116 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

PŮVODNÍ PRÁCE

Hodnocení biotypizace lékařsky významných kandid

P. HAMAL1, D. KOUKALOVÁ1

1Ústav mikrobiologie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

SOUHRNHamal P., Koukalová D.: Hodnocení biotypizace lékařsky významných kandidCíl: Byla ověřována rozlišovací schopnost biotypizačního systému podle Oddse pro vnitrodruhovou diferenciaci kvasinek na základěfenotypových znaků. Dále byly porovnány biotypy izolátů z různých anatomických lokalit, v definovaných věkových skupinách a z hle-diska pohlaví pacientů.Materiál a metody: Celkem bylo hodnoceno 343 klinických izolátů šesti nejčastějších druhů kandid. U každého z nich byla testovánaschopnost asimilace sorbosy, citrátu a močoviny, tolerance pH (1,4 a 1,55) a vyšší koncentrace NaCl, rezistence k jodistanu sodnémua kyselině borité a růst na McConkey agaru.Výsledky: V souboru kmenů Candida albicans (n = 230) bylo rozlišeno 41 biotypů, C. glabrata (n = 27) devět, C. parapsilosis (n = 25)13, C. krusei (n = 25) 12 a C. lusitaniae (n = 18) pět biotypů. V případě C. tropicalis bylo všech 18 kultur typově identických. V soula-du s dříve publikovanými pracemi byla potvrzena vysoká rozlišovací schopnost metody, Simpsonův index diversity dosahoval pro C. al-bicans hodnoty 0,92. Naopak reprodukovatelnost výsledků, ověřovaná opakovanou typizací 12 náhodně vybraných izolátů C. albicans,byla poměrně nízká: naprosté shody bylo dosaženo jen u dvou z nich, dalších pět se lišilo v jednom, zbylé ve více testech. Při analý-zách výskytu biotypů v různých anatomických lokalitách, věkových skupinách a v závislosti na pohlaví pacientů nebyly zjištěny statis-ticky signifikantní rozdíly. Uvedená zjištění potvrzují, že nejčastější zdroj infekce bývá endogenní. Při porovnání s výsledky jiných au-torů byly zjištěny výrazné rozdíly v profilech dominujících biotypů, což mohlo být důsledkem rozdílů ve složení testovacích médií,odlišné interpretace výsledků, ale také geografické specifity izolátů.Závěr: Celkově je možno konstatovat, že největšími přednostmi biotypizační metody podle Oddse z hlediska využitelnosti v epidemi-ologických studiích je vysoká rozlišovací schopnost a ekonomická dostupnost, mezi nedostatky naopak patří problematická reprodu-kovatelnost výsledků, poměrně dlouhá doba potřebná pro jejich získání a relativní technická náročnost daná přípravou většího počturůzných testovacích médií.

Klíčová slova: kvasinky, Candida, typizace, epidemiologie

SUMMARYHamal P., Koukalová D.: Evaluation of biotyping of medically important Candida spp.Background: The biotyping system according to Odds and Abbott belongs to the most frequently used phenotypic methods. The aimof the study was to evaluate its discriminatory power in our laboratory. In addition, biotypes of isolates obtained from various bodylocations, present in defined age groups of patients and in males and females were also compared.Material and methods: A total of 343 clinical isolates were typed belonging to six most frequent Candida spp. Nine types of tests forbiotyping were prepared: sorbose, citrate and urea assimilation, tolerance to pH 1.4, pH 1.55 and higher concentration of NaCl, resi-stance to sodium periodate and boric acid and the ability to grow on MacConkey agar.Results: Forty-one biotypes were found among 230 C. albicans isolates, nine among 21 C. glabrata, 13 among 25 C. parapsilosis, 12among 25 C. krusei and five biotypes among 18 C. lusitaniae isolates. Contrary to other species, all of 18 C. tropicalis isolates belon-ged to the same biotype. In accordance with previously published reports, high discriminatory power of the method was found withSimpson’s diversity index for C. albicans reaching 0.92. On the other hand, reproducibility was relatively low; from 12 randomly cho-sen C. albicans isolates tested repeatedly, only two showed identical results, five differed in one test and the others in several tests.Analysis of the occurrence of individual biotypes related to different anatomical locations, age groups and sexes of patients revealedneither statistically significant variations in distribution nor predilection of any single biotype. These findings suggest that the sourceof infection was endogenous in most cases. In comparison with results of similar studies, marked discrepancies in profiles of predo-minant biotypes were found, probably due to slight differences in composition of the test media or distinctive evaluation of results; ho-wever, it may reflect also geographical specificity of isolates.Conclusion: It can be concluded that the main advantages of the Odds biotyping system are high discriminatory power and cost-ef-fectiveness. On the other hand, discrepancies in reproducibility of results as well as relatively long period for preparation of test me-dia and for achieving of results decline its usefulness for epidemiological studies.

Keywords: Yeasts, Candida, typing, epidemiology

Klin mikrobiol inf lék 2009;15(4):116–124

Adresa: Doc. MUDr. Petr Hamal, PhD., Ústav mikrobiologie LF UP a FNOL, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, e-mail: petr.hamal@fnol.cz

Došlo do redakce: 13. 3. 2009Přijato k tisku: 13. 6. 2009

ÚvodKvasinkovité mikroorganizmy rodu Candida vyvolávají

79–85 % všech nozokomiálních mykóz a na mnoha odděle-

ních zejména amerických nemocnic představují již v dnešnídobě hlavní epidemiologický problém [1]. Nejzávažnějšímdůsledkem exogenního šíření v nemocničním prostředí je

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 117

PŮVODNÍ PRÁCE

vznik miniepidemií (outbreaks). Pro potřeby analýz a ná-sledných protiepidemických opatření je důležité rozhod-nout, zda se v takových případech jedná o skutečnou epide-mii nebo o náhodnou koincidenci několika případůendogenních infekcí. Vedle druhové identifikace zachyce-ných izolátů je proto nezbytné provést i jejich vnitrodruho-vou typizaci.

Rozvoj typizačních metod se datuje od konce sedmdesá-tých let. V současné době se využívají při vyhledávání zdro-jů a zkoumání způsobu šíření infekce včetně příčin jejich re-cidiv, studiu mikroevoluce infekčních populací, faktorůvirulence kandid a patogenetických mechanizmů infekcenebo při analýze mechanizmů vývoje rezistence k antimy-kotikům. Postupně byla připravena celá řada různých tech-nik, které jsou obvykle členěny na dvě velké skupiny, feno-typové a molekulární. Jako biotypizace se označujífenotypové postupy, zjišťující schopnost utilizace zdrojůuhlíku a dusíku a/nebo detekující extracelulární enzymy,případně určité chemické struktury v buňce. Nejznámějšíz této skupiny je typizační systém podle Oddse [2,3]. V pod-statě se jedná o kombinaci asimilačních reakcí a rezistotypi-zace, tedy testování odolnosti kmenů ke známým koncent-racím různých chemických činidel a barviv. Poslednězmíněný typizační přístup byl již dříve vyzkoušen i v našílaboratoři [4]. Přestože jsou v současné době izoláty mno-hem častěji typizovány genetickými metodami, představujíněkteré dříve často používané fenotypové techniky stále je-jich alternativu pro laboratoře, kterým chybí finanční zdro-je nebo průprava k provádění sofistikovanějších a náklad-nějších molekulárních technik [5,6].

Cílem této práce bylo ověřit použitelnost Oddsova bioty-pizačního postupu při studiu epidemiologie kandidových infekcí se zaměřením na rozlišovací schopnost metodya diskutovat některé technické aspekty mající vliv na spo-lehlivost výsledků. Dále zjistit na poměrně rozsáhlém sou-boru klinických izolátů, zda existuje predilekční výskyt určitých biotypů v anatomických lokalitách, věkových sku-pinách nebo v závislosti na pohlaví pacientů.

Materiál a metodikaBiotypizováno bylo celkem 343 izolátů kvasinek z růz-

ných klinických vzorků. Z nich C. albicans (n = 230) bylazískána od 206 pacientů, C. glabrata (n = 27) od 21, C. pa-rapsilosis (n = 25) rovněž od 21 nemocných; dalších 25 kul-tur C. krusei pocházelo od 17 pacientů, C. lusitaniae (n = 18)od 18 a zbylých 18 izolátů C. tropicalis bylo zachyceno od17 hospitalizovaných osob.

Pro vnitrodruhovou typizaci bylo připraveno, přesně pod-le Oddsových metodik [2,3], devět testovacích půd. Za úče-lem stanovení kódového profilu byly rozděleny do trojic:(1) průkaz asimilace sorbosy, citrátu a močoviny, (2)  tole-rance pH 1,4, pH 1,55 a vyšší koncentrace NaCl a (3) rezi-stence k jodistanu sodnému, kyselině borité a schopnost rů-stu na McConkey agaru (Himedia Laboratories, Mumbai,India).

Inokulace kvasinek na jednotlivé půdy byla provedenatechnikou podle Mencla a Otčenáška [7]. Jejich 72hodinovékultury, vyrostlé na Sabouraudově agaru (Himedia Labo -ratories) s thiaminem (0,1 mg/ml) a chloramfenikolem(50 μg/ml), byly suspendovány ve sterilním fyziologickémroztoku. Velikost inokula byla upravena na 4–6,5 × 106 bu-něk ml–1 počítáním v Bürkerově komůrce. Suspenze pak by-ly pipetovány do jamek speciální mikrodestičky (obr.  1a)a následně pomocí jehlového inokulátoru vlastní výroby,který obsahoval 30 injekčních jehel č. 14 s ubroušeným hro-tem (obr. 1b), přeneseny na příslušné diagnostické médium.Velikost jednotlivých inokul tak odpovídala 15–20 μl.Otiskem inokulátoru na povrch testovacích půd vznikl ade-kvátní počet naočkovaných bodů, přičemž šest bodů v jednéřadě představovalo inokula z jedné základní suspenze.

Naočkované půdy byly inkubovány při 37 °C a hodnoce-ny, jak je uvedeno v tabulce 1 a na obr. 2. Za pozitivní vý-sledek testu byl považován růst izolátu nejméně ve třech in-okulačních otiscích. Biotyp byl stanoven pomocí O-profilu[8], kdy každé trojici testů byly v případě pozitivity přidě-leny hodnoty 1, 2 a 4, resp. 0 při negativním výsledku.

Pro objektivní hodnocení spektra a poměrného zastoupe-ní jednotlivých biotypů ve studovaných souborech kandid

Tabulka 1Způsob hodnocení biotypizačních testů

Název testu Inkubace (dny) Nejslabší růst hodnocený ještě jako pozitivní

Asimilace močoviny 3–4 v celém rozsahu inokula velký počet drobných mikrokolonií s tendencí splývat

Asimilace sorbosy 6–7 jakákoli stopa růstu

Asimilace citrátu 3–4 v celém rozsahu inokula souvislý splývavý růst

Tolerance pH 1,40 6–7 jakákoli stopa růstu

Tolerance pH 1,55 3–4 jakákoli stopa růstu

Tolerance NaCl 3–4 v celém rozsahu inokula souvislý splývavý růst

Rezistence k NaIO4 3–4 po obvodu inokula výrazný souvislý lem

Rezistence k H3BO3 3–4 v celém rozsahu inokula velký počet drobných mikrokolonií s tendencí splývat

Růst na McConkey agaru 7–8 v celém rozsahu inokula velký počet drobných mikrokolonií s tendencí splývat

118 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

PŮVODNÍ PRÁCE

byl tentýž biotyp, zachycený opakovaně od stejného pacien-ta, považován za identický kmen a byl do výsledků započí-tán pouze jedenkrát. Naopak v případě, kdy byly v rámcitestování reprodukovatelnosti získány dva odlišné biotypy,byly do výsledků zahrnuty oba. Celkový počet studovanýchizolátů a jednotlivých biotypů se proto liší.

Reprodukovatelnost výsledků byla ověřována na 12 vy-braných izolátech Candida albicans, které byly hodnocenypři dvou různých příležitostech, aniž by odečítající předemznal jejich pozici v testovaných souborech. Rozlišovacíschopnost metody pro soubory C. albicans byla matematic-ky stanovena pomocí Simpsonova indexu diversity (D) [9]:

1 s

D = 1 – ————— ∑ xj(xj – 1)N(N – 1) j = 1

s = počet biotypů, xj = počet kmenů souboru spadajících doj-tého biotypu, N = velikost souboru. Hodnota D se pohy-buje v intervalu 0 (žádné rozlišení) – 1 (maximální rozliše-ní).

Dále byla u nejčastějších biotypů C. albicans hodnocena,pomocí frekvence záchytu, jejich případná závislost na některých anatomických lokalitách, věku či pohlaví. Statis -tická významnost byla vyjádřena pomocí χ2 testu. U něko-lika nemocných byla rovněž zjišťována přítomnost identic-kého, resp. konkurenčního biotypu kandid. Přitom bylyhodnoceny izoláty získané opakovaně z téže lokality neboz většího počtu různých míst, odkud bylo provedeno po jed-nom odběru.

VýsledkyČetnost biotypů, reprodukovatelnost a rozlišovací schop-

nost metody. Kultury C. albicans (n = 230) byly rozdělenycelkem do 41 biotypů. Nejčastějším byl 573, identifikovanýu 32 izolátů, následovaly 773 a 577 (n = 30), 777 (n = 24),567 (n = 20), dále 771 (n = 12), 563 (n = 9), 571 (n = 7), 767a 561 (n = 6), 763 a 575 (n = 4). Jejich poměrné zastoupeníje graficky vyjádřeno na obr.  3. Zastoupení nejčastějšíchbio typů non-albicans kandid je v absolutních číslech i pro-centech sumarizováno v tabulce 2. Izoláty C. glabrata(n = 27) byly rozděleny do celkem devíti biotypů, C. para -psilosis (n = 25) do 13, C. krusei (n = 25) do 12 a C. lusita-niae (n = 18) do pěti. V případě C. tropicalis (n = 17) bylzjištěn pouze jediný biotyp.

Rozlišovací schopnost metody, vyjádřená pomocí D, čini-la pro typizovaný soubor C. albicans 0,92.

Reprodukovatelnost byla testována na souboru 12 náhod-ně vybraných izolátů C. albicans. Opakovaným testovánímbylo dosaženo identického výsledku jen u dvou z nich(16,7 %), dalších pět (41,6 %) se lišilo v jednom testu. Dvaze zbývajících pěti izolátů (16,7 %) měly rozdílné výsledkydvou testů, další dva (16,7 %) tří a pátý (8,3 %) se odlišovalve čtyřech znacích. V posledním případě však nebylo mož-no kulturu řádně suspendovat, a proto ani odpovídajícímzpůsobem naředit inokulum.

Vztah biotypů k věku, pohlaví, anatomickým lokalitám.Výskyt nejčastějších biotypů C. albicans v moči, na sliznicipochvy a orofaryngu je přehledně uveden v tabulce  3.Poševní izoláty (n = 94) byly rozděleny do 33 biotypů s nej-početnějším zastoupením typů 577 a 773, kvasinky z orofa-ryngu (n = 62) do 18 biotypů s nejčastějším nálezem typu577. Mezi osmi biotypy, do kterých bylo rozděleno 25 izo-látů z moči, byly nejčastěji zachyceny typy 773 a 573. Nebylzaznamenán statisticky signifikantní rozdíl v kolonizacizkoumaných lokalit.

Tabulka 2Přehled nejpočetnějších biotypů non-albicans kandid

Druh kandidy Biotyp Počet kmenů(n = počet izolátů) absol. v %

243 6 25,0

C. glabrata 343 5 20,8

(n = 27) 643 3 12,5

443 3 12,5

245 4 18,3

C. parapsilosis 244 4 18,3

(n = 25) 745 3 13,7

743 2 9,1

765 4 20,0

C. krusei 767 3 15,0

(n = 25) 567 3 15,0

745 2 10,0

C. lusitaniae 767 11 61,1

(n = 18) 763 4 22,1

C. tropicalis(n = 17) 743 17 100,0

Tabulka 3Přehled nejpočetnějších biotypů Candida albicans

ve vybraných anatomických lokalitách

Lokalita Biotyp Počet kmenů(n = počet izolátů) absol. v %

577 13 13,8

pochva 773 12 12,8

(n = 94) 573 11 11,7

777 10 10,6

577 12 19,3

orofarynx 573 8 12,9

(n = 62) 567 7 11,3

773 6 9,7

773 6 24,0

moč 573 5 20,0

(n = 25) 567 4 16,0

563 4 16,0

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 119

PŮVODNÍ PRÁCE

Distribuce nejčastějších biotypův rámci definovaných věkových skupinje demonstrována v tabulce 4. U ma-lých dětí (0–5 let) bylo nalezeno 14 bi-otypů s četnějším zastoupením typů573 a 773, po 27 biotypech bylo zjiště-no ve věkových skupinách 10–35a 36–60 let, přičemž v první z nich pře-važoval typ 577 a ve druhé 573. Ve vyš-ším věku (61 a více let) bylo rozlišeno13 biotypů s převahou typů 773 a 573.Z výsledků vyplývá, že rovněž vztahbiotypů k věkovým skupinám nebylstatisticky významný.

Mezi 164 izoláty od mužů bylo rozli-šeno 39 biotypů, od žen bylo 67 zachy-cených kultur rozděleno do 18 biotypů.Nejčastěji se vyskytující biotypyu obou pohlaví jsou uvedeny v tabulce5. Z ní je patrné, že vesměs převažova-ly bio typy 573, 577 a 773. Statistickysignifikantní rozdíl v záchytu biotypůu obou pohlaví nebyl zaznamenán.

V tabulce 6 je uvedena frekvence vý-skytu identického, resp. rozdílného bi-otypu kandid ve vybraných anatomic-kých lokalitách několika pacientů. V 16případech byl prokázán identický, ve23 konkurenční biotyp. Izoláty rozdíl-ného biotypu však byly v 11 případechvelmi blízce příbuzné, lišily se od sebejen v jediném testu.

DiskuzeOddsova biotypizační sestava je vý-

sledkem výběru z velkého počtu posu-zovaných asimilačních a inhibičníchvlastností kvasinek. Původní obsahova-la devět testů v pořadí: tolerance pH1,4, produkce proteinasy, rezistencek flucytosinu, asimilace urey a sorbosy,tolerance vyšší koncentrace NaCl, asi-milace citrátu a glycinu a rezistencek safra ninu [2]. V pozdější modifikacibyla utilizace glycinu nahrazena hod-nocením schopnosti růstu v přítomnos-ti kyseliny borité [3]. Testy byly účelo-vě rozděleny do tříčlenných skupin,počínaje těmi s údajně nejvyšší rozlišo-vací schopností a reprodukovatelnostípo nejméně spolehlivé. Z tohoto důvo-du také autoři navrhli testy první skupi-ny jako orientační typizační sestavu proběžné diagnostické laboratoře [2].

Naproti tomu pořadí testů v naší se-stavě vycházelo z jejich fyziologickécharakteristiky, tj. v první skupině šloo asimilaci zdrojů dusíku a uhlíku, vezbývajících dvou o testy tolerance,resp. rezistence. Navíc bylo nutné

(a) 1 2 3 4 5 (b) 1 2 3 4 5 (c) 1 2 3 4 5

(d) 1 2 3 4 5 (e) 1 2 3 4 5 (f) 1 2 3 4 5

(g) 1 2 3 4 5 (h) 1 2 3 4 5 (ch) 1 2 3 4 5

Obr. 2Demonstrace výsledků jednotlivých testů biotypizační metody podle OddseNa povrch každého testovacího média bylo naočkováno horizontálně zleva

doprava 5 izolátů, vždy v podobě 6 pod sebou umístěných inokulačních bodů.Hodnocení: asimilace (a) močoviny – pozitivní výsledek byl zaznamenán

na pozicích čísel 1, 2, 3 a 5, (b) sorbosy – pozitivní 3, (c) citrátu – pozitivní 1, 3, 4 a 5; tolerance, (d) pH 1,4 – pozitivní 1, 2 a 5,

(e) pH 1,55 – pozitivní 1, 3, 4 a 5, (f) NaCl – pozitivní 1, 2 a 4; rezistence k (g) NaIO4 – pozitivní 1, 3, 4 a 5, (h) H3BO3 – pozitivní 2, 3, 4 a 5;

(ch) schopnost růstu na McConkey agaru – pozitivní 1, 3, 4 a 5.

Obr. 1Potřeby pro inokulaci kmenů při biotypizační metodě podle Oddse

(a) mikrodestička a (b) multibodový manuální inokulátor

a b

PŮVODNÍ PRÁCE

120 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

v Oddsově schématu učinit určité změny. Testy na produkciproteinasy a rezistenci k flucytosinu a safraninu byly nahra-zeny hodnocením tolerance pH 1,55, determinující druhC. albicans, dále rezistence k jodistanu sodnému a schop-nosti růstu na McConkey agaru, které byly do Oddsovy se-stavy zařazeny jako doplňkové testy [3]. Produkce proteina-sy metodikou podle Oddse [2] byla prokazována u 258kmenů našeho souboru, avšak pokaždé s negativním vý-sledkem. Vzhledem k tomu, že uvedené zjištění zásadně od-porovalo literárním údajům a mohlo být důsledkem neodha-lené laboratorní chyby, byl tento test posléze ze sestavyvyřazen. V případě flucytosinu nebyla při zahájení biotypi-zace k dispozici příslušná substance a později nebylo vhod-né zvolenou sestavu měnit. Někteří autoři navíc zjistili níz-ký rozlišovací potenciál testu a navrhli ho proto nahraditjiným [10]. Důvodem vyřazení rezistence k safraninu byla

skutečnost, že má údajně velmi malou reprodukovatelnost[11]. Naopak o zařazení testu rezistence k jodistanu sodné-mu rozhodla jeho publikovaná dobrá schopnost vnitrodru-hové diferenciace pro většinu druhů kandid zařazených donašeho souboru, v případě sledování schopnosti růstu naMcConkey agaru to byla zase jednoduchost provedení [3].

Zmíněné rozdíly v biotypizačních sestavách jsou příčinoujen omezené srovnatelnosti se soubory autorů metodiky[2,3,12,13]. Při hodnocení celkového počtu a procentuálníhozastoupení biotypů se naše soubory od uvedených význam-ně nelišily. Dalším porovnávacím kritériem bylo hodnocenípoměru pozitivních a negativních výsledků jednotlivýchtestů, především u izolátů C. albicans, kde bylo k dispozicinejvíce údajů. Rozlišovací schopnost naší sestavy je demon-strována na obr. 4. Porovnáním s výsledky Oddse byl u našich kmenů zjištěn vyšší podíl pozitivních výsledků.

Statisticky signifikantní byly diferenceve výsledcích u asimilace močoviny,sorbosy, citrátu, tolerance pH 1,4,NaCl, rezistence k jodistanu sodnémua ke kyselině borité (p  <  0,001 vevšech testech). Zásadní rozdíl byl zjiš-těn při testování schopnosti růstuC. albicans na McConkey agaru – za-tímco v rámci našeho souboru byl vy-hodnocen jako test s nejlepším rozliše-ním (44,3  % pozitivních kmenů),Odds uvádí růst na tomto médiu pouzeu C. parapsilosis a vzácně C. glabrata[3]. Shodných výsledků tak bylo dosa-ženo pouze v testu tolerance pH 1,55.Naše výsledky pěti z celkového počtušesti testů naopak velmi dobře korelo-valy se souborem 153 kmenů C. albi-cans, které typizovali Neely et al. [14].Nebyl zaznamenán rozdíl vyšší než6  %, v průměru dokonce jen 2,8  %.Signifikantně větší počet izolátů naše-ho souboru toleroval jen zvýšenoukoncentraci NaCl (p < 0,001).U ostatních druhů kvasinek byly, připorovnávání našich výsledků biotypi-začních testů se soubory Oddse, zjiště-ny největší diference u C. krusei.Statisticky signifikantní rozdíly bylyzaznamenány v pěti testech – asimila-ci močoviny (p = 0,028), sorbosy (p =0,003), toleranci pH 1,55 (p  =  0,002),NaCl a ve schopnosti růstu naMcConkey agaru (p  <  0,001 v oboutestech). Izoláty C. glabrata se vý-znamně lišily v rezistenci k jodistanusodnému (p = 0,007) a kyselině borité,dále ve schopnosti asimilace citrátua tolerance NaCl (p < 0,001 ve všechtřech testech). U C. parapsilosis bylyprokázány signifikantní diferencev testech asimilace citrátu (p = 0,023),močoviny (p = 0,009) a rezistence kekyselině borité (p = 0,003). Významné

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

%

573

773

577

777

567

771

563

571

767

561

763

575

n =

32

n =

30

n =

30

n =

24

n =

20

n =

12

n =

9

n =

7

n =

6

n =

6

n =

4

n =

4

n =

46os

tatn

í(n

= 2

9)

biotypy

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

McC

BOR

JOD

SLT

1,55

1,40

CIT

SOR

URE

URE = asimilace ureySOR = asimilace sorbózyCIT = asimilace citrátu

test

% pozitivityJOD = rezistence k NaIO4BOR = rezistence k H3BO3McC = růst na McConkey agaru

1,40 = tolerance pH 1,41,55 = tolerance pH 1,55SLT = tolerance NaCl

Obr. 3Distribuce biotypů Candida albicans mezi sledovanou populací pacientů

Obr. 4Rozlišovací schopnost jednotlivých testů Oddsovy biotypizační metody

pro izoláty Candida albicans

PŮVODNÍ PRÁCE

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 121

rozdíly ve schopnosti růstu v přítomnosti uvedené kyseliny(p = 0,048), stejně jako v asimilaci močoviny (p = 0,028),byly detekovány také u C. tropicalis.

Rovněž jiní autoři zjistili při porovnávání souborů značnérozdíly. Například Korting a Dorsch, typizující C. albicanspřesně podle původního Oddsova schématu, zjistili sicerámcovou shodu v počtu a poměrném zastoupení biotypů,jejich charakteristika na základě hodnocení jednotlivýchtestů však byla naprosto odlišná [15]. Budak byla schopnav souboru 350 izolátů C. albicans rozlišit jen 9 biotypů, ze-jména z důvodu zjištěné 100% asimilace sorbosy a citrátu,tolerance NaCl, rezistence k safraninu, citlivosti ke kyseliněborité a 98% tolerance pH 1,4 [16]. Pospíšil zase uvádíu 75 % testovaného souboru C. glabrata toleranci pH 1,4,přičemž uvedený druh by neměl být schopen růstu ani připH 1,55 [3,17].

Samotný Odds uvádí, že výsledková variabilita vznikalaz neočekávaných a nepoznaných příčin také v jeho labora-toři přes zejména počáteční snahu je odhalit a podrobně po-psat [18]. Navíc osobní komunikace s kolegy majícími zku-šenosti s jeho metodikami ukázala, že se objevily další,zdánlivě triviální faktory, které mohou mít vliv na výsledkytestů. Přímá diskuse a demonstrace byly při jejich odstraňo-vání mnohem účinnější než formálně publikovaný popis.Odlišné výsledky biotypizace na různých pracovištích rov-něž potvrdila mezinárodní studie, v rámci které byla zjiště-na velmi dobrá reprodukovatelnost výsledků v jednotlivýchlaboratořích, ale mezilaboratorní shoda v charakteristice bi-otypů byla nedostatečná [19]. Autoři proto doporučili meto-du jen k výzkumným účelům.

Příčiny rozporných výsledků biotypizačních testů mohoubýt různé. Jako jeden z možných důvodů připadá v úvahuodlišné složení kultivačních médií, způsobené chemikálie-mi od různých výrobců nebo nepřesností při jejich dávko-vání. Navíc bylo zjištěno, že dlouhá doba sušení půd a sou-visející vypařování vody snižuje jejich hodnoty pH [3].Připravená testovací média by proto neměla být uchovávánadéle než 10 dnů. Výsledky jsou významně ovlivňovány takévelikostí inokula, které by se mělo pohybovat v rozmezí5 × 105 – 5 × 106 cfu/ml. K dosažení této koncentrace jsouv původní metodice použity 24–30hodinové subkultury.V naší práci bylo při přípravě inokula postupováno podlepublikace Mencla a Otčenáška, kteří doporučili 72hodinovéprimokultury a hustotu suspenze odpovídající 4–5  × 106

cfu/ml, tedy na horní hranici rozmezí udávaného Oddsem[2,7]. Analýzou výsledků ředění bylo dále zjištěno, že veli-kost inokula se u většiny našich izolátů pohybovala mezi5–6 × 106, což by mohlo být příčinou většího podílu pozi-tivních výsledků v jednotlivých testech při porovnání sesoubory Oddse [2,3]. Vysoký počet izolátů C.  albicansa C. glabrata asimilujících citrát a tolerujících pH 1,4, zjiš-těný Menclem, Otčenáškem a Pospíšilem, uvedené tvrzenípodporuje [7,17]. K usnadnění technicky poměrně náročné-ho způsobu přípravy inokula v původní metodice, navrhliChildress et al. dva alternativními postupy využívajícíKlettova kolorimetru, resp. McFarlandovy zákalové stupni-ce [11] a při porovnání výsledků s Oddsovými dosáhli vel-mi dobré korelace. V naší práci byl použit přesnější, alepracnější způsob, tj. počítání buněk v Bürkerově komůrce.

Při hodnocení výsledků biotypizace bylo problematické

exaktní stanovení hranice mezi pozitivními a negativnímivýsledky testů v případech, kdy byla definována kvantita-tivně, různou intenzitou růstu. V naší sestavě se jednaloo testy asimilace močoviny a citrátu, tolerance NaCl, rezi-stence ke kyselině borité a jodistanu sodnému a růst naMcConkey agaru. Tato skutečnost odpovídá zjištění Oddse,který na základě vlastních zkušeností upozorňuje, že zejmé-na asimilace močoviny a citrátu může být různými hodnoti-teli interpretována různě. Testy zařazené do modifikované

Tabulka 4 Přehled nejpočetnějších biotypů Candida albicans

v závislosti na věku

Věková skupina Biotyp Počet kmenů(n = počet izolátů) absol. v %

0–5 let 573 8 17,8

(n = 45) 773 7 15,6

771 5 11,1

577 16 17,8

10–35 let 777 12 13,3

(n = 90) 573 10 11,1

773 10 11,1

36–60 let 573 8 14,0

(n = 57) 773 5 8,8

567 5 8,8

773 7 20,0

≥ 61 let 573 6 17,1

(n = 35) 577 5 14,3

567 4 11,4

777 3 8,6

Tabulka 5Přehled nejpočetnějších biotypů Candida albicans

v závislosti na pohlaví

Pohlaví Biotyp Počet kmenů(n = počet izolátů) absol. v %

573 23 14,0

Ženy 577 22 13,4

(n = 67) 773 20 12,2

777 19 11,6

567 13 7,9

773 10 14,9

Muži 573 9 13,4

(n = 164) 577 8 11,9

567 7 10,4

771 6 9,0

PŮVODNÍ PRÁCE

122 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

verze jeho metody, z nichž jsme použili rezistenci ke kyse-lině borité, jodistanu sodnému a kultivaci na McConkeyagaru, nejsou z uvedeného hlediska definovány vůbec,a proto byla stanovena naše vlastní kritéria. U testu asimila-ce sorbosy, kde měla být jako pozitivní zaznamenána jaká-koli známka růstu, často nastala situace, že růst byl patrnýz různého počtu inokulačních bodů. Podle kritérií Menclaa Otčenáška byly izoláty vyrůstající z jednoho a dvou bodůhodnoceny jako negativní (i když de facto sorbosu asimilo-valy), ze třech a více bodů jako pozitivní [7].

Příčinou protikladného výsledku některého testu při opa-kované biotypizaci kmenů může být shoda prahové kon-centrace testované látky pro příslušný izolát s použitou kon-

centrací [2]. Testy jsou navíc založeny na detekci expresea funkce kompletních enzymatických systémů, které jsouz hlediska reprodukovatelnosti přirozeně méně spolehlivénež sledování jednotlivých makromolekul, jako je tomu na-příklad u sérotypizace nebo fagotypizace [19]. Jiným zdro-jem variability může být i „switching“ fenomén, který ne-musí postihovat pouze morfologické znaky, jeho vliv semůže projevit i změnou fyziologických charakteristik [20].

Oddsův biotypizační systém teoreticky umožňuje rozliše-ní kmenů do celkem 512 různých typů, počet skutečně zís-kaných však bývá podstatně nižší. Variabilita souborů vždyzávisí na řadě faktorů, jako je počet a charakter testovanýchkmenů, preciznost přípravy médií a inokula, způsob hodno-

Tabulka 6Výskyt identických a rozdílných biotypů kandid u téhož nemocného

Typ Původ izolátů Počet pacientů s nálezem biotypuodběru identického rozdílného

1 pochva 1 6

moč 3 3

hemokultura 3 2

sputum 1 2

nosohltan 1 1

ucho 0 1

stěr z rány 1 0

2 nosohltan – moč 3 0

nosohltan – sputum 0 2

nosohltan – stolice 0 2

nosohltan – kanyla 1 0

hemokultura – moč 1 0

hemokultura – kanyla 0 1

kůže – mateřské mléko 0 1

rty – ucho 0 1

stěr z pupku – kanyla – hemokultura – nosohltan – stolice 1 1

celkem 16 23

Typy odběrů: 1 = opakovaně z téže lokality, 2 = z různých lokalit

Tabulka 7Vzájemná příbuznost nejpočetnějších biotypů Candida albicans

Kód biotypu 777 773 577 573 567

777 1/9 1/9 2/9 2/9

773 1/9 2/9 1/9 3/9

577 1/9 2/9 1/9 1/9

573 2/9 1/9 1/9 2/9

567 2/9 3/9 1/9 2/9

Pozn.: čísla v tabulce udávají poměr počtu odlišných testů (znaků) k jejich celkovému počtu

PŮVODNÍ PRÁCE

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 123

cení výsledků apod. Uvádí se, že s vysokou mírou pravdě-podobnosti lze za fenotypově odlišné kmeny považovat izo-láty, které se liší ve více než dvou testech [14,19,21]. Za to-hoto předpokladu by se rozlišovací schopnost metodyv našem souboru C.  albicans podstatně snížila, neboť pětnejpočetnějších biotypů se, až na jedinou výjimku, vzájem-ně lišilo pouze v jednom nebo dvou testech, jak je patrnéz tabulky 7. S podobnými výsledky je však možné se setkatv mnoha publikovaných pracích [2,16,22].

Při opakovaném hodnocení testů u vybraných izolátůOddsova souboru se variabilita pohybovala průměrně mezi5–10 %. Důvodem dobré reprodukovatelnosti je zřejmě pra-videlné testování referenčních kmenů s hraniční pozitivitou,které napomáhají objektivnímu hodnocení v případech ne-příliš přesně definovaných kritérií. V naší práci nebyly pou-žity, neboť je Odds v té době již neměl k dispozici. Nutnostverifikace výsledků tímto způsobem uvádějí i jiní autoři[23]. Během naší typizace proto byly využity vlastní kme-ny, které byly považovány za „referenční“, neboť jejich vý-sledky v konkrétních testech byly hodnocené jako hraničněpozitivní. Další ověřování této vlastnosti však prováděno ne-bylo, nejprve z důvodu naší zamýšlené orientace na publi-kovanou novější verzi biotypizace [24], později kvůli zave-dení klasifikace pomocí přesnějších genetických metod.

Při analýzách výskytu jednotlivých biotypů v různýchanatomických lokalitách nebyla námi, stejně jako většinoujiných autorů, zjištěna jejich signifikantní predilekce, cožpotvrzuje charakter kandid jako oportunních patogenů a ob-vykle endogenní zdroj infekce [7,13]. Dále, ve shodě s naši-mi dřívějšími zjištěními i publikovanými studiemi, nebylynalezeny rozdíly v distribuci biotypů mezi zdravými a ne-mocnými jedinci [4,12]. Z tohoto důvodu nebyly do našehosouboru zařazeny izoláty od zdravých dobrovolníků.Rovněž v souladu s literárními údaji nebyla v naší studiiprokázána predilekce určitého biotypu k věku, pohlaví či di-agnóze pacientů [25]. Naproti tomu je v některých pracíchdokumentována závislost výskytu určitých biotypů na kon-krétních geografických lokalitách, což by mohlo být příči-nou rozdílů při vzájemném porovnávání výsledků biotypi-zace kandid různými autory [2,13,15,16]. Hunter uvádí, žekmeny získané z téže oblasti mívají velmi podobné biotypy,což vysvětluje schopností kvasinek adaptovat se svými fe-notypovými vlastnostmi na dané prostředí [9].

Naše studie dále hodnotila u jednotlivých pacientů stabi-litu biotypů v určitých anatomických lokalitách a záchytidentických, resp. konkurenčních biotypů z různých klinic-kých materiálů. V našem souboru celkově převažovaly kon-kurenční. Pokud však byly kultury získány následně v krát-kých časových intervalech, byl jejich profil velmi podobný(většinou se odlišovaly v jediném testu) a bylo by tedy mož-né považovat je ještě za identické. Rozdíly mezi izoláty za-chycenými po několika měsících byly větší, naznačovalyzměnu osídlení příslušné lokality jiným biotypem, případněvýraznou modifikaci fenotypu téhož kmene v reakci na mě-nící se podmínky prostředí. Většina takto charakterizova-ných kultur pocházela z pochvy a byla odebrána v souvis-losti s léčbou kandidovou vakcínou [26]. K podobnémuzjištění dospěl i Odds, který ve svém souboru sice demon-stroval převažující biotypovou stabilitu v různých anatomic-kých lokalitách, ale také prokázal, že v poševních výtěrech

pacientek vyšetřovaných po třech a více měsících se konku-renční biotyp vyskytoval u třetiny případů [12,21]. Taképodle O’Connora a Sobela byly identické kultury mnohemčastěji izolovány z časných případů rekurentní vaginálníkandidózy, než v souvislosti s vyšetřeními provedenými pošesti a více měsících [22]. Neely et al. vysvětlují přítomnostrůzných biotypů v opakovaně odebraných vzorcích superin-fekcí po eliminaci původního biotypu antimykotiky [14].Někteří autoři dokonce upozorňují na možný výskyt většíhopočtu konkurenčních biotypů v určitých lokalitách součas-ně [14,21]. Skořepová a Hauck proto doporučují u predispo-novaných pacientů typizovat současně až šest náhodně vy-braných kolonií [23].

I přes uvedené nedostatky představuje Oddsův biotypizač-ní systém přijatelnou experimentální alternativu přesnějšímgenetickým metodám v případech, kdy jsou z ekonomickýchdůvodů nebo z hlediska nedostatečného přístrojového vyba-vení pracoviště nedostupné. Metoda je málo nákladná, po-měrně jednoduchá na provedení, avšak inkubační doba ně-kterých testů je poměrně dlouhá. Podle našich zkušeností jepoužitelná pro většinu druhů kandid. Možnou výjimkou bymohla být C. tropicalis, neboť všech 18 námi testovanýchizolátů tohoto druhu náleželo do jednoho biotypu, alei v Oddsově souboru (n = 26) měly tři testy vždy stejný vý-sledek a ve zbylých šesti se lišilo pouze 1–6 izolátů [3].

Praktickou aplikací metody bylo získáno mnoho novýchpoznatků o patogenezi vaginální kandidózy [12,21,22,25,27]. Svůj význam prokázala také při analýze epidemie C. al-bicans na jednotce intenzivní péče v londýnské nemocnici,kde dokumentovala přenos infekce rukama ošetřujícího per-sonálu [28]. Dále byla využita při identifikaci zdroje nákazyv případě epidemie kandidové endoftalmitidy u narkomanů,kteří používali kontaminovaný citrónový džus k rozpouštěnítzv. uličního heroinu [29].

Pro použití systému jako součásti rutinní diagnostiky v la-boratořích klinické mykologie, příp. mikrobiologie by bylapotřebná jeho komerční dosažitelnost. Tím by byla v rámcivýroby odpovídajícím způsobem zajištěna kontrola kvalitya v laboratoři ušetřen čas spojený s přípravou a validací jed-notlivých testů [24].

ZávěrBiotypizace podle Oddse je metoda s velmi dobrou rozli-

šovací schopností, která je spolu s ekonomickou dostupnos-tí její největší výhodou, umožňující vnitrodruhovou diferen-ciaci i v laboratořích, které nemají možnost využít přesnějšígenetické techniky. Avšak testování reprodukovatelnosti,i když bylo provedeno pouze na malém souboru izolátůC.  albicans, diskrepantními výsledky u většiny hodnoce-ných kultur potvrdilo v literatuře uváděnou nestabilitu feno-typů. Praktickou využitelnost metody pro epidemiologickéstudie dále snižuje nutnost přípravy většího počtu různýchtypizačních médií a poměrně dlouhá doba potřebná pro růsttestovaných kultur.

PoděkováníAutoři děkují paní Jitce Cankařové za technickou asisten-

ci. Práce byla podpořena výzkumným záměrem MŠMTč. MSM 6198959223.

PŮVODNÍ PRÁCE

124 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

Literatura1. Fridkin SK, Jarvis WR. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin

Microbiol Rev. 1996;9(4):499–511.2. Odds FC., Abbott AB. A simple system for the presumptive identification of

Candida albicans and differentiation of strains within the species. Sabouraudia.1980;18(4):301–17.

3. Odds FC, Abbott AB. Modification and extension of tests for differentiation ofCandida species and strains. Sabouraudia. 1983;21(1):79–81.

4. Hamal P, Koukalová D, Hájek V. Naše zkušenosti s klasifikací kvasinkovitýchmikroorganzmů. I. Kombinovaná biotypizační metoda podle Mencla a Otčenáškaa typizace s využitím „killer fenomenu“. Epidemiol Mikrobiol Imunol. 1998;47(3):87–92.

5. Vazić-Babić V, Mlinarić-Missoni E, Kalenić S. Biotypes of Candida albicans iso-lated from cardiovascular system and skin surveillance cultures of hospitalized pa-tients. Acta Dermatovenerol Croat. 2006;14(4):219–24.

6. Polonelli L, Conti S. Biotyping of Candida albicans and other fungi by yeast kil-ler toxins sensitivity. Methods Mol Biol. 2009;499:97–115.

7. Mencl K, Otčenášek M. K rozlišení izolátů Candida albicans biotypizací. ČeskEpidemiol Mikrobiol Imunol. 1987;36(4):231–7.

8. Potužník V. Enterobakterie. In: Zahradnický J, et al. Mikrobiologie a epidemiolo-gie. Praha: Avicenum;1987. s. 334–64.

9. Hunter PR. A critical review of typing methods for Candida albicans and their ap-plications. Crit Rev Microbiol. 1991;17(6):417–34.

10. Gorškova GI, Bogomolova TS, Korněv NR, Pachomova EN, Labuněc IA.Metodičeskije voprosy biotipirovanija Candida albicans. Ž Mikrobiol EpidemiolImmunobiol. 1989;9:7–11.

11. Childress CM, Holder IA, Neely AN. Modification of a Candida albicans bioty-ping system. J Clin Microbiol. 1989;27(6):1392–4.

12. Odds FC, Abbott AB, Reed TAG, Willmott FE. Candida albicans strain types fromthe genitalia of patients with and without Candida infection. Eur J Obstet GynecolReprod Biol. 1983;15(1):37–43.

13. Odds FC, Abbott AB, Stiller RL, et al. Analysis of Candida albicans phenotypesfrom different geographical and anatomical sources. J Clin Microbiol.1983;18(4):849–57.

14. Neely AN, Odds FC, Basatia BK, Holder IA. Characterization of Candida isolatesfrom pediatric burn patients. J Clin Microbiol. 1988;26(9):1645–9.

15. Korting HC, Dorsch R. Zur Korrelation von Biotyp und Antimykotika-Sensibilitätbei Candida albicans. Mykosen. 1987;30(11):512–9.

16. Budak A. Epidemiology of Candida infection. II. Application of biochemical me -thods for typing of Candida albicans strains. Arch Immunol Ther Exp. 1990;38(5–6):369–77.

17. Pospíšil J. Torulopsis glabrata. Morfologické vlastnosti, biotypizace a citlivostizolátů k antifungálním preparátům in vitro. Česk Epidemiol Mikrobiol Imunol.1991;40(1):43–8.

18. Odds FC. Biotyping of medically important fungi. Curr Top Med Mycol.1985;1:155–71.

19. Odds FC, Auger P, Krogh P, Neely AN, Segal E. Biotyping of Candida albicans:results of an international collaborative survey. J Clin Microbiol. 1989;27(7):1506–9.

20. Soll DR. High-frequency switching in Candida albicans. Clin Microbiol Rev.1992;5(2):183–203.

21. Odds FC, Webster CE, Fisk PG, et al. Candida species and C. albicans biotypes inwomen attending clinics in genitourinary medicine. J Med Microbiol. 1989;29(1):51–4.

22. O’Connor MI, Sobel JD. Epidemiology of recurrent vulvovaginal candidiasis:identification and strain differentiation of Candida albicans. J Infect Dis.1986;154(2):358–63.

23. Skořepová M, Hauck H. Differentiation of Candida albicans biotypes by the met-hod of Odds and Abbott. Mykosen. 1985;28(7):323–31.

24. Odds FC. Quantitative microculture system with standardized inocula for straintyping, susceptibility testing, and other physiologic measurements with Candidaalbicans and other yeasts. J Clin Microbiol. 1991;29(12):2735–40.

25. Odds FC, Webster CE, Riley VC, Fisk PG. Epidemiology of vaginal Candida in-fection: significance of numbers of vaginal yeasts and their biotypes. Eur J ObstetGynecol Reprod Biol. 1987;25(1):53–66.

26. Koukalová D, Hamal P, Hájek V, et al. Mikrobiologická vyšetření u pacientek lé-čených vakcínou KANVAKOL. Klin Mikrobiol Inf Lék. 1999;5(9–10):325–31.

27. Poirier S, Auger P, Joly J, Steben M. Interest of biotyping Candida albicans inchronic vulvovaginitis. Mycoses. 1990;33(1):24–8.

28. Burnie JP, Odds FC, Lee W, Webster C, Williams JD. Outbreak of systemicCandida albicans in intensive care unit caused by cross infection. Br Med J.1985;290(6470):746–8.

29. Shankland GS, Richardson MD. Epidemiology of an outbreak of Candida en-dophtalmitis in heroin addicts: identification of possible source of infection bybio typing. J Med Vet Mycol. 1988;26(3):199–202.

PŮVODNÍ PRÁCE

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 125

ÚvodCandida albicans stále zůstává nejběžnějším původcem

humánních invazivních houbových infekcí, její podíl

u systémových kandidóz činí v průměru 66 % [1]. Podleúdajů Národního systému surveillance nozokomiálních in-fekcí USA byla v letech 1980–1990 sedmým nejčastějším

Využití morfotypizace při vnitrodruhové diferenciaci Candida albicans

P. HAMAL1, D. KOUKALOVÁ1

1Ústav mikrobiologie, LF UP a FN Olomouc

SOUHRNHamal P., Koukalová D.: Využití morfotypizace při vnitrodruhové diferenciaci Candida albicansCíl: Studie byla orientována na ověření použitelnosti morfotypizace při vnitrodruhovém rozlišování klinických izolátů kvasinkyCandida albicans. U lokalit s větším počtem testovaných kultur byla porovnána také struktura a poměrné zastoupení morfotypůa zhodnocen jejich výskyt z hlediska věku a pohlaví pacientů.Materiál a metody: Typizováno bylo 97 náhodně vybraných klinických izolátů C. albicans od 93 pacientů. Pomocí vatového tampónubyly 24hodinové kultury inokulovány ve formě pruhů na agar se sladinovým extraktem. Morfologie jejich okrajů a povrchů byla hod-nocena po 10 dnech inkubace při 30 °C.Výsledky: Celkem bylo zjištěno 30 morfotypů, z nichž nejpočetnější měl kódový profil 7240 (n = 13, 13,4 %), následovaly 5240 (n = 11)a 7340 (n = 9). Rozlišovací schopnost, vyjádřená Simpsonovým indexem diverzity, dosáhla hodnoty 0,95. Při testování reprodukova-telnosti výsledků bylo dosaženo naprosté shody u 54,6 % izolátů, dalších 36,1 % se lišilo v jednom znaku. Část studovaného souboru(n = 35) byla současně biotypizována naší modifikací metody podle Oddse. Na základě morfologických kritérií bylo definováno 14 fe-notypů, biotypizací 8. Porovnáním vzhledu kultur získaných z orofaryngu, pochvy a moči byl zaznamenán statisticky signifikantní roz-díl v osídlení zkoumaných lokalit, stejně jako při hodnocení výskytu morfotypů u mužů a žen.Závěr: Bylo prokázáno, že hlavními přednostmi morfotypizace izolátů C. albicans je velmi dobrá rozlišovací schopnost, jednoduchostprovedení a ekonomická dostupnost. Nevýhodou, v porovnání s genetickými přístupy, je nižší reprodukovatelnost výsledků. Proto jev epidemiologických studiích doporučována především pro předběžnou orientační typizaci izolátů. Uvedený způsob hodnocení mor-fologické diverzity kmenů je však možno využít i při zkoumání jejich schopnosti adaptace na rozdílné podmínky prostředí v rámci stu-dia virulence, „switching“ fenoménu nebo působení antimykotik.

Klíčová slova: Candida albicans, typizace, epidemiologie

SUMMARYHamal P., Koukalová D.: The strain differentiation of Candida albicans by morphotypingBackground: Morphotyping is a phenotypic method for strain differentiation of yeast cultures based on the comparison of appearan-ce of their surfaces and fringes. For its simplicity and cost-effectiveness, it is recommended as an alternative tool to genotyping ofCandida albicans. Our study aimed at verifying its usefulness for typing a group of C. albicans clinical isolates with emphasis on disc-rimination power. Prevalence of specific morphotypes in body locations with more tested isolates and according to age groups and gen-der of patients was also evaluated.Material and methods: The tested group comprised 97 C. albicans isolates from 93 patients. With a cotton swab, 24-hour cultures we-re streaked onto malt extract agar. The surface and fringe morphology was assessed after 10-day incubation at 30 °C.Results: A total of 30 morphotypes were detected. The most frequent one had a code profile 7240 (n = 13, 13.4 %), followed by 5240(n = 11) and 7340 (n = 9). The discrimination power calculated by Simpson’s index of diversity reached 0.95. Results of reproducibili-ty testing were identical in 54.6 % of isolates, another 36.1 % of isolates differed in one character. Some isolates (n = 35) were biotypedby our modification of Odds method. Using morphological criteria, 14 different phenotypes were defined, as opposed to 8 found bybiotyping. Statistically significant differences were found when comparing morphotypes from the oropharynx, vagina and urine; thesame was true for male and female morphotypes.Conclusion: Our results clearly documented very good discrimination power of morphotyping for C. albicans isolates. This advanta-ge as well as easiness to perform and low costs but markedly lower reproducibility in comparison with molecular genetic techniquesmakes it an optimal typing method for first-line use. Evaluation of morphological diversity of strains by this method can be further uti-lized in the studies of virulence, switching phenomenon or antifungal resistance.

Keywords: Candida albicans, typing, epidemiology

Klin mikrobiol inf lék 2009;15(4):125–130

Adresa: Doc. MUDr. Petr Hamal, Ph.D., Ústav mikrobiologie LF UP a FNOL, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, e-mail:petr.hamal@fnol.cz

Došlo do redakce: 13. 6. 2009Přijato k tisku: 2. 9. 2009

PŮVODNÍ PRÁCE

126 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

nemocničním patogenem, v období 1992–1997 způsobilanejvíce urogenitálních infekcí na interních jednotkách in-tenzivní péče (JIP) [2,3]. Přitom pro celkovou incidencisystémových kandidóz je stále charakteristický mírný a tr-valý vzestup i při rozvoji antifungální léčby [1]. C. albicansbývá také často uváděna jako etiologické agens miniepide-mií na různých typech JIP včetně novorozeneckých [4–6].Na kardiochirurgickém oddělení byla příčinou infekcí ranu pacientů po resekcích hrudníku, stejně jako u neurochi-rurgických nemocných po laminektomii, kdy vektorem pře-nosu byly zřejmě umělé nehty zdravotnické pracovnice[7,8]. Kontaminací dialyzační tekutiny vyvolala rovněž my-kózy u pacientů s chronickým selháním ledvin [9]. K analý-zám takových případů jsou vesměs využívány vnitrodruho-vé typizační metody.

Z biotypizačních postupů, sledujících fenotypové odliš-nosti kmenů, je pro jednoduchost provedení a finanční ne-náročnost stále využívána morfotypizace, založená navzhledových odlišnostech kultur. Původně byla popsánaBrown-Thomsenem [10] a modifikována Phongpaichitemet al. [11]. Přestože se její význam s nástupem genetickýchtechnik výrazně snížil, byla využita při epidemiologickýchanalýzách kvasinkových infekcí i v relativně nedávné době[12–14].

Cílem této studie bylo ověřit použitelnost morfotypizacepři diferenciaci klinických izolátů C. albicans se zaměřenímna rozlišovací schopnost metody, reprodukovatelnost vý-sledků a případný predilekční výskyt určitých morfotypův anatomických lokalitách, věkových skupinách a v závis-losti na pohlaví pacientů.

Materiál a metodikaCelkem bylo hodnoceno 97 izolátů C. albicans od 93 ne-

mocných metodou podle Phongpaichita et al. [11]. Kulturybyly získány z různorodého klinického materiálu od pacien-tů hospitalizovaných ve Fakultní nemocnici Olomouc(FNOL) nebo ošetřených v ordinacích ambulantních specia -listů běžných odborností v letech 1994–1998. Z oblasti oro-faryngu bylo typizováno 22 izolátů, z moči a pochvy po 21,hemokultur 12, sputa 7, stolice 6, zevního zvukovodu 2 a pojednom z bronchoalveolární laváže, endotracheálního sekre-tu, kůže, stěru z rány, punktátu a exsudátu.

Jejich identifikace byla provedena na základě mikrosko-pického vzhledu na rýžovém agaru se zaměřením na detek-ci chlamydospor a ověřena biochemicky auxanografickoutechnikou, resp. pomocí zymogramů [15]. Před typizací by-ly uchovávány ve sbírce kvasinkovitých mikroorganizmů naÚstavu mikrobiologie LF UP a FNOL, nejprve na šikmémSabouraudově dextrózovém agaru (HiMedia Laboratories)při 4 °C s přeočkováváním v tříměsíčních intervalech, po-zději v médiu obsahujícím 20 % BBL Skim Milk Powder(Becton Dickinson) při –20 °C.

Při provádění morfotypizace byly 24hodinové kultury, vyrostlé na Sabouraudově dextrózovém agaru s thiaminem(0,1 mg/ml) a chloramfenikolem (50  μg/ml), suspendoványv 5 ml sterilní destilované vody. Zákal suspenze byl upraventak, aby odpovídal množství 1 × 106–1 × 107 kvasinkovýchbuněk/ml. Inokulace na 6% Malt Extract agar (Oxoid) s pří-davkem 2 % Bacto agaru (Difco) v Petriho miskách o prů-měru 90 mm byla provedena ve formě pruhu o délce 55 mm

pomocí vatového tampónu. Na jedné plotně byly současnětestovány dva izoláty. Inkubace probíhala 10 dní v termo-statu při 30 °C.

Příklady morfotypů jsou demonstrovány na obr.  1a–e.Hodnocení okrajů a povrchů vyrostlých kultur bylo prová-děno zjednodušeně podle Huntera et al. [16]. Základní kó-dové profily sestávaly ze čtyř čísel charakterizujících rozlo-žení, šířku a strukturu vláken na okraji pruhů a topografiijejich povrchů. Příležitostně byly zaznamenány i další zna-ky uvedené v tabulce 1. Rozlišovací schopnost metody prosoubory C. albicans byla vypočtena pomocí Simpsonova in-dexu diversity (D) [17].

Dále byla hodnocena predilekce nejčastěji se vyskytují-cích morfotypů C. albicans k vybraným anatomickým loka-litám, věkovým skupinám (0–9 let, 10–35 let, 36–60 leta > 60 let) a pohlaví pacientů. Statistická významnost dosa-žených výsledků byla vyjádřena pomocí χ2 testu a u částisouboru (n = 35) porovnána s výsledky, dosaženými našímodifikací biotypizace podle Oddse (viz práce „Hodnoceníbiotypizace lékařsky významných kandid“ v tomto čísle).

VýsledkyMezi 97 izoláty C. albicans bylo zjištěno celkem 30

vzhledově odlišných kultur, z nichž nejpočetnější byl mor-fotyp 7240 (n = 13), následovaly 5240 (n  =  11), 7340(n = 9), 3240 (n = 6), 1240, 5230, 7230 a 7330 (n = 5), 5330,5340 a 7540 (n = 4) a 5540 (n = 3). Po dvou izolátech pat-řilo do morfotypů 0000, 2230, 7220, 7320 a 7546, jedenkrátbyly zachyceny kódové profily 0001, 2240, 5320, 5334,5345, 5532, 5546, 7316, 7332, 7345, 7346, 7542 a 7544.U početnějších morfotypů bylo možno pomocí dodatečnýchznaků uvedených v tabulce 1 rozlišit dalších 9 subtypů.Procentuální poměr mezi nejčastěji se vyskytujícími morfo-typy je vyjádřen v grafu 1.

Rozlišovací schopnost metody byla velmi vysoká(D  =  0,95). Přímým porovnáním s biotypizací, provedenéu části souboru (n = 35), bylo definováno 14 morfologickyodlišných profilů a pouze 8 biotypů. Kombinací obou me-tod pak bylo rozlišeno celkem 29 fenotypů (D  =  0,99).Současně bylo zjišťováno zastoupení identických kmenů uvnitř jednotlivých biotypů a morfotypů. Předpokládanáshoda však byla prokázána pouze u 10 z nich (3,5 %), vzá-jemná příbuznost zbylých izolátů byla oběma metodami de-finována odlišně.

Reprodukovatelnost výsledků byla ověřována opakovanoutypizací celého souboru izolátů, z toho třetina kultur(n = 32) byla testována celkem třikrát. Shodných výsledkůbylo dosaženo u 53 izolátů (54,6 %), 35 (36,1 %) se lišilov jednom, osm ve dvou a jeden izolát ve třech znacích.Nejčastěji byla odlišně hodnocena struktura vláken (n = 29),dále jejich rozložení (n = 17), topografie povrchu (n  =  5)a šířka vláken (n = 1). Kultury C. albicans typizované třikrátse zcela shodovaly v 11 případech (34,4 %), v 18 (56,3 %)se lišil výsledek jednoho testování, morfotyp zbylých tříizolátů byl vždy definován odlišně.

V rámci studia predilekce morfotypů k anatomickým lo-kalitám bylo hodnoceno 22 kultur z orofaryngu a po 21z pochvy a moči. Izoláty z orofaryngu byly příslušníky 13morfotypů s převahou profilu 7240 (22,7 %), mezi 13 mor-fotypy z moči převažoval 3240 (19,0  %), u 16 poševních

PŮVODNÍ PRÁCE

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 127

nebyl žádný výrazně dominantní. Při statistickém vyhodno-cení byl však v kolonizaci uvedených tří lokalit zaznamenánsignifikantní rozdíl (p = 0,037).

Z hlediska věku pacientů bylo ve skupině 0–9 let (n = 21)rozlišeno 16 morfotypů s převahou profilu 7240 (16,7 %), veskupině 10–35 let (n = 28) 19 s dominujícím profilem 7340(17,9 %) a u 36–60letých nemocných (n = 24) 12 s nejpo-

četnějším profilem 5240 (25,0 %). Mezi pacienty staršími60 roků (n = 20) nebyl žádný ze 14 zjištěných profilů za-stoupen častěji než ostatní. Vztah morfotypů k věkovýmskupinám nebyl statisticky signifikantní (p < 0,001).

Při hodnocení distribuce morfotypů v závislosti na pohla-ví bylo u mužů (n = 37) rozlišeno 17 vzhledově odlišnýchtypů s převahou profilu 7240 (18,4 %), u žen (n = 54) jich

Tabulka 1Způsob kódování mor fologických znaků

Znak Kód Popis

Okraj pruhu

0 žádná vlákna1 nesouvislé; výskyt na < 20 % obvodu

Rozložení vláken 2 nesouvislé; výskyt na 20–50 % obvodu3 nesouvislé; výskyt na 60–90 % obvodu5 souvislé pouze na periferii nebo vějířovité uspořádání vláken7 souvislé; paralelní uspořádání vláken

0 žádná vláknaŠířka vláken 2 ≤ 2 mm

3 3–5 mm5 ≥ 6 mm

0 žádná vlákna1 velmi hrubá

Struktura vláken 2 hrubá3 střední4 jemná

Povrch pruhu

0 hladká1 uzlovitá2 s dolíčky

Topografie 4 kráteriformní5 kráteriformní se záhyby nebo lomy6 záhyby nebo lomy8 vlasatá

0 žádné hodnotitelné znaky2 drsné nebo široké

Kvalita topografických znaků 3 střední4 jemné nebo úzké

0 žádné hodnotitelné znaky Hloubka a četnost 2 mělké a málo četnétopografických znaků 4 mělké a hojné

6 hluboké a málo četné8 hluboké a hojné

Pomocné znaky

(1) hladká nebo nesouvislá vrstva kvasinkových buněk na okraji pruhu

(3) hranice mezi pruhem a okrajovými vlákny bez ostrého ohraničení

(4) čočkovité zóny na okraji pruhu

(5) klínovité zóny na okraji pruhu

(7) vlasová vlákna přes povrch pruhu

(8) vlasová vlákna přes povrch pruhu i okrajových vláken

(9) vlasová vlákna přes povrch okrajových vláken

znaky vytvářející základní kódový profil

PŮVODNÍ PRÁCE

128 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

bylo identifikováno 24 s dominancí profilu 5240 (12,3 %).V osídlení obou pohlaví byl zaznamenán statisticky signifi-kantní rozdíl (p = 0,041).

DiskuzePhongpaichit et al., jako autoři moderní verze morfotypi-

zace, vyvinuli detailní systém založený na kódování jednot-livých znaků při hodnocení vzhledu kultur [11]. Jsou posu-zovány tři vlastnosti okraje a stejný počet znaků na povrchuinokulovaných pruhů. Výsledkem je šestimístný kód, příle-žitostně doplněný o další čísla popisující pomocné znaky.Avšak při porovnávání populací je uvedený postup interpre-tačně obtížný pro velkou různorodost definovaných morfo-typů. Později se proto přistoupilo ke zjednodušení schéma-tu na čtyřmístný kód, vyjadřující tři okrajové a jednupovrchovou charakteristiku a k testování na médiích s ba-revnými indikátory [17,18]. Ve všech uvedených variantáchse jedná o jednoduchou metodu s velmi vysokou rozlišova-cí schopností, využitelnou k typizaci C. albicans i v běž-ných diagnostických laboratořích. V dřívějších studiích by-la udávána také vysoká reprodukovatelnost výsledků,posléze však byla zpochybněna průkazem přechodných va-

riací morfologie kolonií (zejména tzv.switching fenoménu) pod vlivemzměn v prostředí, složení či pH kulti-vačních půd nebo jako důsledek dlou-hodobé konzervace izolátů [12,13,16,19].Také podle našich zkušeností je mor-fotypizace jednoduchá, finančně do-stupná metoda s vysokou rozlišovacíschopností, avšak poměrně dlouhoudobou potřebnou k získání výsledků.Komplikaci při hodnocení některýchmorfotypů představoval odlišný cha-rakter rozložení a šířky vláken na pra-vé a levé straně pruhu, jejich rozdílnástruktura na periferii a v těsné blízkos-ti pruhu nebo kombinace vějířovitéhoa paralelního souvislého růstu. Vesporných případech byl výsledný kó-dový profil stanoven na základě po-rovnání s publikovanou fotodokumen-tací [11,16]. Příčinou uvedenéhopolymorfizmu může být skutečnost,že pruh je složen z velkého počtu bu-něk a změny mohou nastat jen u částipopulace. Rozmanitost vzhledu hod-nocených znaků, ztěžující porovnává-ní kultur, udávají i jiní autoři [12,20]. Rozlišovací schopnost metody bylavyšší než u naší va rianty Oddsovy bi-otypizace (D = 0,95 vs. 0,92), nejběž-nější morfotyp zahrnoval pouze 13,4% kmenů, což jsou lepší výsledky připorovnání s obdobnými studiemi v za-hraničí [12,13,16]. Na druhé straně jenutno konstatovat, že kódové profilynejčastějších morfotypů jsou v jednot-livých studiích, naši nevyjímaje, častojedinečné a vzájemně odlišné. Můžese jednat o geografické rozdíly, ale ta-ké o důsledek zmiňované variabilitypopulace buněk tvořících pruhy a do

Tabulka 2Vzájemná příbuznost nejpočetnějších mor fotypů Candida

albicans

Kód morfotypu 7240 5240 7340 3240

7240 1/4 1/4 1/4

5240 1/4 2/4 1/4

7340 1/4 2/4 2/4

3240 1/4 1/4 2/4

Pozn.: čísla v tabulkách udávají poměr počtu odlišných testů(znaků) k jejich celkovému počtu

0

5

10

15

20

25

poče

t izo

látů

7 24

0

5 24

0

7 34

0

3 24

0

1 54

0

5 23

0

7 23

0

7 33

0

5 33

0

5 34

0

7 54

0

5 54

0

osta

tní

(n =

18)

morfotypy

(a) (b) (c) (d) (e)

Obr. 1Příklady mor fotypů Candida albicans. (a) 0000, (b) 0001, (c) 5546, (d) 7340,

(e) 7546

Graf 1Distribuce mor fotypů Candida albicans mezi sledovanou populací pacientů

PŮVODNÍ PRÁCE

Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4 129

určité míry i subjektivního hodnocení příslušných znaků.Repro dukovatelnost, z hlediska dosažení zcela identickýchvýsledků, byla u námi studovaných kultur významně nižší(54,6 %), než udávají zahraniční práce (84 %) [11,16]. Navícbylo od čtyř pacientů hodnoceno po dvou izolátech, násled-ně získaných z téže lokality, ale žádná z těchto dvojic neby-la morfologicky zcela shodná. Pokud by při hodnocení re-produkovatelnosti byla tolerována odlišnost v jednomznaku, zvýšilo by se zmíněné kritérium na velmi dobrouúroveň (90,7 %), protože však v našem souboru byla zjiště-na blízká vzájemná příbuznost nejčastěji zachycených mor-fotypů (viz tabulka 2), byla by tím negativně ovlivněna roz-lišovací schopnost.

Na základě vztahu určitých morfotypů k závažným my-kotickým infekcím vyslovili Hunter et al. názor o jejich vyš-ší virulenci [16]. Jako nejpodezřelejší uváděli izoláty s ne-souvislou vláknitostí. Současně formulovali tři hypotézyo vztahu určitého morfotypu a virulence: souvisí s (1) ně-kterou vlastností povrchu buňky, (2) léčbou antimykotikynebo (3) switching fenoménem. Brown-Thomsen nalezl, narozdíl od uvedené studie, mezi „divokými“ kmeny nejvícekultur s hladkým povrchem bez vláken a proto se domníval,že takový morfotyp by mohl být nejvirulentnější [16].Phongpaichit et al. však později upozornili, že k potlačenívláknitosti může vést přehřátí testovacího média během pří-pravy [11]. Ribeiro et al. zase na základě jejich nedávné stu-die usoudili, že virulentní kmeny by mohly mít morfotyps dlouhými souvislými vlákny (> 6 mm) [14]. Nejvíce na-šich kultur (82,5 %) mělo souvislou vláknitost, z nich všakmělo dlouhá vlákna pouze 16,3 % izolátů. Různé formy ne-souvislé vláknitosti mělo 14,4 % kandid. Hladké nevláknitékultury byly zachyceny jen dvě, z hemokultury a sputa,a dále jeden blízce příbuzný morfotyp 0001 z nosohltanu.Z pochvy nebyl žádný takový izolát zachycen, což je v roz-poru s obdobným souborem Otera et al., kde kultury s uve-deným vzhledem tvořily 40,4 % [21]. Celkově lze konstato-vat, že pestrá distribuce morfotypů nám, ve shodě s jinýmiautory, neumožnila prokázat jejich souvislost s virulencí[22,23]. Vztah morfotypů k anatomickým lokalitám a po-hlaví pacientů se v naší studii, na rozdíl od publikovanýchprací, sice ukázal jako statisticky významný, ale výsledekmůže být zkreslen malými počty vyšetřených izolátů [12].

Morfotypizace byla dosud využita v řadě klinicko-epide-miologických studií. Hunter et al. uvádějí, že je vzhledemk jednoduchosti provedení a vysoké rozlišovací schopnostioptimální pro předběžné vnitrodruhové rozlišení. Olivera Reade touto metodou zjistili, že u pacientů se závažnější-mi stadii infekce virem lidské imunodeficience (tj. ARC,AIDS) se s vysokou frekvencí vyskytoval fenotyp 724, ne-prokázaný u séropozitivních nemocných bez manifestníhoonemocnění [23]. Borromeo et al. prokázali pravidelný vý-skyt většího počtu morfotypů v postupně odebíraných vzor-cích z dutiny ústní u pacientů s erytematózní kandidózou,zatímco kontrolní skupiny zdravých jedinců měly většinoupouze jediný [22]. Relativně nedávno byly rovněž morfoty-pizovány izoláty C. albicans získané od dětí s Downovýmsyndromem, asymptomatických HIV-pozitivních pacientůnebo zachycené od nemocných, sester a z prostředí chirur-gické a úrazové JIP [12–14]. Giammanco et al. porovnávalimorfotypizaci s metodami založenými na analýze DNA

a došli k závěru, že největším kvalitativním rozdílem je re-produkovatelnost výsledků v důsledku fenotypové variabili-ty kmenů [13]. Doporučili proto ověřování pomocí stabil-nějších genetických znaků. Uvedené zjištění je ve shoděs výsledkem dřívější studie Maffei et al., kteří dokumento-vali, že rekurentní vaginální kandidózu obvykle způsobujeperzistence stejného kmene, který však mění svou morfolo-gii vlivem selekčního tlaku vyvolaného léčbou antimykoti-ky [24].

ZávěrBylo prokázáno, že hlavními přednostmi morfotypizace

izolátů C. albicans je velmi dobrá rozlišovací schopnost,jednoduchost provedení a ekonomická dostupnost.Nevýhodou, v porovnání s genetickými přístupy, je nižší re-produkovatelnost výsledků. Proto je v epidemiologickýchstudiích doporučována především pro předběžnou orientač-ní typizaci izolátů. Uvedený způsob hodnocení morfologic-ké diverzity kmenů je však možno využít i při zkoumání je-jich schopnosti adaptace na rozdílné podmínky prostředív rámci studia virulence, „switching“ fenoménu nebo půso-bení antimykotik.

PoděkováníAutoři děkují paní Jitce Cankařové za technickou asistenci.Práce byla podpořena výzkumným záměrem MŠMT

č. MSM6198959223.

Literatura1. Pfaller MA, Diekema DJ. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent pub-

lic health problem. Clin Microbiol Rev. 2007;20(1):133–63.2. Emori TG, Gaynes RP. An overview of nosocomial infections, including the role

of the microbiology laboratory. Clin Microbiol Rev. 1993;6(4):428–42.3. Richards MJ, Edwards JR, Culver DH, Gaynes RP. Nosocomial infections in me-

dical intensive care units in the United States. National Nosocomial InfectionsSurveillance System. Crit Care Med. 1999;27(5):887–92.

4. Betremieux P, Chevrier S, Quindós G, et al. Use of DNA fingerprinting and bio-typing methods to study a Candida albicans outbreak in a neonatal intensive careunit. Pediatr Infect Dis J. 1994;13(10):899–905.

5. Boccia S, Posteraro B, LaSorda M, et al. Genotypic analysis by 27A DNA fin-gerprinting of Candida albicans strains isolated during an outbreak in a neonatalintensive care unit. Infect Control Hosp Epidemiol. 2002;23(5):281–4.

6. Huang YC, Lin TY, Peng HL, et al. Outbreak of Candida albicans fungaemia ina neonatal intensive care unit. Scand J Infect Dis. 1998;30(2):137–42.

7. Moro ML, Maffei C, Manso E, et al. Nosocomial outbreak of systemic candidosisassociated with parenteral nutrition. Infect Control Hosp Epidemiol. 1990;11(1):27–35.

8. Parry MF, Grant B, Yukna M, et al. Candida osteomyelitis and diskitis after spinalsurgery: an outbreak that implicates artificial nail use. Clin Infect Dis.2001;32(3):352–7.

9. Pertowski CA, Baron RC, Lasker BA, Werner SB, Jarvis WR. Nosocomial outb-reak of Candida albicans sternal wound infections following cardiac surgery tra-ced to a scrub nurse. J Infect Dis. 1995;172(3):817–22.

10. Brown-Thomsen J. Variability in Candida albicans (Robin) Berkhout. I. Studies onmorphology and biochemical activity. Hereditas. 1968;60:355–98.

11. Phongpaichit S, Mackenzie DW, Fraser C. Strain differentiation of Candida albi-cans by morphotyping. Epidemiol Infect. 1987;99(2):421–8.

12. Khan ZU, Chandy R, Metwali KE. Candida albicans strain carriage in patients andnursing staff of an intensive care unit: a study of morphotypes and resistotypes.Mycoses. 2003;46(11–12):479–86.

13. Giammanco GM, Lopes MM, Coimbra RS, et al. Value of morphotyping for thecharacterization of Candida albicans clinical isolates. Mem Inst Oswaldo Cruz.2005;100(5):483–90.

14. Ribeiro EL, Scroferneker ML, Cavalhaes MS, et al. Phenotypic aspects of oralstrains of Candida albicans in children with Down’s syndrome. Braz J Biol.2006;66(3):939–44.

15. Otčenášek M, Hejtmánek M. Identifikace kvasinek. In: Schindler J, Ticháček B,Potužník V (eds). Vyšetřovací metody při mykotických onemocněních. Praha:Avicenum; 1990. s. 46–58.

PŮVODNÍ PRÁCE

130 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 2009 4

16. Hunter PR, Fraser CA, Mackenzie DW. Morphotype markers of virulence in hu-man candidal infections. J Med Microbiol. 1989;28(2):85–91.

17. Hunter PR, Fraser CA. Application of a numerical index of discriminatory powerto a comparison of four physiochemical typing methods for Candida albicans.J Clin Microbiol. 1989;27(10):2156–60.

18. Quindós G, Fernández-Rodríguez M, Burgos A, et al. Colony morphotype onSabouraud-triphenyltetrazolium agar: a simple and inexpensive method forCandida subspecies discrimination. J Clin Microbiol. 1992;30(10):2748–52.

19. Soll DR. High-frequency switching in Candida albicans. Clin Microbiol Rev.1992;5(2):183–203.

20. Hunter PR. A critical review of typing methods for Candida albicans and their ap-plications. Crit Rev Microbiol. 1991;17(6):417–34.

21. Otero L, Vázquez F, Palacio V, et al. Comparison of seven phenotyping methodsfor Candida albicans. Eur J Epidemiol. 1995;11(2):221–4.

22. Borromeo GL, McCullough MJ, Reade PC. Quantitation and morphotyping ofCandida albicans from healthy mouths and from mouths affected by erythematouscandidosis. J Med Vet Mycol. 1992;30(6):477–80.

23. Oliver AJ, Reade PC. Morphotypes of oral isolates of Candida albicans from patients infected with the human immunodeficiency virus. J Med Vet Mycol.1993;31(4):289–97.

24. Maffei CM, Paula CR, Mazzocato TS, Franceschini S. Phenotype and genotype ofCandida albicans strains isolated from pregnant women with recurrent vaginitis.Mycopathologia. 1997;137(2):87–94.