PRIMA, DURANTE ...INVECE DEL RESTAURO

atti del congressoParma, 16-17 novembre 2012

a cura di:CESMAR7

Chiara Lodie Cristiana Sburlino

Sesto congresso internazionale

COLORE E CONSERVAZIONEmateriali e metodi nel restauro

delle opere policrome mobili

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Colori indesiderati: prove di rimozione enzimatica di macchie di ori-gine fungina dalla cartaMarta Fiacconi*, Piero Colaizzi*, Daniele Ruggiero**, Lorena Botti e Flavia Pinzari*, 1, 2

AbstractMolti microrganismi sono alla base di gravi problemi di conserva-zione del patrimonio archivistico e librario, a causa dei danni strut-turali e delle alterazioni cromatiche che possono produrre sul sub-strato. La rimozione delle macchie fungine e del micelio stesso dacarte e tessuti rappresenta un passaggio importante nelle operazio-ni di restauro e di conservazione. Lo scopo di questo studio è lavalutazione dell’efficacia di una serie di soluzioni enzimatiche, inassociazione all’utilizzo di gel rigidi (Gellano), nella rimozione delmicelio fungino da differenti tipologie di carte. Le analisi sui cam-pioni di carta prima e dopo la crescita fungina e prima e dopo l’ap-plicazione dei trattamenti enzimatici hanno riguardato la misura delpH, delle coordinate di colore e l’utilizzo di un microscopio elet-tronico a scansione a pressione variabile equipaggiato con un detec-tor EDX per l’analisi delle superfici prima e dopo i trattamenti.

IntroduzioneI funghi ed alcune specie di batteri rappresentano una delle maggio-ri minacce alla conservazione del materiale archivistico e librario perla molteplicità di tipologie di danno che essi sono in grado di pro-vocare. Questi microrganismi utilizzano le sostanze che compongo-no i supporti quali la cellulosa, le emicellulose e la lignina come fon-ti di nutrimento, distruggendo i materiali costitutivi di opere grafi-che, libri e documenti. Oltre al danno di tipo strutturale, i funghisono responsabili di alterazioni cromatiche dovute alla formazione dimacchie che presentano caratteristiche varie sia per forma che percolore. I pigmenti fungini possono essere classificati in endopigmenti,che conferiscono colore agli organismi, ed esopigmenti (principal-mente flavonoidi, chinoni e melanine) che vengono secreti nell’am-biente circostante. La funzione biologica di numerosi pigmenti fun-gini non è ancora nota; alcuni di essi agirebbero da filtro contro leradiazioni luminose nocive, altri sarebbero dotati di proprietà anti-biotiche [8]. La loro produzione è influenzata dalle caratteristicheambientali, quali disponibilità di nutrienti, reazione nel mezzo (pH),luce e temperatura. L’alterazione prodotta può essere di varia entità,

* Laboratorio di Biologia, Istituto Centrale per il Restauro e la Conservazione del PatrimonioArchivistico e Librario (ICRCPAL). Via Milano 76, 00184 Roma. Tel.+390648291309-215. E-mail:flavia.pinzari@beniculturali.it

** Laboratorio di Fisica Istituto Centrale per il Restauro e la Conservazione del Patrimonio Archivisticoe Librario (ICRCPAL)

1 Attuale recapito: Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura. CRA-RPS Via dellaNavicella, 2-4, 00184 Roma

2 Autore per la corrispondenza

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ma trattandosi di manufatti di interesse storico-artistico la presenzadi macchie risulta comunque dannosa e può compromettere grave-mente la corretta lettura delle opere. L’azione dei biodeteriogeni èstrettamente legata alle condizioni ambientali e micro ambientali incui il manufatto è conservato: solo quando l’umidità relativa dell’ariasupera il 60% e il contenuto di acqua della carta raggiunge la sogliadell’8% si verificano le condizioni idonee allo sviluppo di gran par-te dei microrganismi. Il controllo dei parametri quali temperatura,umidità relativa, luce e areazione è quindi indispensabile per rallen-tare i processi di deterioramento. Nonostante l’applicazione di tuttele tecniche di prevenzione che possono essere messe in pratica, spes-so non è possibile evitare completamente l’attacco dei microrganismial supporto cartaceo. In questo caso la rimozione delle macchie fun-gine e del micelio stesso da carte e tessuti rappresenta un passaggioimportante nelle operazioni di restauro e di conservazione. Le tecni-che, prevalentemente di tipo chimico o meccanico, utilizzate fino adoggi in questo ambito sono spesso nocive ai materiali o poco effica-ci nella rimozione delle alterazioni [8, 7, 3]. I metodi meccanici con-sistono nella rimozione fisica dei biodeteriogeni con strumenti manua-li ma sono sconsigliabili perché, trattandosi spesso di colonizzazio-ni non solo superficiali, per una rimozione completa delle strutturepossono verificarsi danni secondari quali fori o rotture. L’utilizzo dimetodi chimici non sempre garantisce il raggiungimento di un risul-tato soddisfacente a causa della natura stessa dei metaboliti funginiche possono talvolta risultare insolubili nei prodotti generalmenteimpiegati nel restauro. Per questo motivo lo studio e l’applicazionedi nuove tecniche di rimozione sembra essere un campo di studi essen-ziale per la corretta conservazione e pulitura dei beni culturali costi-tuiti o supportati da carta.

Presso l’ICRCPAL si sta verificando l’efficacia di alcuni trattamentienzimatici come possibile alternativa alle tecniche sopra citate nel-la rimozione delle macchie e del micelio fungino da supporti carta-cei. L’attività enzimatica è stata valutata in associazione all’utilizzodi gel rigidi (Gellano) capaci di veicolare i principi attivi, di assor-bire sostanze idrosolubili per capillarità e di supportare in teoria l’at-tività degli enzimi [6, 1].

Materiali e metodiLa valutazione dell’efficacia pulente di diverse miscele di enzimi èstata valutata su macchie fungine prodotte in vitro attraverso inoculicontrollati su carte con caratteristiche diverse. Le macchie sono sta-te prodotte inoculando singolarmente quattro ceppi fungini di altret-tante specie di funghi biodeteriogeni su tre tipologie di carta. I cam-pioni di carta utilizzati sono: Carta Whatman CHR1 (Cat No. 3001917), Carta Mezzofino (Cat No. 200953), prodotta dall’Istituto Poli-grafico dello Stato e carta Fabriano tipo Perusia fatta a mano. Le car-te sono state tagliate in frammenti di 2x5 cm e sono state steriliz-zate in autoclave a 121°C per 30 min.

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I ceppi fungini utilizzati per produrre macchie sulle carte sono:Eurotium chevalieri L. Mangin, Aspergillus terreus Thom, Cladosporium sphae-rospermum Penzig e Aureobasidium pullulans (Debary) Arnaud. I funghisono stati coltivati in vitro su agar nutritivo (Malt Extract Agar,Oxoid). A maturazione delle strutture conidiali le colonie funginesono state utilizzate per ottenere sospensioni di spore a titolo notoal fine di ottenere un inoculo delle carte a densità standardizzata.Per la preparazione delle sospensioni sono stati utilizzati 10 ml diuna soluzione di H2O distillata e Tween-40 allo 0.25% in cui sonostate disperse le spore fungine, quindi si è proceduto alla titolazio-ne attraverso una camera di Thoma. Le sospensioni sono poi statediluite con del brodo nutritivo diluito al 5% in acqua (Czapek doxbroth, Difco) per fornire alle spore il nutrimento necessario per lagerminazione. L’inoculo sulle carte è stato realizzato prelevando 100µl della sospensione e distribuendola in due punti sulle strisce di car-ta. Le carte con gli inoculi sono state collocate in caspule Petri esono state quindi sistemate in una campana di vetro con doppio fon-do contenente acqua distillata (UR 100%) e incubate nel termosta-to a 25°C per una settimana.

Le macchie ottenute sono state volutamente intense e con carat-teristiche diverse (figg. 1, 2 e 3), date per ogni ceppo fungino dal-la diversa interazione con le carte contenenti oltre alla cellulosa altresostanze in diversa misura (es. lignina, collanti, sostanze minerali).

La rimozione delle macchie è stata tentata utilizzando misceleenzimatiche disciolte in un buffer fosfato a pH 7.2 con o senza ilgellano come supporto [6]. Le miscele sono state sperimentate a con-centrazioni e per tempi differenti (30 e 60 min). Gli enzimi utiliz-zati nella preparazione delle miscele pulenti sono stati: lipasi da Can-dida rugosa (EC No. 232-619-9); proteasi da Aspergillus saitoi (EC No.232-796-2); chitinasi da Streptomyces griseus (EC No. 232-578-7). Oltrealle miscele di enzimi puri è stata saggiata una miscela enzimaticaindustriale prodotta dalla Realco S.A. (Louvain-la-Neuve, Belgio) ecommercializzata con il nome di Biorem™, costituita da due diver-se sostanze utilizzate in combinazione: il Biorem A1, una base alca-lina detergente contenente tensioattivi di origine vegetale e il Bio-rem 10, un cocktail enzimatico costituito da proteasi e lipasi.

I campioni di carta con e senza le macchie (controllo) sono sta-ti analizzati prima e dopo i trattamenti. In particolare sono stati misu-rati il pH e le coordinate di colore. Per la misura del pH è stato uti-lizzato il metodo non distruttivo della misura del pH superficiale(come da ATICELCA MC23-73). Le misure colorimetriche per lavalutazione e la comparazione delle macchie fungine sono state con-dotte con un colorimetro portatile Minolta, sistema CIE e CIELAB).Per definire in maniera oggettiva le differenze di colore è stato uti-lizzato il parametro ΔE, che rappresenta la variazione globale delcolore. Il colorimetro, una volta eseguite le due misure da confron-tare, oltre a fornire la differenza di colore fornisce anche il ΔL, cherappresenta la variazione di luminosità ed i Δa e Δb, permettendo

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di quantificare in maniera globale ed esaustiva le differenze tra i duecolori presi in esame. La superficie dei campioni è stata inoltre ana-lizzata per mezzo di un microscopio elettronico a scansione a pres-sione variabile ZEISS VP-SEM EVO50 ed è stata misurata la com-posizione elementale dei campioni prima e dopo il trattamento permezzo della microanalisi con un analizzatore EDS INCA Energy250. I campioni sono stati montati su degli stub in alluminio del dia-metro di 12,5 mm (Agar Scientific, Essex, England, pin stubs, Cod.No. G301F) e fissati con del nastro biadesivo in carbonio.

Il confronto fra i diversi trattamenti è stato condotto per mezzodell’analisi statistica dei dati. A tale scopo sono stati utilizzati l’ANO-VA, il test t-Student e l’analisi fattoriale discriminante. Il livello disignificatività è stato fissato per p<0.05 ed è stato utilizzato il soft-ware XLSTAT 2009 (versione 2009.4.06). L’analisi fattoriale discri-minante (AFD) effettua la comparazione tra più gruppi (i campionidi carta con i diversi trattamenti enzimatici) sulla base di più varia-bili (le coordinate di colore o altri descrittori quantitativi), metten-do in luce quali di queste rivestano un ruolo primario nella separa-zione dei gruppi stessi.

Risultati e discussioniE’ stato eseguito il test t di Student sui dati colorimetrici per valu-tare in quale misura le modalità di applicazione dei trattamenti (agoccia o su Gellano) abbiano influito sui risultati ma non sono emer-se differenze significative fra le due modalità di applicazione perentrambi i tempi di posa.

Dai dati colorimetrici relativi ai trattamenti su carte macchiate daA. terreus sono emerse differenze statisticamente significative fra trat-tati e non trattati. In particolare confrontando i valori L*a*b* deicampioni trattati con la miscela di lipasi e chitinasi o con la misce-la Biorem si è riscontrato un significativo aumento del grado di bian-co (L) rispetto alle macchie non trattate.

L’effetto dell’enzima chitinasi è stato significativamente diversosecondo i ceppi fungini e le relative macchie prodotte sulle carte.La chitinasi è un complesso enzimatico che comprende la chitobio-sidasi e l’endochitinasi che degradano la chitina [4, 2]. La chitina,polimero costituito da unità di N-acetyl-D-glucosamina, è la com-ponente prevalente nella parete cellulare dei funghi. Pertanto la chi-tinasi è in grado di dissolvere una parte strutturale fondamentale delmicelio fungino, che talvolta è responsabile della colorazione brunadelle macchie sulle carte, contenendo essa stessa melanine ed altripigmenti protettivi. L’adesione delle ife fungine alla cellulosa è sta-ta poco studiata finora, sebbene ci siano evidenze che sostanze pro-teiche e lipidiche abbiano un ruolo in tal senso [5].

Le combinazioni di enzimi saggiate hanno avuto effetti diversisui campioni preparati in vitro, indicando una elevata variabilità nel-le modalità di adesione delle ife alla cellulosa nelle specie fungineutilizzate nei test.

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La microanalisi eseguita sui campioni di carta dopo il trattamen-to enzimatico ha evidenziato alcune modificazioni nella loro com-posizione elementale. E’ stato documentato un aumento della con-centrazione in fosforo (P), dovuto al tampone fosfato utilizzato persciogliere gli enzimi, tampone che rimane sui campioni dopo il trat-tamento e che pertanto dovrà essere sostituito in prove future da unveicolo per gli enzimi meno invasivo. Zolfo e potassio, invece, dimi-nuiscono sensibilmente dopo il trattamento, ad indicare una nettadiminuzione della presenza fungina sul substrato.

Dall’analisi discriminante (fig. 4) effettuata utilizzando come cri-terio di raggruppamento i differenti trattamenti enzimatici (diversecombinazioni degli enzimi lipasi, chitinasi e proteasi, con e senzagel) è emersa una bassa “forza” delle categorie individuate a prioriper l’analisi, e quindi la creazione di un modello di classificazionedebole, incapace di distinguere nella massa dei campioni quelli trat-tati in un modo piuttosto che in un altro. I dati raggruppati in baseai trattamenti sono apparsi in gran parte sovrapposti. Il trattamentocon chitinasi è quello in cui le osservazioni sono risultate più effi-cacemente classificate a posteriori (50%), mentre negli altri casi siè avuta una percentuale di classificazione più bassa.

Non sono emerse complessivamente differenze apprezzabili tral’applicazione enzimatica a gocce o l’utilizzo del gel come suppor-to. Una differenza è emersa invece dai risultati relativi ai tempi diposa delle soluzioni enzimatiche sulle macchie: una variazione sta-tisticamente significativa è stata riscontrata nella differenza di lumi-nosità (ΔL) che è risultata maggiore per i 30 minuti di posa rispet-to ai 60 minuti (fig. 5).

La spiegazione è stata trovata nell’effettiva azione della chitina-si: aumentando il tempo di posa, infatti, è aumentato il tempo diazione dell’enzima che ha materialmente sciolto la parete cellularefungina determinando, soprattutto nei funghi melanici come l’A. pul-lulans il rilascio, fra le fibre di cellulosa, del pigmento scuro, provo-cando paradossalmente in alcune carte un peggioramento dell’aspettodelle macchie brune.

Oltre alle miscele enzimatiche formulate in laboratorio, è statosaggiato anche un trattamento basato sull’applicazione di un pro-dotto industriale coperto da brevetto e sviluppato in Belgio cometrattamento enzimatico per la rimozione dei biofilm dalle superfici(es. macchinari degli impianti industriali). Fra tutti i trattamenti spic-ca proprio l’efficacia del prodotto industriale Biorem ed inoltre quel-la della miscela lipasi+chitinasi. I campioni macchiati dal fungo etrattati con il prodotto industriale hanno mostrato dei buoni risul-tati. Va però considerato l’inconveniente che questo prodotto pre-senta, ossia la colorazione molto scura della soluzione enzimaticaprodotta industrialmente che difficilmente si è riuscita ad eliminarecompletamente, se non dopo numerosi lavaggi acquosi. Alcuni fun-ghi, come l’A. terreus utilizzato nella sperimentazione, sono però anchecellulosolitici ed oltre alla macchia provocano un indebolimento del

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supporto cartaceo, per cui i successivi lavaggi acquosi possono esse-re estremamente controproducenti in una situazione di questo tipo.L’efficacia del Biorem si evidenzia anche dal valore della variazionedi luminosità, ΔL, il più elevato tra tutti i trattamenti. Un cambia-mento sostanziale del grado di giallo (Δb) delle macchie si è avutoinvece soprattutto con l’utilizzo della miscela L+C.

Il pH delle carte è stato monitorato durante tutta la sperimenta-zione. Rispetto a prima dei trattamenti il valore di pH rimane entrovalori di neutralità ben tollerati dalla carta. L’unico trattamento cheha comportato un innalzamento sensibile di pH (fino a valori di cir-ca 8,0) è quello in cui è stato utilizzato il Biorem con il tensioattivo.

ConclusioniFra tutti i trattamenti testati nella sperimentazione, spicca l’efficaciadel trattamento industriale Biorem, oltre a quella della miscela lipasi+ chitinasi. La scelta di testare un prodotto industriale, oltre allemiscele enzimatiche formulate in laboratorio, è nata dalla consape-volezza che uno dei limiti dell’utilizzo nel restauro dei trattamenti abase di enzimi risente dell’elevato costo degli enzimi stessi che seacquistati puri rendono i trattamenti quasi proibitivi per gran partedei laboratori di restauro, soprattutto se artigianali. Per queste ragio-ni si ritiene utile di valutare l’applicabilità di prodotti enzimatici giàformulati per processi di pulitura o di rimozione di biofilm e con costiabbattuti dalla produzione industriale. Va però considerato l’incon-veniente che questo prodotto presenta, ossia la colorazione moltoscura della soluzione enzimatica, che difficilmente si è riusciti ad eli-minare del tutto, se non dopo numerosi lavaggi acquosi, non sempreperò praticabili sui supporti cartacei. Una valutazione degli effetti alungo termine dei trattamenti enzimatici non potrà che richiedere, inun successivo approfondimento delle ricerche, una serie di prove con-trollate di invecchiamento accelerato dei campioni. In prospettivasarà interessante proseguire la sperimentazione puntando su prodot-ti enzimatici industriali già formulati ma con caratteristiche più ido-nee all’utilizzo sui beni culturali cartacei, ossia una colorazione menoinvasiva nei confronti del supporto e un’azione più incisiva nei con-fronti dei pigmenti che causano le alterazioni cromatiche.

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Bibliografia[1] CREMONESI P. (1999) L’uso degli enzimi nella pulitura di opera policrome. il prato casa editrice,

Padova.[2] DAHIYA N., TEWARI R. (2006) “Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review”.

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[4] EKENLER M., TABATABAI M.A. (2002) “Effects of trace elements on -glucosaminidasi activi-ty in soils”. Soil Biology and Biochemistry, 34, pp. 1829-1832.

[5] GARETH JONES E.B. (1994) “Fungal adhesion”. Mycological Research, 98, pp. 961-981.[6] IANNUCCELLI S. & SOTGIU S. (2010) “La pulitura superficiale di opere grafiche a stampa

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[7] NIETO-FERNANDEZ F.E. ET AL. (2003) “Enzymatic approach to removal of fungal spots fromdrawing on paper” in Koestler R.J. et al., Art, Biology, and conservation: Biodeterioration of worksof art. The metropolitan museum of art, New York, pp.110-127.

[8] SZCZEPANOWSKA H.M. & LOVETT C.M. JR. (1992) “A study of removal and prevention offungal stains on paper”. JAIC 31, pp.147-160.

Fig 1. Macchie prodotte dal fungo A.terreus rispettivamente su car-ta Whatman, Mezzofino ePerusia (da sinistra versodestra).

Fig 2. Macchie prodotte dal fungo C.sphaerospermum rispettiva-mente su carte Whatman,Mezzofino e Perusia (da sini-stra verso destra).

Fig 3. Macchie prodotte dal fungofilamentoso A. pullulans rispet-tivamente su carta Whatman,Mezzofino e Perusia (da sini-stra verso destra).

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Fig 4. Analisi discriminante effettuata utilizzando come criterio di raggruppamento i differenti trattamentienzimatici mentre le etichette fanno riferimento alle carte con i funghi (P: trattamento con pro-teasi; C+L+P: trattamento con chitinasi, lipasi e proteasi; C: trattamento con chitinasi; C+L: trat-tamento con chitinasi e lipasi; M: carta Mezzofino; W: carta Whatman; P: carta Perusia; p: A. pullu-lans; t: A. terreus; c: E. chevalieri).

Fig 5. Valori medi delle variazioni di colore ottenute sulla base del tempo di posa del trattamento enzi-matico (Test t-Student per p<0.05. ΔE: variazione globale di colore; ΔL: variazione di luminosità).Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media.

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Scopo del lavoroScopo del lavoro è stato testare di alcuni trattamentienzimatici nel rimuovere macchie e micelio fungini da supporticartacei (Fig.1). delle ife fungine alla cellulosa èstata poco studiata finora, sebbene ci siano evidenze chesostanze proteiche e lipidiche abbiano un ruolo nella lororesistenza alla rimozione (Gareth Jones, 1994) (Fig.2-3).

Materiali e metodiLe macchie sono state prodotte inoculando singolarmente quattro ceppi fungini di altrettante specie di funghi biodeteriogeni su tre tipologie di carta (Fig 4).

Campioni di carta utilizzati: Carta Whatman CHR1 (Cat No. 3001 917), Carta Mezzofino (CatPoligrafico dello StatoCarta Fabriano tipo Perusia fatta a mano.

Ceppi fungini utilizzati per produrre macchie sulle carte: Aureobasidium pullulans (Debary) Arnaud (Fig 5)Eurotium chevalieri L. Mangin, (Fig 6)Aspergillus terreus Thom,Cladosporium sphaerospermum Penzig

Inoculo: sospensione di spore in H2O distillata e Tween-40 allo 0.25% con un titolo di circa 500 spore/ul. Incubazione al 100%UR a 25°C per una settimana.

Enzimi utilizzati (Tab 1): Lipasi da Candida rugosa (EC No. 232-619-9); Proteasi da Aspergillus saitoi (EC No. 232-796-2); Chitinasi da Streptomyces griseus (EC No. 232-578-7Miscela enzimatica industriale prodotta dalla Realco S.A. (Louvain-la-Neuve, Belgio) e commercializzata con il nome di Bioremtm.

Modalità di applicazione (Fig. 7-8):Miscele enzimatiche disciolte in un buffer fosfato con o senza il gellano come supporto (Iannuccelli S. & SotgiuS., 2010). a diverse concentrazioni per tempi differenti (30 e 60 min).

Analisi dei campioni di carta prima e dopo i trattamenti: pH ATICELCA MC23-73coordinate di colore (Colorimetro Minolta)microscopio elettronico a scansione a pressione variabile ZEISS VP-SEM EVO50 microanalisi EDS INCA Energy 250. ANOVA, , test t-Student , analisi discriminante (XLStat, Addinsoft, Parigi)

Risultati (Fig. 9-13)Applicazione dei trattamenti a goccia o su gel: nessuna differenza significativa (test t-Student)Applicazione dei trattamenti per 30 o 60 minuti: nessuna differenza significativa (test t-Student)Microanalisi : nei campioni di carta dopo il trattamento

aumenta la concentrazione in fosforo (P), a causa del tampone fosfato utilizzato per sciogliere gli enzimi. Zolfo e potassio, diminuiscono sensibilmente dopo il trattamento, ad indicare una netta diminuzione della presenza fungina sul substrato. Risultati colorimetrici : differenze statisticamente significative fra trattati e non trattati. I valori L*a*b* delle macchie trattate con la miscela di Lipasi e Chitinasi o con la miscela Bioremindicano un significativo aumento del grado di bianco (L) rispetto alle macchie non trattate.

Chitinasi è stato significativamente diverso secondo i ceppi fungini e le relative macchie prodotte sulle carte.

Biorem, oltre a quella della miscela Lipasi + Chitinasi.

Unwanted colours: enzymatic cleaning tests in the removal of fungalstains on paper

RationaleFungi are one of the main problems in the conservation of paper-supported works of artbecause of the different damage they may cause. Besides the structural damage, fungi canproduce discolouration and cause defacing spots, different in shape and colour, on thecellulosic materials (Fig.1-3). Chemical and mechanical methods usually used in paperrestoration are often harmful to the materials or ineffective in removing stains (Szczepanowskaet Lovett 1992; Nieto-Fernandez et al. 2003; De Mico et Pinzari, 2009). The aim of the study isto test the enzymatic removal of fungal stains as a possible alternative to the above mentionedtreatments. Enzymes were used also in association with Gellan gum, which is able to carry theenzyme, absorbing water-soluble elements by capillarity and supporting enzyme activity(Iannuccelli S. & Sotgiu S., 2010; Cremonesi P., 1999).

Colori indesiderati: prove di rimozione enzimatica di macchie di origine

fungina dalla cartaMarta Fiacconi1, Piero Colaizzi1, Daniele Ruggiero2, Lorena Botti2 e Flavia Pinzari1

1Laboratorio di Biologia, Istituto Centrale per il Restauro e la Conservazione del Patrimonio Archivistico e Librario (ICRCPAL). Via Milano 76, 00184 Roma. Tel ++3906 48291309-215. E-mail: flavia.pinzari@beniculturali.it

2Laboratorio di Fisica, Istituto Centrale per il Restauro e la Conservazione del Patrimonio Archivistico e Librario (ICRCPAL)

Fig. 1. Macchie fungine su materiale cartaceo. La chitina, polimero costituito da unità di N-acetyl-D-glucosamina, è la componenteprevalente nella parete cellulare dei funghi, responsabile spesso della colorazione delle macchie sulle carte, contenendo essa stessamelanine ed altri pigmenti protettivi.

Fig.2. e Fig. 3. delle ife fungine alla cellulosa è stata poco studiata finora, sebbene ci siano evidenze che sostanze proteichee lipidiche abbiano un ruolo in tal senso (Gareth Jones, 1994). Nelle immagini ottenute con il SEM, ife fungine con fibrille adesive ederosione enzimatica della cellulosa ad opera dei funghi.

Fig. 4. Macchie prodotte dal fungo filamentoso A.pullulans rispettivamente su carta Whatman, Mezzofino e Perusia (da sinistra versodestra).

Fig. 5. Strutture pigmentate di A.pullulans

Fig. 6. Ascocarpi di E.chevalieri

Gareth Jones E.B. (1994) Fungal adhesion. Mycological Research, 98, pp.961-981.Iannuccelli S. & Sotgiu S. (2010) La pulitura superficiale di opere grafiche a stampa con gel rigidi polisaccaridici

Giangemi editore, Roma.Nieto-Fernandez F.E. et al. (2003) Enzymatic approach to removal of fungal spots from drawing on paper in Koestler R.J. et al.,

-127. Szczepanowska H.M. & Lovett C.M. Jr. (1992) A study of removal and prevention of fungal stains on paper. JAIC 31, pp.147-

160.

A gocce

Su gel

Materials and methodsThe efficiency in the removal of fungal stains was studied in vitroby producing model samples. Three paper grades wereinoculated with four fungal species (Fig.4).

Paper samples: Whatman CHR1 (Cat No. 3001 917), Mezzofino(Cat No. 200953) and Perusia.

Fungal species used for spot reproduction: Eurotium chevalieri L.Mangin, Aspergillus terreus Thom, Cladosporiumsphaerospermum Penzig and Aureobasidium pullulans (Debary)Arnaud (Fig. 5-6).

Enzymes tested are Lipase from Candida rugosa (EC No. 232-619-9); Protease from Aspergillus saitoi (EC No. 232-796-2) andChitinase from Streptomyces griseus (EC No. 232-578-7)obtained from SIGMA-Aldrich (Italy), and an industrial enzyme-solution, Biorem, produced by Realco S.A. (Louvain-la-Neuve,Belgio). (Tab.1)The water-based enzyme solutions (in a phosfate buffer) wereapplied as drops with a sterile pipette or applied on the Gellangum, left onto paper sample for 30 and 60 minutes and thenwashed with sterile water. (Fig 7-8)

The analysis of paper samples before and after fungal growth,and before and after the application of the enzymatic mixturesconsisted in colorimetric measurements, pH measurement,observation with a variable pressure SEM instrument ZEISS VP-SEM EVO50 and an EDX detector for microanalysis (EDS INCAEnergy 250). The statistical analysis (ANOVA, t-student anddiscriminant analysis) was used to compare different treatments.

The effectiveness of Chitinase was different depending on the different fungal species;this enzyme can solve the fungal wall (Dahiya et Tewari 2006), composed mainly ofchitin, which is often responsible of the stains on paper. The adhesion of fungal hyphaeto cellulose is a key aspect and there are evidences that proteins and lipids areprobably involved (Gareth Jones, 1994); different enzymes showed different results,demonstrating that adhesion can be different among different fungal species. Themicroanalysis showed that with respect to not treated paper, the enzyme treatmentprovokes some modification in the sample composition. An increase in thephosphorous (P) concentration is due to the buffer used to solve enzymes. Sulphur (S)and potassium (K) concentrations in the infected paper appeared sensibly reduced byall the treatments considered, indicating an overall good removal of fungal mat.

Results (Fig. 9-13)There are no statistically significant differences between theapplication as drops and on Gellan gum. There are colorimetricdifferences between samples non-treated and treated withLipase and Chitinase, and with Biorem. Among all thetreatments, Biorem and Lipase+Chitinase showed the bestresults. An increase in the L value, which corresponds to thewhite grade, was observed but only on the spots caused bysome of the tested fungi.

Riferimenti bibliograficiIl prato,

Padova.Dahiya N., Tewari R. (2006) biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review.

Appl. Microbiol. Biotechnol. 71: 773-782.De Mico A. & Pinzari F. (2009) Application of enzymatic solutions on paper to remove

fungal stains. SEM-EDS evaluation of the effects. Proceedings, 4th International

Vol.II Session B. Angelo Ferrari, Italy.(continua..)

Fig.1

Fig.2

Fig. 3

Fig.4

Fig.5

Fig.6

Fig.7

Fig.9

Fig.8

Fig.10Fig.11

Fig.12

Fig.13

Tab.1

Peso

Gel + enzima

Carta

Fig. 7. Applicazione delle miscele enzimatiche sui provini di carta per mezzo del gellano.Fig. 8. Applicazione delle miscele enzimatiche sui provini di carta.Fig. 9. Analisi discriminante di confronto dei trattamenti sulla base di tutte le variabili (pH, colore,grado di bianco). Sono per chiarezza mostrati solo i centroidi dei gruppi e non le osservazioni. Lachitinasi se applicata da sola si comporta in modo diverso dagli altri trattamenti.Fig. 10. Osservazione della superficie dei campioni infungati prima e dopo i trattamenti enzimaticiper mezzo del SEM-VP. Si osserva la rimozione di biona parte del micelio fungino.Fig. 11 e Fig.12. Fig. 13. Variazione di colore delle macchie dopo i trattamenti. Con chitinasi elipasi. Differenze di resa rispetto ai diversi funghi considerati.

PRIMA, DURANTE ... INVECE DEL RESTAURO

atti del congressoParma, 16-17 novembre 2012

a cura di CESMAR7Chiara Lodi e Cristiana Sburlino

Sesto congresso internazionaleCOLORE E CONSERVAZIONEmateriali e metodi nel restauro delle opere policrome mobili

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI PARMA

In copertina:P.I. Spolverini (1657-1734), Corteo del Cardinale Ulisse Gozzadini verso il Duomo di Parma in occasione delle nozze di Elisabetta Farnese,Civiche Raccolte d’arte del Comune di Parma, Municipio di Parma, olio su tela

Con il patrocinio di:

Le giornate del convegno sono state organizzate con il contributo di:

INDICE

Prima, durante… invece del restauroE. Signorini

I gemelli dissimili o: vero e falso nel confrontoE. Weddigen

Opere o feticci: restituire il senso alle coseM. Fratelli

Per un’etica del restauro: ritorno ai principiG. Bonsanti

Sostenibilità: un nuovo paradigma per il restauroM. Fratelli

Il controllo ambientale nella nuova normativa italianaed europea per la conservazione dei beni culturaliD. Camuffo

Esempi di controllo ambientale condotti all’internodel Progetto Europeo Climate For CultureC. Bertolin, D. Camuffo, A. Vergottini, I. Bighignoli, M. Tonellato

Il monitoraggio assistito per la conservazione preventivadei beni culturali: dal progetto all'applicazioneP. Mandrioli, D. Fernandez, P. De Nuntiis, L. Branzanti

Ai primordi del controllo del clima nella letteraturatecnica e negli edifici dell'Età Moderna: sistemi passivie “sistemi attivi” tra architettura e “meccanica” A. Grimoldi

Il rilievo del microclima nella Galleria d’Arte Modernadi MilanoC. Manfredi, A. Luciani, D. Del Curto, L. Valisi

La Palazzina gonzaghesca nel Bosco della Fontana(Mantova). Il monitoraggio di uno “storico” climainterno D. Del Curto

La conservazione del patrimonio storico-artistico: la necessità di un progetto integratoM. Ciatti

p. 7

p. 11

p. 29

p. 45

p. 51

p. 57

p. 67

p. 77

p. 87

p. 103

p. 115

p. 129

“Una città per gli archivi”.Digitalizzazione e conservazione preventiva: una doppia strategia per salvare la nostra memoriaM. Montanari, E. Boccedi, M. di Marco, A. Antonelli

Tüchleine of St. Nicholas of Bari (Casbas, Huesca):Preservation and Maintenance PlanG. Torres Llopis, R. Piquero Fernández

Determining the acceptable ranges of RelativeHumidity and Temperature in museums and galleriesM. F. Mecklenburg, L. Fuster López

The De-acidification of Canvas PaintingsS. Hackney

Nanomateriali per la deacidificazione di materialearchivistico e librarioR. Giorgi, G. Poggi, N. Toccafondi, P. Baglioni

pH and DP studies of painting canvasesM. Oriola, M. Strlic , G. Campo, A. Možir, A. Nualart-Torroja, C. Ruiz-Recasens

La liofilizzazione quale intervento di recuperodi volumi alluvionati ed attaccati da microfunghiF. Troiano, N. Barbabietola, P. Colaizzi, P. Livi, M. Montanari, F. Pinzari

Farnesia Arbor, opera grafica dipinta su cartafoderata: dalla caratterizzazione preliminare altrattamento di deacidificazioneA. Casoli, C. Isca, F. Romagnoli, I. Saccani, F. Saggese

Problemi conservativi ed espositivi delle operegrafiche su carta trasparente di Giuseppe Pellizza,dello Studio-Museo di VolpedoL. Montalbano, S. Micheli

Influenza delle preparazioni sul comportamentomeccanico delle teleA. Roche

The choice of consolidating materials: concerns andsolutionsR. Ploeger, E. R. de la Rie, C. McGlinchey

p. 135

p. 151

p. 165

p. 183

p. 191

p. 201

p. 209

p. 215

p. 231

p. 247

p. 261