I98I���I�99 �� �866;0,�������� �������� '�6F88�� #)# )IF6I88I�8� )I�FI9�I�6�I�9� �� ���;;(��������� � ���� '&M�F6F6 ##� �#6I�6� )I9#I9�I��# �� ���;F(��������� ��������� 'B�F;699 ##; ��8I�68 )I9#I9�I��6 �� ��#�F�������, 1-�) ��, '��;98F9 #�8 F8I�96 FI9#I9�I8#I��� �� ���6��� � )��,%��� '���F��9 #9; )9IF6IF�I�;� )I98I���I�8� 6�;��� � � �1�� '���F��# #9� F�IF#I��9 )I98I���I�;8 �� ����6(%����� � �-,%�'��� '���F�#8 )�8 �6#I��9 )I98I#;; 6)6

��66#

� �����,�$��,�A%� ����

& �����

��������� ��� $� � ������������

%���������

$�

&+����:��6�

&��

���

�����%�������, �������#

� ���� �����%� A%+������ ������/ � � �:) ���� ��#F ��0 &������ ������1���� �2�� ����$���,�� $� �,�'�� �� #� � ������ .� � �D���%7 *� � ������/'%7�� � � .&�� 1 ����� ���� �����%�/ ���I � $�� ������ ��� � ��, � ����� ��������0

��������

-2������ %� �,������ ���� �:�8������ 2��, ��������� ��$���� ��%�� ����� .�3/ 2��� �������� � �,�"��������� �,������(� � ������ �� �� �+��,���%$��� �� � &�����$�� ���F � ��$�%��� ����2��� ����%��� �� �,� ��%��0 �3 2�� ��1��� �� �� ���I�7������ ��������%�� � �#809 �� � � ������ ����� � � �#8 �� � �� ����� �2 ����� ��2��,�� ) , �� � ������� 2��, �� �$� �%�� ��%�� ��,�� � %�� �966 � �6;I*0 ��� ���� � ����� 2�� $������ �� � ������� � ��� �,������ ��� ���� ���,� ��%��0�� �,� 1��� ��� � �3 ������ $� � �������

2��� � ������� � � ��� ��� $� � �%��%�� �� �,����� 2,�� �,� ������� 2�� ��$����0 �� ���, ��$�������� � �2 � �,��� ������� � �����,���� $� ���� �� � ������� ��� %� ���,����� .�K�/ 2���� ������� � � $� � �%��%��0 &%$��4%��� �������2��� � ������� ����� #:) ���� �� �,� ��$���� ����� �� ��������0 K�� %� $� � ������� � � ���2��� � ������� �� �%$�� � �������� A�-' .&�����������%� ��/ ��� ����������� �� ������ � ����0 �� �� ������� 2��, � �%�� ���� ���������� �� ����� ��� $� � ��%��� � � ����,�� � ��,� ����� �� ���� �� � �3 $� ��� ��� )� ����%���� $� � ������� 2��� $������ � � �����������0

&�� �4� ������

���� ,%����� �* � 2, �� $� � � ����� �%������� � 2��� %��� � � �,� �3' �� ���� � .�3'�� ���� � E�� �������D �� �+��, ���%$���/ ���,� � �� 2��� ������= �� � 1��� ���� ����,� �����2��� ��+�� ��� �,� ������ � 2,��� $� � ����� ������� ������� $������ 2�� ������� 2��, 9 "I�* � �������� .&���� '�����, ����%� ��/0 �%��,������ ����� $� ���! ��� ��������� ��� �,� �,� �� �������� �%�������%� �,� ������� 2�� ���� ����0�3' �� � ��+�� ����� 2�� $ %�� � �� ��, %�&��� ��������� 2��,�� ��� ���� ���� �� 96 �* � -A $%����0 -,� � ��������� � � �%����� �����2������%��� ������ �, � ���������� .N���O%����3'I�3'&����� �, � ����� �,�������������"&'/0�

����

*� ����%��

� �

����

,�

��-��

.�

����

�/�

�,

/��

� ��

,��

���

����

0��1�

)��

���

� ��

,��

��0�

�1�

��2

�� ��

,��

��0�

�1�

���

���

�� �

��0�

1�

&�

,��

���%��

�2

����

)�-

� �

��%�

�,

L�F��#

#;6

9I�I)6I9;I8�I�;�

)I9#I9�I�))

6��

2��

�� )

�-�

�,

����

*� )

�-��

�'�6#8#9�

#;�

9I�I9;I8�I�6�

)I9#I9�I�)9

6�� 6�#

2��

�� �

��,

���

����

'B�#6;F8

#9�

�98I��)

)I9�IF�I��F

�� ��)8;

2��

�� �

��,

�)

�-�)

��,

L)88�9

#)�

)I��I�98I�;�

)I9�IF�I�6F

�� ��9)�

0)�

���,

)�-

� �

'� �

� ��

,'��;8�#6

)�;

9I��I�#I)#I�6;I�#F

)I9#I9�I#66

6�6

���������������,� �����������������������%������� �N����!��4%�����0

$��������������,� ������������������������ ������������������2��,��� �%�������

���������

2�3�0

� �� �+��,� ������ � � ��� ���������� �+��,���%$���<�3-��+��, �� ��!3��� ���� ������ � �-����%��%����� �+��,���%$���< � ������ � �

��� $� � ��������%�� �����!"������������&����'���(�"���������� �������� �+��,���%$���0

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

���) $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#

���� ������ �� ��,������"� ���� ��� ������ ���� ������"� ���� ���

�� ���� � �� �� � ���$�� �������������� ���%��� 2��� � �,� �������� � ��� ��,�$�� �� �� ����������������� �� �������� �������� 2�� � ����%����0-,� �������� �������� 2�� �������� � $� ������1�� $� �,� ���� ������ ��� �� �,� �%���� �3' $%���������� � ��� �� �%�� � � ��������� ��+�.9�� $�/ 2,��, 2�� � � �������� $� �,� ��������� ���+���� %��� �� �,�� 2 �!0 ��� � ��& ���,� �� �� 2�� %��� � � �,�� �%�� �� >�;?0��� �$����� �������� 2��, �������� ��������

�������� ��� � ������ � ��� � ��4%����� .������1�� ��������� � $������ ��%����� �-&� ��4%����/2��� �������� 2��, �,� -' �� ���� E�� .������ ���� 3K *��! �,� 3��,�������/0 -,� ��� �$������������� 2��� �7������� 2��, �,� O�'NA3 �������� ��� E�� .O����� N������/ �,�� ������ ��, � ���������� ����%��� ��� ���%��� � ���� ������ � ��������� �� �� -A $%����0

���%,� ��� ����� �������

� � ������� � � �,� %�������� �%���� �-&���4%���� �� �4%�� ��� ��7�%�� � � �2��� �������� ."3�� 9���� ��� ��� ��� ��� ��� ���#� "3���9���� ��� ��� ��� ��� ��� ���#� ���"3��$ 9���� ������ ��� ��� ��� ���#�/ ��� � ������� ������ "3��.9���� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��#�/ 2��� %���0 -,�96 �* ��� ��7�%�� � ������� � �� �&���� ����� �7 .O����� ������ N������/ �9 �� � � "3����7�%�� ������� �9 �� � � "3�� ������ �66 � � �"-� .&����/ 609 " � %�������3'���� ������.&����/ � � �,� ��������� � � � ���$�� �� ���� ���������� � ��� 9 �* � �������� �3' �� �%�������� �������� �3' �� ���� �0 -,� ��� ������ �2�� ���� ���� �� � �,����� ������ .�-���66 B�������, J����� 2� ' "&'/ %���� �,� � ��� 2��� � ����� ��= .�/ ���%$��� � �� #F �� � ��6 ��� � � "�N ��������� � �� 2�� $� �,� ��������������� � � �3' � �������� �� �; �� � � �� ���<.$/ )6 ������ � �������� � � �����%���� � ���� � ��6 � �� �; �� �� ��������� ���� � � �6 � �� 98 ����� �� �7����� � ���� � � #6 � �� F� ��< ��� .�/ �,�1��� �7����� � �� F� �� � � ) ���0

(������"��% �����

-,� ����������� � ��� �����1���� � 2�� ������ ��%��1�� $������ ��%����� �3' � ������ � ��� ��������� ��� ,%��� $� � ������ 2��, $������

��%����� ������ �%��1�� �3' � $������ ��%����� ���� ������ � ��� � �������� 2�� ������ �, � ����������� 4%����1�� �6�� �� �������� ���%��� ��� �,���������� ����� � �,� �����7�%��0$������ ��%���������� 2��� �%������� �� 60�@ 3��� � %���� �� �%P �! �,��$�� ��� �������� ���%��� ��� $� � ����4% ��0 �3' �� � �,��� ������� 2�� �� �����.�3' �� ���� � E�� �������D/ ��� �,�� ������������� � �,� ��� ��7�%��

���� ������ ����%���

��������� � �������� � �����1�� ��� �� �%���2�� ���� ���� $� ������ 2�3� .��#'� ��� 0� ����� �%������ ������� � .3�2 A������ � *�$������� ' "&'/0 -,� ��������� � ��������� 2������������ � � #@ .2�I� �/ ���� �� ��� �������2��, ��,���%� $� ���� ���%���+�� $� "K ���������%������ � .#�� ��/ ��� �����+�� $� "*-�'*" ."�����*%� ���0 ������ �� �' "&'/ ���������� � ��� �������� ������0

(�2�������

-,� �����1���� � �� �%��� 2��� �������1�� �����4%����� �� � $ �, ����� $� %���� "3�� ���"3�� ������� ������������0 '�� ��4%����� 2����� ������ $� Q&�4%�������&������( � K��NA3�� ��& � ������� �������, N�$� .J��� '%�����/��� �,� �������� 2�� ���� ���� 2��, �,� � ��2����,� ��� K��0 �0;� .-��,������%� ����������'%�������/ ��� �,� �*"&-'*J �� ����0

�,���� ��2����� ����%���

-,� ��4%����� � �-&� ��� ��5����� ���� �� � 908&��3' ��� �9& ��3' � )6 �%���� ������� 2������,���� �� � �,� N����! ����$��� .3��� ��������� � � � ���,� � �� ��� ����� � 3��/0"���� �,� *'&- ��� ���,� � �����, � � ������������ ��4%�����, � � ���� 2�� ���� ���� >�F?0 %������ ���������� 2��� ���� ���� 2��, �,��*"&-'*J �� ����0 -,� ��*� �������� �� ��,��� ��4%����� 2��� ��������� 2��, �,� ��� ��,� JA�"--A� ���0 �060 �� ���� .-�$�� �/0

�('��(

'��"� ��� � �,� � ����������%

-,� ������� %��� � � %�������� �%���� ������� �2��� �������� ����� �,� ��4%���� �������� � )6���� %� �%���� ������� �� � �,� N����! ����$���0

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

&����� �� �� �%���� ���, ���� ���9

-,� � �2��� ������ "3�� ����,�� � �� $%� � ���� ������ ��4%�����0 '� 'IN�������, �� � ���� �� �� � �,� 9� ��� � �,� "3�� ������ ��4%���� ���,������������ � � $�-)� � ���� ��0 ( ��� ,-��� ��0$ ����� ����0 ��0 ��� /���� ����� ���� ��0 -,� �%$�����%�� � 'I- �� � ���� � ) �� ������� � � $������)������� �� ��� �,� -I� �%$����%�� � �� � ���� � �F�� �,������������ � � ��� � ��0 ��� ���� ,�� � ��0�� �,�� $���� ������ ��� ������� ."3��� ���"3��$/ ����,��� �,� ����� ��� �%$����%�� ��2��� � ����%����0 ������ "3�� ����,�� 2��� ����,� �%���� ��4%����� ������ .���%�� �/0-,� �%���� ������� ������ � � "3�� ��� "3��

������ �����1���� ��� ������ �� -�$�� �0 A���� ������������� � ������ �����1���� � �� �%�� � � ���������� �����,0 3 �����1���� � �� �%��� 2����������� 2��, ,%��� �3' .�� ����� �� � ,%�����%! �����/ ��� $�������� �3' .0���������� � �� ���.��)�-� � ���� ������/.���� � � �, 2�/0

'��"� ��� � �,� � �������"��%

-,� ��� ������ �2�� �$�� � ������ ���� 7�������; � ���� � �,� � ������ � ��� � ������� �6 �� ��������� ���%��� $� ��%�����4 ��� ��� �3' .� ������ ����� � 60# ����� �����/0 -,� ������� � ������������ � $������ )������� �� � ��� � ��0 %���� ��������� "3�� ������ 2�� �6:�66�� �� � 2��� ������ � �,� ����������� � ��7�%�� � "3��"3��� ��� "3��$ �������0 -,� ����������� � �,������� �� ���� � �%���� �3' ������� � �� �����,����� $� � ������� .�%����� ���� �%��1���� � ��������1���� � ��� ������ �, ����� ������� �/ 2������ 7������� �,��� $� ��%����� ����� ��� ���������� � ���!�� 2, �� $� �0

(������ ��������������

'����1�� �� �%��� %����2��� ������ ���������2��, ������ ��� 2�3� ��������� � ��� �%�������0'����1���� � �� �%�� �����, � ��� ��,���.'�*�/ ��� ��������� � �������� �����, � ���� ��,��� .��*�/ �����+�� 2��� %��� � � �%$���4%��� ������1���� � � �%���� �������0 -,� '�*���� ��*� �������� 2��� ��������� ��� ����� � �,���4%����� $������ �� � �,� N����! ����$������ 2��� ������ � �,� �%���� ������� ������ ��-�$�� �0 '��, %�, �,� ����������� � � ����������+�� � ���� �� ��� ������ �, ����� 2�� � � ���%����� �� %�, �,� �6 $� �������� �����, ����������2�� ������� �������$�� ��� ���� � ���$�� �,������$�� ������1���� � � �,������������ ��������� �

��������0 ���%����� '�*� ��� ��*� �������� � ��������� �%���� ������� ����,�� �,� ������ ���������������� ���0� %����� ����� ������� .�� $������ ��� # � ��

$������ �������/ ��� �� �,�� ��������� ��� ������ �� ��%������ �%��� ��� ������ �,���� 2��������� �� �,� ��%�� .-�$�� �/0 -����� ������ ��� ��������� ,��, ������ � ������������ �����$�������H����� �� '�*� ��� ��*� �������� �����1��� %�, � � ���%���� ������1���� �0 � � ������������� � � �,� �� ���� ������� $� ��%����� ��� $��������%��������� �,� %�� � �� �,�� ��������� � ��� �%������� ..��#'�/ 2�� ���������0 -,� '�*� �����*� �������� � �,�� ������ �%��� 2��� ���%�������1� ���,�� �,�� �������������1�0 -2 ��������� %�� (�)��*����� ���0 ��� /���������, ���0 �� ��%��� ������� �������� ����������� �,� �� %� �(�)��*����� 5���� (� )���������� (� ��*�� 0,���������������� ��� �,� �� %� � (� '�,�*���� (� �������/���������, *���� '����, ��� /� ���-� *���,0 '������ ��� ��������� 2��, 0� �� ��� �%������ ��� 2���%��,�� ������������ � � (�)��*����� ���0 ��� /���+������, ���0

������� �����������

-,� �������$����� � �,� ���, � � �������� ���������� 2�� ������ � 9) ������� .9# $� � ���������� �� �%�� $� ���/ �� � �) �,������ 2��, ��������� �30 -2�����1�� %� � #8 .;90F�@/ ��������� � ��� �������� 2��� ����� ������ � � �%�����3'0 � � �%��%��� 2��� � ������ �� 1�� ��������2,��� �� �,�� �2 $� ���%��%�� �������� ��������,�� � ������ �,� ����2�$ �%��%���0 -,� �����1����� � � �%��%����� ����� ������� � ����� ���� � �,�������%� $������ $� ���:��*� ������1���� �.-�$�� �/0 -,� � �� ���4%����� �������� �������2�� $� ��%����� .� �������I) ��������/0 '� �� �,�� ����%����� ������ $� �� )������ .; �������I)��������/ $� *��%���� .) �������I� ��������/ ���$������� .� �������I� �������/ 2��� ��������0 �3'� ����� ����� � '�)��*����� ���0 2�� �������� �� �� ������� .���%�� �/0 -,� ��������� �) ��������.�; �������/ 2��� $ �, �%��%��� ��� ������������0-,� ���:��*� ���, � ���%���� �� ���� �����

������� � � �%���� ���, ����0 A���� ���%��� � � �,��������� � �$����� � �%���� �3' �� ����������������� 2��� ��,����� 2��,�� ) , 2��, �������� ��� ) , ��������� � � �,� ������� ������1����� �0 '�� � ������ �������� 2��� ������� �%������%������ � � �������� �� � ����� � �������� ������������ ��������� �� �,� ��� � �,� ���������0

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

���; $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#

����� 5 ���%��� � ������� � ��� ������� ������1���� � � �%���� ���, ���� �� �6 �������� 2��, � �%������ �%������ $� �%��%�� � ���

� (�4 ���-������������� #��� ��� ������"� ����� � ��������� ��

&� �����2�������� �,,����

� �8 ��� ����� ��

$� � : (�)��*����� ��0��6 ��# �9F

(� '�,�*����'��#8�880��66@I#6F $�

�3�;�N������� ��� ����� �� ����� �8��;���%� ��� 2��, �%�� �$������� �9F

�%�� �$����� �%��%�� 3�.$� ���/

(�)��*����� ��0���, � ����� �������� � ��������� ���

(� '�,�*�����9F

�,�����< '� ��� � ��� '� '��#8�880� �%�� ��= � �

� �F '** $� � $� ��%������9

$� ��%������9 �8 ��6

$� ��%�����'���F;6�0��66@I��F $�

�3�6� .��� ���� ��/ �%� ������,�����= ��%� ��+ ���%�� ��= � �

$� � $� *��%�����8

$� *��%�����8��6

$� *��%����'���8��90��66@I#F8$�

�3��� .��� ���� ��/N� ������ �� �K������� �8 �,�����= '��%�� ��= � �

# 9 ��%� �$���� ��

$� �.�K�/

$� �� )�������8

$� �� )�������8

$� �� )������'����66�0��66@I#F8 $�

�3�6��K� ������ ��6�,�����= ��%� ��+ �� �K� �7������ � ��6�%�� ��= � �

$� � : $� �� )�������8 ��

$� �� )������'����66�0��66@I�;8 $�

) ) '** $� � : $� ��%������� ��

$� ��%�����'���F;6�0�

�3;� �%� �����$� ��%����� �%��%��� �� � �,� �� �2�$ ���,�����= ��%� ��+ ���%�� ��= � �

9 � # '** $� � : $� �������8

$� ������*)F��#0�

�3��N������� �� �%� ������%��%��� �� � �,� �� �2�$=$� ��%����� ��,�����= ��%� ��+ ���%�� ��= � �

; ) '** $� �.�K�/

� $��� )��������

$� �� )������'����66�0�

�3�����,���� ������ ���,�����= ��%� ��+ �� �K� �7������ � ���%�� ��= � �

F � '** $� � � $� �� )��������

$� �� )������*)F���0�

�3#����,���� ������ ���,�����= ��%� ��+ �� �K� �7������ � ���%�� ��= ��

$� �.�K�/

$� �� )��������

$� �� )��������

$� �� )������*)F���0��66@I�;8 $�

��66#

� �����,�$��,�A%� ����

& �����

��������� ��� $� � ������������

%���������

$�

&+����:��6�

&��

���

�����%�������, �������F

(�2�������

-,� ������1���� � � �%���� ������� $� ���:��*�2�� � �1���� $� ������ ��4%������ � ������1�� ��������� ��� � ������ � 2��, ��4%������� � �,� N����! ����$��� .-�$�� �/0 �%�����+������� ��4%������ � �,� �����1�� �������� �$� �� )������ 2�� ���������� %��%������%�0 J,����4%����� �� � $ �, ���� ��� �8� � �� �%��� ������ %� � #�9 ������������ 2��� %���$��% %��������$��0

&�('((���

' ����� ��� �����$�� ���� ��, � �,� ������� � ��%���� ���, ���� ��� �%$��4%��� ������� �������1���� � $� � ���:��*� ���, � 2�� ����� ���0-,� �������$����� � �,�� ���, � 2�� ������ ��%���� �� ����� ��� �� �������� ������� �� � �,������� 2��, ������ ��� ��$���� ��%�� �����0 ��� �%�, �� �%����� �,�� �,� �-&� ��4%����

��� �,� ��4%����� � ��5����� 908& ��� �9& ��3'����� � %�� $� ������ ������� � � �,� ������ ����� � ��� ������ � � �%��� ������� � ���������� ������1���� � >�#�9�;�8�����)?0 -,�����4%����� � ����� �,�� ����������� ,��,�� � �������� ���� �� �,�� ��� ��� 2 Q$� ��������(�%���� ������� �0 *����, ��� ��4%���� �����$����� � �,� ����� �-&� ���� � �� �����$�� � � �,� �%$���4%��� ������� ������1���� � � � �������� ���� � �������0 �� ��� �%���� ����� � ����� �%������� ���� � �,��� ��4%����� .)6:86 ������ � ���� ���,��� �� ��� ��/ ���%����� �� �� ��������� ������������ � ������� � >�8?0�� �,�� ��%�� �-&� ��4%����� ��� ��5�����

���� �� � )6 � ������� �%���� ���, ���� 2��������+�� ��� ������� ."3�� ��� "3��/ 2����������� �������� � �,� � ������� ���� �� �908& ��� �9& ��3' �����0 ������� �,� ,��,��� ������� ��4%����� � �,��� ���� �� �,� ���������� � � � �������� ����, �,� ��4%����� ���� �����+�� ������� .�0�0 $������ )������� �� ���� � ���0/ ���%����� �� �� �%�, �� �66�� ��� 2�� ������� � �����������0 -,�� � �� � ������������ %�� ������ �,� �$����� � ������ � �� ������������� ����� ���, ����0 � � �������� �%� ���� ����� ������ �������� �� ��%�� ����� ,���� � ������������� $%� ��� �� �� ��� �� �7������� � �>��#6?0 -,%� ������ ��� ������� ."3��� ���"3��$/ 2��� �������� ��� �4%�� ��� � �$������ � � ��� � �2��� ������� ���� � �,� �����1������������ � �����������0�

����

5� ����%��

�(�4

���

-��

�����

�����

�#

���

���

����

��"�

����� �

����

�����

��

&� ��

���

2���

�����

�,

,��

��

8�

��'**

$� �

$�

��%�

����

�8

$�

��%�

����

�9�8���

$�

��%�

����

'���F;6�0�

�66@I��F$�

�38��������������%�� ����

������������9��)

�,�����=��%� ��+ ��

�%�� ��=��

��

)' *

$� �

�$

�*�

�%��

���8��9

$�

*��%

����

'���8��90�

�66@I#F8$�

�38�

N��������#

,�����=��%� ��+ ��

�%�� ��=��

�6

�' *

$� �

:$

���

���

����8

$�

�����

�*)F��#0�

�F@I#6�$�

�39��%� �����

�,�����=��%� ��+ ��

�%�� ��=��

3��������%�$��< ����<�������<'**��%������, $���� ����%!����<' *��%������ ����%!����<�3

4������, ����� � ���$�������%�� �����.������/<�

44�,��� ��3���� �<�K����������� %����,����<3�� �� ��<'����, �������<��� ��������� ����0

��4%������� ����������,����4%����������������=������ ��%�$��: �����������,��������������� � �����������4%����.3��� ���������� �� ���,� � ��

��� ����� �:3��/0

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

���8 $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#

-,� ,��, � �� �%�$�� � �-&� ��4%���� ���%���� ����� >���8? ��� 2�� ���� ��������� �������� � .�$ %� # ����� � $������ ��%����� ��� � �* ����!�� $� �/0 �� ��� �,� � ���$�� ������������ � � �%���� ��� ��� �3' �%���� �,� �� ���� ��� ���� ��� 2�� �,� ������� � � ���� ���� �,�� ���%���� ���� ��� ���, ��� ������ �0 -,� �����1����� � �� �%��� 2��� �������� �� ���%�� �� � $���%����� ��� ��� �3' � ����� ����� � 60# ���������� � � ��7 � ���� � � ������ � ��� � �������0-,� ��� �������� ,��, ����������� � �,�

���, � ��� �,� � ���$����� � ������� � � ���� �������� ��������� �,� ���! � �����:� ���������%���0 -,� �7��������� � %�� %7 �� ��0 >#�? � ��$$�� � ���� ��5����� 2��, $� ��%����� ����� ����%��1�� ���, ��� �3' �, 2�� �,�� �,� $� ���������� � ���� �3' � ���� �������� �� �� 2���,�� �,� ��������� � ���$�� ����� �%�������� �,�

� ���$����� � ������� � � ���� �%���� �����0 -,����� �,�� � �� �%���� ���� � �������� ��� %$�4%��� %� ��� ��� � %�� �� �� �,�� ������ �� �,����������� ����� ��� �!�� �� ,%���� �� � ���� ��,� � ���� H �� �� �� �,�� �� $��� ����� �� �,�������� � � �%���� ���, ���� >#�?0 � 2���� ����������� �� ���%� � ��� ����� �������� ���, � ������� ���%�� �, %�� $� � �������� 2��, ������������� �� >##?0 �� �,� �,�� ,��� �����:�����������%��� 2��� � �,� �������� � ��� ��,�$�� �� ���������� ��������� ���,� ��� ������ �,� �����$����� � �,� ���, � >#)?0 -,� %�� � �� �������� ����������� 2�� %� � � ��� � �,� ������ �(� ���� ��������� �� �� �����:�������� ���%��� >�;?0 �� ������ ��,� %�� � �,� �������� �������� ��� ������ �,�4%����1���� � � �������� ���, ���� ��� �,� � ���� ���� � ��������� ���� ��� $� 4%���������� � ���������� ���0

��� � 5 ���:��*� ������� � ���������� ������1���� � � �%�������, ���� �� $� � � �������� 2��,��$���� ��%�� �����0 A�,���%� $� ������������� ���� �� ����0 .�/ ���������� � � �%���� �-&� ��4%���� ��$� � � �������� %���� %���������%���� ������� "3� � ��� "3��0 �) 9 F 8 : � ������ �������� .��(�)��+*����� ��0 )�� ��%����� 6+$�*��%���� 7+$ �� )������ 8�� ������/< � # ; 8 ��������� ��������< � : �������� �� ���� �� ��� �< �6 : � ������ � ��� � .�6�

� ���� � ) ������ � ��� � )���,��/< �� :��� �������� � ��� � .��������� 2��������� ��� �,� ��� ������ �/0 69 $��������� : �����1�� �������� ���������0 .$/ ��*��������� $������ ������ ������ �����1���� � � ��������(�� �%��� ������� 2��, ���&&& .�/ ���2�3& .$/ ��� �%�������0 � �(�)��*�������0 �+$�*��%���� #�� �� )������ "+������� 6+� ��%������ �+ �6 $� � ����%��� 2���,� ��������0

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

&����� �� �� �%���� ���, ���� ����

���%�� �,��� ��� �����1���� ����������� �� ������%���� ��%� �%������$����� �� �� �%���� ����������%���� ������1���� � �� ��������� � � �%������%����������0 �� �,�� ��%�� 2� ��� �������� �,����*� ��� '�*� � ��� ��,��� �������� �� �%����$�� � � �,� ������������ � ��� ������1���� � �� �� ������ �%���� ���, ���� .-�$�� �/0 A�� �%������� ��������� � �����1�� ��������� 2��,������ ��� 2�3� ��+���� ������� �����1� ���������� � �������� �,�� ��� 2�� ������� ����� ������������� � � �,� ������� �����0 �������� ��� ����������� �%�, ��$� ��%����� $� �� )������ $� *��%���� $�)���)��� ��� $� ������ $� ���������� �$� ��'-� �������%��4%� ��*� ���'�*� �������� �,�� ��� 2�� �,���%��4%�� ��� ������1���� �0 � � 1������ %� �%���, 2���� $���%�� �,�� ��� �,�� ����������� �� ����� ������� ��������� � �������� $������ $� ���������� 2��, ������ 2�3� ��� 0� �� ��� �%�������2��� ���%�� ���,�� �,�� �������� �����1�0 � � �,���������� ������� ������1���� � �,�� ��������� ���� �%������� ��� ���������0'��, %�, ������� �%�, �� ,��� ��� ��������

�,� �������$����� � �,�� ���� ��, �� ������� �������1���� � � �%��%����� ����� �%���� �������>�;���)? � �� � �,�� ,��� %��� ������*������ � � ������ �%���� ������� � ��� ������1���� ��� � �������� ���������0 -,� � ���$����� � %�����,� ���:��*� �������� � � ������� � � �%�������, ���� 2�� ������ � � �� %� � �������� 2��,������ ��� �30 -,� ��� ������� � ����������� ��%���� ������� � 2�� ,��,�� �� � ������ � � �,��������� �%��%�� ���, �0 -,� �%���� ��������������� $� �%��%�� � ����� ���� 2��, �, ���������� $� ��� ��� ��� 1������ 2��� � �����$��2��, �,� �������� ����%� � �,� ��������0�� ��� ����� �,� ���������� � �%���� ���, ����

�,��������+�� $� '�*� ��� ��*� �������� 2���� � �,� �%�� �� � �,�� ��%�� �%��,�� � �1���� $������� ��4%������ � �����1�� �� �%��� .-�$�� �/0���� �,� �%�����+� ������ ��4%������ � �,� ������1�� ��������� � $� �� )������ 2�� ����������%��%������%�0 '���� ��4%������ �� � $ �, ������� 2�� � ���$�� � ��� ���+� %���$��% %��� ����8� $� ��� �� $� ������������ � �,� �-&� ���� �0J� ����%���� �,�� �,� �������� $� �� )������ 2��,���� +�� %� � � �,� �-&� ���� � � � �������������� �-&� ��4%���� �������� �� � �� 2�� �������� � �,� ���������� ������ .�&��/ �� $�������>#9#;?0 �� ����� � �,� ���� �,�� ��4%������ �� �,�� �� ������� ���, � � � �%���� ������������ � ���� � � ����� ���� ������ � � � %���� �������� .����� ��%���� ��$ �� %� ��� �7�������/0

��� � �,� ��5 � ���������� � ���:��*������ �� ��� ,��, �����0 A������ �����%���� ���������� �� %�%���� ������� ����� #:F ���� � ��$������%�� ����� ��� ����� � ���� ��� � ����$� ����>#F:#�?0 -,� ��������� ���, � ��� � �1�� �,��%���� ��� � �� � �������� ����� �� 2��,�� 8 ,��� � ��� 2 ������� ��� �������� ���������0 �������� � $���%�� �,�� ���, � �� �%��%�� ������������ ���%��� ��� � � �������� $� �,� ���$����� ��� 2�, � �,� �����0 3 ���%�����$�� � ������� %� �������� ��� $� ��������0 � 2���� �,������ ��, � �� � � ��������� �����%���� ��%� �%�������$������� 2,��, �%�� ����� $� ����$���,�� $��%��%���$���� ������0 �� �,� �,�� ,��� �,�� ���,���4%� �� �����$�� ������ ����� �� ��� ��4%���� ��� $���� � ���%��� $� � �� �!����0�� � ���%�� � 2� ,��� ����� ��� � ���:��*�

����� � � �,� ������� � ��� �,� ������1���� � ����, ����� �%��� 2,��, �� ����� ��������� �����$����� ���� � ���� ��0 -,�� ���� ��, � %�� � ���������� $� ������� � �,� ������1���� � � �%��%����%��� � %��� � � �,� ������� � � ���, ��������� ������� �� $ �� H%��� � �������� ����%��0'��, %�, �%��,�� ��%���� � ������ �� %�� ��������� ��� ��������� � � �,� �������� ����%��� � � �,� ���, � %� ���%��� �%����� �,�� �,�������$�� ���:��*� ����� � %�� $� %���%� � ������ ��� ��������� ����� ��� � �%���� ������� ����� ��� ���� �� �,� ���� � ���%� � ��� ������ ��������0

�$��6�&�#��(

-,�� 2 �! 2�� �%�� ���� $� ����� 3 ;F86�#I�66� �� � �,� �������� �+��, N����� '����� � �,� ������� � �����, � �,� �+��, ���%$���0

� ��(

�0 ��!�&��%� � B����� J�0 &��%��� ������ �� �,�������� � �� � � � � ���� �%���� ������� �� �� �,�"����� &����� ��86:�60 3��� ��� 3 � � ���� �������� �� &%���������� &�����0 � &�'�� ��� ���#< �;F=��)F:9�0

�0 ����!�� &E B����� J�0 A������ � �� � � � � �����%���� ������� ��0 $��� ���� %� � ��� ���;< �= )��:9��0

#0 3%��� &���� � 3 %�� '� �� ��� ���! ���� ����� �����$%��$�� � ������� ��� ������ 2��, �%����������� �� �� ��%�� ����� �������� 2��, ������0 $���&�'��� ��� ���F< �)= 9F9:�0

)0 N ����, B ���� A� �� �� ��� ������������%��� ��� �������� � ���! ���� �� � � ��������

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

��66 $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#

�������� ������� � ����� ���� 2 ������������� �0 �&�'��� ��� ����< �;)= F#�:)60

90 J��� ' *��������� J ��� %��! B' 2��� �'0A������ � �� � '��������%� ������� �� �� � ������ , �� � �������� %����� ��� $ �� ���� 2 �������������� �0 � &�'��� ��� ���F< �F9= �)9�:;;0

;0 '������� AB ��� N� ������� N0 A��������%���� ���, ����0 0�� � $��� ���� %� � &�'��� �����8�< 8= #�#:#60

F0 �,�������, % A E������ � * - ������ B �� ��� ������ �,�� � ���%��%�� ���, �� � � ����� ��� ��������� ������� ������� �� �� ��� ������ $ ������ 2 ��� � ��� ���� ���������� ����������0�-� ��� ����< )�= �#�:)F0

80 ���,���� � � E !!� �0 3�2 ������������ ���,� ����� ��� � �������� �%���� ������� ��0 (����� ����< #�= #�F:#90

�0 �%5��� & *��!�� ' * �� -B ����� A ���� � �B0 ��� ������� � ����� ��+��� ���%� ����� � ������������������� �3' �� � $������ �)����� �� $� �0 �$��� ���� %� � ���9< ##= �;�:F0

�60 � ���� '� ���� � �� &,��,��� N B��!��� ���0 ������� � � $������ ��%����� ��� �,�� ������ ��$� � $� ���0 � $��� ���� %� � ���)< #�= ��8:#�0

��0 ���� B E ��RCD! ' K ��CD�S�! B AS CD,�� ��D B E%$�D��!K0 A������� � � �������� �,��� ������ � � � �������� � � ���� ��� ��� ������� ��= � �������� � $��%� ���0 �-� ��� ���8< )�= )F�:90

��0 ���,��� JB K��2��5 �A ��� ��� �%�! � �� ���N������ ��������������� ��� � � ������� � �(�)��*����� �������0 � $��� ���� %� � ���)< #�= �F�6:F0

�#0 ��,�D��! B � ���D�, � ������ ����CD! B0 ������������ � � �������� ��� ��� ������� � %���� � ��������� �,��� ������ � �� �,������ 2��, ������0:����� ;�� � �666< �#= �8F:�60

�)0 K�� %��! B' ���� � � &�,���!,��� �J 2��� �'0 ����%���� ��� ����� � � ������� � ��%���� ������� � �� ,%��� $� � ���������0 � $������� %� � ���8< #;= ��;�:F90

�90 A������L��+ � ��� �, � "�%$%�% � O%�� � '0������������ � � ������ $� ��*� �������� � �,�908& ��3' ���� ��� �,� �2 ��$ � ��� ����������������$�� �������0 &�� � .-�� !������ � ����< �=#��:#F0

�;0 �,�� M� A����� B� E����� �� ��� ������������ � � ��������� ��� ����� ������ %���� ����$����������� � � �3' ��4%���� � ��� ��,���� �� �,��������� ��������$�� ������ � ���� � � �,� ��3'�����0 � $��� ���� %� � �666< #8= �#6�:�60

�F0 B���� &' � ����� � � $���� �30 "�� � �� ��3'�������� ��������$�� ������ ���� � � �������%��,�,�� ����������� �� ���� ������� ������� � �,������� L�� ����,�� ����� ��� - �%���� ��0 &�� �.-�� !������ � ���;< );= �8�:�)0

�80 E%���� M '�� -0 &������������ � �� ����� �� ��� ��,��� �������� � ������������� ��$ � ���� �3' �������� ��������$�� ������� � ���������

����� ������� � '��������%� ����� � �����0 ())�0���� � ���� %� � ���;< ;�= ��)F:9�0

��0 * �� -B %��� L��� ����������� � A��� � ����� A0 &�4%���� �������� � �,� �������� ���������$�� ������ � .�-&�/ �� � ����� ������� 2��,���,� ���%� �������0 $��� ���� %� � ���8< #;= ;#:�0

�60 * �� -B E%�!������ �B ����� A0 3%��� ���� ���4%���� �������� � �,� 908& ��3' ��� ��5����� �-&����� � � $������ ��%����� ��� ������� �������0 <�������#< �= ����:�6;0

��0 ��� �,�� � K����� � �� ��� B N�%���� � �������� �0 �,�� ������� �������� � �,� .������+ ,-��� ���������� �� %� $���� � � ��� ��,���� ���3' ������ ��4%�����0 &�� � .-�� !������ � ���8< )8=��9:#6#0

��0 -%����� �M &���,� &A � $�� �B E��� 2�!� B'E�$��� ' 0 ����� ������������ � � �%��� $� %�����,� �-&� ������� ���� � ��� �� �%� ����� ��% �������� ��������� ������ �, ����� ������0 � $������� %� � ����< #F= �8);:9�0

�#0 K������ � ��� � B� *� ����� �0 &�4%������ �� �� � �� ����� � ���%��� ��7 � ��0 $�� � ���� %� �����< )9= �)�:980

�)0 K������!� ' E��$ %��� A &!��� ��� N &����� ��� %�����L� %�� ' *���!�� 3B0 ������������ � � ��������� ����������� �%���� ������ $� � ��������� �,��� ������ � � �� 2�� $� ��������� ���+��� ��������0 �0�. &,,�� � ��� ���� %� �����< �#= #6#:��0

�90 J,��� -B %��� -� *�� & �� ��� '���������� � ��������� ��4%������ � �%���� ��$ � ��� �3' ������ � �,�� ��������0 ��= ����� ' N������ ��&����!� BB J,��� -B ���0 /$� /� � � ��0 &�� ���� ��= '������� ����� ���6< #�9:��0

�;0 &��$��� �� *�����! BJ���0 � ��&0 � ����������3' ��������� � � %�� �� �������� ��������� ��4%���������� ���0 ��= *�����! BJ ��0 2�� /$�2�����3��= >����������� /$�0 3���� ' "&'= A�� ��%$���,��� ���F< ;F:860

�F0 '����,%� &� N��, J ����� J ���� AJ *������B0 ���� � ��� ��������� �����, � �0 � � � !� ����6< ��9= )6#:�60

�80 &�,���� & ���� � 0 N������� � $������ ��%�����0���� %� � ��� ���6< 9)= ��;:)�0

��0 3 ���� ' ������ � ����� �� ��� %� ���� ����� ,���� � ��� ������������= �� �������� �%����������� �0 ���,�� � *��� �666< 89= �6;8:F�0

#60 ����� * ����� � - �� ' �� ��� %� ���� ��� ���������� 2��, ,����� � ����� ������������= � ���� ��������� �������� ��%�� � #F �����0 N� A '������� � �� ���� .N�%�� ������� ������� A���� � ���,� ������ ����('�%�� /0 !� � ���,�� � ���F<��= ##�:;0

#�0 %�� %7 �%� �� � ��� B �� ��� &��%� ��� �� �%���$�� �,�� 2, �� $� � � � ����� ��� ��������� ����������� $� ������ ���0 � $��� ���� %� �����< #F= ��9:#60

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

&����� �� �� �%���� ���, ���� ��6�

#�0 J����� 3N ��+�� E�0 $������ $�-)� � ���� ���;���� <����� ' ������� &,) ������0 ��= %���� �� ����� ���0 ;�, ���0 J��,���� � ��= '������� & ������ � ��� $� � �� ���9< F�#:#F0

##0 A�2���� BA ������ &N0 �%����� ���������� � ��������� �������� �����������= ���,���� � �������� �� �� � ���%�� ����� ��������0 $��� &�'��� �������< �= &�6;:�#0

#)0 N��������� * J,��� -B0 &����� ��������� � ���,� ��0 ��= ����,��� �� &���, -� -�� ��� �� J,���-B ���0 ���*� ���� � ������� ���� %� � *-0 J��,����� � ��= '������� & ����� � � ��� $� � �� ���#<;F:860

#90 '�� � '� ������+� %���� 'B � ����%�+�K����� �0������������� ��������� � �,� �#& ��3' ���� ��� �,�

������ ���� � � 2������� �� 0���������� � ��0 �!������ � ����< �8�= �F6#:�0

#;0 �,%� B �%4 ' � �2��� ��0 '������� � �;&��#&��3' ���������� ������ ���� �� � ?�%�� �� �������� ?�%�� ,�,����0 ())� 0���� � ���� %� � ����< ;9=��6�:80

#F0 ��� N %������� �%�%�� J �� ��� �%����������� �� �� ������ ��������= �� ��������� ����%� ��� �%����0 0�� � $��� ���� %� � &�'��� �������< ��= ��:�6�0

#80 ��++ �'0 ��������� � ����� �� �������� 2��,������ ��� �������������%��� ��%�� �����0 @ 0�*� ���� ���#< #�8= �#�#:#�0

#�0 ��++ �' � ����! �N0 /�����)��� ��� /������� '/�������� ;�� � *-0 *������ �������� ���F< �6#:�80

� �66# � �����,� $� �,� A%� ���� & ����� � �������� ��� $� � �� ��� ������� %� �������� $�& + ����:��6�

��6� $������� ���� %� � *- ��� &�'���� � K �%�� � 3%�$�� �� �����$�� �66#