caractérisation génétique de l'effort reproducteur de l'huître

UNIVERSITÉ DE LA ROCHELLE

ÉCOLE DOCTORALE Sciences pour l'Environnement « Gay-Lussac»

IFREMER Laboratoire de Génétique et Pothologie des Mollusques Marins (La Tremblade)

THÈSE

prés entée pa r : Emilie FLAHAUW

soutenue le 20 septembre 2013

pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université de La Rochelle

Discipline: Biologie des Organismes

Caractérisation génétique de l'effort reproducteur de l'huître creuse, Crassostrea gigas, dans le cadre des mortalités estivales de juvéniles:

JURY: Pascal FAVREL Pascale LE ROY

Pascale GARCIA Arnaud HUVET Christopher SAUVAGE

Sylvie LAPEGUE

Approche QTL.

Professeur, Université de Caen Basse-Normandie, Rapporteur Directrice de recherche, INRA, Rapporteur

Professeur, Université de La Rochelle, Examinateur Cadre de Recherche 2A, HDR, IFREMER, Examinateur Chargé de Recherche 2 nde classe, PhD, INRA, Examinateur

Cadre de Recherche 2B, HDR, IFREMER, Directeur dethèse

1

REMERel EMENTS

}/près tant a'fieures consacrées à fa préparation ae ce manuscrit, fe moment est venu ae remercier tous ceux.qui ont contri6ué(aeprès, ae foin et même a'ai[feurs .. .)àfa réafisation Ife ce travai{J J'ai attenau fe aemiermoment pour écrire cette partie parce que je pressentais l'émotion qui monterait en me remémorant ces 3 années (et un peu plus !) et qu 'i[ faffait que je garae tes iaées cfaires ae fa première l1[Jne ae fa page ae garae jusqu'au point fùzaf au résumé.

Parce que sans financement, ce travai[ n 'aurait pas pu être mené à 6ien, je tiens à remercier l' IP'8!,E9vI'E/l{et fa 'Rfgion Poitou-Cnarentes. 9vlerci égafement à l' }/gence 'Nationafe ae fa 'R§cfierche a'avoir soutmu fe projet (j}/9vI'E'l'OCfE'N'FS aa1lS fequef s'est inscrit ce sujet ae thèse.

Ce travai[ a été réaEisé au sein au La60ratoire ae (jénétique et Patno wgie aes 9vlo[[usques 9vlari11S dé fa Station IP'8!,E9vI'E'R,. ae La 'l'rem6faae. Je remercie 'l'ristan 'R§nauft, responsa6fe au LÇp jusqu'à récemment, et Jean Prou, responsa6fe ae fa Station, ae m'avoir accuei{[ze aans feur équipe.

Je tiens à exprimer ma reco nnaissance à Pascafe L e 'R,.oy et Pascaf P avre[ ae m'avoir fait l'ho 1l1zeur a'être tes rapporteurs ae ma tnèse et a'avoir consacré une partie ae feur été à Eire mon manuscrit. Je remercie égafement Pascafe Çarcia a'avoir accepté ae participer à ce jury. J 'dresse un aou6fe merci à}/rnaua Xuvet et Christopher Sauvage qui ontfaitpartie ae 1/lon comité ae tfièse et ont réponau présents pour l'évafuation finafe ae ce travail

Je sounaite remercier ma directrice ae tnèse, Sy[vie Lapègue, qui m'a accoraé sa confùlIlce en acceptant ma canailfature et aont tes nerfs ont sûrement été mis à ruae épreu.ve ces aemiers mois salis qu'effe ne faisse rien paraître. )/ titre p[us perso1l1zef, je fa remercie ae m'avoir consei[œ ae regaraer « Sur fa route ae 9vldison» ! 9vlerci égafement à Lionef ([)égremont, qui a assuré fe rôfe ae co-encaarant penaant tes aeux. premières all1zées ae ma tnèse, avant ae saccoraerulle parenthèse venaéell1ze ! (jrâce à [ui, j'ai appris tout ce qu 'i[ fa[fait savoir sur l'éfevage aes nuîtres. 9vlafheureusement, je n'ai pas réussi à apprenare à compter tes nuîtres aussi rapilfement que [ui !

Je tiens à remercier très cfiafeureusement P niEippe-Jacques Xatt qui aime partager son expérience et transmettre ses nom6reuses connaissances. J'ai vraiment apprécié nos aiscussio1lS et je garaerai toujours fe souvenir au 60n accuei[ que [ui et son épouse m'ont résel'rJé fors ae notre escafe à 'Noirmoutier.

Le soutien ad-ministratif compte pour 6eaucoup aans fa réussite a'un projet scimtifique! Je tiens aonc à remercier 9vlartine pour tes nom6reuses commana es passées, Pwrence pour sa capacité à 06tenir rapilfement aes références introuva6tes pour fe commun aes mortels, et, surtout, à 'fJéronique pour fa préparation aes missions . .. pas toujours simpfe a'organiserfe transport pour quelqu'un qui n 'a pas fe permis ae cOllauire et lIe veut pas prenare l'avion! 9vlerci égafement à Jeanne-9vlarie Œaricne qui, aepuis 'Nantes, sest toujours montrée aisponi6fepour réponare à mes premières questions concernant fa mutueffe comme à mes aernières questions concemant fa fin ae mon contrat et aont je sa[ue fagranae humanité.

Sans un matérie[ mowgique au top, ce travai[ n'aurait pas pu être accompEi. 9vlerci aonc à toute l'équipe Ife l'écwseriepour l'intenaance, fa maintenance, fa proauctionlfepnytopfancton et tes 60ns conseils! Vn merci spécia[ à 'EEise qui a toujours été présente wrsqu 'i[ faffait aes 6ras suppœmelltaires pour fes mopsies, tes comptages ou tes sorties en mer. 9vlerci également à l'équipe ae fa nurserie ae Œouin et p[us particulièrement à 9vlax, fa nounou Ife mes 6é6és fiuîtres, pour son 60n accuei[ et sa joviaEité même si« on n'aura jamais fa pface pour caser tout ça ! ».

3

La force de ['équipe génétique, ce sont ses deuJ(Super-'fectinicietls (oui oui, comme des Super,Héros ... enmieu.,c!). If Y a d'a60rdpforence: Ca rapUfité de IBip-IBip associée à l'inventivité de '0f Coyote! Sans eCfe, mes huîtres n'auraient pas francfii fe cap de Ca fo.ation avec succès: if faffait au moins ['intervention de Ca tornade pfo pourannufer {es effets de Ca tempêteXy"tfiia ! 'Merci égafement de m'avoir guidée pour ma première <PC<]{.: je m 'en faisais une montagne mais,finalement,j'y ai pris goût! 'Et puis, if y a Serge, mon cofocataire pelldant 3 ans: Ca sagesse d';ll.f6us <Dum6fedore associée à Ca productivité d'Jfermione granger. Ce fut un réeC pCaisirde travai{fer à ses côtés, dans un caEme apaisant! grâce à fui, j'ai pris COllScietlce de mon addiction pour fes post-it . .. de toutes fes formes et de toutes fes coufeurs (et surtout pfein de coufeurs partout, tout fe temps !)! 'Merci d'avoir su me faire une pCace parmi fes cartons d'ordinateurs, fes 60îtes de fogiciefs et fes coffections d'échanti{fons !

Je tiens égarement à remercier fes autres équipes de CaStation : ['équipe « pattio », et notamment :Nieofe et <Phifippe pour fes commandes passées, paifois ell urgence; ['équipe de Ca ce{{ufe tlnafytique, et notamment IBruno et 'EmmallueCfe pour feurs 1l0m6reuJ(conseifs en tiistofogie; ['équipe du L'E!J(-<PC et pfus particulièrement Jean-Luc Seugllet, qui a pifoté fe 6ateau à cfiacune de mes sorties en mer et m'a toujours fait remo nter à 60 rd avant d'avoir de ['eau par -dessus mes cuissardes. 'Merci égafement à Sywù; 'fairrade dont fes écCats de voi:(1Il'ont souvent fait sourire (ou sursauter !) et aUJ( << anciens» dont ['tiumour et fes anecdotes ont fait de ctiaque repas, un vrai moment de détente.

L 'tiistofogie tryant été une découverte, je tiens à remercier }lmaud (finalement, ce sera un tripfe merci !) qui m'a proposé de passer une semaine au L<P l de IBrest pour apprendre à interpréter fes Cames d'fiistofogie avec '0rgife! 'Merci donc à '0rgife pour sa patience et Ca quafité de ses ex:pfications. 'Et merci à <Pierre Œoudry, responsa6fe du L<PI, d'avoir accepté de m'accueiffir ! }lu cours de ces 3 ans, nous nous sommes rencontrés à pfusieurs reprises et je reste impressionnée par sa cuEture et sa curiosité scietltifiques !

Je tiellS égaremellt à remercier fes «llOn-ifreménims» qui Ollt contri6ué à mon travaif de tfièse: }lrmeC(])aveneC et Stéphane ~ueCfec, de ['I~'PE}I de Cflsllnes, pourfeurinvestissement dans feprojet « l'lI.;M des huîtres » même si «e{fes sont trop petites » ou qu '« e{fes coincent Ca Euffe » ; Prédéric 'Martins, de Ca pCatiforme de géllotypage qenotouf, qui a formé Serge au gétlOtypage des S:N<Ps sur mes fiuîtres, et CtiristoptieŒoury, de Ca pCatiforme genome 'franscriptome de IBordeaw;, qui agénotypé Ca delV(jème série d'tiuîtres maliJré des concentrations ell}l(]):Nfai6fes, nuffes voire négatives (oui oui, c'est un magicien !).

Ifs n'ont été que de passage au L g<P mais feur contri6utionfut précieuse! 'Merci à <Pfiifippe Laporte de m'avoir appris à« ouvrir fes fiuîtres comme une fiffe» . grâce à fui, je pezvifrimer un peu à :Nod! 'Merci à 'fallguyet Caro fine pour fes nom6reU)(services qu'ifs m'ont rendus au cours de mL! première « grosse manip »,

merci aussi à Prançois, qui m 'a men fait rire pendant fe contrôfe par Ca gelldannerie au retour de Œouin . .. c'est vrai qu'if avait fes ylJllX.. rouges mais c'était uniquement de Ca fatigue (contraiflJlnent aUJ(accusations de Lioner; nous n'avions pas dormi pendant fe trajet affer ... à peine somnofé, peut-être, mais seufement queCques minutes !), c'est vrai que Ca vignette d'assurance n'était pas Ca 601l11e mais ce n'était pas sa faute! 'Merci égafement à Cécife et 'RSJ1lzain qui ont i{{uminé fe Ca60 de « ma mof» par feur gentiffesse et feur joie de vivre . .. 'Et je garde fe mei«eur pour Ca fin, un énorme merci à mon stagiaire priféré, Œrieg, qui a 6ien fai{{j camper dans Ca saffe du séquenceur et dont fes petits post-it (encore euJ(!) lIl'ont manqué après son départ !

Vn merci, peut-être originaf mais qui me tient à cœur, pour ce travai{ de thèse qui m'a amenée à repousser mes propres fi1llites, que ce soit en touchant des animaw;, en voyageant seufe pour Ca première fois ou 6ien IJll prenant Ca parofe en pu6fic. CeU)( qui me connaissent savent à queC point tout ceCa est surprenant !

4

Quitter mon :Nora nata{ n'a pas été fadfe mais, fieureusement, âes mon arrivée ell Charente maritime, j'ai rencontré aes gens formiaa6fes ! Je tie/lS aonc à remercier :Marie-Cfauae et Cfauae, aes agents immo 6i{iers au grana cœur qui ont accoraé Feur c01ifiallce à un coupfe ae « petits jeunes », ainsi que fes atfora6fes commerçallts ae fa !Presqu 'îfe a')!l'vert, <R...osa et 1J)0minique, pour feurs succufelltes pizzas et José et rJ(psefyne, pour feurs aéEiciew;ftuits et figumes en toute saison!

)/ rJ(pnce-fes-Œai/lS, c'est 6iell connu, (es rues ne sont pas vraiment peupfies penaant ffiiver ! J'ai pourtant eu fa cfiallce a'avoir aes voisi/lS e:tœptionnefs " merci à fa fami{fe !Pfaza, sans qui je n'aurais jamais rencontré mon présentateur favori; merci à :Monsieur :Moreau qui est capa6fe ae soutenir qu'i{ne pfeut jamais en Charente maritime avec un parap(uie à fa main; et e/ifin, merci à lJ)efphine, IJ)jmitri, :Margot et 't'ae{ pour nos fongues aiscussio/lS autour au gri(fage (fes pauvres pfants ae tomates ont souffert ae fa soif pmaant que nous pfaisantions au fieu ae fes arroser !) et pour fe « pets sitting» penaant fes vacanCes !

'Et 6ien sûr, i{ y a tous ceUJ(qui m'ont ellcouragée aans ce projet foumafnré Feur peille ae me voir partir à 800li.Jn a'elO\! Vn grana merci à 'M,flaeEine qui a quitté fa recfiercfie pour fenseignement mais qui reste fa seufe personne ae mon entourage à vraiment comprenare ae quoi i{ s'agit quanaje parfe ae Q'TL et ae pfiénotypage . . . :Merci a'être toujours présente, mafnré fa aistance ! :Merci égafement à mes trois autres «'Emi[œ's)/ngefs », Cfiarfotte (aEias Couz 'a')!mour), lJ)efpfiine (Ina sœur) et Sopfiie (aEias 'Wonaerwoma1~ qui m'ont aiaée à mener ae front fa réaaction ae ce lIUlnUSCrit et fa préparation au procfiain grana événement ae ma vie. Leurs icfées, conseifs, avü ... m'ont permis a'avancer sans négEigermon travaiO

Je suis très reconnaissante à mes 6eaUJ(-parents qui ont toujours été a 'un grana soutien mafnré féfoignement ae Feur fifs unique! :Merci pour fe 6rico{age, fe jartfinage, fes nom6reUJ(aéménagemmts, fa recette au ta60ufi . .. votre présence fe jour ae ma soutmance !

f{ne sait pas Eire mais son arrivée aans ma vie m'a permis ae surmonter ma plus granae peur. (Parce qu'i{ne m'a jamais tenu rigueur ae ma mauvaise humeur et que son regara ae coc!?!r peut suffire à me faire sourire, merci à Pfoya!

'Elifin, je aétfie tout ce travail à ceUJ(qui ont ta ujours cru en moi et sans qui je n'aurais jamais pu , • J ••

arnver Jusqu ICI.

'Tout a 'a60ra, àmes parents qui m'ont apporté Feur soutienfinancier et (surtout 1) mora{ aepuis ma naissance. J 'ai compris en regaraant autour ae moi que ce n 'était pas fa règfe mais une diance e:tœptionneffe! Leur fierté est ma plus 6erfe récompe/lSe ! Ces quefques {ignes ne suffiront pas à feur eJ([irimer toute ma gratituae.

'Et je tenninerai ces remerciemetlts par ce[ui qui partage ma vie aepuis 11 ans (aéjà ?!),' :Matfiieu qui m'a encouragée à postufer à cette offre ae tfièse. Je ne sais pas colm/lent fe remercier pour toutes fes vaisseffes, fes passages a'aspirateur, fes préparations ae repas qu 'if a assurés aepuis fe aé6ut ae cette thèse (et etlcore p[usvers fa fin !), pour son soutien sallsfai[fe forsque f éfoignement aes miens aevenait trop foura à porter seufe et surtout, pour sa aemanae en mariage inattmaue mais profonaément espérée, ce soir au 18 janvier 2012, sur fe ponton ae rJ(pnce-fes-Œains!)/ aeUJG nousformons une équipe soEicfe !

!Pour concfure ces quefques pages, Une pensée spéciafe à 'Tata Sy[vie qui, pour fa première fois, n'a pas pu 60ire «une coupette » pour fêter ma réussite! 'Tu me manques . ..

5

SOMMAIRE

Introduction générale ....................... ... ......................................................................................... 17

1. Dans un contexte de mortalités massives de naissain .................................................... 18 2. Biologie de l'espèce .......... ...................................................................................... ........... 21

2.1. Systématique ............. ................................... .. ......... ...................... ............................. 21 2.2. Un cydedevie marqué par les mortalités .................................. ............................. 21 2.3. Une anatomie tournée vers la reproduction ...... .. ............................. ...................... 24 2.4. Une reproduction encore mystérieuse ...... ........................................................... .. .. 25

2.4.1. Déterminismesexuel ..... ............ ......................................................................... 25 2.4.2. Développement de la gonade ............................................................................ 27 2.4.3. Notion d'effort reproducteur .................................................. ................ ........ .. 27 2.4.4. lien avec les mortalités estivales .......................................... ............................ 28

2.5. Génome ........................ ......... ...... ......... ............. ... ...................... ................................. 30 3. RecherchedeQTLschezles organismes marins ................ ............ ........ ......................... 31

3.1. Principe de la recherche de QTls ...... .. ...................................................... .......... .... .. 32 3.2. Caractères d'intérêt chez les espèces aquacoles ........................... .......................... 35 3.3. QTLs détectés chez Crassostrea Gigas ........................................ ........ ........ ........ ...... 35

4. Plandela thèse ........................... ............ ...................................... .... ................................. 37

Pa rti el: De nouvea ux outils pour ca ra ctéris er l'effort reprod ucteur ....................................... 40

1. Un matériel biologique particulier: les familles F2 .... ...... ............ ........ .................. ......... 40 1.1. Choix des grands-parents: la génération FO ............................................................ 40 1.2. Production des parents: la génération Fl ............................................................. ..40 1.3. Production du matériel biologique de l'étude :Ia génération F2 ........................... 41

1.3.1. Choix des géniteurs ................. ........................................................................... 41 1.3.2. Croisement... ............................................................. .......................................... 42 1.3.3. Obtention des gamètes etfécondation ............ ...... .................... .... .................. 44 1.3.4. Elevage larvaire ................................................. ............ ...................................... 44 1.3.5. Micro-nurserie ............................................................................ .................... .... 45 1.3.6. Nurserie ............................................... .......... .. .............. ...................................... 46 1.3.7. Tests desurvie .................................................................................................... 46

2. Nouveaux outils moléculaires: recherche des marqueurs et génotypage ................... 47 2.1 . Les marqueurs microsatellites .. ................... ........ ... .................................................. 47

2.1.1. Choix des marqueurs .................................................. ................................ .. ...... 47 2.1.2. Génotypage des marqueurs microsatellites ... ............................................. .. ... 50 2.1.3 . Une utilisation des marqueurs microsatellites : l 'assignation de parenté ... .. 53

2.2. Les marqueurs SNPs .. ..... ....... .......... ......... ............... ........ ............ .... ........................... 54 2.2.1. Choix des marqueurs SNPs ............................... .. .......................... .... .... .. .. .. ....... 54 2.2.2. Génotypage des marqueurs SNPs ................... .. ................................................ 55 2.2.3. Dosage de l'ADN par mesure de la fi uorescence ............................................. 55 2.2.4. Développement des marqueurs SNPs .......... ..................... .... .. .......................... 55

7

3. Nouvell e technique de suivi de 1 a ga métogenèse : 1'1 magerie pa r Résonance Magnétique ........ ...................... ........................... .. ...................................... ........... ....... .. ......... 69

3.1. Contexte ................ ... ......................................... .......................................................... 69 3.2. L'imageriepar Résonance Magnétique ............... .......................... .. ...................... ... 69

3.3. Validation de la technique d'I magerie par Résonance Magnétique ...................... 71 3.3.1. Principaux rés ultats détaillés dans l 'arti cl e 2 ........................ .................... ... .. .. 71 3.3.2. Correction des incertitudes ................................ ............................. .................. 72 3.3.3. Article 2 : « Gonad volume assessment i nthe oyster Crassostrea gigas:

Compa rison between a histological method a nd a magnetic resonance imaging (MRI) method » .............................. ..... .. ................... ......... ........ ................ ............ .......... 73

Partie Il : Caractérisation phénotypique des familles au cours dela gamétogenèse .. ... ......... 79

1. L'histol ogi e quanti tative, une obs ervation ponctuell e et destructive ................ ........... 80 1.1. Méthode ........................................................... .......... ................................................ 80

1.1.1. Préparati on des la mes ........................................................................................ 80 1.1.2. Analyse d'i mages ........ ..................................... ........ ... .................. .. .................... 82

1.1.2.1. Analyse qualitative ............ .......................................................... ......... .. ........... ..... 82 1.1.2.2 . Analyse quantitative ........................................ ..................................... ................. 83

1.2. Résultats .......... ................ ............... ............................ ..... ......... ....................... ........... 84 1.2.1. Analyse qualitative des lames d'histologie .................... ............... .. .................. 84

1.2.2. Analyse qua ntitative des lames d'histologie ................................ .................... 84 2. L' I mageri e pa r Résonance Magnétique, un suivi temporel non destructif ................... 86

2.1. Principaux résultats détaillés dans l 'article3 ...................... ..................................... 86 2.2 . Article 3 :Temporal monitoring ofthe ga metogenesis i nthe Pacifie oyster,

Crassostrea gigas, by Magneti c Resonance Imaging (MRI) ............................................. 87 2.2.1. Introduction ............ .... .................... .... ...... ........................................ .. ............ .... 88 2.2.2. Materials and methods ................. .......... ...... .......................... ......... .................. 89 2.2.3. Results ............................................ ................................................. ......... ........... 93

2.2.4. Discussion and conclusions ........... ................................................................... 101

Pa rti e III : Ca ra ctérisa ti on généti que de l'effort reproducteur ............................... .......... ...... . 108

1. Préambule .......................................................... ............ .......... ... ............ ... ...................... 108

2. Arti cl e 4: Détection de QTLde l'effort reproducteur chez l'huître creuse, Crassostrea gigas ................. ............................... ................................. ............................. ........ ... ........ .... .. . 108

2.1. Introduction ........................................................................ .. .. ............................ ... ... 108 2.2. Matériel et Méthodes ........................................................................................ ...... 110

2.2.1. Matériel biologique .. .. ...................................................................................... 110 2.2.2. Suivi de la ga métogenèse par Imagerie par Résona nce Magnétique ........... l11 2.2.3. Analyse des images IRM ................................................................................... 112

2.2.4. Observation de la gamétogenèse pa r histologie ........................ ...... .............. l13 2.2.5. Marqueurs moléculaires etgénotypage .... .......... ...... ............ .. ...................... . 114 2.2.6. Cartographie génétique ................................................................................... 114

2.3. Résultats ........ ..................................................... ....... .. ..................................... ... ..... 115

8

2.3.1. Suivi dela gamétogenèse par IRM .............. .................................................... 115 2.3.2 . Suivi dela gamétogenèse par histologie .......... .............................................. 116 2.3.3. Marqueurs moléculaires et génotypage ...... ................................................... 117 2.3.4. Cartographie génétique ................................ ................................................... 117

2.3.5. Détection de QTL.. ........................................................................................... . 123 2.4. Discussion ......................... .... .. .................. .. .................... ......... ................................. 130 2.5. Remerciements ..................................................................................... ... .. ... ... ........ 132 2.6. Références ................... ........ ............. .... ................. ............ .................. ............ ......... 132

PartielV:Contributions de cette étude à la caractérisation génétique de la réponse aux mortalités estivales .......... ........ ... .... ................... ................ .. ... ............... ... .. ................................ 137

1. Préambule ............... .... ........................... .......................................................................... 137

2. Articl eS: Détecti on de QTLde réponse a ux mortalités estivales chez l'huître creuse, Crassostrea gigas ........................................................................ ...... ...................................... 13 7

2.1. Introduction ................................................................ ... ...... ............. ........................ 137 2.2. Matériel et Méthodes ....................................................................................... ....... 139

2.2.1. Matériel biologique .. ....... ...................... ..... ............ .......... ... ... ............. ... ........ .. 139 2.2.2. Suivi de la mortalité au cours d'un épisode de mortalité estivale ................ 139 2.2.3. Mesure de la charge virale pa r PCR qua ntitative .............................. ............. 140 2.2.4. Marqueurs moléculaires etgénotypagesélectif.. .... ...................................... 140

2.2.5. Cartographie génétique ................................................................................... 141 2.2 .6. Détection de QTL. ...................................... .. ................ ........................... ... ....... 141

2.3. Résultats ................................................. ............................. ..................................... 142 2.3.1 . Suivi de la mortalité ................................................ ..................... ..................... 142 2.3.2. Mesure de la charge viral e .. ............................................................................. 145 2.3.3. Marqueurs moléculaires et gén otypage .. .. .. ................................................... 145 2.3.4. Cartographie génétique ............................................ ........................ ............... 146 2.3.5. Détection de QTLs ...... ............... .. ................... ............. .............................. .... ... 151

2.4. Discussion ........ ................................ ... ........... ....... ............ ...................... .................. 154 2.5. Remerciements ................................................ ................................... .... .... .. ........... 155 2.6. Références .................... .... ................................ ................................... .. .... .. .. ........... 155

Conclusion générale et Perspectives ....... ... ........... .................................................................... 160

1. Synthèsedes résultats ............................................................................... ................. .. ... 160 1.1. Meill eure connaissance du ca ractère« effort reproducteur » ...... .. ..................... 160 1.2. Meilleureconnaissance génétique des caractères étudiés .......... ........................ 162

1.2.1. Apportdecette étudeà la connaissance du ca ractère« survieaux mortalités estival es » ...... .................... ... ... ...................................................................................... 162 1.2.2. Proxi mité des QTLs impliqués dans 1 a survie et des QTLs impliqués da ns l 'effort reproducteu r .......................... .. ........................................................................ 163

2. Perspectives ........ ..... ........................................................................................................ 166 2.1. La Nouvelle Génération deSéquençage .......................... ........................... .... ........ 166 2.2. Apport du séquençage du génome de l'huître creuse ............ .... .......................... 166

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2.3 . Utilisation des QTLs détectés dans un programmedesélection .. .... ........... .. ....... 167

Bibliographie hors articles ............. ................... .............. ... .......... .. ... .. ........................................ 170

Annexe 1 : Extraction d'ADN avec le kitQIAamp DNA Mini Kitde Qiagen ... ... ... .................... 180

Annexe 2 : Protocole d'a mplification de l'ADN par PCR en simpl exe .... .......... .... .......... ... ... .. . 181

Annexe 3 : Protocole d'a mplification de l'ADN par PCR en multi plexe ....... ... ... ....... .. ... ..... ..... 182

Annexe4 : Protocol e de dosage de l'ADN par mes ure de la fl uorescence .... ... ...................... 183

Annexes 5: Liste des 384 SNPs génotypés pour les articles 1 et5 .............. ......................... ... 184

Annexe6 : Annotation des 384 SNPs génotypés dans les articles 1 et5 ........ .... .................... 196

Annexe7: Préparation des lames d'histologie ... ............. ..... ... .......... .............................. ......... 203

Annexe8 : Liste des 384 SNPs génotypés dans l 'article4 ....... ..... ... ... ............................. ......... 204

Valorisation des travaux de thèse ... .. ... ............. ........ .......................... ....... ....... .... .. ........ .. .. .... ... 218

Abstract. .............................................................. ...... .. .... ................... .. .. ................. ............. ... ..... 220

Résumé ....................................................... .... ... ............ ...... .............. ...................... .......... .......... 221

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TABLE DES FIGURES

Figure 1. Productions annuelles mondiale, européenne etfrançaised'huÎtres creuses,

Crassostrea gigas, de 1950 à 2011selon l'Organisation des Nations Unies pour l'a limentation

et l'a gri cul ture (FAO, 2013 ) . .................... .............. .............................................. ...................... ... 17

Figure 2. Répa rtition des productions mondiale et européenne 2011 d'huîtres creuses,

Crassostrea gigas, selon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l 'agriculture

(FAO, 2013) ..... ............................................................................................................................... 18

Figure 3. Mortalités moyennes d'huîtres creuses, Crassostrea gigas, de 1995 à 2012. D'a près

1 es données d es rés ea ux REMO RA et RESCO - Ifremer ..................................................... .. .... .. 19

Figure 4. Taux de mortalité des lignées « sensibles » et des lignées « résistantes» en

co mpa raiso n à des lots d'h UÎtres témoi ns di pl o'ldes ettri pl oïdes ...... .. .. .. ................ ...... ........... 20

Figure 5. Cycl e de vi e de Crassostrea gi gas. (D'a près Dégremont, 2003 ) .................... ............. 23

Figure 6. Ana tomi e dei' huître creus e a dul te (1 fremer) ....... ................................... ................... 24

Figure 7 .Esti mati on semi-quantitative du pourcentage de surface gonadi que détermi né pa r

hi stologie d'huîtres « résistantes » et d'huît res « sensibles» a ux mortalités estivales. D'a près

Sa main et al. 2007 ........... ................. ................................. ................ .................. .. .... .................... 29

Figure 8.Esti mation de 1 as urface gonadique moyenne de 51 ignées d'huîtres « sensi bles » et

de 5 lignées d'huîtres « résistantes » aux mortalités es tivales . D'après Huvet etaI., 2010 .... 29

Figure 9. Densité de distribution du polymorphismechezCrassostrea gigas estimé par des

fenêtres glissantes mais non-cheva ucha ntes de 10 kb (Zhang et al., 2012) ...................... ....... 31

Figure 10. Détection deQTl par la méthode "marqueur par marqueur" ............. ................... 33

Figure 11. Princi pe de détection d'un QTl pa r la méthode de cartographie d'i ntervalle ....... 34

11

Figure 12. QTls impliqués dansl a réponse a ux mortalités estivales et 1 a chargevi raie en virus

Os HV-1. D'a près Sauvage et al., 2010 ...... .................................................... ........................... ..... 36

Figure 13. Réponse aux mortalités estivales en foncti on de la date de mise sur estra n des

fa mi Il es F1 ayant une des cen dan ce F2 ........................................................................................ 42

Figure 14. P ra fi Is d 'abs orban ce de 2 écha ntillons d'ADN dis ti ncts . .. ............. , .. ........................ 51

Figu re 15. Dosa ge dei 'AD N de 8 éc hanti Il ons ..... .. ..................................................................... 5 2

Figure 16. Si emens Ava nto 1,5 T.. ................................................................................................. 70

Figure 17. Antenn e tête ................................................................................................................ 70

Figure 18. Système de plateaux conçu pour l'i ma geri e des huîtres .......................................... 71

Figure 19. Images obtenues par IRM de deux huîtres creuses matures ................................... 71

Figure 20. Corrélation entre 1 a surface gonadique esti mée sur les coupes histologi ques et le

vol ume gonadi que esti mé à parti r des images IRM ............... ...... .. .................. .......... ................ 72

Figure 21. Empla cement de la cou pe his tologi qu e ...... .............................................................. 81

Figure 22. Etapes de traitement d'une coupe histologique numérisée afin d'estimer le

ra pp ort gona d 0-5 0 ma tiq ue .......................................................................................................... 83

Figure 23. 5 ex-ra ti 0 des fa mi Il es F2-19 et F2 -21.. ....................................................................... 84

Figure 24. Gra phes des moyennes du rapport gonado-5omatique pour 1 es fami Il es F2-19 et

F2-21 ...................... ........................................................................................................... ............. 85

Figure 25. Distributions du ra pport gonado-5omatique au sei n des familles F2 -19 et F2-21. 85

Figure 26. Distribution du rapport gonado-somatique en fonction du sexe au sei n de la

fa mi Il e 19 ....................................................................................................................................... 86

12

Figure 27. Descri ption of the maturation stages based on MRI images ................................... 94

Figure 28. Distribution of ma turati on stages over ti me ............................................................. 95

Figure 29. Dateofspawningfor studiedoysters in 2011 compared to date of spawning of

standard oysters in 2011 and 2012 .............................................................................................. 96

Figure 30. Distribution ofsex changes between 2011and 2012 ........... .................... .. .......... ... 97

Figure 31. Mortality rate i n 2011 for studied and sta nda rd oysters .............. .. .............. ........... 99

Figure 32. Evolution ofseawatertemperaturein 2011and 2012 ....... ....................... .... ... ..... 100

Figure 33. Production des familles expérimentales ........... ............... ................. .. ... ................. 111

Figure 34. Ca rte généti que combi née de Crassostrea gigas. centi Morga ns (cM).

Figure 35. Ci nétique de mortalité du naissa inde 12 fa mi Iles F2 a u cours d'un épisode de

mortalité estival e en août 2010 ......................... ............. ........................ ................................... 142

Figure 36. Ta ux de mortalité de 12 familles F2 a u cours d'un épisode de mortalité estivale

survenu en août 2010 da ns un bassin expérimental ....................... ...... ................................... 143

Figure 37. Taux de mortalité de 21 fa milles F2 a u cours d'un épisode de morta 1 ité estivale

survenu en août 2010 sur estran ... ........ ........ ........................................................................ .... 144

Figure 38. Corrélation entre le ta ux de morta 1 ité obtenu s ur estran et 1 e taux de morta 1 ité

obtenu en bassin expérimental a u cours d'un ép isode de morta lité estiva le survenu en août

2010 ............. ........ ..... .................................................................................................................... 144

Figure 39. Ca rte génétique combinée de Crassostrea gigas ............................................ ....... 148

Figure 40. Evolution du volume gonadique a u cours des 6 sessi ons d'I RM de 2011 pour 6

individus appartenantà la famille F2-18 ..... .............................................. .. .. ............................ 161

13

Figure 41. Ca rte généti que combinée « Survi e» et « Effort reproducteu r » ............... ...... .... 164

Figure 42. Modél isati on de l'effet d'un QTLdans un schéma de sélection classique (à gauche)

et sur un schéma combiné {à droite) .......... ........................................................................... .... l67

14

TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1. Origine des familles Fl .. ............................................................................................. 41

Tableau 2. Producti on des fa mill es F2 ............................................ .. ............................ .. .. .. ......... 43

Tableau 3. Taille de maill e de tamis et opérations en sali e d'éi evage larvaire ............. .. ....... ..45

Tableau 4 Les marqueurs microsatellites multi pl exés ........ .......................... .. ........ .. .. .... .......... .48

Tableau 5. Les marqueurs microsatellites en simpl exe (Pontreau, 2012) .. .... .................... .. .... 49

Tableau 6. Caractéristiques des stades de maturité de la gonage de l'huître creuse Crassostrea gigas ................... .............. .............................................................................. 82

Table 7. Gender-related specificiti es ................... .. .......... .. .......................................................... 97

Tableau 8. Coefficients de corrélation de Pearson entre l'indice de chair et l'indice gonadique estimés par 1 RM sur la famille F218 et statistiques descriptives de l'i ndi ce gonadique .. ............................................................................................... ............... .. ...... 116

Tableau 9. Ca ra ctéristiques des cartes généti ques combinée (a) et des fa milles F2-18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d) ................................... .. ................. ...................................................... 118

Tableau 10. Rés ultats des recherches de QTLs impli qués da ns la ga métogenèse de l'huître creuse, Crassostrea gigas, s ur les groupes de 1 iaison (GL) des cartes des fa milles F2 -18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d) ........ .... ........................................................ .... .. .... .. .. .... ...... .... 126

Tableau 11. Statistiques descriptives dela chargevirale pour les 3 familles F2 étudiées .... 145

Tableau 12. Ca ractéristiques des cartes généti ques combi née (a) et des fa mi Il es F2 -18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d) .............................................................................. ........................ 147

Tableau 13. Résultats des recherches de QTLs impliqués dans la réponse aux mortalités estivalesdel'huÎtrecreuse,Crassostrea gigas, sur les groupes de liaison (GL) des cartes des familles F2-18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d) ........................ ............................. 153

15

INTRODUCTION GENERALE

En 2011, la production mondiale d'huître creuse j a pona ise, Crassostrea gigas, s'est

él evée à 4,4 mi Ilions de tonnes (FAO, 2013 et Figure 1), L'Asie est le 1"' producteur avec plus

96% de la production mondiale; l'Europe arrive en 2ème position avec environ 2,5%, La

production française, avec ses 95 000 tonnes produites en 2011, représente 87% de la

production européenne (Figure 2), L'huître creuse, Crassostrea gigas, est donc une es pèce

d'intérêtéconomiquetantau niveaumondial qu'aux niveaux européen etfrançais ; c'est

pourquoi les mortalités massives de C. gigassont étudiées depuis de nombreuses années,

5

4,5 -VI 4 QJ

c: 15 3,5 ... QJ

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c: :: 2,5 E - 2 c: 0

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LJ1 LJ1

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o CD Cl'> M

LJ1 CD

~ Année

Monde

• Europe

• France

Figure 1. Productions annuelles mondiale} européenne etfrançaise d'huîtres creuses, Crassostrea gigas, de 1950 à 2011 se lon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO,2013),

17

~ OCEA,NIE : 0,19%

France : 87%"\

AMERIQUE : 0,95%

Irlande : 7%

Pays-Bas: 3%

~ ~,,,,e> pays européens :3%

Figure 2. Répartition des productions mondiale et européenne 2011 d'huîtres creuses, Crassostrea gigas, selon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FA 0, 2013).

1. Dans un contexte de mortalités massives de naissain

Les premières mortalités estivales d'huîtres creuses ont été enregistrées dès 1915 sur

1 es côtes du Ja pon (Ta keuchi et a 1.,1960). A 1 a fi n des années 1950, des mortalités estival es

apparaissent sur la côte Ouest des Etats-Unis (GI ude 1975; Mori 1979). Les mortal ités sont

alors associées à la surpopulation des bassins de productions aqua col es et aux conditi ons

environnementales _ richesse en phytoplancton et température élevée de l'eau de mer

(lipovsky et Chew, 1972) _ en période de gamétogenèse (Beattie et al. 1980).

Sur les côtes françaises, des mortalités estivales ont été enregi strées dès les années

1980 (Maurer et al. 1986; Bodoy et al. 1990; Soletchnik et al. 1999). Des études sur ces

mortalités ont mis en évidence qu'elles résultaient d'une conjugaison de facteurs

envi ronnementaux (température de l'eau et richesse en nutriments). infectieux (associati on

de Vibriosplendidus et VibrioiFstuarianus dans de nombreux épisodes de mortalités

estivales) et physiologiques (gamétogenèse, système immunitaire).

18

Depuis 2008, les mortalités estivales se sont accentuées et menacent essentiellement

1 es juvén iles de Crassostreo gigas. Le renforcement du phénomène des mortalités estival es,

nommée « morta lités massives », menace ce pa n importantde l'économie aquacole (Figure

3):selon leConseil National Conchyl i cole, en France, 130000 tonnes éta ient produites

chaque année jusqu'en 2009 mais, en 2010 et 2011, la production ne s'est élevée qu'à

80000 tonnes (95000 selon l 'organ isation des Nations Un ies pour l 'Alimentation et

l'Agriculture). Face à cet enjeu, 1 es compétences scientifiques ont été mobi lisées et ont déjà

apporté de nombreuses réponses.

100 ~

'* - 90 VI CIl VI :1 80 CIl ~ u VI 70 E!

,+:. :1 60

oC ~ VI CIl

50 c: c: 40 !!t 0

. 18 mois

• Naissain

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~~~~~####~######~~ Année

Figure 3. Mortalités moyennes d'huîtres creuses, Crassostrea gigas, de 1995 à 2012. Depuis 2008 len rouge), le taux de mortalité du naissain a significativement augmenté. Le calcul tient compte des données de mortalités d'huîtres diploïdes, triploïdes, issues de captage naturel et de production en éc/oserie. Le calcul des écarts-types étant biaisé par le changement de protocole entre 2008 et 2009, les écarts-

types ne sont pas représentés. D'après les données des réseaux REMORA et RESCO -IJremer.

En effet, a u cours des épi sodes de mortalités mas s ives d'huîtres creuses j uvéni 1 es

entre 2001 et 2003, uneforte héritabilité de la s urvi e _ comprise entre 0,4 7 et 1,08 _ a été

mise en évi dence (Dégremont et a 1.,2007 et 2010). Celle-ci résulte d'une forte composa nte

génétique de la résistance/sensibilité à ce phénomène et a permis de sélectionner des

19

individus présentant un mei lieur taux de survie, les 1 ignées dites R, et d'a utres un taux de

survie pl us faible, lignées dites 5 (Dégremont et al., 2010 et Figure 4). Plus récemment, 1 e

testage des lots contrastés etsél ectionnés en 2001 confirme 1 e différenti el de s urvi e entre

les lignées dans le contexte des mortalités massives du naissain observées depuis 2008

(Dégremont, 2011).

100

80

~ 60 • .• . " " t: 0 :.

40

20

0

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Figure 4. Taux de mortalité des /ignées « sensibles )} (en rouge) e t des lignées « résistantes )} (en ble u) en comparaison à des lots d'hUÎtres témoins diploïdes (en vert) et triploïdes (en rose).

Des agents pathogènes sont régulièrement impliqués da ns les épisodes de mortalité

de coquill ages. En Fra nce, 1 a bactéri e Vibrio splendidus et 1 e vi rus Ostreid Herpes Virus 1

(Os HV-1) sont le pl us souvent associés a uxépisodes de mortalités massives d'huîtres creuses

juvéniles (Lacoste et al., 2001; Le Roux et a 1.,2002; Dégremont, 2011; Ga rci a et al., 2011).

L'OsHV-l est un vi rus à ADN appartenant à 1 a famille des Malacoherpesvi ridae (Davison et

a 1.,2009).11 a été purifié à partir de larves de Crassostreo gigas infectées naturell ement (Le

Deuff et Renault, 1999) et son génome a été entièrement séquencé: il s'agit d'un ADN

linéaire double brin de 207 kb codant au 124 gènes (Davison et al., 2005). Un variant

d'OsHV-1, caractérisé par deux mutations non-synonymes au sein d'une même région

codante du génome, semble être impliqué dans l'amplification du phénomène des

20

morta 1 ités estivales observée depuis 2008 : l'OsHV-1J.lvar(Sega rra et al., 2010). Dégremont

et al. (2011) ont démontré que les individus sélectionnés R sont capables de ralentir

l 'a ugmentation de la charge virale en OsHV-l da ns leurs tissus puisde la faire régresser sous

le seuil technique de détection du virus par PCR quantitative.

Actuellement, les recherches concernent essentiellement les mortalités estivales

mass ives dej uvéniles. Cependant, il existe des mortalités à toutes les éta pes du cycle devi e.

2. Biologie de l'espèce 2.1. Systématique

L'huître Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) est coura mment appelée huître creuse

du Pacifique ou huître japonaise. Il s'agit d'un mollusque bivalve dont la position

systématique a été définie par Grassé (1960) de la façon suivante:

Règne Anima/ia Etre vivant hétérotrophe, qui se nourrit de substances orga ni ques

Embranchement Mal/usea Animal invertébré, masse viscérale protégée par un manteau sécrétant une coquille calcaire

Classe Biva/via Coqui Ile composée de deux pa rties disti nctes, 1 es va Ives, réunies par une charnière en permettant l'ouverture.

Ordre Filibranchia Fi laments des branchies à jonctions ciliaires

Sous-ordre Pteriamarphia Coquille sessile (fi xée à un substrat dur) et charnière dysodonte (dépourvue de dents)

Super famille Ostreaidea Coquille inéquivalve Famille Ostreidae Valve gauche plus profonde que la droite Genre Crassostrea Valve gauche creuse, espèce dioïque Espèce gigas . ,

2.2. Un cycle de vie marque par les mortahtes

Le cycl e de vi e de l'huître creuse (Figure 5) se compose de deux phases caractérisées

par une différence d'habitat: 1 a phase 1 a rvai re est pél agi que (la 1 a rve se déplace dans la

colonne d'eau) tandis que le reste de la vie est benthique (à partir du stade juvénile,

l ' i ndivi du vit fi xé sur un substrat). Dès la premi ère a nnée du cycl e de vie, 1 es i ndivi dus

entrent en gamétogenèse. Lorsque les conditions de température et de nourriture sont

suffisantes, les gonades a rrivent à maturité au début de l 'été. L'huître creuse éta nt ovi pa re,

21

les gamètes mâles etfemell es sont émis dans le mil i eu pour donner 1 i eu à 1 a fécondation

externe.

Au bout de 24h, 1 a larve est protégée par une coquille dont 1 a forme 1 ui va ut le nom

de « larve D» ; elle se nourrit et se déplace grâce à son velum. Au cours des premières

semai nes de vie, la qualité des ga mètes peut être à l'origine d'a nomal ies chromosomiques

ou de ma Iformations. Les larves sontéga lementtrès sensi bles à la qua 1 ité de l'ea u et aux

agents pathogènes qui peuplent le milieu . Les huîtres connaissent donc d'importantes

mortalités précoces aussi biendans leurmilieu naturel (Korringa, 1946 cité par Plough et

Hedgecock, 2011) que dans un milieu contrôlé (Guo and Allen, 1994 cité par Plough et

Hedgecock, 2011). Plough et Hedgecock (2011) estiment à 98% 1 eta ux de mo rtalité a u cours

des 60 premiers jours de vie.

En conditions favorables, la 1 arve se développe pendant 2 à 3 sema i nes et attei nt le

stade « la rve ceillée » lors de la formation d'une tâche noi re _ « l'cei 1 » _ au mi 1 i eu de la

coquille de la larve qui signale l'approche de la métamorphose. En parallèle, on voit

éga 1 ement le développement d'un « pied» qui servira à chercher le substrat 1 e plus propi ce

à la fi xation de la larve, nommée pédivéligère. Comme pour bon nombre d'espèces, la

méta morphose est une phase critique pour la survie des individus. En ce qui concerne 1 es

huîtres, si la difficulté à trouverlesubstratqui servira desupport à la croissance peut être

source de mortalités, il a égal ement été démontré que des régions du génome pouva i ent

être à l'origine de mortalités, essentiellement a u moment de la méta morphose (Plough et

Hedgecock, 2012) .

Unefoiscesubstrattrouvé,la larveinitiesa métamorphose : c'est la fin dela vie

pél agique. Le stadej uvénile est attei nt lorsque l'individu ressemble à un adulte mi niature. Il

va donc poursuivre sa croissance et pourra produire des ga mètes dès sa première a nnée si

1 es conditions envi ronnementa 1 es 1 e permettent (Norma nd et al., 2009). A ce stade, les

individus sont menacés pa ries mortalités estiva 1 es, qui ne sont pas les pl us importa ntes

dans le cycle de vie de l 'espèce, mais qui sont les plus visibles et qui ont le plus de

conséquences sur les établissements ostréicoles.

22

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s _ 14mm

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Figure 5. Cycle de vie de Crassostrea gigas. 1- Fécondation :ovocyte en présence de spermatozoïdes. 2- Embryon stade morula (2-3h). 3- Larves D{24h). 4- Larves véligères (14 jours). 5- Larve pédivéligère (lB jours). 6-

Naissains post-fixation (l mois). 7- Naissains (2 mois). B- Naissains (6 moiS). 9- Adulte (la mois). 10-

Géniteur mature (la mois). (D'après Dégremont, 2003).

23

2.3. Une anatomie tournée vers la reproduction

L'a natomie de l'huître creuse adulte est représentée sur 1 a Figure 6.Comme chez tous

les mollusques, la masse vi scérale de l'huître est protégée pa r un ma nteau composé de deux

lobes. Cel ui-ci sécrète une coquille calcaire composée de deux va Ives asymétriques: 1 a droite

est platetandis que la gauche est creuse pour contenir la masse viscéra 1 e. Ces deux va Ives

sont réuni es par une charnière et le muscle adducteur assure l'ouverture et la fermeture de

la coquille.

Le mantea u fi Itre les éléments nutritifs afin que l'huître puisse se nourri r. Il forme la

cavité palléale qui renferme les orifices anal et réna ux ainsi que 1 es branchies qui reti ennent

les éléments nutritifs. Les branchies assurent également la fonction de respiration en

absorbant l'oxygène dissout dans l'eau.

La fonction de reproduction n'est quantà elle pas assurée par un organe perma nent.

En effet, les gamètes s'organisent en un tissu diffus et temporaire, la gonade, dont le

développement se réalise au cours d'un cycle annuel. Le volume de la gonade varie

énormément d'un individu à l'autre, et même entre deux saisons de reproduction pour un

même i ndividu.11 peut parfois représenter pl us de 1 a moitié du vol ume tota 1 de l 'ani mal.

Figure 6. Anatomie de l'huître creuse adulte (Ifremer) .

24

2.4. Une reproduction encore mystérieuse

La reproduction de l'huître creuse est un caractère complexe: si la gamétogenèse a

déjà fait l'objet de nombreuses études, le détermi nis me sexuel, qua nt à 1 ui, n'est que peu

décrit ettoujours source de contradictions (Yusa et al., 2007; Hedrick et Hedgecock, 2010).

2.4.1. Déterminisme sexuel

La reproduction de l'huître creuse se caractérise par un hermaphrodisme

alterné (Galtsoff, 1964; Le Dantec, 1968): un même individu peut être mâle et femelle au

cours de sa vie. Le pl us souvent, cet herma phrodisme est de type prota ndre caries individus

produisent généralement des ga mètes mâ les a u cours des premiers cycles de ga métogenèse

puis produisent des gamètes femelles dans la seconde partie de leur vie (Buroker, 1983).

Lango-Reynoso(1999) a estimé que 50% des huîtres ont la capacité de changer de sexe,

majoritairementdanslesens mâle puis femelle. Dans une moindre mesure, des femelles

peuvent devenir mâles au cours de la gamétogenèse suivante. Des hermaphrodites

synchrones (individus présentant simultanément des gamètes mâles et femelles) ont

également été observés (Galtsoff, 1964).

Contrairementauxespèces pour lesquelles la présence de chromosomes sexuels

confi rme 1 e détermi nisme généti que du sexe des individus, le détermi nisme sexuel de c. gigasest encore mal connu. Il semblerait cependant qu'il soit soumis aux conditions

envi ronnementales telles que la quantité de ressources organiques mise à dispos iti on _les

mâ 1 es prédominant en conditi ons de ma nque de nourriture (Steel e et Mul cahy, 1999) et 1 es

ressources a bondantes favorisant le développement d'une gonade femell e (Enriquez-Di az,

2004L ou la température de l'ea u _1 es mâles prédominantà basse température (Fabioux et

al., 2005). L'hypothèse d'un détermi nisme physiologique semblerait donc concorder avecSe5

observations puisqu'il a été décrit une plus forte capacité de stockage des ressources

énergétiques (Deslous-Paoli et Héral, 1988; Sol etchnik etaI., 1997) et une croissa nce pl us

importante (Baghurst et Mitchell, 2002) des huîtres creuses femelles.

25

Des études sur des croisements contrôlés ont fait apparaître que des facteurs

génétiques pouvaientéga lement influencer 1 e déterminisme sexuel (Hedrick et Hedgecock,

2010) :

• Haley (1977 et 1979, Hedrick et Hedgecock, 2010) proposait un modèle à 2

a Ilèles, m, à l'origine du sexe mâle, et!, à l 'origine du sexefemelle, pour 31 oci

(6 allèles au total):

o les individus [ 6m : Of), [ Sm : lf), [ 4m : 2j] et [ 3m : 3j] seraient

obligatoirement des mâles,

o les individus [2m : 4!] et [lm: Sj] seraient des hermaphrodites

alternés à tendance protandres,

o les individus [Om : 6j] seraient obligatoirement des femelles.

• Guo et al. (1998) proposaient un modèle plus simple où le sexe serait

déterminé par deux génotypes à un seul locus :

o les individus [FM] seraient obligatoirement mâles ,

o les i ndividus [FF] pourraient être mâles ou femelles.

• Hedrick et Hedgecock (2010) ont alors proposé un modèle alternatif à 3

génotypes pour un locus:

o les individus [MM] seraient obligatoirement mâles,

o les individus [FF] seraient obligatoirement femelles,

o les individus [FM] seraientsoitmâles , soitfemelles .

Ces modèles ne permettant pas d'expliquer les observations de différents jeux de

données laissentà penserqueledéterminismegénétiquedu sexe ne reposerait pas sur un

seul gène : une recherche de QTL avait révélé qu'un groupe de liaison se comporterait

comme un chromosome sexuel et serait accompagné de 6 autres régions du génome

répa rties sur Sa utres groupes de 1 iaison (Hedrick et Hedgecock, 2010). Cependant, Guo et al.

(2012) n'ont détecté qu'un seul QTL potenti ellement impliqué dans la détermi nisme du sexe,

confirmant l'hypothèse d'un modèle à un gène majeur.

26

2.4.2. Développement de la gonade

PI us ieurs échelles ont été proposées pour décrire 1 e développement de la gonade de

c. gigas (Mann, 1979 cité et modifié pa rSteel e et Mulcahy, 1999 et Norma nd et al., 2009) :

• En hiver, la gamétogenèse s'initialise mais la gonade n'est pas encore

observable (stade 0)

• Au pri ntemps, 1 a gamétogenèse entre dans sa phase active. Au début, 1 e tiss u

conjonctif est encore abondant mais les gonies, cellules germinales

immatures, apparaissent (stade 1). Puis , par méiose, les oogonies donnent

des ovocytes et 1 es spermatogonies donnent des spermatocytes (sta de 2). A

ce stade, la gonade gagne en volume.

• En été, les gamètes a rrivent à maturité(stade3)etsontlibérés dans l'eau de

mer soit pa rtiellement (stade 4 de Steel e et Mulca hy, 1999), soit tota 1 ement

(stade4 de Normandetal., 2009; stade 5 de Steele et Mulcahy, 1999). Une

fois la majorité des gamètes émis (stade 6 de Steele et Mulcahy, 1999), les

hémocytes infiltrent 1 e tissu gonadique et les ga mètes résiduels sont él imi nés

pa r cytolyse; on pa rie alors de résorption ou d'atrés i e (stade 7 de Steel e et

Mulcahy, 1999).

• En automne, 1 a résorption gonadique permettrait de reconstituer les réserves

énergéti ques afin d'alimenter d'autres fonctions physiologiques (Pouvreau et

al., 2006) ou de préparer 1 a gamétogenèse suiva nte (La ngo-Reynoso, 1999).

2.4.3. Notion d'effort reproducteur

La théorie des budgets d'énergie dynamiques (DEB, Kooijman, 2000) a mis en

évidence que, pour chaque être viva nt, l'énergi e a pportée pa r la nourriture est répa rti e

entre trois grandes fonctions: la survie, la croissance et la reproduction. L'effort

reproducteur correspond donc à la fraction de cette énergi e a lIouée à 1 a reproduction, aux

dépens des deux autres fonctions.

27

Chez les Mollusques, on considère que le volume de la gonade reflète

l 'i nvestissement énergétiq ue dans la reproduction. Chez l'huître, l'effort reproducteur peut

être esti mé pa rie calcul de l 'occupation gonadique (ou Ra pport Gonado-Somati que: RGS)

proposé par Normand etai. (2009) à partir de la relation décrite pa r Enriquez-Diaz (2004). Il

s'agit en effet du ra pportde la surface gonadique (SG) surla surface de 1 a masse viscéra 1 e

(SMV) esti mées s ur une coupe histologique dont 1 a préparation sera déta i Il ée da ns 1 a suite

du manuscrit.

RGS= SG x 100

SMV

L'huître creuse peut investirj usqu'à 65% de son budget énergétique annuel dans la

reproduction, ce qui est considérab le si on la compare à d'autres biva Ives (Va n der Veer et

al., 2006). L'émission des gamètes peut quant à elle représenter une perte de poids fra is de

l'ordre de 62% (Deslous-Paoli et Héral, 1988).

2.4.4. Lien avec les mortalités estivales

Eta nt donné l'i nterdépendance de la survie et de 1 a reproduction et étant donné la

pa rt importante de l'a lIocation énergétique à la reproduction, les huîtres creuses sont donc

plus vulnérables en période de gamétogenèse active (Soletchnik et al., 1997). Or, les

mortalités estivales surviennent à cette période (Cheney et al., 2000}.11 n'est donc pas

surprenant qu'une corrélation soit apparue entre le niveau d'effort reproducteur et la

réponse a ux mortalités estivales: des 1 ignées sélectionnées pour 1 eur résistance (R) ou 1 eur

sensibilité (S) aux mortal ités estivales présenterai ent des niveaux d'effort reproducteur

différents (Samain etaI., 2007; Figure 7). En effet, les individus résistants aux mortalités

estiva les présenteraient un investi ssement reproducteur pl us modeste que 1 es i ndivi dus

sensibles (Huvet et al., 2010; Figure 8). De pl us, les individus sensibles aura i ent tendance à

émettre partiellementleursgamètestoutau longdela périodefavorableà la reproduction

ta ndis que 1 es individus résistants se contenteraient d'un seul épisode de ponte pa r sa ison

de reproduction (Samain et al., 2007 ; Figure 7}.11 apparaît donc importa nt de comprendre

28

les relations, notamment génétiques, sous -jacentes à ces observations et donc, de

caractériser l'effort reproducteur.

100~-----------------*------*-------------.1 -.tr-R _____ S

.-~ 75

* 50

2S

June Jul Oct. Nov. J)ec.

Figure l.Estimation semi-quantitative du pourcentage desutface gonadique déterminé par histologie d'huîtres « résistantes )) (R) et d'huîtres (( sensibles )J (5) aux mortalités estivales ('" signifie que la différence est

significative entre Ret 5). D'après Samain et al. 2007,

A

10

OL--U~~~~~~~~~

Figure S.Estimation de la surface gonadique moyenne de 5 lignées d'huîtres ( sensibles)} (en hachuré) et de 5 lignées dl huîtres (c résistantes » (en gris) aux mortalités estivales. Globalement, les lignées R présentent

une surface gonadique moyenne significativement plus petite que les lignées 5 (respectivement 35 ± 18,7% contre 45,9 ± 15,8%). D'après Huvet et al., 2010.

29

2.5. Génome

le génome de l'huître creuse présente un importa nt polymorphisme nucléotidique

(Hedgecock et a 1.,2005). Ce polymorphisme a été mis en évi dence a u niveau des a Il ozymes,

puis des marqueurs microsatellites et plus récemment à partir des connaissances du

transcriptome: des gènes différentiellement exprimés entre mâles et femelles, entre

différents stades de maturité gonadique ou i mpl i qués dans 1 e développement gonadique

(Dheilly etaI., 2012) ont été détectés et leur séquençage a révélé des mutations pouvant

également être utilisées comme marqueurs moléculaires.

le développement et l'utilisation de ces marqueurs moléculaires a permis d'en

apprendre davantage sur le génome de Crassostrea gigas :

• l'amplification de ma rqueurs microsatellites a révélé une abondance d'allèles

nuls, c'est-à-dire d'allèles non-amplifiés, vraisemblablement à cause de

mutati ons dans les séquences fla nqua ntes serva nt de sites de fixati on aux

amorces nécessaires à l'amplification (McGoldrick et al., 2000; Huvet et al.,

2000; launey et Hedgecock, 2001; Reece et al., 2004). De plus, certains

marqueurs microsatellites présentent jusqu'à 40 allèles différents (Huvet et

al.,2000).

• leséquençagede portions du génome de C. gigas a révélé l'existence de SNP

(Si ngle Nucleotid Polymorphism), polymorphisme d'une seule paire de bases,

envi ron toutes 1 es 60 paires de bases da ns 1 es régions codantes et envi ron

toutes 1 es 40 paires de bases dans 1 es régions non-codantes (Sa uvage et al.,

2007).

Récemment, une première version du génome de l ' huître a été publ iée et a confi rmé

cette grande diversité nucléotidique quel que soit letype de matéri el biol ogi que uti 1 isé : 1 e

taux de polymorphisme est estimé à 1,3% pour les individus sauvages, après quatre

générations de croisements frères-soeurs, le polymorphisme est réduit à 0,73% ta ndis qu'en

combi nant 1 e génome sauvage et 1 e génome consanguin, on observe un polymorphis me de

2,3% (Zhang et al., 2012 ;Figure 9).le taux de polymorphisme de l'huître creuse ainsi esti mé

30

est pl us él evé que celui estimé pour la pl upart des génomes séquencés ma is compara ble au

po lymorphisme estimé chez d'autres espèces connues pour leur fort polymorphisme et

cohérent avec l 'observation deSa uvage et a 1. (2007) car 1 SNP toutes les 40 pb correspond à

un taux de polymorphisme de 2,5%.

Il)

~

;,R. 0 -.t ~

>-.~ c: Ql 0

...,

o

o 2 4

- Heterozygosis of inbred Heterozygosis of wild Polymorphism of 4 hoploids

6 8 Polymorphie Rotes (%)

Figure 9. Densité de distribution du polymorphisme chez Crassostrea gigas estimé par des fenêtres glissantes mais non·chevauchantes de 10kb (Zhang etai., 2012). Chez les individus sauvages (noir), le

polymorphisme est homogène tout le long du génome tandis que chez les individus consanguins (rouge), une part importante de fenêtres présente un très faible polymorphisme cor la consanguinité

favorise l'homozygotie. En revanchel en combinant les génomes des individus sauvages et des individus consanguins rb/eu)1 le taux de polymorphisme est plus élevé au sein de nombreuses fenêtres ,

3. Recherche de QTLs chez les organismes marins

La diversité nucléotidique peut être utilisée comme outil via les marqueurs

mol éculaires etexp l ique éga lement la variabilité ou l'héritabil ité de certa ins caractères . Pour

fa i re 1 e 1 ien entre l es variations du génotype (polymorphismes observa bl es au nivea u des

31

marqueurs moléculaires) et les variations du phénotype (différences de réponse à une

même situation), on peut rechercher des régions du génome impliquées da ns l'expression

macroscopique de ca ractères d'i ntérêt : 1 es QTLs (Qua ntitative Tra it Loci).

3.1. Principe de la recherche de QTLs

Pour un ma rqueur M donné, 1 e principe de 1 a recherche de QTLs est d'observer, dans

la descendance d'un individu hétérozygote M1/M2, s' il existe une différence de

performa nce moyenne selon l'allèle Ml ou M2 transmis: s i la variati on de la performa nce

peut être associée à l'allèle transmis, c'est qu'il existe un QTL génétiquement lié au

marqueur M (Le Roy et Eisen, 2000) . Par exemple, considérons le caractère {( couleur »

déci i né en 3 phénotypes possibles (bleu, rouge etviolet) observé chez 8 individus génotypés

pour 2 marqueurs présentant 3 génotypes possibles: [M], [BB] et [AB] (Figure 10).

Lorsqu 'on observe le génotype des individus F2 pour chaque marqueur, on rema rque que:

• Pour le marqueur1, le génotype [M] est associé au phénotype {( bleu », le

génotype [BB] est associé au phénotype {( rouge » et le génotype [AB] est

associé au phénotype {( violet ».

• Pour le marqueur 2,1 e génotype [M] est associé aux phénotypes {( bl eu » et

{( vi 01 et», 1 e génotype [BB] est associé a u phénotype {( vi olet» et 1 e génotype

[AB] est associé aux 3 phénotypes .

D'un poi ntdevuestatistique, l'association génotype-phénotype est donc significative

pour 1 e ma rqueur 1 mai s pas pour le ma rqueur 2. Un QTL est alors 1 i é au marqueur 1.

Cependant, cette méthode nécessite de phénotyper un grand nombre d'individus pour

vérifier que l'association marqueur-phénotype est statistiquement robuste (Lander et

Botstei n, 1989).

32

Génotypesaux

Individus Génome Phénotypes

A

B

<

D

E

F

G

H

Figure 10. Détection de QTL par la méthode "marqueur par marqueur".

lorsque l'on dispose d'une ca rte généti que, i 1 est possible de rechercher des QTLs s ur

l'ensemble du génome, alors divisé en groupes de liaison. En effet, la liaison entre les

marqueurs génétiques permet de localiser les régions du génome impliquées dans la

variation de la performance observée. lander et Botstein (1989) ont mis au poi nt une

méthode dont le principe est de balayer l 'ensemble du génome en testant l'hypothèse

d'a bsence de QTlà chaque position: la cartographie d'intervalle. les ma rqueurs génétiques

servent a lors de « bornes» entre 1 es quelles se situe potentiellement un QTL. Cette méthode

nécess ite un nombre d'i ndividus nettement moi ns élevé que l'a na lyse ma rqueur pa r

ma rqueur. Reprenons l'exemple précédent ma is en l'appliquant à une famille F2 (Figure 11),

car c'est un type de croisement adapté à la détection de QTl (Massault, 2010). On considère

que 1 es gra nds-parents sont homozygotes pour 4 ma rqueurs d'un même groupe de 1 ia ison:

FO-A, de couleur bleu, est homozygote [M] pour tous les marqueurs et FO-B, de couleur

rouge, est homozygote [BB] pour ces mêmes ma rqueurs. les pa rents Fl-C et Fl-D sont donc

théori quement hétérozygotes [AB] pour les 4 marqueurs et 1 eur phénotype est « vi 01 et ». Si

33

l'on croise les individus Fl-C et Fi-D, on obtient une génération F2 au sein de laquelle

ségrège 1 e caractère considéré: phénotypiquement, on observe des individus bleus tels que

F2-E, des individus rouges comme F2-Fet des individus vi olets tels que F2-G et F2-H. Ens uite,

lorsqu'on observe le génotype des individus F2 pour chaque marqueur, on remarque que:

• Pour les marqueurs 1 et 2, le génotype [AA] est associé au phénotype

« bl eu »,1 e génotype [BB] est a ssocié a u phénotype « rouge » et 1 e génotype

[AB] est associé au phénotype « violet».

• Pour les marqueur 3 et 4, les génotypes [AA] et [BB] sont associés au

phénotype « vi olet» ta ndis que le génotypes [AB] est associé a ux phénotypes

« bleu» et « rouge».

D'un poi nt de vue statistique, l'association génotype-phénotype est donc significative

pour les ma rqueurs 1 et 2 ma is pas pour 1 es ma rqueurs 3 et 4. Un QTL est alors détecté entre

les marqueurs 1 et 2.

Individus

Grand-parent FO-A

Grand-parent fO-B

Parentfl-C

ParentFl-O

Desœndantfl-l

DescendantFl-G

Desc.endantF2·H

Génome Détectlonde Q1l

les marqueurs 1 et 2 sont associés à la variation du phénotype tandis que les

marqut!urs 3 et 4 ne peuvent pas être associés

à la variation du phénotype. Un cm. est donc détecté entre le

marqueur 1 et le marqueur2

Figure 11. Principe de détection d'un QTLpar la méthode de cartographie dJintervalle.

34

3.2. Caractères d'intérêt chez les espèces aquacoles.

Chez les espèces aquacoles, les caractères d'intérêt pour lesquels des QTLs sont

recherchés présentent un intérêt économique.

Parmi les caractères les plus étudiés, on retrouve la taille et la croissance des

individus car a méliorer la croissance de l'espèce permet de rédui re 1 es temps d'él evage.

Chez la Truite a rc-€n-ciel, On corhynch us mykiss, la capacité d'adaptation à l'eau de mer a été

étudiée (Le Bras et al., 2011) car il a été prouvé que la croissance en eau de mer était

mei Ileure qu'en ea u douce (Sedgwick, 1970 ;Johnston et Cheverie 1985 cités pa r Le Bras et

al., 2011). Chez les pétoncles, Ch/amys Jarreri, Argopecten irradians et Nodipecten

subnodosus, des QTLs impliqués dans la va riati on de 1 a tai Il e ont été détectés (Zha n et al.,

2009; Li et al., 2012 ; Petersen et al., 2012).

Un autre caractère très étudié est la résistance aux maladies qui induisent

d'importantes pertes pour les entreprises aquacoles. Chez le Saumon atlantique, Sa/mo

sa/ar, un QTL majeur de résistance à la nécrose pancréatique infectieuse qui provoque

d'importantes mortalités a été identifié par Moen et al, 2009. Chez la Truite arc-en-ciel,

Oncorhynchus mykiss, un QTL majeur de résistance à un Rhabdovirus provoquant la

Septi cémie Hémorragique Vi raie a été détecté pa r Verrieret al. (2013). Chez l'huître creuse

Crassostrea virginica, Yu et Guo (2006) ont identifié des QTLs de résistance à la maladie

« Dermo » induite par le pathogène Perkinsus marin us.

Bi en que des régi ons du génome soient détectées pour ces espèces aquacol es, les

QTLs sont encore rarement uti lisés pour orienter les programmes de sélection aquacoles. En

2007,1 e QTLdétecté pa r Moen et al. (2009) a été intégré dans le programme de sélection de

l'entreprise norvégienne Aqua Gen qui fournit des œufs de saumon à l'i ndustri e aquacole.

3.3. gns détectés chez Crassostrea Gigas

Comme pour 1 a plupart des es pèces pour lesquell es des QTLs sont recherchés, 1 es

caractères considérés présentent généralement un intérêt économique. Ai nsi, Hedgecock et

al. (2007) ontidentifiécinq QTLs impliquésdans la variation du poids etun QTLimpliqué

35

dans la croissance. PI us récemment, Guo et al. (2012) ont également détecté trois QTL

impliqués dans 1 a croissance et un QTL 1 ié au sexe. Plough et Hedgecock(2011} ont identifi é

une qui nza ine de QTLs devi abilité associés à 1 a survie au stade 1 arvai re, essentiell ement au

moment de la métamorphose. Sa uvage et al. (2010) ont, quant à eux, mis en évi dence cinq

QTLs 1 i és à 1 a survie a ux morta 1 ités estival es et à la cha rge vi ra 1 e en herpès vi rus Os HV1

(Figure 12). Acejour, les QTLs détectés chez Crassostrea gigas ne sont pas utilisés da ns des

programmes de sélection.

V

0,0 HA114

23,1 Sili29

43.9 Sili38 48,9 ucdCg150 ucdCg151 51,1 ucdCg188 59,2 Adrenal_Gland_Protein 66.3 ucdCg141 72,5 ucdCg173

98,6 Glycogen_Phosphorylase

VI 0,0 Sodium_Glucoseco·transp.

34,9 Amylase_A 44,9 Flavin_monoxygenase 48,3 ElongationJactor1 49,2 Amylase_B 55,5 Serine praslin 63,0 ucdCg133

94,1 Sili4 95,0 Cytochrom e_P450 95,6 ucdCg156

102,9 Sili43 115,9 BQ427367 124,4 Bcl2 130,6 ucdCg197 144,0 Laccase

168,9 GlutaryLCoA

195,8 Sili50

VII 0,0 7 ,5 ,

37,7 42,2 45,8

"" r-V ./ -!'-

62,7

86,2

112,4 .

IX

Sili15 ucdCg149 NADH_Dehydr.

ucdCg210 Sili7 ucdCg203

ucdCg196

Sili37

0,0 Notch3

32,5 Tubulin_alpha

83,7 ucdCg129 93.8 ucdCg171

104,6 BMP 115,6 ucdCg172

141,6 ucdCg169 Vasa-like

Figure 12. QTLs impliqués dans la réponse aux mortalités estivales et la charge virale en virus OsHV-l . Les rectangles rouges représentent les 5 ans répartis sur4 groupes de liaison. D'après Sauvage e t al.~

2010.

36

4. Plan de la thèse

Les mortal ités estivales dej uvéniles d'huîtres creuses menacent l'économie aquacole

française. Des études précédentes ayant mis en évidence une corrélation entre

l'i nvestissementdans la reproduction et la réponse aux morta 1 ités estiva les (Huvet et al.,

2010), il apparaît important de mieux connaître l'architecture génétique de la

ga métogenèse, jusqu'alors peu étudiée. Des régi ons du génome impliquées da ns la réponse

aux mortalités estivales ayant été détectées (Sauvage, 2008), il est également apparu

intéressant de savoir s'il existait des zones du génome impliquées dans l'effort reproducteur

et de vérifier si elles étaient communes à celles détectées pour la survie et la quantité

d'agents pathogènes lors d'un épisode de mortalité estivale.

Pour répondre à ces questions, le projet GAMETOGENES a été financé par l'ANR

(Agence Nati onale pour 1 a Recherche, projet ANR-08-GENM-041) de 2009 à 2012. Ce projet

éta it un prolongement logique des précédents programmes dédiés à la producti on mass ive

de données génomiques pour un mollusque d'importance économique: l'huître creuse,

Crassostrea gigas. Il s'est inscrit a insi dans la poursuite de certains travaux réa 1 isés da ns 1 e

cadredu projet européen AQUAFIRSTterminé en 2008. Le projet GAMETOGENES s'est en

effet appuyésurles connaissances acquises au cours des programmes antérieurs pour

développer de nouveaux outi Is en génétique, génomique foncti onnelle ai nsi qu'en post

génomiqueafind'améliorerlaconnaissancedes bases génétiques et physiologiques de la

reproducti on et 1 es processus associés da ns 1 e but d'améliorer 1 a producti on aquacol e. Les

obj ectifs de ce proj et éta i ent:

• l'identification des gènes spécifiquement exprimés dans les gonades des

huîtres au cours d'un cycle de reproduction en utilisant des méthodes de

transcriptomique, c'est-à-dire en déterminant des marqueurs spécifiques

d'étapes de la gamétogenèse et en déterminant l'expression de ces gènes

marqueurs en fonction de l'environnement,

• la détermination des bases génétiques de la variabilité de l'allocation à la

reproducti on à l'a i de d'un e approche QTL,

37

• l'exploration de la fonction des gènes impliqués dans les processus de

régulationde la reproduction à travers le développement de méthodes de

post-génomique.

Le coordinateur était l'Université de Caen et les autres partenaires étaient

l'Université de Brest, l'Université de Rennes et l'ifremer (LPI de Brest et LGP de La

Tremblade). LeLGP étaitparticulièrementimpliqué dans le deuxième objectif mais aussi

dans la production d'animaux permettant les expérimentations d'autres partenaires.

Ce sujet de thèse s'est donc intégré dans le projet GAMETOGENES et a visé à

détecter, par une approche QTL, les relations qui existent entre la survie aux mortalités

estivales ou l'effort de gamétogenèse et certaines portions du génome. Cette approche a

nécessité, d'une part, l'amélioration de la carte génétique constituée de marqueurs

moléculaires de type microsatellites et SNPs et, d'autre part, la production et la

caractérisation phénotypique d'un matériel biologique particulier detype « fami Il e F2 ». En

effet, des simulations ont démontré que la détection de QTLs est opti misée par ce type de

croisement (Massault, 2010).

Dans la suite du manuscrit seront donc présentés principalement sous la forme

d'articles scientifiques: 1 e développement de nouveaux outils de ca ractérisation de l'effort

reprod ucteur (Partie 1), 1 a cara ctéri s ati on phénotypi que de fa mi Il es d'huîtres creus es au

cours de la ga métogenèse (Partie Il), la caractérisation généti que de l 'effort reproducteur

(Partie III) et, enfin, la contribution de cette étude à la caractérisation génétique de la

réponse aux mortalités estivales (Partie IV) . Une conclusion permettra de rappeler les

pri ncipaux résultats obtenus, 1 eurs 1 imites, et de 1 es mettre en pers pective dans le cadre des

programmes de sélection qui se mettent en place actuellement au sein de la filière

ostréi col e.

38

PARTIE 1: DE NOUVEAUX OUTILS POUR CARACTERISER L'EFFORT

REPRODUCTEU R

1. Un matériel biologique particulier: les familles F2 1.1. Choix des grands-parents: la génération FO.

Nous avons décidé d'utiliser une génération de type F2 afin de détecter 1 es QTLs liés à

la survie du naissain aux mortalités estivales et à l'effort reproducteur. Pour cela, nous avons

donc chois i d'utiliser comme grands-parents des individus provenant de lignées

sélectionnées au cours d'études précédentes pour ces 2 caractères. En effet, nous avons

utilisédu matériel biologiquesélectionné pour ses réponses contrastées aux mortalités

estivales, 1 es lignées Ret 5 (Dégremont et a 1.,2010 abc) : R signifie que la famille FO est pl us

résistante a ux mortalités estivales que 1 es témoi ns et 5 signifi e que 1 a fami Ile FO est pl us

sens ible a ux mortalités estivales que les témoi ns. Nous avons éga lement util isé du matéri el

biologique aux performances contrastées en termes d'effort reproducteur, les lignées

Hautes et Basses (Normand, 2009) : H signifie que la famille FO présente un effort

reproducteur supérieur à celui des témoins. B signifie que 1 a fa mi Il e FO présente un effort

reproducteur inférieur à celui des témoins.

1.2. Production des parents: la génération Fl

Une fami Ile Fl provient du croisement de deux individus provenant de deux fa mi Iles

FO aux performances contrastées. Par exemple, un mâle issu d'une fa mi Ile R et une femelle

is s ue d'une fami Ile s.

La génération Fl a été produite le 23 février 2009 (Tableau 1):

• Les lots Fll à 12 ont été produits à partir des i ndivi dus FO sél ecti onnés

pour la variabilité de l'effort reproducteur .

• Les lots Fl18à 24ontétéproduitsà partirdes individus FO sélectionnés

pour la réponse aux phénomènes de mortalités survenus au cours de

l'a nnée 2008.

40

Femelle FO Mâle FO Lot Fi

B6 H6 1

B5 H5 2

B4 H4 3 B3 H3 4 B2 H2 5 B1 Hl 6 H6 B6 7

H5 B5 8 H4 B4 9

H3 B3 10

H2 B2 11

Hl Bl 12 Rl 59 18

R8 51 19 R4 54 20 54 R5 21

R5 511 22 511 R4 23

51 R1 24

Tableau 1. Origine des familles Fl len blanc, lots sélectionnés pour l'effort de reproduction, en gris, lots sélectionnés pour la réponse aux phénomènes de mortalité).

1.3. Production du matériel biologique de l'étude: la génération F2

Une fa mi Ile F2 provient du croisement entre deux indivi dus provena nt d'une même

famille Fl, c'est-à -dire, un frère et une soeur.

1.3.1. Choix des géniteurs

Des individus Fl ont été ramenés de 1 a station expéri mental e de Boui nie 8 j ui Il et

2009 ettra nsférés s ur estran 1 e 10 juillet 2009 (500 individus pa rfa mille) et 1 e 07 août 2009

(envi ron 300 i ndivi dus) pour tester 1 a différence de réponse a ux mortalités estiva 1 es en

foncti on de l'âge de mise s urestran (Figure 13). Des individus de ces mêmes familles ont été

préservés detoute morta lité à Bouinafindenepasbiaiserlasélection des géniteurs (si on

uti 1 isait 1 es survivants de l'épisode de mortal ité, on sél ectionnera it 1 es individus les pl us

rés istants de chaque fami Il el. Ceux-ci ont été ramenés à l 'écl oserie expéri mental e de La

Trembl ade et pl acés dans des conditions opti mal es i nduisa nt 1 a maturation 1 e 15 ja nvier

2010. La température a été progress ivement augmentée jusqu'à 20' C.

41

100

90

80 ~

70 -'QJ .~ "'1ii 60 .... ... 0 50 E QJ 40

-C )(

30 :::J

t!!! 20

10

0

r--

r- r- r-

- f- r- f- r- r- r-- r--

- r-

I-- -

l- r - r- - r- r- r- r-•

1 3 5 6 7 8 W il 12 ~ m 21 n 23

FamillesFl

• Juillet 2009

• Août 2009

Figure 13. Réponse aux mortalités es tivales en fonction de la date de mise sur estran des familles Fi ayant une descendance F2.

1.3.2. Croisement

Les croisements ont été réa 1 isés du 15 a u 19février 2010, certains croisements aya nt

été reconduits suite à l'absence de larves le lendemain du croisement.

Pour chaque lot Fl, un ou deux croisements bi-parentaux ont été réa lisés (Tableau 2).

Les lots 5,8 et 10 de la Fl ontfait l 'objet de 2 croisements bi-parentaux du fait du contraste

de survie observé en fonction de l'âge de mise sur estra n lors de l'épi sode de morta 1 ités

2009 (Figu re 13). De la même manière, les lots 21 et 22 de la Fl ont également été

représentés par2 croisements bi -parentaux chacun en raison de 1 eurmortalités moi ndres en

2009 pa r rapport auxautres lots de la Fl sél ectionnés pour 1 a réponse a ux phénomènes de

morta 1 ités. Les lots 2, 3, 9, 11, 20, 22 et 23 de 1 a Fl ont également été uti 1 isés pl us i eurs fois

pour des ra isons pratiques: 1 es lots 2, 3, 9, 20, 22 et 23 pour produi re des croisements de

remplacement au cours des jours suivants et 1 e lot 11 pourpalier à l ' absence de mâ 1 es da ns

le lot 18 de la H.

42

Lot F2 à partir du lot F1 produit en 2009

Date du croisement

1 lot 1

2* lot 2

3* lot 3

4 lot 5

5 lot 5

6 lot 6

7 lot 7

8 lot 8

9 lot 8

10* lot 9

11 lot 10 15/02/2010

12 lot 10

13 lot 11

14 lot 12

15 lot 11

16 lot 19

17* lot 20

18 lot 21

19 lot 21

20 lot 22

21 lot 22

22 lot 23

23 lot 3

24 lot 3 16/02/2010

25* lot 2

26* lot 2

27* lot 20

28 lot 20 17/02/2010 29* lot 22

30' lot 22

31 * lot 22

32* lot 2

33* lot 2

34* lot 2 18/02/2010

35* lot 5

36* lot 5

37' lot 23

38' lot 23

39* lot 23 19/02/2010

40* lot 9

41' lot 9

42' lot 9

Tableau 2. Production des familles F2 (en blanc, lots sélectionnés pour l'effort de reproduction ; en gris, lots sélectionnés pour la réponse aux phénomènes de mortalité ; les lots éliminés pour absence de larves

sont signalés par un *)

43

1.3.3. Obtention des gamètes et fécondation

Les gamètes ont été obtenus parscarification à l'aided'unscalpel puis rinçage à l'eau

de mer de la gonade. Les ovocytes ont été fi Itrés s urdes ta mis de maille 60 Ilm pour él iminer

les macro-débris. Un échantillon recueilli sur une cellule de Malassez a permis une

esti mation du nombre de gamètes femelles par analyse d'i mage grâce au logi ci el SAMBA.

Trois millions d'entre eux ont été conservés da ns un bécher de800 ml contenant de l'ea u de

mer fi Itrée à température ambiante. La fécondation a eu 1 i eu pa r ajout de s permatozoïd es

da ns chaque bécher . Le ratio spermatozoïdes/ovocytes a été contrôlé par observati on au

mi croscope. En cas d'excès de spermatozoïdes , un ajout d'ea u de mer fi Itrée a permis de

di 1 uer 1 e mél ange. En cas de défi cit, des spermatozoïdes ont été ajoutés. Da ns 1 es deux cas,

un nouveau contrôle au microscope a été réalisé.

Une heure après , l 'observation au microscope de globules polaires mettant en

évi dence la fécondation des ovocytes a détermi né le transfert des 1 a rves en sa Il e d'élevage

larvaire.

1.3.4. Elevage larvaire

Après confirmation de 1 a fécondation, 1 es 1 arves ont été pl acées da ns des ja rres de

30L d'eau de mer filtrée à 23°(, Deux jours plus tard, nous avons estimé le taux

d'éclosion par le comptage de trois réplicats par lot. Au cours des trois semai nes qu' a duré

l'él evage larvaire, les 1 arves ont été fi Itrées sur des ta mis de ma i Ile croissante (de 45 Ilm

jusqu'à 220 Ilm). Pa rallèl ement, nous avons procédé à des réductions de densité ponctuelles

pour optimiser la croissance des larves (Tableau 3) .

44

Jour d'élevage Maille du tamis (!lm) Opération

2 45 Réduction de densité (300.000)

5 60 -

8 85/70 Réduction de densité (150.000)

10 85 -

12 100 -

15 112 + 220 Fixation du 220

17 112 + 220 Fixation du 220

19 112 + 220 Fixation du 220

21 125/150/180 + 220 Fixation du 220

23 180 + 220 Fixation du 220

Tableau 3. Taille de maille de tamis et opérations en salle d'élevage larvaire.

En élevage larvaire, les larves ont été no~rries avec un mélange algal composé

d'/sochrisis (T-iso). de Chaetoceros gracilis et de Tetraselmis suecica. Afi n de préveni r toute

dégradation du milieu par les larves mortes ou du phytoplancton, un ajoutd'antibiotiques a

été effectué à chaque changement d'eau de mer (Flumisol : 800 (..lI/3~ L).

A pa rti rdu 1 er mars 2010,1 es larves retenues s urune ma ille de 220 (..lm et présenta nt

des taches ocellaires (larves ceillées) ont été transférées en salle de micro -nurserie pour

permettre leur fixation. Les dernières larves ont été mises en fixation le 9 mars 2010.

1.3.5. Micro-nurserie

Les larves ceilléesontétéplacéessurdestamis demaille 150 (..lm dont lefond avait

préalablement été recouvert d'une fine couche de microbrisure de coquilles d'huîtres,

s ubstratfavorisant la fixation des huîtres. Ces tamis ont été disposés dans des raceways

alimentés en séquentielles premiers jours (conséquences de la tempêteXynthia du 28

45

février 2010) puis en fi uxcontinu d'eau de merfi Itrée a ux UV, chauffée à 21 ·C et enri chie en

phytoplancton.

Les 22 et 23 mars 2010, nous avons filtré les naissains sur un tamis de 500 ~m et

réduit les densités à 5000 naissains par tamis (maille de 350 ~m) .

Les 12 et 13 avril 2010, nous avons fi Itré les naissains sur un ta mis de 2 mm en vue de

leur transfert à la nurserie du site Ifremer de Bouin.

1.3.6. Nurserie

Pour assurer une croissance rapide, le na issain a été tra nsféré à 1 a stati on Ifremer de

Boui n,le 14 avri12010. 11 a été placé s urdes tamisde ma i Ile 1 mm (un tamis par lot) dans des

raceways a limentés en ea u de mer à la même température que dans 1 e mi 1 ieu naturel ma is

avec adjonction de phytoplancton et en immersion permanente.

1.3.7. Tests de survie

La recherche de QTLs nécessitant un nombre important d'individus à phénotyper, il

n'éta it matéri ellement pas possible de suivre l'ensemble des 21 familles produites. En mai et

juin 2010, deux tests de survie ont été menés sur l'ensemble des familles F2 afin de

détermi ner 1 esquelles présentaient 1 es performances les pl us a ppropriées pour la recherche

de QTLs.11 a étédécidéderetenir12 d'entre elles dontlestauxdemortalitéétaientcompris

entre 30 et 80% afin de posséder un nombre suffisant d'individus morts et d'individus

survivants à 1 a fi n de l'épisode de mortalité. Ce choixs'estvu renforcé par la prise en compte

des performances de survie des familles Fi (dont sont issus les géniteurs de nos F2)

enregistrées l'année précédente (Figure 13).

46

2. Nouveaux outils moléculaires: recherche des marqueurs et génotypage

2.1. Les marqueurs microsatellites

Une séquence d'ADN microsatellite consiste en une s uccessi on de répétitions d'un

motif de 2 à 10 nucléotides. Le nombre de répétiti ons de ce motif (de 5 à 40 fois) fa it va ri er

la longueur de la séquence d'ADN. C'est 1 a va riabi 1 ité de cette longueur qui est source de

polymorphisme car ces régions se transmettent à la descendance en suivant les lois de

l'hérédité de Mendel. Situées principalement da ns les i ntrons, les séquences microsatell ites

peuvent être utilisées comme marqueurs moléculaires. Chez l'huître creuse, le fort

polymorphisme peut entraîner jusqu'à plus de 40 allèles pour un marq ueur microsatell ite

(Huvet et al., 2000).

2.1.1. Choix des marqueurs

Les ma rqueurs microsatellites utilis és a u cours de cette étude sont des ma rqueurs

coura mment utilisés a u LGP de La Tremblade. Au tota l, 36 marqueurs mi crosatellites ont été

a na lysés, dont 15 en multiplexes 3 par3, c'est-à-dire que 3 segments distincts sont amplifiés

a u cours d'une seule réaction (Li et a 1.,2010; Taris etaI., 2005; Ta bleau4) et 21 en si mplexe

(Li et al., 2003 ; Yamtich et al., 2005; Sauvage et al., 2010; Tableau 5).

47

Tl Taille Concentratlo Numéro

Locus Motif ré pété Fluorochrome Séquence des amorces 5'-3' (' C)

fragment n dans le mix d'accès (bp) PCR(~M) GenBank

PCR

NICOPLEX 55

CG 49 (GT)35 NED (noir) F:CATCAGGGGTAAATTAAAGTAAGC

142·182 0.2 Y12085 R :CCACAGACGATTTCATATATCCfG

CG 108 (GT)15 FAM (bleu) F: ATATGTAATGATTACGAAACT

128-166 0.4 V1l0a7 R:ATATGT AATGA TT ACGAAACT

llO (AG)26 HEX (vert) F :GGTCAA TTCAAAGTCAA nTCeC

136 0.2 AF1708S0 R:CATGTTTTCCCTTGACTGATCC

PCR 58 multiplex 1

CGEOO7 (TA)7 NED (noir) F: TTTCCCCTGAGAAGACCC

96- 142 0.1 BQ427084 R: AACCAAATCCATTCAACATAAC

Cgsl1l43 (GA)lO HEX (vert) F:AAATGCTGCAGAAATAATCC

210-348 0.3 AM8540n R:AGATGGCTACAGTGAAATGG

Cgsl1l46 (TG)5A(GT)7 FAM (bleu) F: CATGACAATCGAGTCCATAA

R:CATGGTGGAGAAAGAGTTGT 165-211 0.09 AM856490

PCR 52

multipleM 2

CGEOO9 (AG)7 NED (noir) F:TTCGTTGAAGGTGACAAGTG

114-128 0.1 CX068958 R: GCATTTTGGGATGAACAGA

AMY (TC)37 HEX (vert) F:ACCGGTATTGCCCGAGTTACAA

199- 369 0.2 V08370 R: AGTTAGGCATCCCCCATTGTTC

Cgs1ll44 (AG)7AAA(GA)

FAM (bleu) F: TGGCATTTCATGGTTAATTT

349- 355 0.1 AM858556 4 R: TGTTGTATGAAATGTCGGAA

PCR 58

multiplex 3

Cgs1ll39 (AG)13 FAM (bleu) F:GACCATACAGCTCTGTCCAT

355- 383 0.09 AM854746 R: GCT ACTGAATGAGAATGGCT

Cgsill50 (CA)lO FAM (bleu) F: CT ATCTGAGCACGCTTCTCT

201-233 0.09 AM865904 R: TCTCTGTCAGATGATCTCAGG

Cgsl1i4 (AG)26 HEX (vert) F: GGTGCAGTAGTTGGAAACAT

227-349 0.24 AM854894 R: TCACATTTAACTAGCGCTCTC

PCR 58

multiplex 4

CGGOO8 (AG)20 NED (noir) F: TCTCCTCT ACCCCGACAG

181- 253 0.4 AJ579915 R:GTGATGAACAAACCACCAAC

Cgs1ll37 (TC)15 FAM (bleu) F: TTGCTGGTTGTGATGAATAG

159- 293 0.15 8Q427164 R:ATATCTGGCCTAACATGTGC

Cgs1ll6 (GA)26 HEX (vert ) F:ATGAACGTCCAAGTTCAGAC

270- 442 0.2 AM854296 R: ACACATTTCmATAAAGCC

Tableau 4 Les marqueurs microsatellites multiplexés

48

T, Taille des Numéro

publication locus Motif répét é Séquence des Amorces 5'·3'

1°C) N. fragments d'accession

associée Ipb) GenBank

UcdCg 109 ICAT)n F :GCT ATGGTTGTCA TCCTCGAA

55 5 164-225 AF46852S (LI et al., 2003) R:TGCCTTTATCGGTTITGCTr

UcdCg 117 (TC)n F: CCAAGCTTGCACTCACTCAA

58 7 288-332 AF468528 (LI et aL, 2003) R: GAGTGTTCTGGTGTGCCAAAT

UcdCg 119 ITC)n F: AGGATGCCAATCGATTTT ATH

R: ACCATGCCGTCTTAGTGGAC 55 6 208-222 AF468529 (LI et aL, 2003)

UcdCg 120 ICA)nIGA)n F: GGGTGAGATTTAGGGGGAGA

55 5 149-155 AF468530 (U et aL, 2003) R: CTCCATCAAACCTGCCAAAC

UcdCg 129 IGA)n F: CGAA TTTTICGGACA TCGTT

57 7 222-255 AF468S34 (U et aL, 2003) R: GTGGTATGCCTGCATCATGT

UcdCg 141 (TG)n F: CTCAACGACTTTITGCCTGA

57 6 227-262 AF468545 (LI et al., 2003) R: GTGTCTTCTATCCCGCAACG

UcdCg 149 IGA)nIGACA)n F: TGATTAAACGTGGGTGATTCAG

60 7 213-245 AF468581 (LI et aL, 2003) R: TTTCTGACTGTCCGTCTGTGA

UcdCg 151 IGT)n F: AGGTAATCCGCAAACCAGTG

60 7 264-308 AF468553 lU et .1., 2003) R: GCATTGCGTCAGGATIAGGT

UcdCg 156 IGATA)nIGA- F:AGCAGACCTTGGCAAATACG

50 7 116-208 AF468557 (U et aL, 2003) TG)n(TA)n R: CCGTCATCAGGTCCTGTTTT

UcdCg 165 IATCT)nICA)n F:TTTTTACCAGCACTCGCTGT

57 5 171-239 AF468565 (U et aL, 2003) R:TCCGAATTTCACAAGTGTGTGT

UcdCg 166 (TC)n F: CA TCGGAACT AAATCGGGT AA

58 6 204-237 AF468566 (LI et aL, 2003) R: TTCCTTTGTGCTGTCTTACAGG

UcdCg 172 IGAT)n F:CCACCGTTAAACGTAGCATTG

60 2 242-250 AF468570 (LI et al., 2003) R: TTGTGTCCCTrTICCGTCTC

UcdCg 173 ICT)nICA)n F: AAAATGGGAATTCACTGTGTCA

57 6 217-250 AF468571 (LI et ar., 2003) R: CGGCACCGGTTTGTTATCT

UcdCg 181 IGT)nIGA)n F: CACCCCAAAGGACCACATAC

60 4 214-263 AF468579 (U et al., 2003) R: TGTCAGCATGGGTAAGTCCA

UcdCg 186 IGA)n F: GCCGCCGATTCTCTTAGATT

SB 7 243-284 AF468584 (U et aL, 2003) R: GGCTAGCTAGTCATCACCCTA

UcdCg 196 IGAT)nIGAC)n F :CCTTTCA TTTGGAGGTT ACA TTG

55 4 265-273 AF468597 (LI et al ., 2003) R: ATCTTGCCATTTGCTTTTGG

UcdCg 198 ICAT)n F:GAAAGACACGACCGGAGAGA

58 6 220-250 AF468596 (LI et aL, 2003) R: CTGATGATGTCCCACACCTG

UcdCg 200 IGAT)n F: AAAGTTGmTGCTGTCGTC

58 4 232-265 AF468598 (LI et aL, 2003) R: CGCTAACGTGCTTCATTCAA

UcdCg 210 IGAT)n F: TTCACAATGAAGATGACAGTGC

55 3 318-3 25 AY999708 (Yamtlch et al.,

R: CCTCCTCTGCCTCCATATCA 2005)

F: ACAACGTATCAGTTCCATT (Sauvage, Cgslll7 IGA)n

R: ATCTCCCGGCAAGTATATG 57 7 209-300 CU682571

2010)

Cgslii 45 IAG)nAAA F:GTCTAGAAATAAAGCTGGAA

57 7 184-211 AM857706 (Sauvage,

IGA)n R: CAAGATTCCAAGGAAACAAA 2010)

Tableau 5. Les marqueurs microsatellites en simplexe (Pontreau, 2012),

49

2.1.2. Génotypage des marqueurs microsatellites 2.1.2.1. Extraction d'ADN

L'extraction d'ADN a été réalisée à l'aidedu QIAampDNAMini Kitde Qiagen. De 20 à

50 mg de bra nchies ont été prél evés s ur chaque individu, comme indiqué da ns le protocol e

présenté en Annexe 1. Ces écha ntillons ont ens uite été stockés à -20°C jusqu'à l 'extracti on

d'ADN. Les écha ntillons de bra nchies des pa rents (F1) et des gra nds-parents (FO) ont, quant à

eux, été prélevés le jour des croisements puis conservés dans de l'éthanol à 70%.

Afi n de gagner du temps, l'ADN des individus caractérisés pour 1 a reproducti on a été

extraità l'aidede l'automate d'extraction Qiagen, le QiaCube, selon le même protocole, à

l'exception de l 'él uti on qui es t réal isée da ns 200j..lL de ta mpon AE.

2.1.2.2 . Dosage de l 'ADN par spectrophotométrie

Le dosage de l'ADN a été réa 1 isé à l'a i de du Nanodrop 2000. Cet appa rei 1 présente

l 'ava ntage de mes urer la concentration de l'ADN sans dilution préalable. Il suffit de déposer

2 j..lL de 1 a solution ADN+ta mpon d'élution.1I fournit éga lement les va leurs d'a bsorba nce à

260 (A260) et 280 nm (A280) et ca Icule les rapports A260/ A280 etA260/A230 afin devérifier

l 'absencede contamination de l'ADN extrait par d'autres protéines ou par des solvants

organiques. Un extrait d'ADN est considéré comme pur lorsque le rapport A260/A230 est

compris entre 1,8 et 2,2 et lorsque le rapport A260/A280 est compris entre 1,8 et 2.

Cependa nt, les concentrations estimées par 1 e Nanodroponttendance à être surestimées: il

s'agit d'un dosage des acides nucléiques, par conséquent, l'ARN est également pris en

compte.

De pl us, l'a ppareil présente graphiquement ces va leurs d'absorbance. Il est a insi a isé

de distinguer une extraction d'ADN réussie (Figure 14, haut) d'une extraction d'ADN de

mauvaise qualité (Figure 14, bas).

50

" " " n

"

0; 00

o.1!!)

'" ...

Figure 14. Profils d'absorbance de 2 échantillons d'ADN distincts. En abscisses, la longueur d'onde en nm. En ordonnées, J'absorbance à 10 nm. En haut un échantillon d'ADN pur caractérisé par une courbe lisse.

En bas, un échantillon d'ADN contaminé caractérisé par une courbe dégradée.

2.1.2.3. Vérifi cati on de la guai ité des échanti lions pa r mi grati on sur gel d'aga rose

La qualité des échantillons d'ADN de 56 individus par famille retenue pour la

recherche de QTls a été vérifiée s urgel d'agarose à 1 % avant 1 eurenvoi à 1 a plate-forme de

génotypage de Toulouse pour le génotypage des SNPs (Figure 15).

51

Figure 15. Dosage de l'ADN de 8 échantillons. Le marqueur de taille est déposé de part et d'autre.

2.1.2.4. Amplification de l'ADN: la PCR

La PCR permet de ci bler un segment d'ADN pa rti culi er et de l'a mpl ifier afi n qu'i 1

devienne observable.

Elle consiste en une succession d'éta pes induites par des variati ons de température.

Tout d'a bord, une dénaturation de l'ADN-matrice permet la sépa ration des 2 bri ns d'ADN.

Puis, a u cours de 1 a phase d'hybridation, le couple d'amorces spécifique du segment ci blé se

fixesur les séquencesflanquantes du marqueur sur chacun des brins. Ensuite, une phase

d'élongation permet la polymérisation des brins d'ADN complémentaires à pa rtir de chaque

a morce. Ces 3 phases constituent un cycle de PCR. Afi n d'obtenir une quantité suffisa nte du

segment ciblé, 30 cycles sont nécessaires.

Les protocoles de PCR en simplexe et en multi plexe sont déta illés dans les Annexes 2

et 3.

2.1.2.5. 2.1.2.5.1.

Electrophorèse des produits de PCR Principe

Le génotypage a été réalisé à l'aide d'un séquenceur 16 capillaires (Applied

Bi osystems 3130xl GeneticAnalyzer®). Celui-ci permet de génotyper 16 échanti lions d'ADN

simultanément par le mécanisme de l'électrophorèse. Le polymère entraîne chaque

échanti lion le long d'un capillaire. Au cours de la migration, 1 es fragments sont sépa rés en

52

fonction de leur taille qui pourra alors être enregistrée puis analysée par le logiciel

Genemapper.

2.1.2.5.2. Protocole

Afi n de gagner du temps et de l'argent, les produits de PCR des marqueurs ampl ifiés

en simplexe ont été regroupés par 21 ors du génotypage. les produits de PCR en multi pl exe

contiennent les produits d'amplification de 3 marqueurs différents. Afi n de différencier 1 es

profi Is d'électrophorèse, les a morces des ma rqueurs mi crosatellites sont ma rquées à l'a i de

de fluorochromes de couleurs différentes (Tableau 4): NED, de couleur jaune, HEX, de

couleur verte et FAM de couleur bleue.

A ces produits de PCR, on ajoute un mix composé de 9 III de formami de (ma inti en

des fragments d'ADN simple brin malgré une éta pe de dénaturation de 5 mi nutes à 95°C) et

0,25 Illde marqueur deta ille ROX· (permet a u logiciel Genemapper de détermi ner 1 a ta i Il e

des fragments d'ADN amplifiés). Ce marqueur de ta i Ile, de couleur rouge, n' i nterfère pas

avec 1 es couleurs des fluorochromes de ma rquages des amorces. Sa ga mme (de 35 à 500pb)

couvre 1 argement l'a mpl itude de ta i Il e des fragments étudiés.

2.1.3. Une utilisation des marqueurs microsatellites : l'assignation de parenté

le séquençage à ha utdébit présenta nt un coût très élevé, il a fallu choisi r 3 fami Il es

parmi les 12 retenues précédemment. Avant d'affiner notre choix, nous avons voulu vérifi er

qu'a ucun mélange accidentel entre les familles n'avait eu 1 ieu . Pour cela, nous avons util isé

un multiplexede3 marqueurs microsatellites, leNicoplex(Tarisetal., 2005), et nous avons

génotypé 8 descendants F2 parfa mille (4 morts et 4 s urviva nts à l'épisode de morta 1 ités

estivales 2010) ainsi que 1 es parents Fi et les grands-parents FO. Aucun mélange n'aya nt été

constaté, le choix s'est portés ur3 familles dont les grands-parents avaient été sélectionnés

pour la survie. En effet, la sélection pourl'effort reproducteur n'ayant été réalisée que par

observation des gonades 1 ejour du croisement, ri en n' étaits ûrconcernant ce trait. De pl us,

ces fa mi Iles permettaient d'observer 1 a variabilité de l'effort reproducteura u sein de 1 ignées

sélectionnées pour la survie.

53

2.2. Les marqueurs SNPs

Un SNP (Si ngl e Nucleotide Polymorphis m) est une va riation d'une seul e pa i re de

bases du génome entre deux individus d'une même espèce. Chez l'huître creuse, on esti me

qu'i 1 existe un SNP toutes 1 es 40 pa ires de bases en moyenne (Cu roi e et Hedgecock, 2005 ;

Sauvage et al., 2007 ; Zhang et al., 2012).

2.2.1. Choix des marqueurs SNPs

En vue du génotypage,je me suis consacrée dès le début de ma thèse à 1 a recherche

bioinformatiquedeSNPs (SNPs in silico) surla base de données SIGENAE. Ceux-ci devaient

répondreauxcontraintes degénotypageimposées par la technique Illumina: absence de

polymorphisme da ns une région de 120 bases centrée surie SNP d'i ntérêt, à l 'extérieur des

régions répétées. Devant 1 e petit nombre de SNPs obéissant à ces critères (13), j'a i étendu

ma recherche en tolérant un fa ible polymorphisme a usein des régi ons fi anqua ntes. Ceci a

permis d'attei ndre 1 e nombre de 91 ma rqueurs. Au cours de mes recherches, j'ai éga 1 ement

intégré16 SNPs non répertoriés par SIGENAE. Cependant, les 107 SNPs ainsi trouvés ne

réponda nt pas à l'objectif de génotyper les individus pour384 marqueurs SNPs, nous avons

demandéà Messieurs Christophe Klopp, coordinateurdu projet SIGENAE au centre INRA de

ToulouseetCédric Cabau du centre INRA de Tours de nous fournir une nouvelle liste de

SNPs répondantà des critères moins sél ectifs que ceux publ iés sur la base de données en

1 igne. En effet, pour qu'un SNP appa ra isse sur 1 a base de données, il fa Il ait a u moi ns 7

séquences à 1 a position du SNP dont au moins 3 portant l'allèle mi noritaire. Nous leur avons

dema ndé d'a liéger ces contraintes en réduisant à 5 séquences à la positi on du SNP dont au

moins 2 portant l'allèle minoritaire.

Cette nouvell e recherche a permis d'allonger 1 a liste de ma rqueurs SNPs potentiels en

portant leur nombre à 307 au total répartis de la façon suivante:

• 78 SNPs répondant strictement a ux critères imposés par la technique Illumina

• 217 SNPs dans les régions de 61 bases de part et d'autre contena nt quel ques

polymorphismes éloignés du SNP d'intérêt

54

• 12 SNPs non retenus par les 2 recherches mais répondant au critère

précédent

Pourfinir, 77 SNPsin vitro ont été ajoutés à la l iste. Ceux-ci proviennent en partie

d'un séquençage de gènes potentiellement exprimés dans la gonade et 5 d'entre eux ont été

précédemment publ i és (Ba i et al., 2009) .

2.2.2. Génotypage des marqueurs SNPs

L'ADN uti 1 isé pour 1 e génotypage des SNPs corres pond à un sous -écha nti lion de

l'extraction d'ADN décrite précédemment. Le protocole utilisé a été fourni par les

pl ateformes de génotypage de Toulouse (Articl el et Arti cie 5) et de Bordea ux (Article 4).

2.2.3. Dosage de l'ADN par mesure de la fluorescence

La techni que Illumina éta nt très sens ibl e à la qua ntité d'ADN réellement contenue

da ns les échantillons, ceux-ci ont été dosés par mesure de la fi uorescence. Un intercalant de

l'ADN, le Pi coGreen "', est utilisé comme sondefl uorescente : sa fixation entre deux paires de

bases de la molécule d'ADN double bri n induit la formation d'un compl exe 1 umi nescent.

Cel ui -ci est excité à 510 nm puis le maxi mum de fi uorescence est 1 u à 527 nm. Ens uite, 1 a

valeur obtenue est comparée aux valeurs obtenues pour une gamme-étalon dont les

concentrations en ADN sont standardisées entre 0 et 100 ng/~L. Le protocol e de dosage au

PicoGreen '" est détaillé dans l'Annexe 4.

2.2.4. Développement des marqueurs SNPs 2.1.2.6 . Principaux résultats détaillés dans l 'Article 1

Cet a rti cie présente 1 e choix de marqueurs SNPs et 1 e développement de deux jeux de

384 marqueurs pour l ' huître creuse (Annexes 5 et 6) et l'huître plate à l'aide de la

technologie BeadXpress Illumina. Lechoixdes SNPs a été réalisé à partir de séquences de

gènes ou loci candidats pour des caractères d'intérêt, mais aussi à partir de bases de

données principalementtranscriptomiques. Chez l'huître creuse, qui nous intéresse dans le

cadre de cette thèse, les SNPs du premier type, dit « in vitro », ont été principalement

détectés à partir de l 'al ignement de séquences d'écha nti li ons d'huîtres provenant de 24

huîtres grands-parents de familles F2 ségrégeantes au sein desquelles se trouvent les 55

familles étudiées au cours de cette thèse. Le second type de SNPs , dits « in silico », a été

obtenu après une analyse du 6ème assemblage de 1 a base de données tra nscri ptomi ques de

C. gigas (http://public-contigbrowser.sigenae.org:9090/Crassostrea~igas/i ndex.html). Un

total de 307 SNPs in silica et de 77 SNPs in vitra ont été choisis.

Le succès de génotypage est de 70,3% et 1 etaux de conversion, qui n' i ncl ut que les

ma rqueurs polymorphes, est de 60,4%. Ces chiffres sont tout à fa it compa ra bl es à ceux

obtenus chez des es pèces dites non modèl es , c'est-à-di re ne dis posa nt pa s d'un nombre

importa ntd'i nformations génomiques ni du génome complet, comme c'éta it le cas au début

de notre étude. Une analyse par simulation a également été réalisée afin d'estimer le

nombre mi nimal de marqueurs nécessaires pour permettre des assignations de parenté chez

cette espèce dans le ca dre des progra mmes de sél ecti on en cours de développement. La

simulation s'est fondée sur des plans de fécondation tels que ceux réalisés au sein

d'écloseries privées et sur les fréquences des allèles minoritaires estimées dans des

popul ations sauvages incluses da ns ce j eu de données. Il sembl era it que 150 ma rqueurs

SNPs permettent de réa 1 iser, dans ces conditions, des ass ignati ons de pa renté puissa ntes.

Un total de 1278 individus ont été génotypés avec ces marqueurs, dont 1084

a ppa rtenant à quatrefa milles ségrégeant pour 1 a survie aux mortalités estivales de naissa i n

(partie IV). Dans un second temps, les SNPs n'ayant pas fonctionné dans ce jeu de

marqueurs, ont été rempl acés parde nouveaux marqueurs à partirdu 8 ème assemblage de la

base de données huître de SIGENAE et utilisés dans le génotypage de familles pour

1 esquelles des QTLs 1 iés à 1 a reproducti on et sa dyna mi que ont été recherchés (Parti e III,

Annexe 8).

56

2.1.2.7. Article 1: Development of SNP genotvping arrays in two shellfish species

« Développement de puces de génotypage SNPs chez deux es pèces de coqui liages )}

Sylvie lAPEGUE, Estelle HARRANG, Serge HEURTEBISE, Emilie FlAHAUW, Cécile

DONNADIEU, Philippe GAYRAL, Marion BALLENGHIEN, Lucie GENESTOUT, Laetitia

BAR BOTTE, Rachid MAHlA, Pierrick HAFFRAY, Christophe KLOPP - Molecular Ecology

Resources.

Cette étude étant un travail d'équipe, il est impartant de préciser les tâches que j'ai

effectuées, seule ou accompagnée par les coauteurs:

• La praduction et l'élevage des hUÎtres,

• L'extraction et le dosage de l'ADN au Nanodrop

• Le conditionnement de l'ADN en vue du génotypage

• La recherche des SNPs in si/ico

57

Molecular Ecology Resources July 2014, Volume 14, Issue 4, Pages 820-830 http://dx.doi.org/10.1111 /1755-0998.12230 © 2014 John Wiley & Sons Ltd

Arch imer http://archimer.ifremer.fr

Development of SNP genotyping arrays in two shellfish species

S. Lapègue" ', E. Harrang ', S. Heurtebise" E, Flahauw', C, Donnadieu" P. GayraI3,., M. Ballenghien3

, L. Genestout', L. Barbotte', R. Mahla', p , Haffray", C. Klopp'

1 Ifremer, SG2M-LGPMM, Laboratoire de Génétique et Pathologie des Mollusques Marins, La Tremblade, France , INRA, UMR444 Laboratoire de Génétique Cellulaire, Plateforme GeT-PlaGe Genotoul, Castanet-Tolosan, France 3 Université Montpellier 2, CNRS UMR 5554, Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier, Montpellier, France • Université François Rabelais , CNRS UMR 7261, Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte, Faculté des Sciences et Techniques, Tours, France ' LABOGENA, Domaine de Vilvert, Jouy-en-Josas, France 6 SYSAAF, Station LPGP/INRA, Rennes, France , INRA, Sigenae, UR875 Biométrie et Intell igence Artificielle, Castanet-Tolosan, France *: Corresponding author : Sylvie Lapègue, fax: (33) 5 46 76 26 11 ; email address : [email protected]

Abstract: Use of SNPs has been favored due to their abundance in plant and animal genomes, accompanied by the falling cost and rising throughput capacity for detection and genotyping. Here, we present in vitro (obtained from targeted sequencing) and in silico discovery of SNPs, and the design of mediumthroughput genotyping arrays for two oyster species, the Pacifie oyster, Crassostrea gigas, and European fiat oyster, Ostrea edulis. Two sets of 384 SNP markers were designed for two Illumina GoldenGate arrays and genotyped on more than 1000 samples for each species. In each case, oyster sampi es were obtained from wild and selected populations and from three-generation families segregating for traits of interest in aquaculture. The rate of successfully genotyped polymorphie SNPs was about 60% for each species. Effects of SNP origin and quality on genotyping success (Illumina functionality score) were analyzed and compared with other model and non-model species, Furthermore, a simulation was made based on a subset of the C. gigas SNP array wi th a minor allele frequency of 0,3 and typical crosses used in shellfish hatcheries. This simulation indicated that at least 150 markers were needed to perform an accu rate parental assignment. Such panels might provide valuable tools to improve our understanding of the connectivity between wild (and selected) populations and could contribute to future selective breeding programs,

Keywords: SNP genotyping ; GoldenGate technology ; Oysters ; Ostrea edulis\ ; Crassostrea gigas

1. Introduction Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are the most common type of heritable variation at the molecular level (Zhu et al. 2003). Their abundance in animal and plant genomes has led to their increased use in biological studies, from ecology to biology of evolution, and makes them an important tool for population and quantitative genetics studies. They are widely used, even in non-model species, to analyze genetic diversity and characterize genetic population structure, but are also useful in high-resolution genetic mapping, fine mapping of Quantitative Trait Loci (QTLs), linkage disequilibrium-based association mapping, parentage analyses, and marker-assisted selection (Garvin et al. 2010; Stapley et al. 2010; Ekblom et Galindo, 2011). However, their detection and genotyping still remain a challenge in non-model species for which the whole genome is not yet sequenced and assembled (Seeb et al, 2011), Even if a complete oyster genome sequence was released recently (Zhang et al. 2012), mollusks were not considered as model species although they are an important source of food for human consumption and include major fishery and aquaculture species ail over the world. Indeed they account for 23.6% of total aquaculture production (FAO 2011), By 2011 , global production of oyster species has reached 4,52 million tones, among which 105 300 tones for the Pacifie oyster, Crassostrea gigas in Europe. Additionally in Europe, mussels and the European flat oyster, Ost/'ea edulis, remain important aquaculture species, with culture based on natural recmitment from wild populations (mussels: 460 000 t; 0. edulis: 2300 t; FAO, 2011), As a result of their economic value, molecular markers have been developed over several decades to improve characterization of

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these species and tlleir populations and for use as tools in breeding programs. This work began with the use of allozymes and has since expanded to include mitochondrial sequences, AFLPs and microsatellites markers. Several hundred markers are now available in C. gigas allowing the development of Ule fu·st genetic maps (Hubert and Hedgecock 2004, Sauvage et al. 20 10). Although microsatellites remain the most commonly used markers for population genetic studies on non-model organisms (Guichoux et 01.2011) and for parentage assigruuent in aquaculture (Estoup et al. 1998; Haffray et al. 2012), they may be soon replaced by SNPs due to the recent increase of commercially available genome-wide SNP arrays and high-throughput customer-designed genotyping of targeted variants for biologically-focused research, but also the unreliability of microsatellites, rnainly because of allelic dropout. There are two main differences between microsatellites and SNPs. First, as already mentioned, SNPs are more numerous than microsatellites in tlle genomes of most species. Oysters are known for tlleir high genetic variability (Hedgecock et 0/. 2005). In Crassostrea gigas, one SNP per 60 bp has been observed in coding regions and one every 40 bp in noncoding regions (Sauvage et al. 2007). In C. virginica, the density of SNPs was estimated to be one every 20 bp on average (Zhang et 0/. 2010). In tlle European flat oyster a recent study estinlated an average density of one SNP every 76 bp in cocting regions and one evely 47 bp in non-coding regions (Harrang et 0/. 2013). Another important difference is tl13t the mutation rate per generation differs drastically belween the Iwo types of markers, being several orders of magnitude lower for microsatellites than for SNPs (Ellegren, 2000). As a consequence, SNPs are typicaUy diallelic (Krawczak 1999), whereas microsatellites generally have high allelic richness, reaching up to 20 aile les per locus in European flat oyster (Taris et al. 2009; Lallias et al. 2010) and even 40 alleies per locus in Pacific oyster (Rohfritsch et al. 20 13). Consequently, several SNPs are usually needed to atlain the same resolution as a microsatellite. On tlle basis of simulations, one may need two to three SNPs to equal tlle power of a microsatellite in linkage studies (Seddon et al. 2005). The ratio can be about five SNPs to one microsatellite in parentage analyses (G1aubitz et al. 2003), four to twelve SNPs for one microsatellite in genetic structure studies (Rosenberg et al. 2003), or five to Iwenty in association studies (Ohashi and Tokunaga, 2003). In QTL detection and fine genome mapping, increasing the number of markers would clearly be of interest and their usefulness would depend on the polymorphism present in the initial biological materia!. The abundance of SNPs in plant and animal genomes, togeUler with falling costs of detection and genotyping, and increased throughput have favored the use of SNPs in a wider range of studies. A large number of SNP-genotyping technologies have been developed in recent years (Gupta et al. 2008) including medium- to high-tlrroughput SNPgenotyping methods in nonmodel species (Garvin et al. 20 10). Among tllese, the GoldenGate Genotyping technology from Illumina has been reported to be a reliable technology allowing tlle genotyping of large collections of samples (up to 480) for thousands of SNP markers (up to 3072), with high levels of SNP conversion rate (number of polymorphic SNPs divided by the total number of SNPs in the array) and reproducibility (Ganal et al. 2009). This assessment was corroborated in outbred species with high levels of nucleotide diversity (Gratlapaglia et al. 20 II). We therefore chose this approach for the Iwo oyster species in this study, which are undomesticated and vely polymorphic at tlle nucleotide leve!. SNPs can be detected by amplicon resequencing targeting specific genes using large in silico sequence resources. In both Pacific oysters and European flat oysters large EST (Expressed Sequence Tags) databases already exist (Fleury et al. 2009; Morga et al. 2011,2012; Cahais et al. 2012, Gayral et al. 2013), allowing for an in silico approach to be used, whereas resequencing of arnplicons has already been performed ta detect a few SNPs in previous studies on linkage (Sauvage et al. 2010), population structure, or evolution (Rohfritsch et al. 2013; Harrang et al. 20 13). This paper describes tlle discovery and design of the first sets of384 SNP markers, combining in vitro and in silico detection approaches, in bath the Pacific and European flat oysters, llsing tlle Illumina BeadXpress genotyping system. As breeding programs are being developed for the Pacific oyster, we also included a simulation analysis for this species in arder ta investigate the potential use of a sub-panel of the array in parentage analysis.

Material and methods Bi%gical material For the Pacific oyster, biological material came from 1084 individuals from four different three-generation outbred pedigrees used for linkage and QTL mapping ofjuvenile ('spat') resistant to summer mortality. Furtherrnore, we added 194 samples from five European wild and selected populations, for a total of 1278 individuals. For the European fiat oyster, fewer individuals were used (1070 in total), but 434 of them were similarly from four different three-generation outbred pedigrees used for linkage and QTL mapping of bonamiosis resistance and 636 from 16 natural populations sampled ail over Europe. DNA was extracted from the oyster gills. A Wizard® DNA Clean-up System (Promega, Madison, Wisconsin, USA) was used when the samples were collected in 70% alcohol, and a QiAamp DNA mini kit (Qiagen) when the samples where fresh or frozen. DNA quantification was perfomled with a NanoDrop spectrophotometer (NanoDrop Technologies, LLC, Wilmington, DEL, USA). lt should be noted that ha If of tlle individuals from the C. gigas QTL families were dying when sampled, thus reducing the DNA quality.

SNP discovery aI/{l selectioll for array comtruc/ioll For each oyster species, two sets of SNPs were considered. Those that were detecled in sequences obtained by sequencing a subset of individuals for candidate genes will be referred ta as in vitro SNPs. 11lOse that were detected by al igning different sequences from contig databases will be referred to as in silico SNPs.

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Pacifie clIpped oysler For the Pacific oyster, in vitro sequencing investigated 103 loci from ESTs retrieved from the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.govl) or from specifie libraries that had been obtained to detect genes differentially regulated during summer mortality events (Fleury et al. 2009). Primers were designed USUlg the Primer3 software package (Rozen and Skaletsky 2000). For a [IfSt set of ESTs (n ~ 61), 24 oysters belonging to a third generation of selection for summer mortality resistance were used in the SNP discovery phase (Sauvage 2008; Sauvage et al. 2007). A second set of ESTs (n ~ 42) was then added and 10 of the 24 oysters were used for sequencing, as described in Sauvage et al. (2007), together with a third set of five SNPs from the 20 developed by Bai et al. (2009). Sequence alignment was performed with ClustalW via the BioEdit interface (Hall 1999) and DNAMAN version 4.1 (www.lynnon.com). The validity of each SNP was checked manually on the chromatograms and sequence alignments. For the in silico SNPs, we investigated in 2009 the 6th assembly of the Crassostrea gigas EST database (http://publiccontigbrowser.sigenae.org:9090/Crassostrea gigas/index.htrn l). The database contained results of the assembly of 55,851 public ESTs from dbEST and 417 Genbank rnRNA sequences. The assembly, perfomled Witll TGICL (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/; parameters -1 60 -p 96 -s 100000 -0 '-p 75 - s 500'), produced an alignment file from which 1370 SNPs were extracted. We looked for SNPs that omplied with the initial criteria: a minimum deptll of seven sequences, with a minimum allele count of three, and the absence of any other SNP in the 60 bp segment flanking the analyzed SNP to the left or right. As these conditions appeared too stringent, and did not produce many SNPs, we relaxed the criteria to a minimum depth of five sequences with a minimum allele count of !Wo, and allowed tl,ere to be a SNP within 120 bp of the SNP of interest, as long as there was only one and it was not close.

El/ropeall fiai oysler For the European fiat oyster, in vitro sequencing investigated 40 loci from !WO EST Iibraries (Morga et al. 20 II, 2012). Primers were designed using Primer3 software package (Rozen and Skaletsky 2000). A total of 22 oysters, 16 from four different natural populations collected on the Atlantic and Mediterranean coasts and six belonging to the fust generations of three selected families for resistance to bonamiosis were used to investigate polymorphisms. The PCR and sequencing protocols used were the same as those given in Harrang et al. (2013). Sequence alignment was perforrned with ClustalW via the BioEdit interface (Hall 1999). The validity of each SNP was checked individually on nucleotide sequences and sequence alignments. For the in silico SNPs, we investigated 0. edulis transcriptome sequence data from eight individuals from the natural range (http://kimura.univmonto2. frlPopPhyVindex . php?section~data,http://datadrvad.orgiresource/doi : 1 0.5061 Idryad.5 g32f94b/ l , Cahais et al. 2012, Gayral et al. 2011). For the present study, the 454 and Illumina reads were assembled using a multi-kmer strategy (kmers: 37, 41 , 45,49,53,57 and 61, assembled with Velvet version 1.1.03). Contigs longer than 100 bp fi·om every assembly were then meta-assembled with TGICL (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/). TIle Illumina reads were remapped on the contigs using BW A (0.5.9-rl6) and a compressed alignnlellt file was produced using SAMtools view (version 0.1.11 ). TIle alignment file was then used to call the SNPs with SAMtools pileup and varFilter (version 0.1.11). In this database, we looked for SNPs that represented different contigs, with a depth ranging fi·om 20 to 500 at the position and no other SNPs in the sWTOunding 120 bp. The SNP quality score was initially set at 20 but fmally, due to the high number ofSNPs available, we only used SNPs with the highest score of227. Finally in both species, a Iist ofSNPs was submitted to Illumina in order to acconunodate 384 attempted SNPs. An output file gave us important performance values including the Illumina Functionality Score that indicates the expected success of each SNP designed in a given array.

SNP gellotypillg array Illumina GoldenGate technology (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) was used for tlle genotyping reactions, which were performed in accordance with tlle manufacturer's protocol (Lin et al. 2009, Fan et al. 2006). Ten and four DNA samples were duplicated across the different plates for the Pacific and fiat oyster arrays, respectively, in order to assess the reproducibility of the genotyping assay. In total, 1278 cupped oyster and 1070 fiat oyster samples were genotyped. A negative control (water) was also added to each of the 15 plates of each assay. Data generated from tlle BeadXpressTM reader were analyzed with GenomeStudio for automated genotype clustering and calling. A quality score was produced for each genotype. GenCall and GenTrain scores measure the reliability of SNP detection based on the distribution of genotypic classes (AA, AB and BB). A GenCall score cutoff of 0.25 was applied to defme valid genotypes for each SNP and only those which attained a mu1Îmum GenTrain score of 0.25 were kept. These scores are the same stringent thresholds as those applied in previous studies on other species (human: Fan et al. 2003; trou!: Sanchez et al. 2009; pUle: Lepoittevin et al. 2010). TIle call rate was then calculated for each oyster sample as the number of SNPs for which a genotype was obtained, divided by the total number of SNPs. If the cali rate of a sample was below the cali rate of the negative control, the sample was discarded from the analysis. Furtllermore, sampi es were discarded if they showed a GC50 (rate of genotyping success for at least 50% of the SNPs for a single individual) too different (±0.01) from the mean of ail the sanlples.

60

Clusters were visually inspected ta ensure high data quality (Fig. 1). SNPs that did not show clear pattel11s of cluster separation were excluded from further analysis. Exclusion usually corresponded to situations of cluster compression (i.e. when the nonnalized theta va lues of the homozygous clusters were not in the [0, 0.1) or [0.9,1) ranges). Indeed, the compression of the BB homozygous duster towards the AA duster could result tram a paralogous gene matching the A allele, which would increase the signal for the A dye for bath BB and AB genotypes. The minor allele frequencies ofeach SNP (the frequency of the allele in minority: MAF) were calculated in bath arrays.

Parelltal assigllmeJlt power In the Pacific oyster, for which several breeding programs are being developed, we performed an analysis ta develop an efficient and accurate SNP panel for parental assigrunenl. We used AccurAssign® software (Barbotte et al. 2012), which uses the probabilities of Mendelian transmission of the markers and maxinmm likelillood for in silico validation. Briefly, the genotypes of parents and offspring ofa given cross are simulated on the basis of the allelic frequencies of tlle markers in a set of populations (we used the set provided by the four population samples of Pacific oyster). This method allows genotyping errors ta be taken into accounl. Then, the likelihood of a pair of parents for a given offspring is estimated. Four situations can arise: (1) the pair of parents is correct, (2) incorrect, (3) one parent cannat be assigned, or (4) neither of the parents can be assigned. In this study we compared six panels of 50, 75, 100, 150, 175 or 200 SNPs. The cross used to generate the simulated offspring involved 14 sires and 16 dams (each siTe was crossed with 3 dams), for 3 generations. Two hundred offspring were generated in total. The genotypes of ail parents and 200 offspring were simulated, and a genotyping error rate of 1 % and missing genotype rate of 5% were applied. We then compared the likelihood of each pair of parents, considering the difference belween the [lfst and second most likely pair of parents, and the four possible situations described above.

Resl/fts Construction of the SNP arrays For the Pacific oyster, 321 in vitro SNPs were detected in the first dataset of 61 sequenced fragments, and 380 in the second dataset of 42 sequenced fragments. Among those 701 SNPs, 72 were selected (39 and 33 from the Iwo datasets, respectively) because they had high functionality scores and no neighboring polymorphisms. However, as we wanted ta be sure that some genes of interest were represented in the SNP dataset, for several ESTs we kept Iwo SNPs. Therefore, our 72 selected in vitro SNPs were obtained from 65 different ESTs. Adding the five SNPs from Bai et al. (2009), !his gave a total of77 in vi/l'a SNPs to be included in the array, representing 70 different gene fragments. A total of307 in silico SNPs completed the array, which corresponded to 148 different contigs. The Illumina Functionality score (0 to 1), calculated by Illumina for each SNP, ranged from 0.406 ta 1 (Fig. 2). For the fiat oyster, a total of 420 in vitro SNPs were detected in the dataset of 40 sequenced fragments. Among them, the indels (n ~ 34) were discarded. Moreover, 347 SNPs were also discarded because ofneighboring polymorphisms or low functionality scores. However, as we wanted some genes of interest ta be represented in tlle SNP dataset, we kept some (n = 13) that had neighboring polymorphisms. Ta favor genotyping, those polymorphie nudeotides were treated as degenerated nucleotides. In total, 52 in vitro SNPs were induded in tlle array, representing 35 different gene fi·agments. In contrast, a total of 1305 in silico SNPs fitted the proposed criteria. Therefore, we chose the 332 in silico SNPs with the highest Illumina Functionality score (>0.935) ta complete tlle array (Fig. 2). Finally, for bath species, the SNPs were mainly chosen in the highest )0.9-1) dass of lllurnina Functionality scores (Fig. 2), especially for the in si/ico SNPs of 0. edulis CI 00%). However, sorne SNPs Witll lower scores were also selected (sometimes tllOse with scores even lower than the 0.6 recommended by lllurnina) because: (1) for in vitro SNPs, we wanted ta try ta keep as many SNPs as possible tllat were located in genes related ta traits of interest, (2) for C. gigas we did not have many SNPs, even after we relaxed tlle selection criteria. The Iist and characteristies of the SNPs in tlle Iwo arrays are given in Tables SI and S2.

Reprotll/cibilily ami Sl/ccess l'ale According ta the cali rate and GC50 estimated for the samples, 24 C. gigas and 29 0. edulis samples were excluded from furtller analyses, which correspond ta a loss ofrespectively 2.2% and 2.7 % of the samples. For the 10 replicated samples in the Pacific oyster and the 4 in the fiat oyster, the same genotype was observed over the replicates within or belween plates, giving a reproducibility rate of 100%. Based on the GenTrain score and visual inspection of the duster separation (Fig. 1), 232 SNPs were considered as polymorphie for C. gigas, while 38 were monomorphic and 114 failed. For 0. edulis, 234 SNPs were polymorphie, 67 were monomorphic and 83 failed. The main difference belween the Iwo arrays, when considering the Iwo types of SNPs (in silico and in vitro), cornes from the llÎgher percentage of in vitro SNPs that failed compared Witll in silico SNPs for 0. edulis (Fig. SI). Hence, for 0. edulis, in silico SNPs showed significantly higher genotyping success compared ta in vi/l'a SNPs (+30% with x2-test; p-value = 1.ge-06). For C. gigas, we observed independence belween the category of the SNPs (failed, polymorphie or monomorphic) and their origin (in silico, in vitro) with a x2-test pvalue of 0.05951. The GenTraill score distributions of tlle polymorphic SNPs were very similar for the Iwo species: 4% and 10% below 0.5,50% and 50% belween 0.5 and 0.8, and 47% and 39% above 0.8 for C. gigas and 0. edulis, respectively. We measured the overall genotyping success rate by dividing the nurnber of SNPs that were successfully genotyped by the total nurnber of SNPs in the assay. This rate induded both monomorphic and polymorphic SNPs. Then we

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measured the conversion rate, which only corresponds to the number ofpolymorphic SNPs, divided by the total number of SNPs in the assay, as defined by Fan el al. (2003). For C. gigas, the overall success rate was 70.3% and the conversion rate was 60.4%. These rates were vely similar to those measured for 0. edu/is where there was an overall success rate of78.4% and a conversion rate of60.9%. lnterestingly, this success was not striclly correlated with the Illumina functionality score (Fig. 3), but showed a significant increase afterthe score of 0.7, between 65 and 80% for C. gigas and 60 and 81% for 0. edulis (p-values of 0.0027 and 0.0001 , respectively). Finally, MAF indicated a bias toward lower allele frequencies for C. gigas (30% of SNPs, Fig.4), whereas in 0. edl/lis MAF distribution was more homogeneous between classes. ln C. gigas, we focused on a subset of203 SNPs successfully genotyped on 156 samples from four wild European and selected populations in order to assess the ass ignment power of the SNP panel. Estimations of mean MAF in these four populations were ail very close ta 0.3 (Fig. S2).

Power of SNP pal/els for pareI/lai assigl/Illel/t Based on the estimation of MAF in a subset of 203 SNPs and four wild and selected populations of C. gigas, simulations were performed in arder ta test the power of assignment of several SNP panels of different sizes (Fig. 5). With 150 markers, no pairs of parents were incorrect and the group of offspring assigned to both parents was distinguished from fa Ise positive results linked to one or two parents missing. Therefore, at least 150 markers from this panel with a mean MAF of 0.3 are needed to perform a powerful parental assignment.

Discussion ln non-model species, a classical approach to discovering SNPs relies on sequencing random genomic DNA fragments (Primmer et al. 2002) or targeting conserved regions of orthologous sequences from c10sely related species (Aitken el al. 2004). ln oysters, this second strategy was made possible by the availability of candidate genes for interesting aspects of Ille physiology, reproduction and immunology of the species (Huvet el al. 2004; Renault el al. 2011). Although this approach yielded a relatively low number of markers for a large effort, these markers have made an important contribution, allowing c1earer characterization of the genetic structure of populations (Rohfritsch el al. 2013), development of genetic maps and detection of QTLs of traits of interest in aquaculture (Sauvage el al. 2010). Moreover, SNPs dedved from ESTs are located in functional genes, which can help us ta establish potential links between functional genetic variation and these traits. Among the variety of tec1mologies available for SNP genotyping, our main con cern was ta use one that offered flexibility in terms of multiplexing, as we did not know how many SNPs could be retrieved after the in silico analyses. lIIunlina's GoldenGate arrays allowed 48-384 loci ta be genotyped in a single reaction with the BeadXpress platform, and 96-1536 with BeadArray platforrn. When comparing the two oyster species, we can see that database availability had an important influence on the ease of obtaining an array. Nevertheless, we had ta be less stringent for C. gigas SNP discovely in arder to retrieve enough usable SNPs. This can be observed with the Illumina functionality score (Fig. 2) where C. gigas had a lower proportion of in silico C. gigas SNPs between 0.9-1 (60%) compared with the 100% of in silico SNPs with a score of >0.9 in 0. edulis. However, when comparing the genotyping success between the species, the main difference between the two arrays is the higher percentage of in vilro SNPs tllat failed compared ta in silico SNPs for 0. edulis (Witll a 30% difference, Fig. SI) leading ta a poor conversion rate. For C. gigas, there was less variation between in silico and in vitro SNPs for the failed category (a 10% difference), altllough Illumina functionality scores were very similar between in vitro SNPs for C. gigas and 0. edulis (Fig. 2). Contrary ta our observations, a different conversion rate pattern between in silico and in vitro SNPs would generally be expected to favor in vitro SNPs (e.g. Lepoittevin el al. 2010). Genotyping failures could arise from low quality of SNP flanking sequences, or from tlle presence of an exon-intron junction near tlle SNP of interest (Wang el al. 2008). However, sequencing errors could be observed bath in in vitro and in si/ico SNPs because this step is performed in bOtll cases, leading ta fa Ise-positive SNPs (pseudo-SNPs). ln our case, the difference between the two arrays could have arisen from the fact that sorne of the in vitro 0. edl/lis SNPs were developed on oysters (tram the wild or from selected farnilies) that were eventually not included in tlle Illumina genotyping array. Hence the families tlley belonged to where not useful in our QTL analysis. Sorne of the in vitro SNPs proved ta be very rare and were not successfully genotyped in the panel of 1070 genotyped flat oysters. This genotyping failure could be partially explained by tlle high proportion of low Illumina functionality score for failed in vitro 0. edl/lis SNPs (48% below 0.7; 72% below 0.9). Thus, the genotyping success ofSNPs in 0. edl/lis could be particularly sensitive to tlle quality of the flanking sequences. Il should be noted tllat the C. gigas database is regularly updated and that the last assembly performed was the eighth, done in March 2011 (http://publiccontigbrowser. sigenae.org:9090/Crassostrea_gigas/index.htrnl). Although tlle database we explored in 2009 was based on results of the sixth assembly of 55,851 public ESTs from dbEST and 417 Genbank rnRNA sequences, !his same database now contains results of the 8th assembly of 1,013,570 public ESTs from dbEST and Genbank rnRNA sequences. Therefore, we can expect a far higher nwnber of potential SNPs to be included in future genotyping arrays and tlle recently whole sequenced genome (Zhang el al. 2012) ta be use fui in such developments. Without considerulg the SNP origin criteria, bath arrays were very similar in ternIS of GenTrain score distributions for polymorphie SNPs, indicating a good rate of genotyping success. When the GenTrauI scores were completed by a visual inspection of the c1usters (Fig. 1), the overall success rates were 70.3% and 78.4% for C. gigas and 0. edulis,

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respectively, and the conversion rates were 60.4% and 60.9%. The oyster rates fall within the range of values seen in other non-model species, such as 66.1 % to 71% in Eucalyptus (Grattapaglia et al. 2011), or 66.9% and 68.75% in the maritime pine (Lepoittevin et al. 2010; Chancerel et al. 2011), but are higher than the 40.6% obtained in catfish (Wang et al. 2008). TIle success rates are, however, very different from those success rates obtained in model species, which often exceed 80% as tlley can draw on more genomic databases or even on whole sequenced genomes (Hyten et al. 2008, Rostoks et al. 2006, Deulvot et al. 2010, Yan et al. 2010, Loridon et al. 2013). However, the conversion rate can drastically vary depending on the screening population used to detect SNPs. As a consequence, tlle conversion rate can be as 10w as 12.5-19.5% or 12.3-18.4% in F2 mapping families in maritime pine (Chancerel et al. 2011) or sugar pine (Jermstad et al. 20 Il) for SNPs tllat were not a priori screened for their polymorphism in tlle mapping pedigrees. On the contrary, the conversion rate reached 86% in a 384 array that was designed on the polymorphisms of the parents of the map in summer squashes (Esteras et al. 2012). ln non-model species particularly, genotyping failures may be due to (1) low quality of SNP flanking sequences, (2) the presence of an exon-intronjunction near the SNP of interest, or (3) the assembly and/or amplification of paralogous sequences, leading to false-positive SNP and patterns as observed in Figure 1 d. ln this last case, the shifting of tl]e Iwo homozygous clusters together has been observed, leading to a "cluster compression" (Hyten et al. 2008 Yan et al. 2010). Such SNPs patterns are discarded even when they show a clear cluster separation. GoldenGate technology is a robust technology for genotyping, even in non-model species. Although tl]e functionality score calculated by the lllumina Assay Design Tool gives a frrst indication of tl]e likelihood for a SNP to be successfully genotyped, even SNPs with low scores can still be genotyped. This is particularly important when SNPs of interest need to be included in an array, for example ifthey represent loci ofinterest (outliers in population genetics or QTLs to be included in a genotyping panel for use in selection). In the Iwo oyster arrays, respectively 30 and 50% of SNPs with lllumina functionality scores below 0.7 could be genotyped. The genotyping success increased greatly, to belween 60 and 80%, as !his score increased above the tlrresbold. The relationship belween lllumina score and genotyping success is in agreement with a number of other studies performed in non-model species (Lepoittevin et al. 2010; Pavy et al. 2008) and supports lllumina's recommendations of using SNPs with functionality scores above 0.6. However, in the oyster arrays, the threshold was 0.7 for a clear improvement in genotyping success. Botl] arrays in the present study were very powerful as they showed excellent reproducibility and only a few samples had to be excluded. Il should be noted that although half of tlle individuals from the C. gigas QTL families were dying when sampled, thus reducing the DNA quality, there was no notable reduction in tlle genotyping results. Wben considering the infornlativeness of arrays, the MAF parameter can reveal potential biases in interpreting genotyping data. ln the oyster arrays, we observed a particularly high number of C. gigas SNPs showing a low MAF (31% ofthe SNPs had a MAF below 10%). This could be a consequence of tl]e oyster panel used to detect in vitro SNPs. Hence, in vitro SNPs were detected on a small number of animaIs that were parents of families used in QTL studies and originated fi·om Marennes-Oléron bay. This could induce a bias on tl]e MAF of those SNPs. However the propOltion of in vilro SNPs with a MAF below 0.1 among ail SNPs was on the same order as the proportion of in vilro SNPs in the polymorphic SNP panel (respectively 20 and 17%). Consequently, tlle high number ofSNPs with a low MAF is mainly based on in silico SNPs. TIlis result in C. gigas could be explained by the difference in stringency applied for the SNP discovery belween the Iwo C. gigas and 0. edulis arrays: far enough SNPs even with the highest quality score of 227 in o.edulis but relaxed criteria of minimum depth and minimum allele count in C. gigas to get enough SNPs. The contrast might also arise fi·om differences in the nature of the data bases in which the in silico SNPs were detected or differences in the relative rarity of SNPs situated in genes of interest compared with those located elsewhere in the genome. Although next-generation genotyping promises to become a powerful tool for population genomics and genomic selection, low to medium arrays will continue to be sufficient for many applications, especially in non-model species (Seeb et al. 2011). TIle power and flexibility of the present array for Emopean fiat oyster will be used in several population studies at the European and bay scales in order to characterize tlle genetic diversity and structure of flat oyster populations, and to potentially identify discontinuities in the distribution of allele frequencies and signatures of selection. The C. gigas panel will be tested for characterization of the very closely related sub species C. gigas and C. angulala (Huvet et al. 2004) in order to confirrn admixture observed in nature and characterize a set of diagnostic markers for the development of tools to be applied for conservation and management of both species (e.g. Pritchard et al. 2012; Burgarella et al. 2009). TItis panel will also be used to characterize French Pacific oyster resources used to start selection programs. Furthermore, it might allow a better characterization of the QTLs associated with survival during summer (Sauvage et al. 2010). Even without marker-assisted selection, medium-tlrroughput genotyping technologies can be useful in oyster breeding programs that are in progress, to provide tools to improve stock management or genotyping ofmixed families in tlle hatchery. With such strategies in mind, we performed a simulation analysis to make an initial estimate of the number of markers necessary to provide a powerful tool for parental assignment in tlle Pacific oyster. For tlle four wild oyster populations, we observed mean MAF levels close to 0.3 for a subset of our array, which is also the value observed after the genotyping of families produced in shellfish hatcheries (Haffi·ay et al. 2013). We tlrerefore based om sinmlations on this value and observed tllat at least 150 markers from this panel with a mean MAF of 0.3 were needed to perform a powerful parental assigrunent. TItis result was tlle same order of magnitude as that estinrated for French bovine parental assigmnent (Barbotte et al. 2012), wltile considering crosses relevant for shellfish hatcheries (P. Haffray, pers. com.). TItis panel could be useful in parental assignment in breeding programs but also in restocking programs that are being

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considered for the Pacific oyster. Finally these first SNP panels will likely be improved, especially that for C. gigas, which will bene fit from the availability ofnew transcriptomic assemblies and the recently sequenced genome (Zhang el al. 2012).

Acknowledgements The authors wish to thank the organizers and partners of dle projects that supported dlis research: GigADN, funded by FranceAgrimer (contract nOSIVAL NL: 2010-1021), Witll dIe active participation of Gildas Gautier (SFC breeding company, Noirmoutier France) and Marc Vandeputte (INRA); GAMETOGENES (ANR-08-GENM-041), funded by a grant from the Agence Nationale de la Recherche 'Génomique animale' Progranune (ANR-08-GENM-041); SEAF ARE (Sustainable and Environmentally Friendly Aquaculture for the Atlantic Region of Europe - n02009-1/123), funded by dle Atlantic Area Transnational Program (2007- 2013); and Hi-Flo, funded by dle Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-blanc-0334-01). TIlis work was also suppOlted by a European Research Council grant (ERC PopPhyl 232971) coordinated by Nicolas Galtier. The authors are grateful ta ail members of staff of the IfTemer hatchery in La Tremblade and of the nursery in Bouin for producing and rearing dIe oysters. The authors wish to acknowledge the support from the Genomic platform of Genopole Toulouse Midi Pyrénées, on which dle genotyping work was performed. The authors also wish ta thaok Bureau de Traduction de l'Université de Brest (Helen McCombie) for English editing.

Refel'ences Aitken N, Smith S, Schwarz C, Morirl PA (2004) Sirlgle nucleotide polymorphism (SNP) discovery in mammals : a targeted-gene approach. Mo/ecu/al' Ec%gy, 13, 1423-1431. Bai J, Li Q, Kong LF el al. (2009) Characterization of20 single nucleotide polymorphism markers in the Pacific oyster (Crassoslrea gigas). Anima/ Genetics, 40,1004-1005. Barbotte L, Boichard D, Genestout L, Haffray P, Chapuis H, Chantry-Dannon C, Boscher M. Y. (2012). A new parental assigmnent tool for complex mating and large number of animais. In Abslracl Book 33rd Conference of the Internationa/ Society for Anima/ Genetics (p. 100), Cairns, Australie. Burgarella C, Lorenzo Z, Jabbour-Zahab R et al. (2009) detection of Hybrids in nature: application to oaks (Quercus suber and Q. ilex). Heredity, 102,442-452. Calmis V, Gayral G, Tsagkogeorga G, Melo-Ferreira J, Ballengllien M, Weinert L, Chiari Y, Belkhir K, Ranwez V, Galtier N (2012) Reference-free transcriptome assembly in non-model animaIs next-generation sequencing data. Mo/ecu/al' Ec%gy Resources, 12, 834-845. Chancerel E, Lepoittevin C, Le Provost G et al. (20 II) Development and implementation of a higly-multiplexed SNP array for genetic mapping in maritime pine and comparative mapping with loblolly pine. BMC Genomics, 12, 368. Deulvot C, Charrel H, Marty A, Jacquin F, Donnadieu C, Lejeune-Hénaut l, Burstin J, Auber! G (2010) Higlymultiplexed SNP genotyping for genetic mapping and germplasm diversity studies in pea. BMC Genomics, 11,468. Ekblom R, Galindo J (2011) Applications ofnext generation sequencing in molecular ecology ofnon-model organisms. Heredity, 107,1-15 . Ellegren H (2000) Microsatellite mutations in the gerrnline: implications for evolutionary inference. Trends in Genetics, 49, 746-756. Estoup A, Gharbi K, SanCristobal M, Chevalet C, Haffray P, Guyomard R (1998) Parentage assigument using microsatellites in turbot (Scophta/mus maximus) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hatchery populations. Canadian Journal ofFisheries and Aquatic Sciences, 55, 715-725. Esteras C, Gomez P, Monforte AJ et al. (2012) High-dlfoughput SNP genotyping in Cucurbita pepo for map construction and quantitative trait loci mapping. BMC Genomics, 13, 80. Fan JB, Oliphant A, Shen R et 0/. (2003) Highly parallel genotyping. Co/d Spring Harbor ymposia on Quantitative Bi%gy, 68, 69-78. Fan JB, Gunderson KL, Bibikova M et 0/. (2006) Illumina universal bead arrays. Methods in Enzym%gy, 410, 57-73 . Fleury E, Huvet A, Lelong C, et al. (2009) Generation and analysis ofa 29,745 unique Expressed Sequence Tags from dle Pacific oyster (Crassostrea gigas) assembled into a publicly accessible database: the GigasDatabase. BMC Genomics, 10, 341. Ganal MW, Altm3lill T, Roder MS (2009) SNP identification in crop plants. Current Opinion in Plant Bi%gy, 12, 211-217. Garvin MR, Saitoh K, Gharrett AJ (2010) Application of single nucleotide polymorphisms to non-model species: a technical review. Mo/ecu/or Ec%gy Resources, 10,915-934. Gayral P, Weiner! L, Chiari Y, Tsagkogeorga G, Ballenghien M, Galtier N (2011) Nextgeneration sequencing oftranscriptomes: a guide ta RNA isolation in non-model animais. Mo/ecu/or Ec%gy Resources, 11, 650-661. Glaubitz JC, Rhodes OE, DeWoody JA (2003) Prospects for inferring pairwise relationships with single nucleotide polymorphisms. Mo/ecu/or Ec%gy, 12, 1039-1047. Guichoux E, Lagache L, Wagner S et 0/. (2011) Current trends in microsateIIite genotyping. Mo/ecu/al' Ec%gy resources, 11, 591-611.

64

Grattapaglia D, Silva-Junior 0, Kirst M, Marco de Lima M, Faria DA, Pappas Jr GJ (2011) SNP genotyping in the highly heterozygous genome of Eucalyptus: assay success, polymorphism and transferability across species. BMC Plant Bi%gy, 11, 65. Gupta PK, Rustgi S, Mir GG (2008) Array-based high-throughput DNA markers for crop improvement. Heredity, 101, 5-18. Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nue/eie Aeids Symposium Series, 41, 95-98. Haffray P, Vandeputte M, Petit V, Pincent C, Chatain B, Chapuis H, Meriaux JC, Coudurier B, Quillet E, Dupont-Nivet M (2012). Minimizing maternai effect in salmon id families mixed since eyed stages and a posteriori DNA-pedigreed. LivestockScience, 150, 170-178. Haffray P, Bugeon J, Rivard Q, Quittet B, Puyo S, Allamelou lM., Vandeputte M., Dupont-Nivet M (2013). Genetic parameters of in-vivo prediction of carcass, head and fillet yields by internai ultrasoWld and 2D external imagely in large rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). In press in Aquacu/ture. Haffray P, Genestout L, Barbotte L, Lapègue L (2013) GigADN : Tentative de mise au point du contrôle de fùiation avec des marqueurs ADN chez l'huître creuse. Rapport final FranceAgrmer, 27pp. Harrang E, Lapègue S, Morga B, Bierne N (2013) A high load ofnon-neutral amino-acid polymorphisms explains high protein diversity despite moderate effective population size in a marine bivalve with sweepstakes reproduction. Genes Genomes Genelics, 3,333-341. Hedgecock D, Gaffuey PM, Goulletquer P, Guo X, Reece K, Warr G (2005) A case for sequencing the Pacific oyster genome. Journal ofShe/lfish Resem'ch, 24, 429-441. Hubert S, Hedgecock D (2004) Linkage maps ofDNA microsatellite markers for the Pacific oyster Crassostrea gigas. Genetics, 168, 351-362. Huvet A, Fabioux C, McCombie H, Lapègue S, Boudry P (2004) Natural hybridization between genetically differenciated populations of Crassostrea gigas and C. angu/ata highlighted by sequence variation in flanking regions of a microsatellite locus. Marine Ecology Progress Series, 272, 141- 152. Hyten DL, Song Q, Choi 1-y et al. (2008) High-Throughput genotyping with the GoldenGate assay in the complex genome of soybean. Theoritica/ and Applied genetics, 116,945-952. Jermstad KD, Eckert AJ, Wegrzyn JL et al. (2011) Comparative mapping in pinus: sugar pine (Pinus lamberliana Dougl.) and loblolly pine (Pin us taeda L.). Tree Genetics and Genomes, 7,457-468. KIawczak M (1999) Informativity assessment for biallelic single nucleotide polymorphisms. Electrophoresis, 28, 1676-1681. Lallias D, Boudry P, Lapègue S, King J, Beaumont AR (2010) Strategies for the retention of high genetic variability in European flat oyster (Ostrea edulis) restoration programmes. Conservation Genetics, 11, 1899-1910. Lepoittevin C, Frigerio J-M, Garnier-Géré P et al. (2010) In vitro versus in silico detected SNPs for tlle development of a genotyping array: what can we learn from a non-model species? P10s ONE, 5, e11034. Lin CH, Yeakley JM, McDaniel TK, Shen R (2009) Medium- to high-throughput SNP genotyping using VeraCode Microbeads. In: Bugert P, ed. DNA and RNA Profùing in Human B1ood. New York: Humana Press. Pp 129-142. Loridon K, Burgarella C, Chantret N et al. (2013) Single-nucleotide polymorphism discovery and diversity in the model legume Medicago tr!lncatula. Molecu/ar Ec%gy Resources, 13, 84-95. Morga B, Arzul l, Faury N, Segarra A, Chollet B, Renault T (2011) Molecular responses of Ostrea edl/lis haemocytes to an in vitro infection with Bonamia ostreae. Developmental & Comparative Immun%gy, 35, 323-333. Morga B, Renault T, Arzul 1 (2012) New insights in flat oyster Ostrea edl/lis resistance against the parasite Bonamia ostreae. Fish & She/lfish Immunology, 32, 958-968. Ohashi J, Tokunaga K (2003) Power of genome-wide linkage disequilibrium testing by using microsatellite markers. Journal of Human Geneties, 48, 487-491. Pavy N, Pelgas B, Beauseigle S et al. (2008) Enhancing genetic mapping of complex genomes through the design of higly-multiplexed SNP arrays : application to the large and unsequenced genomes of white spruce and black spruce. BMC Genomies, 9, 17. Primmer CR, Borge T, Lindell J, Saetre GP (2002) Single-nucJeotide polymorphisll1 characterization in species with limited available sequence information: high nucJeotide diversity revealed in the avian genome. Molecu/ar Ec%gy, Il, 603-612. Pritchard VL, Abadia-Cardoso A, Garza JC (2012) Discovery and characterization ofa large number of diagnostic markers to discriminate Oncorhynehus mykiss and 0. c1arkii. Mo/ecu/al' Ecology Resourees, 12, 918-931. Renault T, Faury N, Barbosa-Solomieu V, Moreau K (2011) Suppression substractive hybridisation (SSH) and real time PCR reveal differential gene expression in the Pacific cupped oyster, Crassostrea gigas, challenged with Ostreid herpesvirus 1. Developmenta/ and comparative immun%gy, 35, 725-35 . Rohfritsch A, Bierne N, Boudry P, Heurtebise S, Cornette F, Lapègue S (2013). Population genomics shed Hght on the demographic and adaptive histories of European invasion in the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Evolulionaty Applications, doi: 10.1 1II /eva.12086.

65

Rosenberg NA, Li LM, Ward L, et al. (2003) Informativeness of genetic markers for inference of ancestry. American Journal ofHuman Genetics, 73,1402-1422. Rostoks N, Ramsay L, Mackenzie K el al. (2006) recent history of mtificial outcrossing facilitates whole-genome association mapping in elite inbred crop varieties. Proceedings of Ihe National Academy of Sciences, 103, 18656-18661. Rozen, S, Skaletsky H (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Melhods in Molecular Biology, 132, 365-86. Sanchez CC, Smith TPL, Wiedmann RT el al. (2009) Single nucleotide polymorphism discovery in rainbow trout by deep sequencing ofa reduced representation library. BMC Genomics, 10, 599. Sauvage C, Bierne N, Lapègue S, Boudry P (2007) Single nucleotide polymorphisms and their relationship to codon usage bias in the Pacific oyster Crassoslrea gigas. Gene, 406, 13- 22. Sauvage C (2008) Development of molecular markers associated with resistance to summer mortality in oyster Crassostrea gigas - QTL approach. PhD Thesis, University of La Rochelle, France, 272 pp. Sauvage C, Boudry P, de Koning D-J, Haley CS, Heurtebise S, Lapègue S (2010) Quantitative Trait Loci for resistance to summer mortal ity and OsHVI load in the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Animal Genetics, 41, 390-399. Seddon JM, Parker HG, Ostrander EA, Ellengren H (2005) SNPs in ecological and conservation studies: a test in the Scandinavian wolf population. Molecular Ecology, 14, 503-511. Seeb JE, Carvalho G, Hauser L, Naish K, Roberts S, Seeb LW (2011) Single-nucleotide polymorphism (SNP) discovery and applications ofSNP genotyping in nonmodel organisms. Molecular Ecology Resources, 11 (Suppl.l), 1-8. Stapley J, Reger J, Feulner PGD el al. (201 0) Adapatation genomics : the next generation. Trends in Ecology and Evolution, 25, 705-712. Taris N, Boudry P, Bonhomme F, Camara MD, Lapègue S (2009) Mitochondrial and nuclear DNA analysis of genetic heterogeneity among reclUitment cohorts of the European flat oyster Ostrea edulis. Biological Bulletin, 217, 233-24 1. Wang S, Sha Z, Sonstegard TS, Liu H, Xu P, et al. (2008) Quality assessment parameters for EST-derived SNPs from catfish. BMC Genomis, 9, 450. Yan J, Yang X, Shah T et al. (2010) High-Tlu'oughput SNP genotyping with the GoldenGate assay in maize. Molecular Breeding, 25, 441-451. Zhang LS, Guo XM (2010). Development and validation of single nucleotide polymorphism markers in the eastern oyster Crassoslrea virginica Gmelin by mining ESTs and resequencing. Aquaculture, 302, 124-129. Zhang G, Fang X, Guo X et al. (2012) The oyster genome reveals stress adaptation and complexity ofshell formation. Nalure, 490, 49-54. Zhu YL, Song QJ, Hyten DL, Van Tassell CP, Matukurualli LK, Grimm DR, Hyatt SM, Fickus EW, Young ND, and Cregan PB (2003) Single-nucleotide polymorphisms in soybean. Genetics, 163,1123-1134 .

Data Accessibility Lists and characteristics of the 384 SNPs of the Pacific oyster array: Table SI Lists and characteristics ofthe 384 SNPs of the European flat oyster: Table S2 Aligmnents of in vitro and in si/ico sequences used to select the SNPs to be included in the alTays: DRY AD entry doi: 1 0.5061 /dryad.j r233. Author Contributions SL conceived the protocols and wrote Ule fU'st draft ofUle manuscript. EH, SH, EF, CD, PG, MB, CK participated in the choice of the in silico and in vitro SNPs. SL, SH, CD performed Ule SNP genotyping, and SL, LG, LB, RM, PH participated in testing the power of the panel assignment through simulations. Ali authors participated in the writing of the manuscript. Figure Legeods Fig. 1 Examples of clustering results obtained for the Crassosh'ea gigas SNP array. Each dot represents a single oyster sample from a subset of936 C. gigas samples and four SNPs. The y axis (NOlTl1 R) is the normalized sum of intensities of the two dyes involved, and the x axis (Norm Theta) represents the normalized Thela between 0 (homozygous for allele A) and 1 (homozygous for allele B). (a) Pattern considered as successful and polymorphic WiUI Ule three clusters (AA in red, AB in pm'Ple, BB in blue). (b) Atypical pattem with tbree heterozygous clusters, which was nevertheless considered successful because Ule two clusters corresponded to samples from UU'ee different populations and the different clusters were weil separated. (c) Pattern considered as successful but monomorphic. (d) Pattern showing ambiguous clustering WiUI a low intensity, considered as a failed SNP. Fig. 2 Illmnina Functionality scores of the SNPs from the C. gigas and 0. edulis arrays according to their in vitro or in silico origin. Fig. 3 Percentages of SNPs that were successfully genotyped in relation to their Illmnina Functionality score for each array. Fig. 4 Allele Ihquency spectrum for the 232 and 234 polymorphic SNPs genotyped in C. gigas and 0. edl/lis populations, respectively. Fig. 5 Distribution of minimum LOD score (minLOD) and difference between minimum LOD score and the LOD score for the next most likely sire-dmn pair (Delta). Correct (green dots) and incorrect (red dots) assignments of male-

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female parent pairs are plotted for analyses with botll parents present in the genotyped sampi es. Also plotted are the minLOD and Delta obtained when one parent was not present (dark blue dots), and when neither parent was present (light blue dots). Supporting Information Table SI List and characteristics of the 384 SNPs of the Pacific oyster array. Table S2 List and characteristics of the 384 SNPs of the European flat oyster array. Fig. SI Percentage of SNPs for which the genotyping failed, or that were considered as polymorphic or monomorphic according ta their in vitro or in silico origin and for each array. Fig. S2 Box plot representation of minor allele frequency (MAF) in a subset of four C. gigas populations (LAF ~ La Fumée, France; MAR ~ Marennes, France; ARE ~ Arcachon, France; DAN ~ Danemark) for a panel 203 SNPs that were polymorphie in this subset.

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3. Nouvelle technique de suivi de la gamétogenèse : l'Imagerie par Résonance Magnétique

3.1. Contexte

On cons idère que l'effort reproducteur peut être a pproché par la ta ille de 1 a gonade.

La taille de la gonade de l'huître creuse est estimée via une coupe histologique. Bien

qu'effi cace, cette méthode s'avère destructive: 1 a coupe da ns 1 a masse viscéra 1 e entraîne

nécessairement la mort de l'animal. L'histologie ne permet donc pas le suivi d'un même

individu pendant la totalité de la période de gamétogenèse. Or, dans le cadre de ma thèse, il

a ppa raissait indispensable d'en apprendre dava ntage s ur le comportement physi 01 ogique

des individus au cours d'une saison de reproduction incluant un épisode de morta lité

estiva 1 e.

Des études précédentes (Pouvreau et al., 2006; Hatt et al., 2009) ont mis en

évidence que 1'1 RM permet d'observer l'a natomi e de l'huître à travers sa coqui Ile et, pa r

conséquent, sans incidence apparentesur la survie de l'a nimal. De pl us, 1 a richesse en 1 i pides

de la gonade de l'huître en fa it un organe facilement observable par 1 RM et l'observation des

a ni maux a u cours de pl usieurs séances 1 RM offre la poss i bi 1 ité de suivre son évol uti on au

cours d'une saison de gamétogenèse.

Si 1 e ma i ntien en vie des individus était un a rgument de poids da ns le choix de cette

nouvel le technique, il fallait également s'assurer que les conclusions ti rées de l'observati on

des imagesétaientcomparablesauxobservationsclassiques. Nous avons donc sacrifié un

échantillon d'individus pour procéder à des coupes histologiques à l'issue de différentes

séances d'IRM.

3.2. L'Imagerie par Résonance Magnétique

L'I magerie par Résona nce Magnétique est une technique d'i magerie coura mment

uti 1 isée pa r le corps médical. Non-invasive, ell e permet d'observer l'i ntéri eur du corps du

patientsans avoir besoin de l'i rradier. En effet, elle repose sur les propriétés quantiques des

noyaux atomiques: un aimant très puissant diffuse un champ magnétique qui permet

l'alignement des moments magnétiques de spin propres à chaque particule. Puis, des

69

cha mps magnéti ques oscillants moins intenses modifi ent cet alignement pour produi re un

signal él ectromagnétique. C'est ces ignal qui sert à localiser les différents t issus via l ' IRM. Les

huîtres ont été imagées par un appareil d'I RM médical, le Si emens Ava nto l ,ST (Figure 16),

a u sei n de l ' unité PRISM de 1'1 RSTEAde Rennes. Afi n que le cha mp magnéti que soit le pl us

homogène pos sible, 1 es huîtres ont été pl acées à l' intérieur d'une a ntenne tête (Fi gure 17),

prévue pour explorer l'encéphale humain. Pour pouvoir imager 15 huîtres simultanément,

un système de plateaux en plexiglass superposés a été conçu (Figure 18).

~ . -

Figure 16. Siemens Avanto l,ST.

Figure 17. Antenne tête utilisée pour homogénéiser le champ magnétique autour des huîtres.

70

DD

Figure 18. Sys tème de plateaux conçu pour nmagerie des hUÎtres.

3.3. Validation de la technique d'Imagerie par Résonance Magnétique 3.3.1. Principaux résultats détaillés dans l'article 2

La comparaison des i mages obtenues pa r 1 RM et pa r histologie a été réal isée à deux

nivea ux :

• d'un poi nt de vue qual itatif, nous avons pu défi ni rune échell e de stades de

maturité inspirée de l'échelle de Steele et Mul ca hy (1999) mais fondée s ur 1 es

critères observables s ur les images 1 RM. Nous avons éga lement pu définir des

critères objectifs pouridentifi er le sexe des i ndivi dus matures. En effet, les

gonades femelles apparaissent à un niveau de gris pl us élevé (donc plus cl air)

que les gonades mâles (Figure 19) .

Figure 19. Images obtenues par IRM de deux huÎtres creuses matures}

une f emelle là gauche) et un mâle là droite) .

• d'un pointdevuequantitatif, une corrélation fortement significative a été

mise en évi dence entre 1 as urface gonadique mesurée sur 1 es images 1 RM et 1 a

surfacegonadique mesuréesur les images des coupes histologiques . Une

corrélation fortement significative a également été identifiée entre cette

dernière et 1 e vol ume de la gonade estimé grâce à l'ensemble des images 1 RM

71

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(Figure 20). Cependant, des éléments somatiques de niveaux de gris

équiva lents à ceux de 1 a gonade aya nt pu être intégrés à ,'esti mati on de ce

vol ume, une incertitude de l'ordre de 29% demeure 5 ur la va 1 eur du vol ume

gonadique.

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•

•

• •

o • o o ~ :

o 50 100 150 200 250 Gonad area by Histology

Figure 20. Corrélation entre la surface gonadique estimée sur les coupes histologiques et le volume gonadique estimé à partir des images IRM.

3.3.2. Correction des incertitudes

L'article 2 fait état d'une incertitude de 29% pour l'estimation du volume de la

gonade. Celle-ci avait été estimée à partir des écarts à la droite de régression entre le

volume de la gonade estimé par IRM et la surface de la gonade estimée par histologie

(Figure 20). Afi n d'amoindrir cette incertitude, les images à l'origine des points extrêmes ont

été réexa mi nées. Les éca rts importants éta ientdus à des anomalies de l'i mage. La correction

de ces a nomalies a permis de réduire l'incertitude. Cependant, 1 es différences induites par la

pos ition des huîtres sur les plateaux n'ont pas pu être compensées pa r le cal cul d'un terme

correctif. En effet, le sca nner utilisé est régi é a utomatiquement et l'expérimentateur n'a pas

réussi à intégrer un terme correctif dans les paramètres.

72

3.3.3. Article 2: « Gonad volume assessmentin the oyster Crassostrea gigas: Comparison between a histological methodand a magnetic resonance imaging (MRII method »

« Eva 1 uation du volume de 1 a gonade de l'huître Crassostrea gigas : Compa ra ison

entre une méthode histologique et une méthode d'Imagerie par Résonance Magnétique

(IRM) »

Emi 1 i e FLAHAUW, Stépha ne QUELLEC, Armel DAVENEL, Li onel DEGREMONT, Sylvi e

LAPEGUE, Phi 1 i ppe-Jacques HATT- Publ i é da ns Aquaculture en 2012

Cette étude étant un travail d'équipe, il est important de préciser les tâches que j'ai

effectuées, seule ou accompagnée par les coauteurs:

• La production, l'élevage, le conditionnement et le marquage des hUÎtres,

• L'histologie, de la fixation à l'analyse des coupes,

• L'analyse des images IRM.

73

Aquaculture December 20 12, Volumes 370-371, Pages 84-89 http://dx.do i.orgl IO. 1 0 16/i.aquaculture 20 12.10.008 © 2012 Elsevier B.V. Ali rights reserved.

Al'cbimcl' h tin :11 a rchimcr. ifre",er. fr

Gonad volume assessment in the oyster Crassostl'eu gigus: Comparison between a histological method and a magnetic resonance imaging (MRI) method

Emilie Flahauw', Stéphane Quellec b, ',Armel Davenelb, " Lionel Degremont', Sylvie Lapegue', Philippe-Jacques Hatt"

*

'!fremer, AGSAE LGP, Mus du Loup, 17390 La Tremblade, France b Irstea, IRM Food, 17 Avenue de Cucillé, CS 64427, 35044 Rennes Cedex, France cUniversité Européelme de Bretagne, France

*: Corresponding author: Philippe-Jacques Hatt, Tel.: + 33546762649; fax: + 33546762611 ; email address : [email protected]

Abstract: Previous studies comparing Crassas/rea gigas selected lines with different susceptibility to summer mortality concluded that the higher the reproductive effort the lower the survival. But tbey were lacking individual follow up of this reproductive effort which would be of great interest to help us to understand the physiology of the oysters facing summer mortalities. The most frequently used method for assessing the volume of the gonad is to measure the area it oecupies on histological sections. Gonad measurement by magnetic resonance imaging, in contrast, is non-destructive and therefore makes it possible to assess individual evolution as weil as to compare individuals. The present study compared the values of gonad volume by this method with the values of gonad surface obtained by the histological method. The Iwo methods were used successively to assess the volume of the gonads of the same individual oysters at different maturation stages. There is a vely highly significant linear relation belween the results of these Iwo methods. The estimated unceltainty about the volume value is 29%. Causes ofthis uncertainty are considered and discussed.

Highlights

~ How to measure the gonad development of one oyster Crassas/rea gigas? ~ Gonad volume on MRI and gonad surface on histological slides are highly correlated. ~ Uncertainty of the measure by use ofMRI is estimated.

Abbreviations ANOV A, Analysis of variance; MRI, Magnetic resonance imaging ; ROI, Region of interest

Keywords : Oyster ; Crassas/rea gigas ; Reproduction; Histology ; Magnetic resonance imaging ; MRI

1. Introduction Oysters are a major aquaculture species produced along the coasts of France. In 2010, the total French production consisted of 82 800 T Pacific oyster Crassasn'ea gigas and 1300 T European fiat oyster Dsn'ea edulis (FranceAgriMer, 2011). However, since 2008, significant mortality has affected C. gigas spat in ail French oyster production areas. Over the years, these high mOltality rates have led to seed-supply problems in most shellfish fanning areas. Moreover, both types of spat- hatchery and capture--are affected by the pbenomenon. As resistance to swnmer mortality is a highly beritable character (Dégremont et al., 2010), genetic selection is underway to improve the survival of fanned oysters. A national pro gram has been established that will select improved strains and distribute them to oyster faims. The diagnosis of the causes of these mortalities is based on the analysis of environmental factors, farming practices, occurrences ofnew pathogens, and oyster physiology (Samain et al., 2007, Huvet et al., 2010, Segarra et al. 2010). The common practice for studying oyster biology in oyster beds is to sacrifice sampled oysters and make direct observation of theu' who le soft tissues and microscopic observation of histological sections. Consequently, oysters cannot be followed individually over time, which prevents the measm'ement of some physiological parameters and, more importantly, prevents the monitoring of individual phenotypes over the maturation period. A new technique has recently been tested that offers a non-destructive alternative to tbese methods. The first analyses of C. gigas by magnetic resonance imaging (MRI)(Davenel et al., 2006, Pouvreau et al., 2006a) concluded that the MRI technique is able to quantify the volume and mass of the whole f1esh and of sorne organs in a non-destlUctive way, thereby allowing the observer to follow the growth of individual oysters over time. Considering the large investrnent oys!ers make in reproduction (Bourles et al. , 2009, Deslous-Paoli and Héral, 1988, Pouvreau et al., 2006b) and the observation of selected oyster lines with different gonad average sizes and different susceptibilities to smnmer mortality (Samain et al. , 2007, Huvet et al., 2010), the gonad was considered a priority organ for study. Further research using the MRI method

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highlighted a positive relationship between the effort devoted ta reproduction and subsequent growth of the tissues and showed that growth variability within a group of oysters was overestimated by the more commonly used histological method (Hatt et al., 2009). The most commonly used method for assessing the volume of the gonad is ta measure the area it occupies on histologieal sections (Fabioux et al., 2005). The present study compared gonad measurement by MRI with gonad measurement by the histological method, applying the two methods successively ta assess the volume of the gonads of the same individual oysters.

2. Materials and methods

2.1. Oysters The 300 oysters used in this study were aU members of a single bi-parental fuU-sib family, fi'om a second laboratory generation (F2 family) . Reproduction and laI'val rearing took place at the Ifremer hatche.y in La Tremblade (CharenteMaritime, France) in February 2010. Post-Iarval rearing was also done at this hatchery. Afterwards, the oysters were grown on at the Ifremer nursery in Bouin (Vendée, France) from April ta October 20 10. They were then transferred ta the Agnas area ofdle Marennes-Oléron oyster parcs (France) where they were reared at 50 cm from the ground in oyster bags, with approximately 150 oysters pel' bag.

2.2. Magnetie l'esonanee imaging These oysters were imaged on the PRlSM facilities at lrstea (Rennes, Brittany, France) on April 4th, May 5th, and June 7th 2011. They were transported out ofwater between La Tremblade and Rennes (time of transport between 4 and 14 h) in coolers ta limit temperature stress, covered with cotton clothes soaked in seawater. In clear seawater many oysters kept closed and could not expel air bubbles. Therefore, prior ta MRI scanning, they were placed in vats containing phytoplankton-enriched seawater from the La Tremblade hatchery. After one hour, most of the oysters had opened theu' valves and had filtered water from the tray, thus expelling most of the air bubbles that had become trapped between their valves during transport. The few bubbles that remained in the oysters were clearly visible on the MR images and their volume was measured and corrected for when making oyster volume measurements. The epibionts were brushed from the sheUs and then the sheUs were dried with tissues ta limit parasitic signaIs, without any other modification. MRI measurements of oysters were performed with a Siemens Avanto imager operating at 1.5 T (63 .86 MHz), equipped with a -headl probe, which allowed the simultaneous examination of 15 oysters placed on five levels. A T1-weighted 3D Gradient Echo sequence provided 52 contiguous images, highlighting animal tissues, particularly gonadic tissues. The main parameters ofthe MRI protocol were: . Dimensions of the observed field ~ 161.9 x 185 mm2 (matrix: 280 x 320) - Dimensions of the pixel on transverse cuts ~ 0.58 x 0.58 mm' - Distance between two successive transverse cuts ~ 1.5 mm, making the dimensions of the voxel 0.58 x 0.58 x 1.5 mm' - Repetition time ~ II ms; echo time ~ 3.01 ms; flip angle ~ 20° - Number of transverse cuts across the volume ~ 52 - Filters ~ con'ection distortion + standaI'd pre-acquisition + eUiptical filter - Time of acquisition for 52 sections ~ 12 min 56 s (number of excitations ~ 6) An algorithm based on a 3D Object Counter plug-in using the ImageJ software (developed by Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD and available by ftp at zippy.nimh.nih.gov/ or http://rsbweb.nih.gov/ ij/index.htrnl) was used ta extract an image stack of each oyster and calculate its grey-Ievel stack histogram.

2.3. Histology Forty two oysters were sampled the day after MR imaging, 10 on April, 10 on May and 22 on June, They were selected on view of MRI sa the sample comprised males and females of various gonad size and development; no fully immature adults were observed. For each sample, histological sections were prepared as described in Fabioux et al. (2005). Briefly, 3-mm cross sections of the visceral mass were excised in front of the pericardial cavity and immediately flXed in Davidson's solution (Shaw and Battle, 1957) for 48 h. After dehydration and paraffm wax embedding, 5-j.llI1 sections were cut, mounted on glass sections, and stained with Harris' hematoxylin-Eosin Y (Martoja and Martoja-Pierson, 1967).

2.4. Qualitative analysis of histologieal sections AlI the 42 sampled oysters were analysed. Sex and gamete maturation stages were determined under a Iight microscope accarding ta the reproductive scale of Steele and Mulcahy (1999). Only the tbree stages detailed by Huvet et al. (2010) were observed. Briefly, stage 1 was assigned when there were no mature gametes, stage 2 was assigned when there were maturing gametes, and stage 3 was assigned when the gonad was full of mature gametes.

2.5. Analysis of images of histologieal sections Histological sections were also scanned with a digital scanner (Hewlett Packard Scan jet 7400c), and images were saved in TIFF format. Tissue areas were measured using lMAQ Vision Builder image analysis software (National Instruments Corp, Austin, Texas, USA). Firstly, each image was transformed to greyscale. Then, a flJ'st l'egion of interest (ROI) was drawn using a graphics tablet (Wacom Bamboo Pen and Touch, Wacom, Tokyo, Japan) ta remove areas corresponding

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to gills and other peripheral tissues. The surface of this ROI was considered as the whole flesh section area. Finally, a second ROI was plotted to remove digestive gland cells. Gonadic cells were detected by adjusting the grey-Ievel threshold specifie for !his tissue, and the gonadic area was automatically calculated in pixels (Heffernan and Walker, 1989).

2.6. Analysis of MRI images For each of the 42 oysters, an image was chosen from the MRI scan that was as close as possible to the histological section made in front of the perieardial eavity, clearly visible on the images as a dark mass. This seleeted image was analysed using ImageJ software. Using the "Threshold" macro and the image of the histologieal section as a referenee ail pixels that appeared as part of the oyster flesh were selected. The threshold value was an average of 96 for ail oysters. The number of pixels thus selected was tl,en multiplied by the surface of the pixel (0.58 x 0.58 mm'). This value was taken as the surface ofthe oyster flesh on the image. ln the "Threshold" macro, the lower and upper threshold values were adjusted to select pixels that could be considered as part of the gonad by reference to the histological section. However, these pixels were selected according to their greylevel, and sorne were clearly a part of other organs, mainly gills, gut, and digestive gland. A polygon was drawu around the gonad, once again by making reference to the histological section. The pixels within this polygon were considered as belonging to the gonad, and their number was multiplied by the unit surface of the pixel. PreliminalY trials, done using the same method in previous years (Davenel et al., 2006, Hatt et al., 2009), concluded that the grey-Ievel for mature gonads on MRI was between 166 and 510. On the grey-Ievel histograms established on whole oyster body soft tissues with the methods described in subsection 2.2, ail the voxels above 165 were counted as a part of the mature gonads. The volume of the gonad was then computed by multiplying the number of the selected voxels by the voxel unit volume (0.58 x 0.58 x 1.5 mm').

2.7. Data an.lysis To determine relationships between the measurements made on the MR images and those made on histologieal sections, linear regressions were tested using the "Iinear model" funetion of the R software package (available at http://www.rproject.org/). The swfaee values measured on histological sections were used as explanatory variables, and the values from measurements on the MR images as variables to explain. The residual values fi'om the linear relation were analysed with a two-way analysis of variance (ANOV A) using the funetion "ANOVAs" of the R software package (R development core team, 2011) software. This allowed us to assess the eonu'ibution of the residual values of sorne factors such as the sex of the gametes and the maturation stage of the gonad to the variance.

3. Results The results of the data analysis are given in Table 1; ail relationships were established from measurements made on 42 oysters. The gross weights were 9 to 27 g and the total wet flesh volumes measured on MRI from 2.2 to 9.1 c.e. Histologieal sections analysis led to the conclusion that, among the forly two oysters, 26 were males, 14 females and 2 undetermined. A fully mature gonad was observed on 28 oysters (16 males and 12 females), a mid-mature on 8 (6 males and 2 males), an incepting on 5 (4 males and one undetermined), and one showed no gonad. Figures 1 to 3 show selected examples of histological sections and the MR images of oysters for each maturation stage, one without any visible gonad, one stage 1 (undetermined), one male and one female for stage 2 and for stage 3. The grey-Ievel of the female gonad is higher than that of the male gonad for both maturation stages. On the histological sections, vesicular cells are clearly distinct inside the gamete crown. In the same location on the MRI, the pixels have a grey-Ievel that is higher than that of gamete pixels. The grey-Ievel of the digestive tract is fi'equently amongst the highest levels on the MRI. This might be due to the phytoplankton that the oysters ingested when they were stored in phytoplankton-rich seawater before being passed through the scanner.

The whole body is clearly visible on the MR images. As a validation test for the whole body, we first tested the relation between the assessed surface on the histological section and that on the closest MR image. Because this relation was very highly significant, we then tested the relation between the gonad surfaces measured on the histological section and those on the closest MR image. Finally, because this relation was also very highly significant, the relation between the gonad surface measured on the histological section and the gonad volume measured on the whole MRI was then assessed. The value of the Y-intercept of the last relation is significantly higher than zero. The linear relation between the gonad surface from the histological section and the gonad volume from the MRI is shown in Figure 4, with a point for each oyster. From this relation, we estimated that there was an uncertainty of 29% for the volume value measured by MRI (p < 0.05) on the scope of sampled sizes. The gonad volume from the whole MRI corresponded to the number of voxels in which the grey-Ievel was above 165. This included other organs, such as the vesicular cells and the digestive tract, observed on the MR image. The volume ofthese organs varied among the maturation stages, and the grey-Ievel of the gonad on the MR image was lower for males than it was for females. From these observations, the influence of maturation stage and sex was tested on the above linear relation. Two-way ANOV A on the residual values fi'om !his linear relation showed no difference between males and females or among maturation stages.

76

4. Discussion and Conclusions The surface values obtained from transverse sections examine by the two methods were very highly correlated for both the whole body and the gonad alone, The volume of the gonad measured by MRI was very highly conelated with the surface of the gonad measured on the histological sections but, for small oysters in the flfst stage of gamete maturation, gonad volume measurements by MRI were proportionately higher than for large fully mature oysters: however this is based upon a small sample and needs a larger one for confirmation, When the gonad was large, and therefore had a greater number of voxels, the contrasts between organs were better and the effects of small volumes added by the partial inclusion of other organs became significantly less important. In addition, the size of a pixel (0,58 x 0,58 mm2) on the MR image was much larger than the size of a pixel on the image of the histological section (0,042 x 0,042 mm'), On the MRI, a pixel could consist of mature gametes and somatic cells; as such, its grey-Ievel was higher than the sunounding pixels consisting of only somatic ce Ils, and the pixel was therefore recorded as "mature gonad", However, this approach gave an overestimation of the volume of gametes, On the histological section, it was possible to distinguish mature gametes from other cells, On the MRI, the accuracy of the image did not always make it possible ta distinguish the mature gonad from other organs, such as vesicular cells or digestive tract, which frequently had a similar grey-Ievel and were adjacent to the mature gonad, As indicated above, the gonad volume assessed from the MRI was the number of voxels with a grey-Ievel above 165, But the observation on successive transverse cuts led us to conclude that these measurements had included tissues other than the gonad because they had a similar grey-Ievel (e,g" vesieular cells, sometimes gills or digestive tract), In the linear relationship between the gonad volume from the MRI and the gonad smface from the histological section, the Yintercept was very high, and the average gonad volume was 20 times that of the average gonad surface, It can therefore be hypothesized that the high values observed were related to additional volume from the inclusion of these somatic organs. Measurement of the surface of the gonad on histological sections is a reference method for assessing reproductive effort and its evolution over time within a population of oysters, The linear relationship established between the value obtained by this method and the value obtained by MRI demonstrates that this last method is appropriate for computing a volume that is propOitionate to the actual gonad volume, It is non-deshuctive (MRJ was conducted with shell intact) and therefore makes it possible ta assess individual evolution and to compare individuals, A fu'st estimation of the uncertainty for this volume value was 29% on the scope of sampled sizes, Fwther measurements will be used to validate this first estimation and to test a possible difference according to mahu'ation stage and/or sex, However, this method could already be very useful for finer analysis of sorne phenotypic characteristics of oysters within a maturation and spawning period, namely, the effOit devoted ta reproduction, and the precocity and duration of gonad maturation, This individual examination wi ll also allow the study of gonad development to be put in its genetic context through attempts ta link sorne of these traits to p .. ts of the oyster genome using a Quantitative Trait Loci approach,

Acknowlcdgements This work was funded by a grant from the Agence Nationale de la Recherche -Génomique animalel pro gram for the GAMETOGENES project (ANR-08-GENM-041), The authors are grateful ta ail members of staff of the Ifremer hatchery in La Tremblade and of the nmsely in Bouin for producing and rearing the oysters and would particularly like to thank Virgi le Quillien for his conh'ibution to making and analysing the histological sections,

References Bourles, y " Alunno-Bruscia, M" Pouvreau, S" ToUu, G" Leguay, D" Arnaud, C" Goulletquer, p " Kooijman, S, (2009). Modelling gl'Owth and reproduction of the Pacific oyster Crassosh'ea gigas: Advances in the oyster-DEB model through application to a coastal pond, Journal ofSea Research 62(2-3), 62-71. Davenel, A" Quellec, S" Pouvreau, S, (2006), "Noninvasive characterization of gonad maturation and determination of the sex ofPacific oysters by MRJ," Magnetie Resonance Imaging 24(8): 1103-11 10, Davenel, A" Pouvreau, S" Cambert, M" Suquet, M" Mariette, F, (2009), "NMR relaxometry as a potential non-invasive routine sensor for characterization of phenotype in Crassostrea gigas," Aquaculture 29 1(1-2): 74-77, Dégremont, L., Bedier, E" Boudry, p, (2010) Summer mortality ofhatchery-produced Pacific oyster spat (Crassosh'ea gigas) , TI. Response to selection for survival and its influence on growth and yield, Aquaculture 299(1-4), 21-29, Deslous-Paoli, lM" Héral M, (1988), Biochemical composition and energy value of Crassos/rea gigas (Thunberg) cultured in the bay of Marennes-Oléron, Aquatic Living Resources 1,239-249, Fabioux, C" Huvet, A., Le Souchu, p" Le Pennec, M" Pouvreau, S, (2005), Temperahu'e and photoperiod drive Crassos/rea gigas reproductive internaI c\ock. Aquaculhu'e, 250 (1-2): 458-470, FranceAgriMer, 20 II , Les filières pêche et aquacultw'e en France, Editions Les cahiers de FranceAgriMer, MontreuilsOlls-Bois, France. Hatt, P,-J" Davenel, A" Eliat, P,-A" Quellec, S, (2009), "Magnetic resonance imaging as a means to assess the body growth and the gonad development of the oyster Crassos/rea gigas," Aquatic Living Resources 22: 331-339, Heffernan, P,B" Walker, RL (1989), Quantitative image analysis methods for use in histologieal studies of bivalve reproduction, Journal of Molluscan Studies 55,135-137,

77

Huvet, A., Normand, 1., Fleury, E., Quillien, V., Fabioux, C., Boudry, P. (2010). Reproductive effort ofPacific oysters: A trait associated with susceptibility to summer mortality. Aquaculture 304, 95-99. Martoja, R., Mattoja-Pierson, M. (1967). Initiation aux techniques de l'histologie animale. Masson et Cie, Paris. Pouvreau, S., Rambeau, M., Cochard, 1. C., RobeJt, R. (2006a). "Investigation of marine bivalve morphology by in vivo MR imaging: First anatomical results of a promising technique." Aquaculture 259( 1-4): 415-423. Pouvreau, S., Bourles, Y., Lefebvre, S., Gangnery, A., Alunno-Bruscia, M. (2006b). "Application of a dynamic energy budget model to the Pacific oyster, Crassostrea gigas, reared under various environmental conditions." Journal ofSea Research 56(2): 156. RDevelopment Core Team (201 1). R: A language and environment for statistieal eomputing. RFoundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.orgi. Samain, J.F., Dégremont, L., Soletclmik, P., Haure, 1., Bédier, E., Ropelt, M., Maal, J., Huvet, A., Bacca, H., VanWormhoudt, A., Delap0l1e, M., Costil, K" Pouvreau, S., Lambelt, C., Boula, V., Soudant, P., Nicolas, J.L., Le Roux, F., Renault, T., Gagnaire, B., Géret, F., Boutet, L, Burgeot, T., Boudry, P. (2007). Genetically based resistanee to summer mortality in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and its relationship with physiologieal, immunologieal eharacteristics and infection process. Aquaculture 268, 227-243. Segarra, A., Pepin, J-F., Arzul, L, Morga, B., Faury, N., Renault, T. (2010). Detection and description of a particular Oslreid herpesvirus 1 genotype associated with massive mortality outbreaks ofPacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research, 153:92-99 Shaw, B.L., Battle, H.!. (1957). The gross and microscopic anatomy of the digestive tract of the oyster Crassostrea virginica (Gmelin). Canadian Journal ofZoology 35, 325-347. Steele, S., Mulcahy, M.F. (1999). Gametogenesis of the oyster Crassostrea gigas in southern Ireland. Journal of the Marine Biologieal Association of the United Kingdom 70, 673-686.

Tables Table 1 : Parameters of linear regressions between measurements made on the histological sections (explanatory variable) and on the MRI (explained variable) ("': p < 0.001; ": p < 0.01; ': p < 0.05; n.s.: not significant). These relations are based upon a sample of 42 oysters of different sex (2 nndetetmined, 26 males and 14 females) and different maturation stages (1 immature, 5 at stage 1,8 at stage 2 and 28 at stage 3).

Parameters Value

Whole-body surface (mm') Y-intercept 93 Regression coefficient 0.57 F Fisher 115'*' Gonad surface (mm') y -intercept 11 Regression coefficient 0.65 F Fisher 216*"

Gonad surface on histological sections (mm') and gonad volume onMRI(mm') y -intercept 1345 Regression coefficient 14.3 FFisher 84*'*

Figures

Standard essor

12 0.05

6 0.04

194 1.6

Student's 1

7.4 10.7

1.9 14.7

6.9 9.2

P (>Ili)

5e,09*** 2e,13***

0.06 n.s. <2e,16***

2e,08*** 2e,lI ***

Figure 1: Histological sections (left) and closest original MR image (right) of an oyster at maturation stage 1 (upper) and an immature oyster (lower).

78

Figme 2: Histologieal sections (left) and closest original MR image (right) of oysters at maturation stage 2, male (upper) and female (lower).

Figw'e 3: Histologieal sections (left) and closest original MR image (right) of oysters at maturation stage 3 (upper) , male (upper) and female (lower).

Figme 4: Relation between the gonad swfaee measmed on the histologieal section and the gonad volume measmed on the whole MR1. The different symbols indieate the different gonad maturation stages observed on the histologieal sections,

;::: 6000

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79

PARTIE Il: CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES FAMILLES AU COURS

DE LA GAMETOGENESE

La gamétogenèse de l 'huître est un processus biologique complexe (fortes variati ons

individuelles, forte influence des facteurs environnementaux ... ) qui impacte les autres

foncti ons physiologiques de l'animal (Soletchnik et al., 1997; Ernande et al., 2003, Enri quez

Di az, 2004, Enriquez-Diaz et a 1.,2009), nota mment 1 a s urvi e. En effet, une corrélati on a été

mise en évidence entre la réponse à un épisode de mortalités estivales et l'effort

reproducteur: 1 es a ni maux produisant une gonade vol umineuse seraient pl us sensi bles aux

mortalités estivales (Samain et al., 2007; Huvet et al., 2010). Dans le contexte actuel des

mortal ités estivales qui touchent sévèrement les juvéniles d'huîtres creuses et menacent la

production aquacole, il semble important de mieux comprendre les mécanismes de la

ga métogenèse a insi que 1 es processus généti ques sous-jacents qui pourra ient expl iquer 1 e

lien apparent entre ces mortalités et l 'effort reproducteur.

L'histologieestuneméthodeclassiqued'observation de la gamétogenèse. D'abord

qua 1 itative, elle a permis de déterminer 1 e sexe et 1 a maturité des individus pa r observati on

microscopique des coupes histologiques (Steele et Mulcahy, 1999). A partir des années

2000, l'histologie quantitative a été uti 1 isée pour esti mer l 'effort reproducteur, fondée sur

l'estimation du Rapport Gonado-Somatique (Enriquez-Diaz, 2004). Bien qu'informative,

l'histologie ne peut pas être considérée comme représentative de l'effort reproducteur réel.

En effet, étant destructive, elle ne permet d'obtenir qu'une estimation de l'effort

reproducteur à un moment donné. Cet inconvénient est d'a uta nt pl us handicapan t lorsqu'i 1

s'agit de comparer l'effort reproducteur des individus: compte tenu des variations

individuelles dedynamiquede la maturation, l'observation à un instant t de l'ensemble des

huîtres n'offre pas la possibilité de comparer tous les animaux à leur maximum de maturité.

De cefa it, il semblait important d'utiliser une méthode non-destructive permettant le suivi

individuel et temporel des huîtres. L'Imagerie par Résonance Magnétique, déjà

fréquemmentutiliséepourdes invertébrés terrestres ou dulçaquicoles (Jasanoff etSun,

2002; Wecker et al., 2002; cités par Pouvreau et al., 2006, mais rarement pour les

invertébrés ma rins (Bocket al., 2001; Bocket al., 2002; Mark et al., 2002 ; Toussai nt et al.,

81

2005; cités par Pouvreau et al., 2006) s'est a lors présentée comme un outi 1 prometteur pour

l'étude des huîtres (Pouvreau eta 1.,2006). Non-invasive, 1'1 RM permet de suivre 1 es mêmes

individus et d'observer de nombreux traits i mposs i bles à observer pa r histologi e sa ns

menacer la survie des animaux.

L'IRM était donc un outil adaptéà cetravail dethèse :afin de comparer l'effort

reproducteur des individus, il éta it important de pouvoir 1 e caractériser de la façon la pl us

représentative possible de la réalité et la possibilité de mesurer d'autres caractères

simultanément a éga lement permis de rechercher des QTLs pour ces caractères. Toutefois, il

éta it i mpossi ble de soumettre nos 3 fa mi Il es à 1'1 RM ; c'est pourquoi 2 fa mi Iles ont été

observées par histologie.

1. L'histologie quantitative, une observation ponctuelle et destructive.

L'histologie quantitative avait été prévue pour 300 individus pour 2 familles F2. Pour

la fa mille F2-19, 266 individus ont pu être exploités tandis que, pourla fami Ile F2 -21, seuls

135 individus ont pu être exploités: pour les autres, il s'est avéré i mpossi bl e d'obteni rune

coupe utilisable, probablement en raison d'un mauvais enrobage des tissus.

1.1. Méthode 1.1.1. Préparation des lames

Les individus, placés s urestran en octobre 2010, ont été ra menés à l'écloseri e de 1 a

stati on de La Tremblade 1 e 6 juin 2011. Nous avons a lors procédé à 1 eur ouverture pui s à la

bi opsie des branchies en vue de l'extraction d'ADN pour le génotypage. Ensuite, 1 es animaux

ont été enfilés entiers sur du fil de pêche et séparés par un morceau depapier calque

numéroté afin de les identifier. Les « colliers» ainsi préparés ont été immédiatement

plongés dans du fixateur de Davidson modifié (voir composition en Annexe 7). Cette étape a

permis une première fixation des gonades visiblement matures qui a uraient pu sevi dersi la

coupe avait été réalisée immédiatement.

Le lendemain, une coupe de quelques millimètres a été réalisée en amont de la

régi on péricardique (Figure 21). Celle-ci a été i mmédi atement plongée dans du fixateur de

82

Oavi dson modifié pendant48h afin defixerl a totalité des tissus puis conservée en éthanol à

70" jusqu'à l' inclusion en paraffine.

L'i ncl usion en pa raffine a été réa lisée à l'aide d'un automate à inclus ion. Cette éta pe

cons iste en l'enveloppement des tissus dans un bloc de paraffine qui les rend s uffisa mment

durs et homogènes pour pouvoir être coupés en vue de l'observation. La paraffine étant

hydrophobe, il est nécessaire de débarrasser les tissus de toute l'eau qu' ils contiennent.

Pour cela, ils sont déshydratés progressivement dans des bains d'éthanol de degré croissa nt

(Annexe 7). Ens uite, 1 es tissus sont clarifiés: des ba i ns de xyl ène permettent de rempl acer

l'étha nol a bsolu da ns les tissu s. Cette éta pe est indispensable à l'imprégnation des tissus par

la paraffine.

Ensuite, les coupes sont enrobées dans de la paraffine liquide pour former, en

refroidissant, des blocs, plus faciles à couper au microtome. Le microtome permet de

réaliser des coupes de 5 ~m d'épaisseur. Celles-ci sont déposées sur de l'eau bidistillée

chauffée à 45"C pour éliminer les éventuels plis. Pour finir, on récupère 2 coupes par

individu sur une lame d'observation.

Après séchage, 1 es coupes sont colorées à l'hématoxyl i ne/éos i ne (Annexe 7) . Cette

méthode de coloration combinée uti lise un colorant nucléaire basique, l'hématoxyl i ne, qui

colore les noyaux des cellules en bleu, puis un colora nt cytopl asmique acide, l'éos i ne, qui

colore les cytoplasmes en rose.

Enfi n, on procède a u montage des coupes entre 1 ames et 1 a melles : de 1 a rés i ne est

déposée s ur la lame puis on recouvre pa rune 1 amelle en évitant la formation de bulles d'a i r.

Figure 21. Emplacement de la coupe histologique

83

1.1.2. Analvse d'images 1.1.2.1. Analyse qualitative

Les lames sontobservées en microscopie électronique afin de déterminer le sexe

(mâ le, femell e, hermaphrodite) et le stade de maturité des gonades (Ta blea u 6) d'a près la

cl assification éta blie pa r Normand et a 1. (2009) à partir de classifications précédentes (Mann,

1979; Lango-Reynoso et al., 2000).

Stade de

maturité

Stade a

Stade 1

Stade 2

Stade 3

Stade 4

Processus

Prolifération des cellules souches

Mitoses goniales

Méioses, maturation des

cellules germinales

M atu rité des cellules germinales

Emission des gamètes

Tubules gonadiques

Invisibles

Développement

Extension

Confluence

Tissu conjonctif

Occupation de

l'ensemble de (c l'espace

gonadique»

Prédominance

Régression

Disparition

Désorgan isation Désorganisation

Gonade mâle Gonade femelle

Tableau 6. Caractéristiques des stades de maturité de la gonage de l'huître creuse Crassostrea gig05.

84

1.1.2.2. Analyse quantitative

D'un poi nt devue qua ntitatif, on cherche à déterminer 1 a partde la gonade pa r ra pport au

reste du corps de l'a nimal : on esti me l'i ndi ce gonadique ou Rapport Gonado-Somatique

(RGS) qui équiva ut a u ra pport de 1 a surface occupée pa ries cell ules gonadi ques sur 1 a

surface totale de la coupe histologique. Pour cela, les lames d'observation ont été

numérisées à l'aide d'un scanner Epson (Figure 22 a). Ensuite, via le logiciellmaq Vision

Buil der®, l'image est converti e en nivea u de gris (Figure 22 b) puis, on él i mi ne 1 es zones

correspondant aux branchies etaux autres tissus périphériques en dessinant une région

d'intérêt autour de la masse viscérale (Figure 22 c) afin de ne conserver que les tissus

nécessaires au calcul du RGS (Figure 22 dl. Dans un premier temps, on estime la surface

totaledela masseviscéraleen sélectionnantlatotalitédes pixels de la coupe (Figure 22 el.

Pui s, on dessine une seconde région d'i ntérêt afin d'éliminer 1 es cellules digestives (Figure 22

f) et de ne conserver que les cellules gonadiques (Figure 22 g). On peut alors sélecti onner

uniquement les pixels correspondant au tissu gonadique (Figure 22 h) pour estimer la

surface gonadique (Figure 22 il.

a b c

Figure 22. Etapes de traitement d'une coupe histologique numérisée afin d'estimer le rapport gonado somatique.

85

1.2. Résultats 1.2.1. Analyse qualitative des lames d'histologie

L'observation microscopique des lames d'hi stologie a révélé que l'ensemble des

individus étudiés présentaient une gonade au stade 3 de maturité, pour chacune des 2

familles . En revanche,ausein dechaquefamille, la sex-ratio est différente (Figure 23). En

effet, 1 a famille 19 est en grande partie composée de mâl es (74% contre 22% de femelles)

tandis que la famille 21 possède une sex-ratio plus équilibrée (55% de mâles, 44% de

femelles). Des hermaphrodites ont également été identifiés dans une moi ndre mes ure (4%

pour la famille 19; 1 % pour la famille 21).

Sex-ratio de la famille F2-19 Sex-ratio de la famille F2-21

F

F

------~=.:j_ MlF MlF

M

M

Figure 23. Sex-ratio des familles F2-19 et F2-21

1.2.2. Analyse quantitative des lames d'histologie

La fa mi Ile F2-19 présente un rapport gonado-somatique plus él evé (~=0,542±0,156)

que 1 a fa mille F2-21 (~=0,477±0, 139) (Figure 24) . De pl us, la distribution du rapport gonado

somatique diffère entre les deux familles (Figure 25) . Le RGS varie signifi cativement en

fonction du sexe des individus (F=4,45 ; p=O,Ol) . Par exemple, pour la famille 19, on

rema rque que 1 eRGS est pl us fa ible pourl es hermaphrodites (~=0,419±0,122) que pour 1 es

mâles (~=0,555± 0,148, différence significative : t= -2,73; p=0,02) ou les femelles

(~=0,521±0,177, différence non-signifi cative) (Figure 26).

86

III

'" Ile

q

" 0

'" 0

'" 0

" 0

~ -

~ 0

0

F2-19 F2-21

Figure 14. Graphes des moyennes du rapport gonado-somatique pour les familles F2-19 et F2-21.

DIstribution du RGS au sein de la famille F2-19 Distribution du ROS au sein de la fam Ille F2-21

-

c

0.0

--,-

~ N

r- !il r-r-

I-- [

-~ :e •

r-

, ~

;t ;!

1--

-

-rI Il ~

c

r-

1 0.2 0.4 0.6 0.6 1.0 0 .0 0 .2 0 .< 0.6 0.8 1.0

RGS RGS

Figure 15. Distributions du rapport gonado-somatique au sein des familles F2-19 et F2-21.

87

Distribution du RGS en fonction du sexe au sein de la famille F2-19

<Xl d

ID d

UJ Cl <>:

d

N d

0 d

~

• • • , , , ,

~ , , , , , , , ,

8 E? 1,----'-----,1 , , , , , , , , , , , , , . • • ~ . ~

o

F M

Sexe

, , , • • • ~

MlF

Figure 26. Distribution du rapport gonado-somatique en fonction du sexe au sein de la famille 19,

2. L'Imagerie par Résonance Magnétique, un suivi temporel non destructif.

2.1. Principaux résultats détaillés dans l'article 3

Au cours de cette étude, nous avons pu suivre le développement de la gonade d'un

pointdevuequalitatif(sexe, changement de sexe, stades de maturation, date de ponte) et

d'un poi nt devue quantitatif (indice gonadique) de 300 individus de la fa mille F2 -18. Afi n de

s'assurer que notre matériel biol ogi que se comportait de 1 a même façon que des huîtres

sa uvages, nous avons comparé nos données à celles obtenues par le RESeau d'observations

COnchylicoles (RESCO-Ifremer). Nous avons ainsi pu constater un synchronisme de la

période de ponte (Figure 29) et du pic de mortalité estivale (Figure 31) .

Le sexe pouvant être déterminé sur les images IRM (Article 2), nous avons pu

observer des spécificités liées au sexe des individus. En effet, la cinétique de la

gamétogenèsevarie en fonction du sexe: les mâles sont plus précoces et matures plus

longtemps que 1 es femelles . De pl us, 1 es femelles semblent plus touchées pa ries mortal ités

88

estivales que les mâles. Cependant, nous n'avons constaté aucune différence entre les

indices gonadiques des mâles et des femelles et le changement de sexe entre les deux

années d'observation ne dépend pas du sexe au cours de la 1 ère année.

L'I RM éta nt une méthode non-destructive, nous avons pu suivre 1 es mêmes individus

au cours des 8 séa nces 1 RM réparties s urdeux années (6 séa nces en 2011 et 2 séa nces en

2012). Nous avons ainsi pu observer des différences entre 1 a gamétogenèse de 2011 et 1 a

gamétogenèse de 2012 : la gamétogenèse a été pl us précoce en avril2012 qu'en avri 1 2011

mai s, en juin, 1 a tendance s'est inversée et l'i ndice gonadique a été globa lement pl us él evé

en 2011 qu'en 2012. Ces différences sont probablement dues aux conditions

envi ronnementa 1 es atypi ques observées en 2012. En effet, au pri ntemps, un bloom

pla nctonique précoce a pu déclencher une gamétogenèse pl us précoce. A pa rti rde ma i, des

préci pitations très importantes et une stagnation des températures peuvent expl i quer 1 a

tendance inverse observée entre juin 2011 etjuin 2012.

2.2. Article 3: Temporal monitoring of the gametogenesis in the Pacific oyster, Crassostrea gigas, by Magnetic Resonance Imaging (MRI)

« Suivi temporel de la gamétogenèse de l'huÎtredu Pacifique, Crassostrea gigas, by

Magnetic Resonance Imaging »

Emilie FLAHAUW, Sylvie LAPEGUE, Stéphane QUELLEC, Armel DAVENEL, Virgile

QUI LU EN, Ca roline FABIOUX, Phili ppe-Jacques HATI- En prépa ration pour soumission à

Journal of Sea Research après correction de l'Anglais.

Pour cette étude, j'ai effectué, seule ou avec l'aide des coauteurs:

• La production, l'élevage, le conditionnement et le marquage des huîtres,

• L'histologie, de la fixation à l'analyse des coupes,

• L'analyse des images IRM,

• Les analyses statistiques.

89

2.2.1. Introduction

Gametogenesis is the process that leads to the formation of gametes of living

orga nisms.ln marine molluscs, gametogenesis is knownto be a n energy consumingfunction,

possibly affecting energy allocation to other physiological functions (Soletchni k et al ., 1997;

Ernande et al., 2003; Enriquez-Diaz, 2004; Enriquez-Diaz et al., 2009). The reproductive

effort is a proxy of the energy devoted to gamete production . ln the oyster Crassostrea

gigos, it has been negatively correl ated with spat s ummer morta 1 iti es: i ndivi dua Is with

higher reproductive effort wou Id be more susceptible to s ummer mortalities (Sa ma i n et al.,

2007; Huvet et al., 2010). Furthermore, si nce 2008, the detecti on of a newly descri bed

OsHV-1 variantcalled OsHV-1 JlVar was most oftime reported during massive mortality

outbreaks among C. gigas in several farming areas in Europe (Efsa , 2010; Segarra et al.,

2010, Lynch et a 1., 2012; Peel er et al., 2012; Renault et a 1.,2012; Roq ue et al., 20 12)(Sega rra

et al., 2010). These outbreaks affect severely the cupped oysters farming _ up to 85% of

mortal ity in Marennes-Oléron Bay i n 2012 according ta the RESCO (RESea u d'observati on

COnchylicole, Shellfish Fa rming National Observatory)_ whi ch represents an importa nt part

ofthe French aquacultu re. 1 ndeed, the French production of oysters decreased by 130,000

tons per yea r in 2009 to 80,000 tons in 2010 and 2011 (CNe, French Shellfis h Nati ona 1

Committee, http ://www.cnc-france.com). Cha ra cterizi ng the reproductive effort and

rel ationships underlying these observations is therefore a n important issue for the future of

aquaculture.

Ga metogenes is follows a n a nnual cycl e strongly i nfl uenced by water temperature

and nutrition conditions (Fabioux et al., 2005, Enriquez-Diaz, 2009) : in winter,

gametogenesis i niti alizes; i n spring, active gametogenesis ta kes placeto reach full maturity

at the beginning of summer and spawning and, in autumn, unspwaned gametes are

resorbed . Given the high i nvestment in reproduction, a ni ma Is a re more vul nera ble and

mortalities occur more frequently in summer (Soletchnik et al., 1997).

The mostfrequently used method for measuring reproductive effort is to assess the

vol ume ofthe gonad by semi-quantitative histology (Fabioux et al., 2005). Butthe size of the

gonad varies during gametogenesis and its dimension at a given time may not be

90

representativeofthe final reproductive effort. However, this method is destructive. It is

therefore not poss i bl e to foll ow i ndividua 1 evol uti on of ga metogenes is .

Fi rst morphological investigation of oysters by in vivo Magnetic Resona nce 1 maging

(MRI) i ndicated that MRI is a good non-invasivetool to i nvestigate in vivo anatomic traits and

phys i ology in oysters (Pouvreau et al., 2006), i ncl udi ng assessment of the vol ume a nd the

maturation stage ofthegonad (Davenel et al., 2006; Hattetal., 2009). Moreover, in a

previ ous study(Flahauw et al., 2012), highly significa nt 1 i near relati ons hip between the

measure by means of histology and by means of MRI demonstrated that MRI is an

a ppropriate method to assess the vol ume ofthe gona d a ndthe proxyis proportionateto the

actual gonad volume.

The presentstudywas designed to follow the same i ndividuals over two seasons of

reproduction. We werethereby a bleto assess several qualitative (sex, reproductive stage,

maturity of the gonad) and qua ntitative traits (i nternal vol ume, vol ume of the adductor

muscl e, volume ofthe gonad) that a lIowed confirming information avail abl e on the cupped

oyster reproduction but also giving new i nsights on this important physiologi cal process in

oysters.

2.2.2. Materials and methods 2.2.2 .1. Oysters

The oysters used in this study were a Il members of a single bi-parental full-sib fa mi Iy

(F2 family). Briefly, this family was created using divergent lines for their responseto

summer morta Iities. 1 n FO, two groups were characterized according to survival to s ummer

morta 1 ities of thei r progeni es in fi eld. Then, one « resista nt» ma 1 e was mated with one

« sensitive» fema leto produce a Fi fa mily. Within this Fi fa mily, one male a nd one fema 1 e

were used to generate the F2 generation in February 2010.

For each cross, to control fertilization, ga metes were collected by stri ppi ng gonads.

Then, larval rearing and micro-nursing were performed at the Ifremer hatchery in La

Trembl a de (Charente ma ritime, France). Afterwa rds, oysters were transferred to the Ifremer

nursery in Bouin (Vendée, Fra nce) for nursinga nd keepi ng away from summer mortal iti es

91

fromApriltoOctober201O.Atotal of3000ysterswereindividuallytagged and divided in

two oyster bags, with 150 oysters per bag. They werethen tra nsferredto Agnas (Ma rennes

Oléron Bay, Fra nce) where they were rea red at 50 cm from the ground.

The i ndividual grossmass rangewas 5-29gon the begi nni ng of this study (April 4 t h

2011) and 9-47g on the end (June 6 th 2012).

2.2.22. Magnetic Resonance Imaging

These oysters were i maged on the PRISM facilities at 1 rstea (Rennes, Brittany, France)

on eight sessions (April 4th, May 5th, June 7th, July 6th, August 3 rd, October 12th 2011, April 6 th,

June 6th 2012). The protocol is described in Flahauw et al. (2012). Briefly, they were

transported outofwater between La Tremblade and Rennes and, prior to MRI scanning,

they were pl aced in vats conta iningseawaterfrom the La Tremblade hatchery, for maki ng

them to open their valves and expel most of the air bubbles that had becometrapped

between their valves during transport. The volume of the few remaining bubbles was

measured on the MR images and taken into account when making oyster volume

meas urements. The epi bionts were brushed from the shells and then the s hell s were dri ed

with tissues to limit parasitic signais, without any other modification.

MRI measurements of oysters were performed with a Siemens Avanto imager

operating at 1.5 T (63.86 MHz), equipped with a "head" probe, which allowed the

simultaneousexaminationof15 oysters placed on five levels. A Tl-weighted 3D Gradient

Echo sequence provided 52 contiguous images, highl ighti ng ani ma 1 tiss ues, pa rti cula rly

gonadic tissues.

The main parameters of the MRI protocol were:

Dimensions of the observed field = 161.9 x 185 mm' (matrix: 280 x 320)

Dimensions of the pixel on transverse cuts = 0.58 x 0.58 mm'

Distance between two successive transverse cuts = 1.5 mm, making the

di mens i ons of the voxel 0.58 x 0.58 x 1.5 mm3

Repetition time = 11 ms; echo time = 3.01 ms; flip angle = 20·

92

Number of transverse cuts across the vol ume = 52

Fi Iters = correction distortion + sta nda rd pre-acquisiti on + ell i ptica 1 fi Iter

Ti me of acquisition for 52sections = 12 mi n 56 s (number of excitations = 6)

An algorithm based on a 3D abject Counter plug-in using the ImageJ software

(developed by Wayne Rasband, National 1 nstitutes of Health, Bethes da, MD a nd available by

ftp at zi ppy.ni mh.nih.gov/ or http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html) was used to extra ct an

image stack of each oyster and calculate its grey-Ievel stack histogram.

2.2.2.3. 2.2.2.3.1.

Reproductive stage assessment Maturation stages

Pa rt ofthe oysters (42 i n 2011 and 28 after MRI session of June 2012) was sa crifi ced

for histological sections . For each sample, histological sections were prepa red as des cri bed

in Fa bioux et a 1. (2005) . Briefly, 3-mm cross secti ons of the viscera 1 mass were exci sed in

front ofthe peri cardial cavity and immediatelyfixed in Davidson's solution (Shaw and Battle,

1957) for 48 h. After dehydrati on and paraffi n wax embeddi ng, 5 -Ilm s ecti ons were eut,

mounted on glass sections, and stained with Harris' hematoxylin-Eosin Y (Martoja and

Martoja-Pierson, 1967). These 70 sections allowed comparing the traditional method to

assess gonad development, histology, to the non-destructive method of MRI (see FI ahauw et

al., 2012 for more deta ils). 1 n additi on to the highly signifi cant correl ati on between the

esti mations of surface a ndvolume of gonad by thesetwo methods, this study a Iso enables

to identify sex of oysters (with 100 % of success on fully mature gonads) and their

maturation stage correspondi ng to the reproductive scal e of Steel e and Mul ca hy (1999)

directly on MRI images.

2.2.2.3.2. Measurement and calculation ofreproductive effort indexes

Previous studies (Davenel et al. 2006, Hatt et al. 2009) concluded on:

a very highly significant 1 inear relation between the weight of the water withi n the

s hells pl us theflesh and the number ofvoxels on the MR images, which grey-I evel is

higher than 63,

93

a very highly significant 1 inear relation between theweight ofthe dri ed fies ha nd the

number ofvoxels on the MR images, which grey-Ievel is higher than 95.

From a nother previous study (Flahauw et al., 2012)we concluded thatthe number of

voxels on MR images which grey-Ievel is higher than 165 is a proxy for the gonad volume.

The adductor muscle is clearly distincton the MR images.lts surface was measured on the

image where its transverse sectionwas the 1 argest. This measurewas consi dered as a good

proxy ofthe somatic tissues .

As the oysters were of very different s izes, for comparisons a mong i ndividua Is of the

gonad volume, the fi esh volume a nd the adductor muscle surface, we used the ratios below:

Flesh volume Flesh index = ---'.'---'-

Intravalvular volume

M 1· d Add uctor muscl e su rface

usc el n ex = --- --- -IntravalvLÙar volume

Gonad volume Gonad index =- ----

Intravalvular volume

The variation of the gonad index during the spawning/resorption period which

represents the proportion of gametes spawned was used as an indirect measure of the

reproduction effort. Theseva riations were compared withthe evol utions of the fi esh index

and the muscle index .

2.2.2.3.3. Comparison with data ofRESCO monitoring network

To determi ne if the F2 fa mi Iy studi ed behaved 1 i ke wi 1 d oysters duri ng the

observation period, we compa red thei r kinetics of reproduction to of those of oysters from

the RESCO monitoring network. 1 ndeed, for this network, a batch of di pl oi d oysters ca Il ed

"sta ndard oysters" has been ma intainedwith the same procedure every year si nce 2008 in

the same location as our studied oysters. They are 18 months old, naturally collected in June

2009. Thei r averageweight isll g mi d-April and 23 g atthe end of September 2011. Some of

them are s a mpled everytwo weeks fram May to July and everyfour weeks in Apri l, August,

September and October .

94

On each sample of 30 oysters, are meas ured the average tota 1 weight, the average

weight of the fresh fi esh, of the s hells a nd of the dri ed fi esh. From those meas ures, are

drawn the tota 1 growth, the growth of the fi esh a nd the s pawni ng period.

2.2.2.4. Environmental factors

Close to the Agnas oyster bed in Marennes-Oleron bay, wherethe oysters were

reared, several parameters are measured: the water temperature, salinity and the

fi uorescence, which is a good proxyofthe phytoplankton density. They are measured every

20 minutes by means of in situ probes, whieh are ealibrated every month.

2.2.3. Results 2.23.1. Gonad development

Based on observati ons of histological slides, sixstages were defi ned according to the

gonad devel opmentseen on MRI i mages (Figure 27). At stage 0, gona dis not distinguishabl e

from other tissues (Figure 27a). Then, atstage 1, some 1 ighters pots a ppear on the periphery

ofthe body, a round the digestive gland andtract (Figure 27b). At stage 2, peri phery seems

1 ighter, more or less thick but continuous, around the digestive gland and tract (Figure 27e).

At stage3, whole peripheral bodyis lighterwith darkspots in the middle corresponding to

ves i eular eells (Figure 27d). Forthe maj ority, the gonad went from fully mature (stage 3 on

Figure 27) to stage 4 on two successive MRI sessions, but for some oysters partial

spawning/resorption (stage 3p on Figure 27)was noti eed after stage 3 and before stage 4.

The s pawning/resorption period was longer, in accordance. 50 stage 3p is defi ned when the

peri pheral surface is reduced of at least40% i n comparison to previous MRI session (Figure

27e). Fi na lIy, at stage 4, periphery becomes again darkertha n for previous MRI session with,

someti mes, lighter spots in the middle eorrespondingto ves ieul ar cells a nd digestive tra ct

(Figure 27f).1 ndeed, stage 4 is related to the disappearance ofthe mature gonad on the MR

images: this can be related to the post-spawning period (complete or incomplete). The

peri od of ga metes spawning or resorption was defined as period ofti me precedi ng the date

oftheobservation ofthestage4.

95

Figure 27. Description of the maturation stages based on MRI images. Here are represented the six stages defined from observations of MRI images. The white arrow shows the gonad.

2.2.3.1.1. Maturation stages

1 n Apri 12011, oysters were ma inly atstage 1 (87,7%) while i n April 2012, oysters were

mainly at stage 2 (58,8%). In May 2011, close to 80% of oysters were in stage 2 of

ga metogenes iS.1 n 2012, observations are limited to Apri 1 and June but we ca n noti ce that

distributions of maturation stages are signifi cantly different from Apri 1 and June 2011

(respectively X'=143, PO<0,0001;X'=22, PO=0,0002).1 ndeed, 1 n June 2012, i ndivi duals were

s urprisingly 1 ess maturethan i nJune 2011, des pite the 30 oysters sacrifi ced for histol ogy

which were ail at stage 3.ln June and July 2011, 70-80%offully maturegonads were

observed (Figure 28) and there were no oyster at stage 0 and only 0,5% at stage 1.

Conversely, in June 2012, 5,7%were still atstageO and 2,1% atstage 1 and only 57,9% atthe

stage 3.

96

100% - r-

90% I-- 1-- - - r--80% r- r- - - 1-

70% - 1-- - - r--60% - 1-

50% - 1-- r- - r--> u c: 40% -QI

r- r- I-

'" C' 30% i!! - - r- I- -

u.. 20% - - 1-- 1- -

10% - - r- I- -0%

Figure 28. Distribution of maturation stages over time.

2.2.3.1.2. Date ofspawninq/resorption

Ga metogenesis did notstart atthe sa me ti me for ail oysters but, d es pite different

patterns of ga metogenesis, oysters 5 pawned (completely or pa rti a Ily) mai nly between July

6th a nd August3 rd i n 2011 (89%). There also had some ea rlieri ndividuals (0,6% between May

4 th a nd June 7th; 3% between June 7th and July 6th) and some later i ndivi dua 15 (7% between

August3 rd a nd October 12th) . Date of spawning s howed no 5 ignifi ca nt difference between

mal es and fema les. However, pa rtial spawning is more common forfemales (23%) than for

males (18%).

The evolution of the average flesh weight of the standard oysters of the RESCO

monitoringnetwork (Figure 29) in 2011 indicated two s pawning events around mi d-July and

after mi d-September (Velyger, http://wwz.ifremer.frjvelyger). These a rethe same periods of

97

ti methat our experi mental stock. lt ha s to be noted that, in 2012, the spawni ng occurred

one month later for standard oysters.

Date of spawning 100% ~-----------------------------------r

90 % t-------------~----

80% t-------~~----~~ ,

~ 70% t-----~---.-.~~--~ ~ .. •.. ~ 60% t-~~~~----------~ .Ë 50% t-------------------~ 40% t------------------Il on 30% t-------------------

20% t-------------------

10% t-------------------

, , , ,

.> (!'

",'li ",e;~

Date of observation

7

6 :§

5 'C ~

'" 'C C

4 J!I on ,

Males 2011

c:=:::J Fernales 2011

- -~ - Standard 2011

.. ..... Standard 2012

Figure 29. Date of spawning for studied oysters in 2011 compared ta date of spawning of standard oysters in 2011 and 2012.

2.2.3.1.3. Gonad index

The average maximal gonad index of the 106 survivi ng oysters in 2012 (11= 0,36 ±

0,11) is 1 owertha nthei r maximal gonad index of 2011 (11= 0,55 ± 0,11) but data of the two

years aresignificantlycorrelated (t=2,56;p=0,01):oysterswhich had a high gonad index in

2011 ha d mainly a high go nad index i n 2012 and, conversely, oysters which had a low gonad

index in 2011 had mainly a low gonad index in 2012

2.2.32. 2.2.3.2.1.

Gender-related specificities, Sex ratio

Sex ratio was based on observations of fully mature gonads to ensure correct

assignation. There is no significant difference between 2011 and 2012 (Ta ble 7), the sex ratio

98

bei ng around closeto 50/50 . Some oysters clearly s howed a ma le gonad in a pril or may then

a female gonad in the same year, that were called hermaphrodites.

Number of oysters

Sex ratio Stage 2 Stage 3 Martallty

>• :;;

Between l May l and June

2011

Between

June

2011 and June 2012

.. !~.~,~~.~rm.!r!~~ .......... ~.~ ... l .... ~? .. .... .. : ..... ; .... .. : ..... ..... : ..... ; ...... : .. ... 1 ...... :., •••• • 1 ....... : ....... ; ..... : ........ : .. .. ; ....... : ..... ; ...... : ..... ; ...... : ... .. j. . ..... ~.~~ .. .... i ........ ~~~ ..... .

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Table 7. Gender-related specificities

2.2.3.2.2. Sex change

Amongthe 146 surviving oysters on 6th April 2012, 80weresexed as males and 66 as

fema 1 es in 2011.1 n 2012, 18 (14 ma les and 4 females, in 2011) had notsuffici ently matured

to determine their sex. Among the 128 other oysters (61 males, 66 females, 1

hermaphrodite), which showed a mature gonad, 33% had a sex different from that

expressed in 2011: 24 males in 2011 becamefemales in 2012and 19females became males.

However most of the oysters kept the sa me sex duri ng the two years (Figure 30).

100%

75 % +---

50% +----l

25 % +-- -{

0% Males in 2011 Females in 2011

• Sex change bet wee n

2011and 2012

El Sa me sex in 2011 and

2012

• Und etermi ned in 2012

Figure 30. Distribution of sex changes between 2011 and 2012.

99

2.2.3.2.3. Gametogenesis kinetics

The number of MRI sessions for which gonads were observed at stage 3 is used as a

proxy ofthefull maturity period of ti mes. Males s howed as ignificantly(x2= 16,8, PO=0,0002)

longer full maturity period ofti mes tha nfema le (respectively ~=1, 7±0,5; ~=1,5±0,6)(Table 7).

1 n April 2011, 13% of the oysters were at stage 0 and the other 87% s howed a gonad

at stage Lit appea rs that males were significantly ea rlier than females to reach the stage 2

(X2=8,01; PO<0,04) and stage 3 (X2=14,1, PO=0,003) of gametogenesis (Table 7).

2.2.3.2.4. Summer mortalitv

Oysters have shown no summer mortaliti es duringthei rfi rst year, but they suffered

mortalities during our study (Table 7). As observed for standard oysters (Figure 31),

mortal ities were cha racteri zed bya pea k between May 4 th and June 6th (77 i ndivi dua Is) .

Amongthesedead oysters, there is a highly significant majority offemales : 35 females

against 8 males (and 34 undetermined), while the sex ratio on May 4 th was balanced .

Regardinga relationbetween maturationstageand mortality, number of data is sufficient

only for the period related to the peak of mortality. On May 4 th, the distribution of

maturation stages for oysters that wou ld soon die was significantly different from the

distribution of maturation stages for oysters thatwould survive (X2=11, PO=O,Ol): s urvivors

showed less mature gonads than dead oysters.

34 other oysters died between June 2011 and June 2012, most of them during

summer 2011 (41% of females and 35% of males).

100

100%

90%

80%

70% 21 .. 60 % ~

~ 50 % 1l ~ 40 % ::;:

30%

20%

10%

0%

2.23.3 . 2.2.3.3.1.

Mortality rate in 2011

.,<""- ",'" (;:-v ~v

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/ 1 1/

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Figure 31. Martality rate in 2011 for studied and standard aysters.

Quantitative monitori ng Reproductive effort in 2011 and post-spawning growth

-_ .... _-- Stan dard

~Studi ed

Reproductive effort i n 2011 was assessed as t hevariation between maxi ma l gona d

index (between Apri l and August 2011) and minimal gonad index (in August or October

2011). The evol ution ofvolume ofwet fi es h post-spawningcorresponds to the variati on of

f i esh i ndex between the date of MRI session after s pawning a nd October2011. Va r i ati on of

f lesh index post-spawning is significantly correlated to reprod uctive effort (t=-3,S9;

p=O,OOOS): oysters whichs howed an important reproductive effort arethose which grewthe

mos t after s pawning. The sa me relationshipexists between reproductive effort i n 2011 and

variation of muscle index between post-spawning and 6th April 2012 (t=-3,08; p=0,003).

Furthermore, t he highestthe muscle index was in Apri 1 2011, the highest the gonad index

was duringga metogenesis 2011 (t=3,63; p=0,0003) a ndthe i ncreasing of musc l e index was

synchronous to the increasing of gonad index .

101

2.2.3.3.2. Growth post-spawninq and reproductive effort in 2012

Maxi mal gonad index in 2012 is highly correlated to the growth post-spawni ng 2011

(t = 10,9; p=3.lO,20): oysters which had the most s ignifi ca nt i ncreasi ng of fi esh index and

muscleindexafterspawning2011 werethosewhich had the highestgonad index in 2012.

2.2.3.4. Temperature. salinitv and phytoplankton density

1 n 2011, the water temperaturewas slightly above the 15 years average from mi d

Ma rch ti Il mid-June a nd from Augustti Il October.1 n 2012, the springtime wa rming occurred

four weeks later (Figure 32). However it also appeared a very important bloom atthe

begi nni ng of the spring (March 2012)a nd secondly a decrease of salinity in Apri I-May 2012

a nd a stagnation of the temperature (REPHY network, S. Guesdon, Pers. Com).

30

27

6 24

~ 21

~ 18 ::> !§ 15 .~ 12 E 9 !!' 6

3

- .a nn8e 201 1 - a nnée 2 0 1 2

-t o 1 i

Jan. FélJ, Mars Avr. Mai Juin

~t 1 1

Jui. Août Sep. Oct.

Figure 32. Evolution of seawater temperature in 2011 and 2012.

Nov. Déc,

102

2.2.4. Discussion and conclusions

Magnetic Resonance 1 maging appears as a tool which allows a tempora 1 monitori ng

of ga metogenes is of oysters. Beca use it is a non-destructive method, it is a Iso possi bl e to

compare several periods of ga metogenesis for the same i ndividuals, which is closerto rea lity

than when comparisons were based on observations of different sub-samples. It is

particularly importantwhen we know the i ndividual va riability and pl asti city of oysters for

numerous traits .

To ensurethatstudied oysters behaved likewild oysters, we compared our data to

data from the national monitoring network RESCO. Even if we observed the peak of

mortal ities atthe sameti mefor studied a nd standard oysters, the mortality ratewas higher

for standard oyster than for our studied oysters. This could be dueto the effect of the

genetic background, the age/size of oysters or their date oftransfer to Agnas.

The observation of maturation stages was consistent with the scal es proposed by

Mann (1979),Steeleand Mulcahy (1999) or Normand etaI. (2009). However, individual

monitoringrevealed i ndividual ki netics of ea rly ga metogenesis : each oyster matured a t its

own speed but were mostly fully mature at the same time.lndividual tagging allowed

detecti ng sex changes: i ndependentlyfrom gender, 1 oysteron 3 changed sex between 2011

and 2012 while La ngo-Reynoso (1999)estimated that 50% ofthe oysters have the abi 1 ity to

cha nge sex, ma inly from ma le to fema le. Despitethis frequency of sex changes between the

two peri ods of gametogenesis, sex ratio remained sta ble and balanced contrary to increase

ofthe percentage offema les observed by Guo et a 1. (1998). This coul d be expl ai ned by the

higher mortality rate offema les during s ummer 2011 or by environmental fa ctors promoting

males in 2012 such as lower water temperature.

Monitoring on two successive seasons of gametogenesis for the same oysters

s howed an i mportantva riability of sometra its related to ga metogenesis. Duri ng this study,

we observed that global reproductive effort, represented bythe gonad index, was lower in

2012 tha n i n 2011a nd thatthe maturation of gonads was later in 2012 tha n in 2011. It has

to be noted that, to ensure that maximal gonad index measured in June 2012 could be

103

compa red with that of 2011,30 oysters were sacrificed to ma ke histol ogi ca 1 secti ons . The

a na Iysis of histologica 1 si ides confi rmed that i ndividuals were fully mature and that the

ma ximal gonad index is representative of the reproductive effort in 2012. These global

observations could be partly explained by the variations of environmental conditions

between thetwo years : thespringtimewarming occurred four weeks later in 2012 and it

was shown thattemperature stronglyinfluences kineticgametogenesis and nutrient content

the reproductive i nvestment (Enriquez-Diaz" 2009, Fabioux et a 1. 2005). When focusi ng and

compa ring two peri ods (Apri 1 a nd June ava i 1 a bl e for both yea rs), we could try to better

understandthe ki netic of gametogenesis in relation with environ mental parameters. Hence,

the very important phytoplanktonic bloom observed in ea rly spring 2012 coul d expl ai n the

precocityofgametogenesis in 2012 compared to 2011. However the low salinity in May

20121 inked to very important rainfallatthis period a nd stagnation oftemperatures in May

June2012 couldexplain a final delay of gametogenesis in June 2012 compared to 2011 .

However, reproductive effortseems proportion al from oneyear to another and suggests a

genetic origin of reproductive capacity.

Contrary to current empirical observations, Normand et al. (2009) observed by

hi stology a significantly highergonadic occupation offemales comparedto ma 1 es suggesting

that males and females mature at differentspeed, females bei ng ea ri ier because having a

more devel oped gonad ata given time. Gender a nd maturation stages bei ng differentiated

on MRI images, it is also feasible to establish gender-related s pecifi citi es . As Erna nde et al.

(2004), we observed no difference between gonad index of males a nd fema les but month by

month monitoring revealed differences in kinetics between mal e a nd female ga metogenesis

_ males were earlier and longer matures than females _ butthe spawning date is not

s ignifi ca ntly different by gender. This seems cons istent with the bi ology of the s peci es:

external fertilization in a moving environ ment requires synchronized spawni ng to promote

meeti ng between ma 1 e ga metes and female gametes. Moreover, the s pawni ng occurred at

the sa meti mefor other oysters rea red in Ma rennes -01 éron Bay. We a Iso observed that

females are more susceptible to summer mortalities . However, it is known that female

gametogenesis is more costly in energy tha n the ma le gametogenes is . Femal es are thus

104

more vul nerable when s ummer mortalities occur.lt a ppears also that partial s pawni ng is

more common for females.

Accordingto a previous studyconducted in a n experimental environment (Hatt et al.,

2009), growth post-spawning is positivelycorrelated to reproductive effort: oysters whi ch

had a significant reproductive effort a rethose which hadthe most signifi ca nt growth after

spawning.1 n ourstudy, monitoring on two s uccess ive yea rs al so ail ows to con cl ude that

growth post-spawning is positively correlated to reproductive effort of the next year:

i ndividuals whichgrewthe most during autumn and wi nter 2011 are those whi ch had the

most significant reproductive effort in 2012. Although, we are not able to differenciate

gametes resorption from reserves accumulation, ifan oyster doesn't need to reabsorb

ga metes, reserves accumulation can start ea rlier. 50, an oyster whi ch had totally s pawned

ea rly i nyear n, has moreti meto accumul ate res erves for the ga metogenesis of yea r n+l.

MRI thus a ppears as a suitabletool to i nvestigate the ga metogenesi s of Crassostrea

gigas beca use it confirms some previous knowledge a bout reproductive tra its observed by

cl assical or destructive methods and non-destructive monitoring also brings new i nsights on

i ndividual path of ga metogenesis such as sex change or correl ation of gona d index for two

successiveyears. However, itwould be interestingto repeatthis experimenton several

fa mi lies or wi Id populations during more yea rs. These data wi Il be usedto try to detect some

regi ons ofthe genome, QTL (Qua ntitative TraitLoci), i nvolved in ga metogenes is . The fi ner

characterization of such traits linked to gametogenesis should allow a better

characterizationofthegenetic bases ofthosetraits. Furthermore, the development of high

throughputgenotypingtechniques will ta ke advantage ofthis fi ner phenotypi ng for a fi ner

mapping of the areas of interest in the genome.

2.2.5. Acknowledgements

This work was supported by Ifremer and was pa rti a Ily funded by a gra nt from the

Agence National de la Recherche « Génomique animale» Programme (GAMETOGENEs

proj ect - ANR-08-GENM-041). The a uthors a re grateful to a Il members of staff ofthe Ifremer

105

hatchery in La Tremblade a nd ofthe nursery i n Bouin for producing and rea ri ng the oysters

and woul d particularly liketo tha nk PatrickSoletchnik for providing the envi ronmental data.

2.2.6. References

Davenel, A., Quellec, S., Pouvreau, S., 2006. Noninvasive characterization of gonad maturationanddetermination ofthe sex of Pacific oysters by MRI. Magn. Reson. Imaging. 24 (8), 1103-1110.

EFSA, 2010. Scientific opinion of the panel on animal hea Ith and welfa re on a request from the European Commission on the increased mortality events in Pacific oysters Crassostrea gigas. EFSAJ. 8,1894 -1953.

Enriquez-Diaz, M., 2004. Va riabilité et bioénergétiquede la reproduction chez l 'huître creuse Crassostrea gigas. Océanologie Biologique. Brest, Université de Bretagne Occidentale. PhD. 216p.

Enri quez-Diaz, M.-R., Pouvreau, S., Chavez-Villalba, J., Le Pennec, M., 2009. Ga metogenesis, reproductive investment, and spawning behavior of the Pacific giant oyster Crassastrea gigas: evidence of an environment-dependent strategy. Aquacult.lnt. 17(5), 491-506.

Erna nde, B., CI obert, J., McCombie, H., Boudry, P., 2003. Genetic polymorphism and tradeoffs in the early life-history strategy of the Pacifie oyster, Crassostrea gigas (Thunberg, 1795): A quantitative genetics study. J. Evol. Biol. 16,399-141.

Erna nde, B., Boudry, P., CI obert, J., Haure,J., 2004. Plasticity in resource allocation based 1 ife history traits in the Pacifie oyster, Crassostrea gigas . 1. Spatial variation in food abundance. J. Evol. Biol. 17,342-356.

Fabioux, c., Huvet, A., Le Souchu, P., Le Pennec, M., Pouvreau, S., 2005. Temperature and photoperiod drive Crassostrea gigas reproductive interna 1 cl ock. Aquaculture. 250, 458-470.

Flahauw, E., Quellec, S., Davenel, A., Dégremont, L., La pègue, S., Hatt, P.-J., 2012. Gonad volume assessment in the oyster Crassostrea gigas: Comparison between a histological method a nd a magneti c resonance i maging (MRI) method. Aquaculture. 370-371,84-89.

Ga Istoff, P.S., 1964. The Ameri can oyster, Crassostreo virginica Gmel in. US Fish Wi 1 dl. Serv. Fish. Bull . 64,1-480.

Guo, X., Hedgecock, D., Hershberger, W .K., Cooper, K., Allen, S.K., 1998. Genetic determi na nts of protandricsex i n the Pacifie oyster, Crassostreagigas. Evol ution. 52 (2), 394-402.

106

Hedrick, P.W., Hedgecock, D., 2010. Sex determination: genetic models foroysters. J. Hered. 101 (5), 602-iill.

Hatt, P.-J., Davenel, A., El iat, P.-A., Quellec, S., 2009. Magneti c resonance i maging as a mean to assess the body growth and the gonad development of the oyster Crassostrea gigas. Aquat. Living Resour. 22,331-339.

Huvet, A., Norma nd,J., Fleury, E., Qui Il i en, V., Fa bioux, c., Boudry, P., 2010. Reproductive effort of Pacific oysters: a tra it associated with s uscepti bi 1 ity to summer morta 1 ity. Aquaculture. 304,95-99.

lango-Reynoso, F., 1999. Determination de la sexualité chez l'huître Crassostrea gigas (Thunberg, 1793). PhD Thesis, Institut Universitaire Européen de la Mer, 178pp.

lango-Reynoso, F., Devauchelle, N., le Pen nec, M., Hatt, P.-J., 1999. Elements of reproductive strategy in oysters, Crassostreagigas, from the "Ra de de Brest", France. Invertebr. Reprad. Dev., 36 (1-3), 141-144.

le Dantec,J., 1968. Ecologie et reproduction de l ' huître portugaise (Crassostrea angulata, la ma rck) da ns 1 e Bassin d'Arcachon et sur la rive ga uche de 1 a Gi ronde. Rev. Trav. Inst.Pech. Marit. 32 (3) : 237-362.

lynch, S. A, Carlsson,J., Rei Ily, A O., Cotter, E., Cull oty, S. c., 2012. A previously undescribed

ostrei d herpes vi rus 1 (OsHV-l) genotype detected i nthe pacifi c oyster, Crassostrea gigas, in Ireland. Parasitology, 139 (12), 1526-1532.

Mann, R., 1979. Some biochemical and physiological aspects of growth and ga metogenes is in Crassostrea gigas a nd Ostrea edulis grown at susta i ned el evated temperature. J. Mar. Biol. Assoc. U.K., 59, 95-110.

Normand,J., Ernande, B., Haure, J., McCombie, H., Boudry, P., 2009. Reproductive effort and growth in Crassostrea gigas: comparison of young diploid a ndtriploid oysters iss ued from natural crosses or chemical induction. Aquatic Biol. 7, 229-241.

Peeler, EJ., Reese, R.A., Cheslett, D.l., Geoghegan, F., Power, A, Thrush, M.A., 2012 . 1 nvestigation of mortality i n Pacific oysters associated with Ostreid herpesvirus-lllVar in the Republic of Ireland in 2009 . Prev. Veto Med., 105 (1-2),136-143.

Pouvrea u, S., Ra mbea u, M., Cochard, J.C., Robert, R., 2006. 1 nvestigati on of mari ne bivalve morphology by in vivo MR i maging: first anatomical results of a promising techni que. Aquaculture, 259 (1-4), 415-423.

Rena ult, T., Morea u, P., Fa ury, N., Pepi n, J.-F., Sega rra, A, Webb, S., 2012 . Ana Iysis of clinical

Ostreid Herpesvirus 1 (Malacoherpesviridae) specimens by sequencing amplified fragments from three vi rus genome areas . J. Vi roi., 86 (10),5942-5947.

107

Roque, A., Ca rrasco, N., Andree, K.B., Lacuesta, B., Elandalouss i, L., Ga i ri n, 1., Rodgers, C. J., Furones, M. D., 2012. First report of OsHV-l mi crova r in Pacifi c oyster (Crassostrea gigas) cultured in Spain . Aquaculture, 324, 303-306.

Samai n, J.-F., Dégremont, L., Sol etchnik, P., Ha ure, 1., Bédier, E., Ropert, M., Moa l, J., Huvet, A., Bacca, H., VanWormhoudt, A., Del a porte, M., Costil, K., Pouvrea u, S., Lambert, c., Boulo, V., Soudant, P., Nicolas, J.L., Le Roux, F., Renault, T., Gagnaire, B., Géret, F., Boutet, 1., Burgeot, T., Boudry, P., 2007 . Genetically based resistance to summer mortality in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and its relationship with physi ological, i mmunological characteristics and infection process. Aquaculture. 268, 227-243.

Segarra, A., Pépin, J.F., Arzul, 1., Morga, B., Faury, N., Renault, T., 2010. Detection and description ofa particular Ostreidherpesvirus 1 genotype associated with massive mortal ity outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France i n 2008. Vi rus Res., 153,92-99.

Soletchnik, P., Razet, D., Geairon, P., Faury, N., Goulletquer, P., 1997. Ecophysiology of maturationandspawningin oyster Crassostrea gigas: metabolic (respiration) and feedi ng (clearance a nd a bsorption rates) responses at different maturati on stages. Aquat. Living Resour.l0, 177-185.

Steel e, S., Mul cahy, M.F., 1999 . Gametogenesis ofthe oyster Crassostrea gigas in southern Ireland. J. Mar. Biol. Ass. U.K., 79, 673-686.

108

PARTIE III: CARACTERISATION GENETIQUE DE L'EFFORT

REPRODUCTEU R

1. Préambule

Cette partie est rédigée en Français mais sous la forme d'un article qui sera prochainement troduit en Anglais pour être soumis à Aquaculture.

2. Article 4: Détection de QTL de l'effort reproducteur chez l'huître creuse, Crassostrea gigas.

Emilie FLAHAUW, Serge HEURTESISE, Christophe SaURY, Philippe-Jacques HATT, Sylvie LAPEGUE

Cette étude étant un travail d'équipe, il est important de préciser les tâches que j'ai effectuées, seule ou accompagnée par les coauteurs :

• La production, l'élevage, le conditionnement et le marquage des hUÎtres, • L'histologie, de la fixation à l'analyse des coupes, • L'analyse des images IRM, • Détection des marqueurs SNPs in silico, • L'extraction et la préparation de l'ADN en vue du génotypage, • L'analyse des données de génotypage, • La cartographie génétique, • La détection de QTLs.

2.1. Introduction

L'huître creuse, Crassostrea gigas, est une espèce d'intérêt économique au niveau

mondi al. En 2011,4,4 millions detonnes ont été produites (FAO, 2013). Cependa nt, sur 1 es

côtes fra nçaises, 1 es juvéniles d'h uÎtres creuses subissent d'i mportantes mortalités estiva 1 es

depuis 2008 (Pernet et a /., 2010) et les conséquences s ur la production nationale sont d'ores

et déjà perceptibles :jusqu'en 2009, la France produisaitenviron 130 000 tonnes d'huîtres

par an tandis qu'en 2010et2011, la production n'a pas dépassé les 80 000 tonnes (Comité

National de la Conchyliculture, http://www.cnc-france.com).

Le phénomène des morta lités estivales d'huîtres creuses estconnu depuis 1945 sur

les côtes japonaises (Koganezawa, 1974), depuis 1980s ur les côtes françaises (Ma urer et a/.

1986; Sodoy et a /.1990; Soletchnik et a/. 1999) et a été pa rticul i èrement étudié dura nt 1 e

110

projet MOREST (Samain et McCombie, 2008). Une forte héritabilité de la réponse aux

morta 1 ités estivales a notamment été mise en évi dence (Dégremont et a 1.,2007) et a servi

de base à la sélection de lignées « résistantes» (R) et de lign ées « sensibles» (S) aux

morta 1 ités estivales (Dégremont et al, 2009). Des régions du génome, Quantitative Trait Loci,

i mpl iquées dans 1 a réponse a ux mortalités estivales ont d'ailleurs été détectées (Sa uvage et

al.,2010).

Pa rallèlement, Samain et al. (2007) et Huvet et al. (2010) ont mis en évi dence une

forte corrélation entre la réponse aux mortalités estivales et l'inves ti ssement dans la

reproducti on : 1 a reproduction est ainsi suspectée de représenter un coût énergéti que élévé

chez les huîtres S (s upérieur à celui des R) à l 'origine de leur fragilité physiologique. De pl us,

un ensembl e de gènes ca ndidats ont été détectés da ns une analyse tra nscriptomique (FI eury

et al., 2010) comme différentiellement exprimés entre des individus RetS tout au long d'un

suiviinsitu.Certainssontdes candidats à privilégier au regard des hypothèses énoncées à

l'origine des mortalités estivales tel/es que 1 e déséquilibre énergétique 1 ié à la reproduction

ou la capacité de réponse au stress (Samain et al. 2007). Ce sont notamment des gènes

codantpourun facteur de croissance gonadique, un récepteur type neuropeptide Y, une

SuperOxide Dismutase, ou une catalase.

Cependant, s i les mécanismes de la gamétogenèse de l 'huître creuse et l'i nfluence de

l'environnement sontbien décrits dans la littérature (Enriquez-Diaz, 2004; Fabioux et al.,

2005; Normandetal., 2009), la part génétique du contrôle de caractères liés au sexe, sa

miseen placeetson dével oppementestencore mal connue. Par exemple, le déterminisme

sexuel n'a, à ce jour, pas encore été élucidé bien que des modèles à un locus (Guo et al.,

1998; Hedrick et Hedgecock, 2010) ou trois loci (Haley, 1977) aient été proposés. Ai nsi,

connaître l'architecture génétique de l 'effort reproducteur de l 'huître creuse pourrait être

une cl é de 1 a compréhension du lien entre la reproducti on et 1 e phénomène des mortal ités

estivales. L'objectif de cette étude est donc de détecter non seulement des régions du

génome i mpl iquées dans l'effort reproducteurde l 'huître creuse, ma is pl us 1 a rgement da ns

la dynamique de la reproduction afin de donner des clés de compréhension des méca nismes

111

compl exes sous-jacents. Des zones candidates à privilégier pour des études génomi ques et

fonctionnelles plus poussées pourront être proposées.

2.2. Matériel et Méthodes 2.2.1. Matériel biologique

Les huîtres uti lisées da ns cette étude a ppartien nent à trois familles bi -pa renta 1 es de

type F2, nommées F2-18, F2-19 et F2-21 (Figure 33). Ces familles ont été choisies en fonction

des ta ux de mortalité a u cours de l'épisode de morta lité estivale d'août 2010 (voi r pa rtie IV

pour pl us de déta ils). Pourproduire ces familles, des individus a ux performances contrastées

en termes de survie aux mortalités estivales issus de la sélection menée au cours du

programme MOREST (Dégremont et al, 2009) ont été utilisés comme génération FO . Une

femell e FO « sensible» a été croisée avec un mâle FO « rés istant» pour produire unefa mi Il e

Fl a u sei n de 1 aquelle 2 mâles et 2 femelles ont été choisis pour obtenir 1 es familles F2 -18 et

F2-19. De la même façon, une femelle FO « résistante» a été croisée avec un mâle FO

« sens i ble» pourprodui re une fa mi Il e Fl au sei n de 1 aquell el mâl e et 1 femelle ont été

choisis pour obtenir la famille F2-21.

Pour chaque croisement et afin de contrôler les fécondations, les gamètes ont été

récupérés par scarification des gonades. L'élevage larvaire et le micro-nursage ont été

effectués à l'écloserie Ifremer de La Tremblade (Charente ma ritime, France). Puis, les huîtres

ont été transférées à la nurserie Ifremer de Bouin (Vendée, France) pour le nursage et la

protectionvis-à-vis des mortalités estivales entre avril et octobre 2010. Pour chaque fa mill e

F2, 300 huîtres ont été répa rties en 2 poches de lS0 et pl acés surdes tables ostréi col es sur

l 'estran à Agnas (Bassin de Marennes-Oléron, Charente maritime, France)

112

,

FO~and-oarents selected on mortalitv rate (Ml durinl! a summer mortalitv event

Q S4 0' RS M = 86 % M = 16%

~ ,

, --

---.~#~ ---

F2-18 family M = 76%

Fl-21 family M = 6S% ~ ~ .... --, ,

" '.

F2-19 family M= 30%

, ,

Q RS O Sl1 M= 16% M = 99%

~ Fl-22 family

M = 71%

F2-21 family M = S8%

Figure 33. Production des familles expérimentales. Les grands-parents FO proviennent de lots sélectionnés pour leur réponse aux mortalités estivales. Le lot R5 présente un taux de mortalité (M) f aible tandis que les lots 54 et 511 présentent des taux de mortalité élevés. Les familles Fl produite s à partir de ces lots

présentent des taux de mortalité intermédiaires. Les f amilles F2 ont été obtenues par des croisements biparentaux de frères et sœurs Fl et présentent des taux de mortalités fa ible (F2-

19), moyen (F2-21) et élevé (F2-18).

2.2.2. Suivi de la gamétogenèse par Imagerie par Résonance Magnétique

Les huîtres de 1 a famille F2-18 ontfa it l'objet d'un suivi individuel de 1 a ga métogenèse

pa ri RM. Pour cela, les 300 individus ont été numérotés di rectement sur 1 eur coqui Il e ava nt

leur transfert sur estran. Les huîtres ont été amenées à 1 a pl ateforme PRI SM de 1'1 RSTEA

(Rennes, Bretagne, France) pourêtresoumisesà 6 sessions IRM en 2011 (4 avril, 5 mai, 7

j ui n, 6 jui llet, 3 août et 12 octobre) et 2 sessions en 2012 (6 avril et 6 jui n). Le protocole a été

décri t da ns FI ahauw et a 1. (2012) . En résu mé, 1 es huîtres ont été tra nsportées à sec entre La

Tremblad eetRennes puis immergées dans de l'eaude mer afin d'ouvrir leurs valves pour

ex pul ser les bulles d'airéventuellementformées pendant letransport. Les coqui Iles ont été

113

débarrassées de leurs épibiontes et séchées pour réduire les signaux-parasites qui

pourraient être émis.

Les mesures 1 RM ont été effectuées pa r un sca nner Si emens Ava nto à l,ST (63,86

MHz) au moyen d'une antenne-tête accueillant15 huîtres à la fois, réparties sur 5 platea ux

superposés. Une séquence de gradient d'écho à pondération Tl a fourni 52 images

éclaircissant les tissus des huîtres et, plus particulièrement, les tissus gonadiques.

Les principaux paramètres du protocole IRM étaient:

Dimensions du champ observé = 161,9 x 185 mm 2 (matrice: 280 x 320)

Dimensions du pixel des coupes transversales = 0,58 x 0,58 mm 2

Distance entre deux coupes successives = 1,5 mm, impliquant/es dimensions

des voxels 0,58 x 0,58 x 1,5 mm3

Temps de répétition = 11 ms; temps d'écho = 3,01 ms; angle d'impulsion = 20'

Nombre de coupes transversales par animal = 52

Filtres = correction de distorsion + pré-acquisition standard + filtre elliptique

Temps d'acquisition pour 52 sections = 12 min 56 s (nombre d'excitations = 6)

Un a Igorithmefondé sur un pl ug-i n 3D abject Counter uti 1 i sant 1 el ogi ci el 1 mageJ

(développé parWayne Rasband, Nationall nstitutes of Hea Ith, Bethesda, MD et dis poni ble

pa rftpsur zi ppy.nimh.nih .gov/ ou http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html) a été uti 1 i sé pour

extra i re une compilation d'images pourchaque huître et calculerl'histogra mme de nivea ux

de gris de cette compilation.

2.2.3. Analyse des images IRM

A partir des histogrammes de niveaux de gris individuels, de nombreux traits en

ra pport avec la ga métogenèse ont été mesurés. Les méthodes et rés ultats de mes ure de ces

différents traits sont détaillés da ns l'article 3. En bref, les stades de maturation gonadique

ont été définis à partir de l'échelle de Steele et Mulcahy (1999). La précocité a été

cons idérée comme la date d'arrivée au stade 2 et a u stade 3. La durée de pl ei ne maturité a

été défi ni e comme 1 e nombre de séances d'I RM pour 1 esquelles le stade 3 éta it observé. La

114

date de ponte correspond au mois précédent l'observation du stade 4. Les sexes ont pu être

différenciés par le niveau de gris plus clair des femelles par rapport aux mâles . Un

changement de ce niveau de gris pour un même individu a permis de supposer un

changement de sexe. L'indice gonadique correspond au rapport entre le volume de la

gonade et le volume intravalvaire. Enfin, la reprisede la croissance après ponte a été

esti mée pa ria var iation de l'indice de cha ir(rapport entre 1 e vol ume de chai r et le vol ume

intravalvaire) suite à l a ponte.

2.2.4. Observation de la gamétogenèse par histologie

La ga métogenèse des huîtres des fa milles F2-19 et F2-21 a été étudiée pa r histologie.

Pour cela, les 7 et8juin 2011 les 300 individus dechaquefamilleontétédécoquillés,

identifiés etfixés entiers da ns du fixateurde Davidson (Shaw a nd Battle, 1957) pendant 24h.

Puis, les 8 et 9 juin 2011, les coupes histologiques ont été préparées comme décrit par

Fa bi oux et al. (2005). En résumé, des coupes de 3 mm de masseviscéra le ont été prél evées

en amontdela cavité péricardique etimmédiatementfixées dans du fixateur de Davidson

(Shaw and Battle, 1957) pendant 48h . Après déshydratation et enrobage dans de la

paraffine, des coupes de 51lm ont été réal isées, montées sur lames d'observation et colorées

à l'hématoxyline de Harris - éosine Y (Martoja and Martoja-Pierson, 1967).

Le sexe et 1 e stade de maturité des gonades ont été détermi nés a u mi croscope selon

l 'échelle décrite par Normand et al. (2009). Les coupes histologiques ont également été

numérisées à l'aide d'un scanner (Epson Perfection 4870 Photo) et les images ont été

sa uvegardées a u formatJPEG. Les surfaces de tiss us ont été mes urées à l'a ide du 1 ogi ciel

d'ana lyse d' images IMAQVision Builder (National Instruments Corp, Austin, Texa s, USA) .

Da ns un premiertemps, chaque i mage a été convertie en nivea ux de gris. Puis, une première

régi on d'i ntérêt (ROI) a été dess inée à l'aide d'uneta blette gra phique (Wacom Ba mboo Pen

and Touch, Wacom, Tokyo, Japan) pour éliminer les branchies et les autres tissus

péri phériques. La surface de cette premi ère ROI a été considérée comme la s urfacetota le de

1 a masse viscérale. Enfin, une seconde ROI a été dess i née pour él i mi ner les cell ul es de la

gl ande digestive. Les cellules gonadiques ont alors étésél ectionnées par ajustementdu seuil

115

de niveau de gris et la surface gonadique a été automatiquement calcul ée en pixels

(Hefferna n and Wa 1 ker, 1989).

2.2.5. Marqueurs moléculaires et génotypage

Les grands-parents FO, l es parents Fl ainsi que les 900 descendants F2 ont été

génotypés pour 384 ma rqueurs SNPs (Annexe 8). Parmi ces ma rqueurs, 206 d'entre eux ont

été développés chez Crassostrea gigas dans l'Article 1. Pa rmi ces 206 ma rqueurs, 35 sont des

SNPs détectés in vitro dans des gènes exprimés dans la gonade lors d'expérimentations

réalisées au Laboratoire de Physiologie des Mollusques à Brest afin d'identifier des

marqueurs impliqués dans les mortalités estivales de naissain; 1 a été détecté par

assemblage d'ESTfournis parGenBank (Bai et a 1.,2009); 170 SNPs ont été détectés in si 1 i co

à parti rdu 6ème assemblage de la base de données d'EST de Crassostrea gigas (http://public

contigbrowser.sigenae.org:9090j Crassotrea...,gigasjindex.html) (voir Article 1). Les 178

autres SNPs ont été choisis dans le 8ème assemblage de la même base de données pour

remplacer 1 es SNPs qui avaient posé problème a u cours du génotypage décri t dans l' Articl e

1.I1s ont été génotypés à l'aide de 1 a technique GoldenGate d'Illumina s ur la pl ateforme de

génotypage de Bordeaux. Les données de génotypage ont été ana lysées via le module

Génotypage du logiciel GenomeStudio développé par Illumina.

2.2.6. Cartographie génétique

Les génotypes ont été ana lysés à l'aide de la fonction de cartographie de régression

du logiciel Joi nMap4.0 (Va n Ooijen, 2006). Letype de popul ation uti lisé est letype CP (Cross

Pollination). Un test X2 effectué par JoinMap a permis d'écarter les loci déviant

significativement des lois mendéliennes (a~ 0,0001). Le LOD d'i ndépendance mi nimum a été

fixé à 3.0 et 1 es autres paramètres ont été 1 a issés a ux va 1 eurs pa r défaut proposées par le

logi ciel. La 1 ongueurdes cartes a été calculée selon la fonction de cartographie de Ha Ida ne.

2.2.7. Détection de QTL

La normalité des traits étudi és a été vérifiée statistiquement pa r un test de normalité

de Shapiro-Wilk grâce a u package RCommander (Fox, 2005) développé pour 1 e programme R

(R Devel opmentCore Tea m, 2005). Afi n de prendre en compte 1 e suivi temporel de l' indice

116

gona dique, une Ana lyse en Composantes Principales (ACP) a été réa 1 isée à l'aide du package

FactoMineR (Husson et al., 2008) développé pour le programme R (R Development Core

Tea m, 2005) . Les i ndi ces gonadi ques de chaque mois ont été désignés comme va ria bl es

a ctives ta ndis que 1 es données de survie, 1 e sexe, levolume i ntravalvaire, 1 es indices de cha i r

mensuels et les indices musculaires mensuels ont été désignés comme variables

supplémentaires. La composante principale de l'ACP a été utilisée comme un phénotype

pour 1 a détecti on de QTLs. Le 1 ogici el MapQTL 5.0 (Va n Ooijen, 2004) a été uti 1 isé pour

détecter des régions du génome impliquées dans la gamétogenèse via le test non

pa ramétrique de Kruskall-Wa Il is et la ca rtogra phi e par i ntervall es . La pa rt de va ri a nce

expliquéeparchaqueQTLest calculée automatiquement par le logiciel selon la formule

suivante: 100 * (HO_var - var) / variance de la population où HO var est la variance

rés iduelle. Les bornes de l'intervalle de confiance ont été défi nies par 1 a valeur maxima le du

LOD à laquelle on soustrait 1 unité.

2.3. Résultats 2.3.1. Suivi de la gamétogenèse par IRM

Le phénotypage de la famille F2-18 a u moyen de l', RM a été décrit da ns l'a rticl e 3.

Les moyennes, éca rt-type, va leur mi ni mal e et maxi ma 1 e des tra its s ont résumés da ns 1 e

Tableau 8.

Les tests deShapiro-Wilkontmisen évidence que seuls les indices gonadiques de

mai 2011 (p-value = 0,59) etj uin 2012 (p-value = 0,06) s uiva ient une distri buti on norma 1 e.

Aux autres dates, la distribution nesuitpas une loi normaleetla transformation en log10 ne

change rien.

Les coefficients de corrélation de Pea rson ont révélé une forte corrél ati on entre le

sexe des individus et le changement ou non de sexe (P = 0,96). L'indice gonadique à un

i nstantt est éga 1 ementfortement corrélé à indice de chair à l'i nstant t : de 0,83 en octobre

2011 à 0,91 en juin 2011 (Tableau 8). De plus , l ' indice gonadique ma ximal en 2011 est

fortement corrélé à l'indice de chair en octobre 2011 (P = 0,83) et l'indice gonadique

maximal en 2012 est fortement corrélé à l'indice de chair en avril 2012 (P =0,86). En

117

reva nche, l'indice gonadique n'est pas corrélé a u sexe (P < 0,20) ni à l'indice mus cul aire (P <

0,20) .

L'ACP a révél é que 1 a composante principale expl iquait 31,92% de la va riati on des

indices gonadiques mensuels.

Indice de chair Statistiques descr iptives

Avril Mal Juin Juillet Août Octobre Avril Juin Min. Max.

Ecart-

2011 2011 2011 2011 2011 2011 2012 2012 Il Type

Avril 2011

0,85 0,39 0,19 0,33 0,13 0,14 0,06 0,07 ° 64 30,6 11,2

Mai 0,29 0,87 0,24 0,36 0,25 0,13 0,13 0,08 ° 66 36,9 12,2

2011 Juin 2011

0,18 0,31 0,91 0,61 0,17 0,03 0,05 -0,11 4 77 53,4 12,9

Juillet 0,26 0,29 0,42 0,86 0,3 0,25 0,05 -0,04 ° 82 37,5 13,8

'" 2011 " 0' Août '6 0,19 0,21 0, 17 0,22 0,84 0,29 0,18 0,06 ° 43 14, 3 7,6 .. 2011 ~ 0 bD Octobre '" 0,17 0,05 0,01 0,2 0,43 0,83 0,45 0,29 ° 28 12,4 7,2

.11 2011 't> !: Avril

2012 0,14 0,12 0,12 0,12 0,25 0,39 0,86 0,45 ° 60 30,6 14,6

Juin 0,14 0,09 -0,08 0,02 0,04 0,23 0,43 0,88 ° 54 21,8 12,0

2012 Maximal

2011 0,17 0,05 ° 0,19 0,43 0,83 0,45 0,29 ° 28 12,4 7,2

Maximal 0,14 0,12 0,12 0,12 0, 25 0,39 0,86 0,45 ° 60 30,6 14,6

2012

Tableau 8. Coefficients de corrélation de Pearson entre l'indice de chair et l'indice gonadique estimés par fRM

sur la famille F218 et statistiques descriptives de l'indice gonadique.

2.3.2. Suivi de la gamétogenèse par histologie

Seullestade3 (Normand et al., 2009) a été observé: les gonades étaient toutes à

pleine maturité au 7 juin 2011. Les sex-ratio des familles F2-19 (77% de mâles, 22% de

femelles) et F2-21 (55% de mâ les, 44% defemelles sont significativement différents (X2= 10 ;

P = 0,001). La famille F2-19 présente un rapport gonado-somatique plus élevé

(~=0,542±0,156) que la famille F2-21 (~=0,477±0,139)

Les tests de Sha pi ro-Wilk ont confirmé que 1 es distri buti ons des ra pports gona do

somatiques des fa milles F2-19 et F2-21 suivaient une loi normale (respectivement p-val ue =

0,17 etp-value=0,68).

118

2.3 .3. Marqueurs moléculaires et génotvpage

Sur les 384 marqueurs, certains ont été rejetés lors de l 'observation graphique des

profi Is fournis pa rGenomeStudio : 99 pour 1 a fa mille F2 -18, 97 pour 1 a fa mille F2-19, 89 pour

1 a famille F2-21. Le taux de succès de génotypage (nombre de marqueurs génotypés avec

succès / nombre total de marqueurs) s'élève donc à 74,2% pour la fa mille F2 -18, 74,7% pour

la famille F2 -19 et 76,8% pour la famille F2-21.

Ensuite, 1 es SNPs monomorphes ont été éca rtés pour chaque fami Il e : 190 pour 1 a

fa mi Ile F2-18, 174 pour la fa mille F2 -19, 176 pour 1 a fami Il e F2-21. En dépit du nombre de

ma rqueurs de dépa rt, seuls 95 SNPs ont été retenus pour 1 a cartographie de 1 a fa mille F2 -18,

113 pour 1 a famille F2 -19 et119 pourla fa mille F2-21. Le ta ux de conversi on, défi ni pa r le

nombre de ma rqueurs polymorphes / nombretotal de ma rqueurs (Fa n et al., 2003) s'él ève

donc à 24,7% pour la fa mille F2 -18, 29,4% pour la famille F2-19 et 30,9% pour la fami Ile F2-

21.


Pa rmi les 95 SNPs retenus pour la cartographie généti que de la fa mi Ile F2 -18, 2 ont

été rejetés en ra ison de 1 a distorsion de s égrégati on . La carte généti que de 1 a fa mi Il e F2 -18

est donc composée de 93 marqueurs et sa longueur totale est de 376,76 cM (Tableau 9

b).Pa rmi 1 es 113 SNPs retenus pourla cartographie génétique de la fami Il e F2 -19, 5 ont été

rej etés en raison de 1 a distorsion deségrégation. La ca rte généti que de 1 a fa mi Il e F2-19 est

donc composée de 108 marqueurs et sa longueur totale est de 351,45 cM (Tableau 9

c) .pa rmi 1 es 119 SNPs retenus pour 1 a cartographie génétique de 1 a famill e F2-21, 10 ont été

rejetés en raison de la distorsion de ségrégation. La carte génétique de la famille F2-21 est

donc composée de 109 ma rqueurs et sa longueur tota 1 e est de 350,16 cM (Ta bl ea u 9 dl .

Pour la carte combinée des 3 fa milles F2, 189SNPs ont été ca rtographiés sur 10 groupes de

liaison dont la longueur totale est de 447,23 cM (Tableau 9a et Figure 34).

Pour les 4 cartes, les groupes de liaison ont été numérotés en fonction de leur

longueur, du plus longau plus court.

119

Groupe de Nombre de Longueur Espacement moyen entre Groupe correspondant

liaison marqueurs (cM) les marqueurs leM) F2-18 F2-19 F2-21 • la 15 58,92 4,21 7b 7e 1d VI et VIII

2a 27 57,67 2,22 3b le 8d 1 et X

3a 17 53,37 3,34 lb 2e 2d IV

4a 8 51,07 7,30 9b 8e 5d VII

5a 26 a

50,60 2,02 8b 3e 4d Il

6a 35 50,39 1,48 5b 4e 6d V

7a 19 48,93 2,72 2b 6e 7d VI

8a 13 41,89 3,49 6b ge 10d III

9a 26 33,27 1,33 4b 5e 3d IX

10a 3 1.14 0,57 lOb 10e 9d -Moyenne 18,9 44,72 2,87 - - - -

Total 189 447,23 - - - - -Groupe de liaison Nombre de marqueurs longueur (cM) Espacement moyen entre les marqueurs leM)

lb 11 71,04 7,10

2b 11 62,06 6,21 3b 13 47,35 3,95 4b 8 46,29 6,61 5b 19 46,16 2,56

b 6b 8 41,93 5,99 7b 7 23,32 3,89 8b 7 19,00 3,17 9b 6 18,47 3,69 lOb 3 1,14 0,57

Moyenne 9,3 37,68 4,37

Total 93 376,76 -Groupe de liaison Nombre de marqueurs Longueur (cM) Espacement moyen entre les marqueurs (cM)

le 20 69,33 3,65

2e 9 56,63 7,08

3e 15 43,48 3,11

4c 21 43,45 2,17

5e 14 40,29 3,10 e 6e 9 33,09 4,14

7e 7 32,34 5,39 8e 6 23,49 4,70 ge 5 8,97 2,24

Wc 2 0,38 0,38

Moyenne 10,8 35,14 3,60

Total 108 351,45 -Groupe de liaison Nombre de marqueurs Longueur (cM) Espacement moyen entre les marqueurs leM)

1d 8 61,84 8,83

2d 14 53,18 4.09

3d 20 48,74 2,57

4d 17 48,60 3,04

5d 7 46,35 7,73

d 6d 20 37,81 1,99

7d 9 29,26 3,66

8d 7 12,10 2,02

9d 3 6,24 3,12

10d 4 6,04 2,01

Moyenne 10,9 35,02 3,90

Total 109 350,16 -. . .. Tab/eau 9. Caractenstlques des cartes genetlques combmee (a) et des famIlles F2 -18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d). Les groupes de liaison de la carte combinée sont reliés aux groupes correspondants sur les cartes de chaque/amille et aux

groupes correspondants sur les cartes précédemment publiées -- (Hubert et Hedgecock, 2004 ; Sauvage et al., 2010) via les marqueurs communs. Les longueurs et les distances sont données en centfMorgans (cM).

120

Figure 34. Carte génétique combinée de Crassostrea gigas. Les QTLs détectés apparaissent sur la carte avec une couleur différente par trait et un motif par famille (F2-18 en trait pJeini F2-19 en tirets et F2-21 en pointillés) . Les distances sont exprimées en centiMorgans (cM).

0.0 2.1

7.4

lB 24.4 25.7 :<li.B 27.3

32.9 33.2

1 snp_AM354177 _247 ESTl04_ 43

snp_CF3S9132_326

snp_CUi84465_9J snp AJ565506 195 snp~4_ CI.I9~1 SOD Flavin_monoxy_2

snp_ CI.I992933 _132 sn P _ M3l5369 _ 25S

.. 1·· .. ·-"· ... 46.0 snpŒIOfMl66353 46.2 snp62 1-"M354967 46.9 snp_AM353792_146

59.9 snpt40 _ AJ.3l0845

OD

8.1

155 16.8 18.4 235 249 252 25.5 25.8 259 lJ.O

37B 3SB G2 a2 «2 ~. 1 ~1 513 ~.7 ~D

~A

~]

2 ~..,

sIiP.CU685ffi3. 126 "'C::> ;}

.; snp.CU992707J94 X..,r:o ~..,,,,

« ~"Ç sop194 AA'857828 l ':<.~ snp 1lI7l36ll0 603 O{ snp045. CU6BtŒ6 ~ snp CU683S58 368 X"" snp=8042717(1095 snp. AMaSnl1_ 491 snp.80426564.125 snp 151 J UiOSJ,t.Ol,t.ON8 snp3BO. AA'858009 snp724 _ M1E62697 snp. CU994453)E6

snpS05. AM854527 snp AI~641 319 snii)54 JUGOsJ,t.018lT1 sn~20_AJ565717 snp237. AA'855591 snp295 ./>M'.67758 snp. 8Q.42692B. 40 snp445JUGOSJ,t.Ol 801 K snp.~I86.569 snp.ABl2lI54.1511 snp. EW77902B. 227 snp. 8Q426928J 15 snp ABl22054 98 snp427 _ CI.I99S'796

OD

33

13.4

24.7 :<li.6 282 31.6 329 338 34,7 35D 36] 40.6 428 44 .4 «.5

63.4

3

sn!69J .FUiOSJ,t.01A613

snp_~61494_473

~ ~ ~

.~e #

snP. CU9!l1225. 417

r:o\~O{,?e

x~~~..,

snp069_CX069262 snp_ AM954612. 119 AY321300 snp.fW777736.246 sn p_~536B7.32 snp_CU%S744)18 ",pm CU987286 snp CKl72327 436 snp572. ftM8597Œ1 snp_~61654_152 snp283_ES789127 snp _ A'0'8551 02. 431 snV'MI551 02.290

snp_CI.I682324_234

121

0.0

15.0

34.3 34.4 35.1 38.8

43,7

51 ,1

4 snpG61_ CU995315

snp_ CU99!Œ6_97

snp_~871 _333 Macrophage_express EST36_29_2 snpl 32_AM856794

snp482_CU990615

snp_~40'7_329

~1Iy ~ "f\:J ~1Iy ~1Iy ~

.~" ",f\:J 'V ~ ~ ....... '" . ~ ~~ ·~'V 8 .§?' ~ .... oS ';\~ l"'co~

l.'V ' ~ ~ .. CO ,,~ ... «'li «"" «'V.,. ~ ..

• 1 1 1

5 0:0 snp_AM357913 _323

3.0 Orac3 1 5.3 snp AM859907 237 5.5 snP;sa_EX15,' ~ snpj,MEl54952_331 6 .1 snp328_CX069134 6.5 / snp348J~OSJ:MI1CaAU 67 sn.~S7 J~OSJA()H3A6L

• • • ;C''?'.l

~('~ ~ q~~(;)

8.1 sn~ ElJG78313 434 ~ 8.9 sn p:CU683S67~) 12 './.0

10.5 snp470_EW777685 <r'4, J'~ .... (;) "'~~l

'19.6 EST34 6 0t.-J. ~.5 sn~43:FœOSJ:MI1AaJX , ':>0 228 snp_AM857816 _166 snp_'EW779l8t]49 '.l"

. snp EW779~81 .638 24.0 snü!,h-\8594673'8 27 .1 snp32IJœOSJA1l2f4RH 273 snp332JœOSJA01AOBO

34.8

39 .0

snp596_fP008883

HEST36_22bis 44" 1 s"p AJ565645 416 45.5 $np:: M.1I3ô3, 7l,lf_t07 46.4 snp .-!.Ml57 471 352 49 ,3 snp:,.!.Ml55277:64 50 :6 snpSS4_S0426822

122

0.0 1.5 1.7 2.5 3.4 3.7 4.1 4.2 4,4 4.8 S.1 $,3 6.0 6.9 8.8

IS.3 15.8 16.5 17.6 18.4 18,9 19.4 . 28.3 J

30.2 31.3 32,8" 36.4 40.1 40,4 40.5 40.7 41.8 43.2 50.4

6 sn p692JU&OSJ,O/lI I>DRS

, snp5ll3_D'A713882 snp_AM362882_S12 sn p M039032 351 snP50UX95~1 snp270_EVV779445

" snp CL6827 14 339 ,\ Adrënal Gland F>rot snpfl~838lt 181

"snp_Af075&97 _181 snp067 _EVV7781n snp_CU986741J9S snp438JU60SJ,O/l t BRIK sn? B042731>9 404 snp - FP000502 0B6 snp:AM36884S-:'1Œi snp_CU994090_266

1\\

snp EVV7 78390 285 . sn(B0426370)7 snp_C U987112_ 458 snp719_CU987495 EST34 21 snp27 (FU50SJ,O/l1 AEMF snp075_EVV778595

. snp CU995994 511 '~ snp:AJ564625_64 lIt snp029 CU984277 l, snp_D\W14015_27 .• snp].r\I35B880_SOO

, 1

~7 e ~ ~e~

snp_AM360034_ 48 snp_M1S66419_2G9 sn p AM361626 100 snpogB_ES789l:12

:s-t:.-"..; ol'«,"V

«,"V~ snp187 J U60SJI>Dl B2700 snp562JU50SJ,t.Dl AYNV

7

0.0 :::fi: sn p699 C F3692'27 1.0 sn p_'è\W7775S_467

6.7 sn p_CU99S085_518 7.5 snp CSS17405 ,591 8.6 snp - EW778456' $7 - -9.8 Sa,d Glue Colran s 2

12.3 sn p'::-CU9SŒ19_2S7 16.9 snpGU_CU994483 17.1 sn p_~6944_535

20.7 sn p AM86529S 466 23.4 sn~9_eS769fl8 24.4 sn p_AM660852_202 25.0 Sad Glue Cotrans 1 27.3 snp~4280_231 31.4 . ... snp_AM863490_83

33.2 sn p_~6753_332

1

• • 1.\

~ ;r

, 1 , , , 1 1

• • • A

47,4 48.9 ·

snp582_AJ547618 1 1 1 . 1 1 snp531_SQ426i57 snp530_SQ426757 1 : 1 D : 1

1 . ,

1

• ~ , 1

1

~~~$~.ft..r:)~~"-Y"-Y~llr:-~#' !Iv It- ~ ~ t:t/ V ' v ~~ '?

.'S:-It-~ ~~ ~ ~ ~~~~ !Iv v -:-,0) ,,;§ {)O0 tQ'tf'Ô .... ~~o{ .... ~~ It-~ ~'V ~ t:t/0 ~ ~'V .., X ~'V,." It-~

~'V ~ « ~ ~ ~ ~4è ~'V ~'1j

P ~q;; ~ ~

123

00

72 8.4 9.8

10.1 11.1 15.6 17.1 185

219

41.5 41.9

8

1'Y\. ~

~1lI èf tf

snJiJ39 _ EW779377

snp_~046_598 snp_~62502_170 snp_ CU988101)15

coO «"V "Y

1

snp282 _ AMl60809 snp_854416)12 snp455_ES789146 snp19a_~58364 snp_~54835_518 EST34_19bis

snJiJ49 JUS OSJ,AOl AR74

snp_~969_249 snp_~58800_222

0.0 2.3 4.2 5.1 5.2 6.1 8.5

13.1 13.2 13.3 16.1 16.9

22.1 29.3 29.5 30.1

32.1

32.6 32.9 333

9 ~\-~

snp033 J U989658 ~ #' snp AM861389 162 .~ ~e snp441 J U60SitIJ.Jl D70E ... ~~~ snp288 FU60 SJtlJ.Jl8J23 . "' Y X snp}M361624JOO Snp}M861624)48i' ~ snp579 JQ420980 1

snp}M861154)65 snp_~8186_636 snp_~7996J6 snp }J.1859469 J 05 snp631 JLIl85657 snp}M858494)11 snpJFœ9799J14 snp _~5035J82

HA114 1 HEST36)8 [1 Nolch 3 snp EW779545 265 snpJU682177)48 snpJOOI737SJ37 snp_EW777483_666snp_AM856693_352 snp_AM862538_267 snp695 JU60SJtlJ.Jl.A20Z snp JQ42711( 169

10 0.0 ~ snp584_BQ426822 0.7 ~ snp AJ565645 416 1.1 snp-AM855277-64 - -

124

2.3.5. Détection de gTL

les ca ractéristiques des QTLs détectés sont rés umées dans 1 e Ta blea u la et 1 es QTLs

sont localisés sur la carte génétique (Figure 34)

2.3.5.1. Indice gonadique

Pour 1 es 3 fa milles, des QTLs ont été détectés pour l'indi ce gonadique en j ui n 2011.

Un QTl a été détecté pour la famille F2 -18 s ur 1 e Gl9b (Ta blea u 9b) . Il expl ique 5,7% de 1 a

va riance observée eta été confi rmé par la présence d'un ma rqueur significatif a u test de

Kruskal-Wallis (EST_36_29_2; P = 0,005). Quatre QTLs ont également été détectés chez la

fa mi Ile F2-19 s ur les GLlc (2 QTLs), Gl4c et Gl6c (Ta bleau 9c).lls expliquent de 5,2 à 9,2% de

la va riance observée et ont tous été confi rmés pa ria présence de marqueurs significatifs au

test de Kruskal-Wallis (0,05 < P < 0,0005). Un QTla été détecté chez 1 a fa mi Ile F2-21 sur 1 e

Gl7d (Ta bl eau 9d). 11 explique 11,6% de 1 a variance observée et 1 e test de Krus ka I-Wa Il is a

mis en évidence des marqueurs significatifs (P = 0,0005).

Sur 1 e Gl2b (Ta bleau 9b), un QTla été détecté pour l'i ndi ce gonadi que en jui Il et et

octobre 2011 a insi qu'en avril etj ui n 2012.11 explique, selon les mois, de 11% en juillet 2011

à 23,2% en juin 2012 de la variance observée et a été confirmé par la présence de

ma rqueurs significatifs a utest de Kruskal-Wall is (0,005 < P < 0,0001) . Un QTl a éga 1 ement

été détecté s ur ce groupe de 1 iaison pourla composante principale de l' ACP.II explique 8,1%

de 1 a va riance et a été confi rmé pa ria présence de ma rqueurs significatifs a utest de Krus kal

Wa 1 lis (P = 0,0001) . le Gl2b aya nt été associ é aux Gl6c et Gl7d pour former 1 e Gl7a de la

carte combinée (Tableau 9a), il existe un QTl commun aux 3 familles pour l ' indice

gonadique.

Sur 1 e Gl3b (Tabl eau 9b), un QTla été détecté pour l'i ndicegonadique en août 2011.

Il expl ique 10% de 1 a variabilité observée et a été confi rmé pa ria présence de marqueurs

significatifs a utest de Kruskal-Wallis (P = 0,005). le GL3b (Ta bl eau 9b) aya nt été associ é au

Gllc pourformer le Gl2a s ur la carte combinée (Ta blea u 9a), il existe un QTl cam mu n aux

familles F2-18 et F2-19 pour l'indice gonadique.

125

Sur 1 e GL9b (Ta bl eau 9b), un QTLa été détecté pour l'i ndice gonadique en avri l, ma i,

juin etjuillet2011 ainsi qu'en avril 2012. Ilexplique,selon les mois de5,7%enjuin 2011 à

12,6% en mai 2011 de 1 a variance observée et a été confi rmé par la présence de ma rqueurs

significatifs a utest de Kruskal-Wallis (0,05 < P < 0,0001) . Un QTLa éga lement été détecté sur

ce groupe de 1 i aison pour la composante principale de l' ACP.II explique 11,2% de la vari a nce

et a été confi rmé pa ria présence de ma rqueurs significatifs a u test de Krus ka I-Wa Il is (P =

0,0001).

Pour 1 a famille F2-18, d'a utres QTLs ont été détectés pour l'i ndice gonadique ma is

uniquement à une seule date:

2.3.5.2.

sur le GL4b en mai 2011 (variance expliquée = 10,8%; P = 0,005),

sur 1 e GLlb en jui Il et 2011 (va ri a nce expl i quée = 10,9% ; P = 0,0005),

sur le GL8b en août 2011 (variance expliquée = 14,8%; P = 0,05),

sur le GL6b en octobre 2011 (variance expliquée = 10% ; P = 0,01).

Déterminisme du sexe

Pour 1 a famille F2-18, aucun QTL n'a été détecté pa ria ca rtographi e pa r i ntervall e

malgré quelques marqueurs significatifs au test de Kruskal-Wallis.

Pour 1 a famille F2-19, trois QTLs ont été détectés pour le détermi nis me du sexe. Sur

1 e GL2c (Ta bl eau 9c), un QTLexplique 4,7% de 1 a variance observée et a été confi rmé pa ria

présence de ma rqueurs significatifs au test de Kruskal-Wallis (P =0,01). Sur le GL5c (Tabl eau

9c), un QTL explique 5,6% de la variance observée et a été confirmé par la présence de

marqueurs significatifs au test de Kruskal-Wallis (P = 0,005). Sur 1 e GL6c (Tableau 9c), un QTL

explique 7,5% de la variance observée et a été confirmé par la présence de marqueurs

significatifs au test de Kruskal-Wallis (P = 0,0001).

Pour la famille F2-21, des QTLs ont été détectés sur 2 groupes de liaison pour le

détermi nisme du sexe. Un LOD supérieur a u LOD-seuil du groupe de 1 iaison est observé sur

tout le GL3d (Ta bl ea u 9d) . Une cartographie MQM (Multiple-QTL Model) a révélé l 'existence

de 2 QTLs distincts expliquant respectivement 40,5% et 9,8% de variance sur ce groupe de

liaison (Tableau 10). Sur le GL6d (Tableau 9d), un QTLexpliquant8,7%de la variance

126

observée a été confi rmé pa ria présence de ma rqueurs significatifs a u test de Kruskal-Wa Il is

(P = 0,005).

2.3.5.3. Changement de sexe

Pour la famille F2-18, deux QTLs ont été détectés pour le changement de sexe. L'un

est localisé sur le GL2b (Tableau 9b), explique 86,1% de la variance observée et a été

confirméparla présencedemarqueurs significatifs au test de Kruskal-Wallis (P = 0,005).

L'a utre est localisé s ur le GL8b (Ta bleau 9b), explique 25,8% de 1 a va riance observée et a été

confi rmé pa ria présence de marqueurs significatifs a u test de Kruska I-Wa Iii s (P = 0,005).

127

Tableau 10. Résultats des recherches de QTls impliqués dans la gamétogenèse de l'huÎtre creuse, Crassastrea gigas, sur les groupes de liaison (GL) des cartes des familles F2-18 (b), F2-19 (c) et F2-2l (d). Le LOD-seuil de chaque GL a été estimé par un test de permutations (1000 permutations, a = 0,05), 10 pOSition, le LOD maximal du QTL et la variance expliquée par Je QTL ont été estimés par cartographie par intervalle et la significativité par le test non-paramétrique de Kruskall-Wallis (K et p-Value :

*. = 0,05; ••• = D,Dl; **** =0,005 ; *"'''''''* =0,001; "'''':II'''.''' = 0,0005 ; ******* =0,0001).

LOD-Position du on Intervalle de

LOD Variance

Trait Famille GL seuil (cM) confiance (cM)

Marqueurs flanquants Marqueurs inclus maximal expliquée K p-Value du GL du Qll. (%)

snp482_CU990615,

Indice gonadique snp132_AM856794,

F2-18 9b 2,1 0,000 - 18,471 3,000 - 18,471 snp_AM864017 _329 ES136_29_2, 4,47 7,3 20,01 ."''''_ ... avril 2011

snp_AM859871_333,

M acroph age_express

Indice gonadique 4b 2,5 5,332 - 31,336 5,332 - 31,336 snp033_CU989658 - snp579_BQ426980,

3,35 10,8 7,89 ."'.'" F2-18 Notch_3 snp AM858186 636

mai 2011 •• * •••• 9b 2,3 0,000 - 18,471 0,000 - 6,000 snp482 CU990615 snp AM864017 329 7,81 12,6 28,44

Indice gonadique Voir page suivante

juin 2011

2b 2,5 0,000 - 6,765 0,000 - 4,765 snp_AM 856753_332 snp531_BQ426757,

3,85 11,0 15,82 ** •••• s np582 AJ547618

snp132_AM856794,

9 b 2,2 9,329 -18,471 9,329 -18,471 snp482_CU990615 -ES136_29_2,

3,09 8,3 9,79 •••• Indice gonadique

snp_AM859871_333,

F2-18 Macrophage express juillet 2011

s np_CU682324_234, snpyM855102_290,

lb 2,8 0,000 - 14,863 0,000 - 14,863 s np292_CU987286 s np_AM861654_152, 3,86 10,9 14,04 "'''''''''''''''' snp572_AM858709, snp_CK172327_436

128

LOD- LOD Variance Trait Famille GL seuil

Position du Qn Intervalle de Marqueurs flanquants Marqueurs inclus maximal expliquée K p-Value

du GL (eM) confiance (cM)

du QTt (%)

EST36_29_2,

F2-18 9b 2,1 13,716 - 18,471 13,716 - 18,471 snp132_AM856794 - s np_AM859871_333, 2,27 5,7 9,24 •• *"' Macrophage expres s

snp_AM857211_491,

snp380_AM858009,

26,435 - 58,401 31,405 - 57,246 snp_CU683658_368 - 5 np 15 1_FU60SJAO lAO N 8,

4,23 9,1 13,59 *.*."'* le 2,5 snp_AM856186_569 snp605_AM854527,

snp054JU60SJA01Bll1, snp445JU60SJA01BQ1K

F2-19 Indice gonadique

juin 2011 63,974 - 69,328 63,974 - 69,328 snp_AB1220641511- snp427 CU995796 2,67 5,2 9,42 * •• *

4e 2,6 20,753 - 21,753 20,753 - 21,753 snp_CU995994_511 -

- 2,92 7,9 7,47 •• snp719 CU987495

snp_AM860852_202,

6e 2,4 0,000 - 12,480 0,000 - 12,480 snp629_ES789178 snp_AM856944_535,

2,74 6,1 10,64 _.** snp614_CU994483,

Sod_Gluc_Cotrans_l

snp_CU990619_287,

snp_BQ426928_40 -snp_CB617405_591,

F2-21 7d 2,5 0,000 - 10,757 0,000 -10,757 snp_CU995085_518, 3,21 11,6 8,76 *.** snp699_CF369227

snp_EW778458_567, Sod_Gluc_Cotrans_2

3b 2,5 0,000 - 7,444 0,000 - 6,444 snp380_AM858009 snp_DV736300_603,

3,69 10,0 13,50 **** snp194_AM85782B

Indice gonadique snp_AM859907 _237,

F2-18 snp_AM864952_331, août 2011 8b 2,2 1,364 -19,002 1,364 -19,002 Drac3- snp328_CX069134, 2,82 14,8 4,359 ••

s np348JU 60SJAO 1 C8AU, snp_EU678313_ 434

'- -

129

LOD- LOD Variance 1

seuil Position du Qn Intervalle de

Marqueurs flanquants Trait Famille GL (cM) confiance (cM)

Marqueurs inclus maximal expliquée K p-Value du GL du QTl (%)

Indice gonadique 2b 2,6 0,000 - 14,765 0,000 - 12,765 snp_AM856753_332 snp531_BQ426757,

4,09 12,5 19,17 ••••••• F2-18 snp582 Al547618

octobre 2011 6b 2,3 39,694 - 41,932 39,694 - 41,932 snp AM866046 598- snp039 fW779377 2,40 10,0 6,71 •••

2b 2,7 0,000 - 13,765 1,000 - 12,765 snp531_BQ426757-

snp582_AJ547618 3,80 15,4 14,28 •••• * Indice gonadique snp AM856753 332

avril 2012 F2-18

9b 2,3 17,061-18,471 17,061 - 18,471 E5T36_29_2 snp_AM859871_333,

2,41 7,9 7,25 •• M acrop hage_express

Indice gonadique F2-18 2b 2,5 5,765 - 18,903 5,765 - 18,903

snp582_Al547618 -snp_AM856753_332 3,02 23,2 10,82 ••••

juin 2012 s np CU990619 287

2b 2,5 0,000 -13,765 0,000 - 8,765 snp_AM856753_332 snp531_BQ426757,

4,72 8,1 20,85 .*** •• * snp582 Al547618

ACP F2-18 snp132_AM856794,

9b 2,2 0,000 - 18,471 9,329 - 18,471 snp482_CU990615-E5T36_29_2,

6,97 11,2 27,7 1 ••••••• snp_AM859871333, Macrophage_express

130

LOD- LOD Variance

seuil Position du Qn Intervalle de

Marqueurs flanquants Trait Famille GL (cM) confiance (cM)

Marqueurs inclus maximal expliquée K p-Value du GL du Qll. (%)

Changement de F2-18

2b 11,7 56,272 - 62,056 57,272 - 62,056 Sod Glu e Cotrans 1 snp fW777756 467 13,12 75,2 10,79 **** sexe 8b 2,1 0,000 - 19,002 0,000 -15,364 snp AM859907 237 snp AM857913 323,Orac3 4,53 24,8 12,60 ****

2e 2,4 29,992 - 31,829 29,992 - 31,829 s np_C U990225_417 -

snp AM853687 32 snp_AM854612_119 2,45 4,7 10,50 •••

5e 2,3 28,201- 39,667 28,201 - 39,667 snpJP089799_114 -

Noteh3, HEST 36-28 3,03 5,6 11,93 **** snp AM856693 352

snp_AM860852_202, snp_AM856944_535,

F2-19 snp614_CU994483,

Sod_Gluc_Cotrans_l, 6e 2,3 0,000 - 33,092 0,000 - 33,092 - snp629_ES789178, 3,49 7,5 15,73 *******

snp_AM856753_33 2,

snp582_Al547618, snp531_BQ426757, snp530 BQ426757

snp_AM853792_146,

snp_AM854177 _2 47 ,

5exe EST104_43,

3d 2,5 0,000 - 61,838 16,000 - 24,000 - snp_CF369132_326, 92,77 97,8 10,56 ••• snp_CU684465_50,

snp_Al565506_195,50D, Flavin_monoxv_2

3dMQM 2,5 8,000 - 33,000 19,000 - 23,000 snp_AM853792_146 -

- 71,82 40,5 10,56 ••• snp_AM854177_247

F2-2 1 snp_CF369132_326 -

3dMQM 2,5 54,888 - 57,928 54,888 - 56,928 snp_CU684465_50 4,01 9,8 35,07 ***** •• snp_A1565506 195

snp_CU986741_195, snpJPOO0502_586,

snp_BQ427368_404 -snp503_EX956381,

6d 2,5 31,565 -34,070 31,565 -34,070 s np270_fW779445, 3,05 8 10,10 •••• snp_CU682714_339

snp583_DW713882, snp_AM869032_351,

snp438JU60SJA01BRIK

131

2.4. Discussion

Cette étude a permis de génotyperun grand nombre de nouveaux ma rqueurs SNPs.

Le remplacement des SNPs dont le génotypage n'avait pas été satisfaisant lors de notre

première expérience (Article 1) par de nouveaux SNPs a permis d'améliorer le succès de

génotypage moyen à 75,2% (70,3% dans l'Article 1). Cependant, malgré les 384 SNPs

génotypés, peu d'entre eux ont pu être cartographiés. En effet, beaucoup de marqueurs

éta i ent monomorphes a u sein des 3 fa mill es étudi ées et 1 e ta ux de convers ion moyen des

ma rqueurs nes'est élevé qu'à 28,3%. Néa nmoins, sachant que les ma rqueurs n'ont pas été

choisis pour leur polymorphisme connu chez les parents de nos familles, ce taux de

conversion ests upérieur a ux 12,5 à 19,5% estimés chez des famill es F2 de pi n ma riti me or

(Chancerel etaI., 2011) ou aux 12,3 à 18,4% estimés chez le pin à sucre (Jermstad et al.,

2011). Choisir uniquement des marqueurs polymorphes chez les parents a permis

d'attei ndre un taux de conversion de 86% chez la courge, Cucurbita pepo (Esteras et al.,

2012). D'a utres ma rqueurs s'écartaient fortement des lois mendél iennes. Cette importa nte

distorsiondeségrégation est bien connue chez Crassostrea gigas (Launey et Hedgecock,

2001) et peut être expl i quée pa r les fortes mortalités qui peuvent entraîner 1 a perte de 98%

des individus au stade larvaire (Plough et Hedgecock, 2011) . Les pratiques d'écloserie,

notammentletamisagesélectifquiviseà éliminer les larves dont la croissance est moins

rapi de, est également une explication possible de 1 a faible diversité génétique rencontrée au

sei n de nos familles (Ta ris, 2005). Néa nmoi ns, la densité de la ca rte génétique de l'huître

creuse a pu être a mél iorée : a u cours de cette étude, nous avons éta bli une ca rte génétique

composée de 189 marqueurs SNPs ta ndis que Sa uvage et al. (2010) avaient publi é une ca rte

génétique composée de 80 marqueurs dont 51 ma rqueurs microsatell ites et 21 marqueurs

SNPs. Grâce à ce nombre de ma rqueurs, 1 a carte génétique couvre désorma is 88,63% de 1 a

longueur théorique du génome contre 76,43% précédemment. Elle est composée de 10

groupes de 1 iaison, ce qui est en accord avec le nombre de chromosomes ha pl oïdes (n=10).

PI us récemment, une carte généti que a été éta bl i e à parti r de 426 marqueurs dont 64 g

SSRs, 42 EST-SSRs et 320 AFLPs (Guo et a 1.,2012). L'utilisation des techniques de la Nouvelle

Générati on de Séq uençage permettra prochainement d'a méliorer davantage 1 a densité de 1 a

ca rte génétique présentée par l'ajout de ma rqueurs detype RAD (Restriction site Associated

132

DNA). Le séquençage récent du génome complet de l'huître creuse (Zhang et al., 2012)

permettra d'a ccroÎtre encore le nombre de marqueurs disponibles et de combi ner des cartes

physiques aux cartes génétiques.

Au cours de cette étude, des QTLs ont été mis en évidence pour l'ensemble des traits

étudi és. Pour l'indice gonadique en juin 2011 et pour le sexe, des QTLS communs à plusieurs

fami Iles ont été détectés . Des QTLs ont égalementété détectés pour 1 es indices gonadi ques

de pl usieurs mois. Cela peut s'expliquer par la corrélation existant entre l'indice gonadique à

un instanttetl'indicegonadiqueà l'instantt-1. Pourlesautrestraits, les QTLs n'ont pu être

détectés que pour unefamille etseraient donc à confirmer avec du matériel biologique

différent. Parmi les 35 SNPs détectés invitrodans des gènes exprimés dans la gonade, 10

ont été associés significativement à la variation des traits étudiés (Figure 34). Il serait

intéressant d'étudier pl us fi nement 1 es régions où ces ma rqueurs sont loca 1 isés.

L'une des familles étudiées par Sauvage et al., 2010 ayant été génotypées pour

certai ns des marqueurs SNPs utilisés dans cette étude, nous avons pu comparer les groupes

deliaisondeleurcarteaveclanôtre(Tableau9a).llestalors apparu queles QTLs détectés

pour l'effort reproducteurau cours de notre étude setrouvaientsur 1 es groupes de li aison

homologues à ceux surlesquelsSauvage et al. (2010) avaient détecté des QTLs impliqués

dans la survie aux mortalités estivales. La corrélation phénotypique entre effort

reproducteur et réponse aux mortalités estivales (Samain et a 1.,2007; Huvet et a 1., 2010) se

retrouve donc au niveau génétique. Cependant, il n'est pas à ce jour pas possible de

conclure à une association génétique réelle et il serait intéressant de comparer la

loca lisation des QTLs détectés au cours de cette étude à 1 a localisation des gènes ca ndidats

différentiellement exprimés dans la gonade des individus dits « résistants» et des i ndivi dus

dits « sensibles» (Fleury et al., 2010).

Enfi n, une expl orationfonctionnelle des gènes candi dats permettra it de démontrer

l'implication decesgènes dans le processus de la gamétogenèse. L'une des méthodes les

pl us efficaces est la créati on de 1 ignées d'i ndividus pour lesquell es le gène d'i ntérêt est

inhibé. L'absence de lignées mutantes pour l'huître creuse ne permettant pas ce type

133

d'étude, la technique d'interférence pa r ARN est une alternative puissa nte (Fa bi oux et al.,

2009).

2.5. Remerciements

Ce trava il a été soutenu pa r Ifremer et fi nancé pa rtiell ement par l'Agence Nati onal de 1 a

Recherche« Génomique animale» Programme (GAMETOGENEs project - ANR-08-GENM-

041). Les auteurs remercient l'ensemble des membres de l'écloserie Ifremer de La

Tremblade et de 1 a nurserie de Bouin pourla production et l'élevage des huîtres, Christophe

Klopp etCédric Cabau pour les données d'assemblage d'ESTs ainsi qu'Armel Davenel et

Stéphane Quellec pour l'exploitation des données IRM.

2.6. Références

Bai,J., Li, Q., Kong, L.F., Li, R.H., 2009. Characterization of 20 single nucleotide polymorphism ma rkers in the Pacifie oyster (Crassostreo gigos). Ami mal Geneti cs, 40, 1001-1005.

BodoyA,Garnier,J.,Razet,D.,Geairon,P.,1990. Mass mortalities ofoysters (Crassostreo gigos) duringspring 1988 i n the bay of Marennes-Ol éron, related to envi ron menta 1

conditions. Conseil International pour l'Exploration de la mer.

Cha ncerel, E., Lepoittevin, C., Le Provost, G. et al., 2011. Devel opment and i mplementati on of a higly-multiplexed SNP array for genetic mapping in maritime pine and comparative mapping with loblolly pine. BMC Genomics, 12, 368.

Enriquez-Diaz, M., 2004. Variabilité et bioénergétique de la reproduction chez l'huître creuse Crassostreo gigos. Océa nol ogie Biol ogi que. Brest, Univers ité de Bretagne Occidentale. PhD. 216p.

Esteras, c., Gomez, P., Monforte, A.J. et al. ,2012. High-throughput SNP genotyping in Cucurbito pepo for map construction and quantitative trait loci mapping. BMC Genomics, 13,80.

Dégremont, L., Ernande, B., Bédier, E., Boudry, P., 2007. Summer mortality of hatcheryproduced Pacificoyster spat (Crassostreo gigos).I. Estimation of genetic pa ra meters for survival and growth. Aquaculture, 262, 41-53.

Dégremont, L., Bédi er, E., Boudry, P., 2009. Summer mortality of hatchery-produced Pacifi c oyster spat (Crassostreo gigos).11. Responseto sel ection forsurvival and its infl uence on growth and yield. Aquaculture, 299 (1-4), 21-29.

134

Fabioux, c., Huvet, A, Le Souchu, P., Le Pennec, M., Pouvreau, S., 2005. Temperature and photoperiod drive Crassostrea gigas reproductive internai cl ock. Aquaculture, 250, 458-470.

Fabioux, c., Corporeau, c., Qui IIien, V., Favrel, P., Huvet, A., 2009. 1 n vivo RNA i nterference in oyster: vasa silencing i nhibits germ cell development. FEBS Journal, 276,2566-2573.

Fa n, J.B., 01 i phant, A, Shen, R. et al., 2003. Highly pa ra IIel genotypi ng. Col d Spring Ha rbor symposia on Quantitative Biology, 68, 69-78.

FAO, 2013. Aquaculture production: quantities and values 1950-2011. Published

electronically on the internet, available directly from http://www.fao.org/fishery/statisti cs/ globa I-a quaculture-producti on/en

Flahauw, E., Quellec, S., Davenel, A, Dégremont, L., La pègue, S., Hatt, P.-J., 2012. Gonad volume assessment in the oyster Crassostrea gigas: Comparison between a histological method a nd a magneti c resonance i maging (MRI) method. Aquaculture. 370-371,84-89.

Fleury, E., Moal,J., Boulo, V., Daniel,J.-Y., Mazurais, D., Hénaut, A, Corporeau, c., Boudry, P., Favrel, P., Huvet, A (2010). Mi croarray-based i dentificati on of gonad tra nscri pts differentially expressed between lines of Pacific Oyster selected to be resistant or 5 uscepti ble to 5 ummer morta 1 ity. Ma r . Bi otechnol., 12,326-339.

Fox, J., 2005. The R Commander: A Bas icStatistics Graphical User 1 nterfa ce to R. Journal of Statistical Software, 14(9): 1-42.

Guo, X., Hedgecock, D., Hershberger, W.K., Cooper, K., Allen, S.K., 1998. Genetic determi nants of protandricsex i n the Pacific oyster, Crassostreagigas. Evol ution. 52 (2), 394-402.

Guo, X., Li, Q., Wa ng, Q.Z., Kong, L.F., 2012. Genetic Mapping and QTL Analysis of GrowthRelated Traits in the Pacific Oyster. Marine Biotechnology, 14,218-226.

Haley, L.E., 1977. Sex determination in the American oyster. J. Hered., 68, 114-116.

Hedri ck, P .W., Hedgecock, D., 2010. Sex determi nation: geneti c models foroysters. J. Hered. 101 (5),602-611.

Heffernan, P.B., Walker, R.L., 1989. Quantitative image analysis methods for use in histologicalstudies of bivalve reproduction. Journal of Molluscan Studies 55, 135-137.

Husson, F.,Josse,J., Lê, S., 2008 . FactoMineR:An R Packagefor MultivariateAnalysis.Journal of Statistical Software, 25(1), 1-18.

135

Huvet, A., Normand, J., FI eury, E., Qui Il ien, V., Fa bi oux, c., Boudry, P., 2010. Reproductive effort of Pacifie oysters: a tra it associated with suscepti bi 1 ity to s ummer morta 1 ity . Aquaculture, 304, 95-99 .

Jermsta d, K.D., Eckert, AJ ., Wegrzyn, J.L. et al., 2011. Comparative ma ppi ng in pi nus: s ugar pi ne (Pin us lambertiana Dougl.) and 1 oblolly pine (Pinus taeda L.). Tree Genetics and Genomes, 7, 457-468.

Koganezawa, A, 1974. Presentstatus of studies on the mass mortality of cultured oysters in Japan and its prevention. Third United States - Japan Meeting on Aquaculture Journal,29-34.

la uney, S., Hedgecock, D., 2001. High genetic 1 oad in the Pacifie oyster Crassostrea gigas. Genetics, 159,255-265.

Ma urer, D., Comps, M., His, E., 1986. Caractéristiques des mortal ités estiva les de l' huître Crassostrea gigas dans le bassin d'Arcachon. Haliotis , 15, 309-317.

Ma rtoj a, R., Martoja-Pierson, M., 1967. Initiation aux techniques de l'histologie animale. Masson et Cie, Paris.

Normand, J., Erna nde, B., Haure,J., McCombie, H., Boudry, P., 2009. Reproductive effort a nd growth in Crassostrea gigas: comparison of young diploid a ndtriploid oysters i ss ued from natural crosses or chemical induction. Aquatic Biol. 7, 229-241 .

Pernet, F., Barret, J., Marty, c., Moal, J., le Gall, P., Boudry, P., 2010. Environmental a noma lies, energetic reserves andfatty acid modifications in oysters coincidewith a n exceptional mortality event. Mar. Ecol. Prog. Ser., 401, 129-146 .

Plough, l.V., Hedgecock, D., 2011. Quantitative Trait locus Analysis of Stage-Specifie 1 nbreed ing Depression in the Pacific Oyster Crassostrea gigas. Geneti cs, 189, 1473-1486.

R Devel opment Core Tea m, 2005. R:A 1 anguage a nd environmentforstatistical computing. R Foundationfor Statistical Computing, Vienna, Austria . ISBN 3-900051-07-0, URL: http://www.R-project.org.

Samain,J.-F., Dégremont, L. , Soletchnik, P., Haure,J., Bédier, E., Ropert, M., Moal , J., Huvet, A., Bacca, H., VanWormhoudt,A, Dela porte, M., Costil, K., Pouvreau, S., lambert, C., Boulo, V., Soudant, P., Nicolas, J.L., le Roux, F., Renault, T., Gagnai re, B., Géret, F., Boutet, 1., Burgeot, T., Boudry, P., 2007 . Genetically based resistance to summer mortality in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and its relationship with physi ological, i mmunological characteristics a nd infection process . Aquacultu re. 268, 227-243 .

136

Sa ma i n, J.F., McCombie, H., 2008. Summer mortality of Pacific oysters Crassostreagigas. The MOREST Project, Quae Editions, Versailles, 379p.

Sa uvage, c., Boudry, P., de Koni ng, D.L, Ha ley, C.S., Heurtebise, S. and LapègueS., 2010. QTL for res istanceto s ummer mortality and OsHV-11 oad in the Pa cific oyster (Crassostrea gigas). Animal Genetics, 41, 390-399.

Shaw, B.L., Baui e, H.I ., 1957. The gross a nd microscopic anatomyofthe digestive tract of the oyster Crassostrea virginica (Gmelin). Canadian Journal ofZoology 35,325-347.

Soletchnik, P., Le Moi ne, O., Fa ury, N., Razet, D., Gea i ron, P., Goulletquer, P., 1999. Mortalité de l'huître Crassostrea gigas dans le bassin de Marennes-Oléron . Etude de la variabilité spatiale, de son environnement et de sa biologie par un système d'information géographique (SIG). Aquatic Living Resources, 12, 131-43.

Steel e, S., Mul ca hy, M.F., 1999. Ga metogenesis of the oyster Crassostrea gigas in southern Ireland.Journal ofMarineBiological Association of United Kingdom, 79, 673 -686.

Ta ris, N., 2005. Conséquences génétiques de la production intensive de la rves d'huîtres en écl oserie: Etude des processus de dérive et de sél ection 1 iés aux pratiques d'él evage. Thèse de doctorat, Université de La Rochelle, 205 pp.

Va n Ooijen, J.W., 2006 . JoinMap®4: Software for the Ca Iculation of Geneti c Li nkage Maps in Experimental Populations. Kyazma BV, Wageningen, Netherlands.

Va n Ooijen, J.w., 2004. MapQTL ®5: Softwarefor the Ma ppi ng of Qua ntitative Tra it Loci in Experimental Populations of Diploid Species. Kyazma B.V., Wageningen .

Zha ng, G., Fang, X., Guo, X., Li, L., Luo, R., Xu, F., Ya ng, P., Zha ng, L., Wa ng, X., Qi, H., Xi ong, Z., Que, H., Xi e, Y., Holi and, P. W. H., Pa ps, J., Zhu, Y., Wu, F., Chen, Y., Wa ng, J., Peng, c., Meng, J., Yang, L., Liu, J., Wen, B., Zhang, N., Huang, Z., Zhu, Q., Feng, Y., Mount, A., Hedgecock, D., Xu, Z., Liu, Y., Domazet-Los, T., Du, Y., Sun, X., Zhang, S., Liu, B., Cheng, P., Jiang, X., Li, J., Fan, D., Wang, W., Fu, W., Wang, T., Wang, B., Zhang, J., Peng, Z., Li, Y., Li, N., Wang, J., Chen, M., He, Y., Tan, F., Song, X., Zheng, Q., Huang, R.,Ya ng, H., Du, X., Chen, L., Yang, M., Gaffney, P. M., Wa ng, S., Luo, L., She, Z., Mi ng, Y., Hua ng, W., Zhang, S., Hua ng, B., Zha ng, Y, Qu, T., Ni, P., Miao, G., Wa ng, J., Wa ng, Q., Steinberg, C. E. W., Wang, H., Li, N., Qian, L., Zhang, G., Li, Y., Yang, H., Liu, X., Wa ng, J., Yi n, Y., Wa ng, J., 2012. The oyster genome revea Is stress ada ptati on and complexity of shell formation. Nature, 490 (7418), 49-54.

137

PARTIE IV: CONTRIBUTIONS DE CEnE ETUDE A LA CARACTERISATION

GENETIQUE DE LA REPONSE AUX MORTALITES ESTIVALES

1. Préambule

Cette pa rtie est rédigée en Français mais sous la forme d'un a rticle. Elle sera intégrée

à un a rticle concernant 1 a caractérisation généti que de la réponse a ux mortalités estivales via

une méthode récente de cartographie fine par RAD (Restriction site Associated DNA)

sequencing qui a été uti 1 isée pourles familles F2-19 et F2-21. En conséquence, chaque pa rtie

sera complétée ultérieurement. Cetravail contribuera en pa rticulier à fa i re 1 el i en entre 1 es

différentes cartes génétiques avec une confiance importante ca rde nombreux i ndivi dus ont

été génotypés danslecadredecetravail, contrairement au génotypage avec la technique

RAD sequenci ng qui a du être restrei nt à un nombre moi ns importa nt d' i ndivi dus.

2. Article 5 : Détection de QTL de réponse aux mortalités estivales chez l'huître creuse, Crassostrea gigas.

P.-A. Gagnaire, E. Flahauw, L. Dégremont, S. Heurtebise, F. Cornette, B. Pontreau, C.

DonnadieuF. Martins, N. Bierne, S. Lapègue

Cette étude étant un travail d'équipe, il est important de préciser les tâches que j'ai effectuées, seule ou accompagnée par les coauteurs:

• La production, l'élevage, le conditionnement des hUÎtres, • Le suivi de mortalité, • La détection des marqueurs SNPs in silico, • Les prélèvements et pesées de tissus en vue de l'extraction d'ADN, • L'extraction et la préparation de l'ADN en vue du génotypage, • Le génotypage des marqueurs microsatel/ites en multiplexe, • L'analyse des données de génotypage, • La cartographie génétique, • La détection de QTLs.

2.1. Introduction

L'huître creuse, Crassostrea gigas, est une espèce d'i ntérêt économi que a u niveau

mondi al. En 2011, 4,4 millions detonnes ont été produites (FAO, 2013). Cependa nt, sur 1 es

côtes fra nçaises, 1 es juvéniles d'huîtres creuses subissent d'i mportantes mortalités estiva les

139

depuis 2008 (Pernet eta 1.,2010) et 1 es conséquences sur la production nationale sont d'ores

et déj à perceptibles :j usqu'en 2009, la France produisait envi ron 130 000 tonnes d'huîtres

pa r a n ta ndis qu'en 2010et 2011, la production n'a pas dépassé 1 es 80 000 tonnes (Comité

Nati onal de la Conchyliculture, http://www.cnc-france.com). Le phénomène des morta 1 ités

estiva les d'huîtres creuses est connu depuis 1945 sur les côtes ja pona ises (Koganezawa,

1974), depuis 1980s ur 1 es côtes françaises (Maurer et al. 1986; Bodoyet al.1990; Sol etchnik

et a 1.1999) et a été pa rticulièrement étud ié durant 1 e projet MOREST (Sa main et McCombi e,

2008). Une forte héritabilité de 1 a réponse a ux mortalités estivales a notamment été mise en

évi dence (Dégremont et a 1.,2007) et a servi de ba se à la s élection de lignées « rés i sta ntes »

(R) etde lignées « sensibles» (S) aux mortalités estivales (Dégremontetal, 2009) .

La caractérisation génétique detra its complexes tels que 1 a résista nce a ux ma ladi es

représente un intérêt pour le domaine de la recherche mais également pour la filière

aquacole. La détection deQTLs peutservirdebaseà la sélection d'allèles de résistance aux

mala dies (Eisen, 2011). Cette a pproche est util isée pour détecter des régi ons du génome

impliquées dans la résistance aux maladies qui perturbent la production aquacole de

nombreuses espèces a quacoles telles que 1 a Truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss (Verrier

et al., 2013), le Saumon Atlantique, Sa l mo salar (Moen etai, 2009) ou l'huître creuse

Crassostreavirginica (Yu etGuo, 2006) . Des QTLs impliqués dans la réponse aux mortalités

estivales et 1 a charge virale en Ostreid Herpes Vi rus 1 (OsHV-l), un pathogène associé aux

morta lités estivales d'huîtres creuses (Dégremont, 2011; Garcia et a 1.,2011), ont égal ement

été détectées pa r Sa uvage et al. (2010).

L'objectifdecetteétudeétaitdevérifiersi les régions détectées par Sauvage et al.

(2010) étaientéga lement détectées sur un matériel biologique différent et da ns 1 e contexte

des mortalités massives subies parCrassostrea gigas depuis 2008. Pour cela, nous avons

a ugmenté la densité de la carte génétique via l'utilisation de nouveaux marqueurs SNPs afi n

de détecter plus finementdes QTLs impliqués dans la réponseauxmortalités estivales et la

charge virale en OsHV-l.

140

2.2. Matériel et Méthodes 2.2.1. Matériel biologique

Les huîtres utilisées pour le suivi de la mortalité appartiennent à 21 fami Iles bi

pa rentales de type F2, pa rmi 1 esquelles trois fa mill es, nommées F2 -18, F2-19 et F2-21, ont

été choisies pour détecter les QTLs . Pour produire ces familles, des individus aux

performa nces contrastées en termes des urvie a ux mortalités estivales issus de la sél ecti on

menée au cours du programme MOREST (Dégremont et al, 2009) ont été utilisés comme

génération FO. Unefemelle FO « sensible » a été croisée avec un mâl e FO « résistant » pour

produire unefa mille F1 au sein de 1 a quelle 2 mâ les et 2 femelle ont été choisis pour obteni r

les familles F2-18 et F2-19. De 1 a même façon, une femelle FO « rés ista nte » a été croisée

avec un mâle FO « sensible» pour produire une fa mi Il e F1 a u sei n de 1 aquell e 1 mâ 1 e et 1

femelle ont été choisis pour obtenir la famille F2-21 (Figure 39) .

Pour cha que croisement et afi n de contrôl er 1 es fécondati ons, 1 es ga mètes ont été

récupérés par scarification des gonades. L'élevage larvaire et le micro-nursage ont été

effectués à l'écloserie Ifremer de La Tremblade (Charente ma ritime, France). Puis, 1 es huîtres

ont été transférées à la nurserie Ifremer de Bouin (Vendée, Fra nce) pour le nursagej usqu'au

28 juillet 2010. Pourchacune des 2lfa milles F2, 450 huîtres ont été répa rties en 3 poches de

150 et pl acées s ur des ta bles ostréicoles s ur l'estran à Agnas (Bassi n de Marennes -01 éron,

Cha rente maritime, France) le 29 juillet 2010 . Parallèlement, pour 12 fami Iles chois i es sur

1 eurs performances aux tests de survie menés préalablement (voir Parti el), 1000 i ndivi dus

ont été répartis en 2 poches de 500 et placés dans un bassin de la station Ifremer de La

Tremblade (Charente ma ritime, France) afin d'y avoir accès quotidiennement. Ce bassin était

al i menté en ea u de mer brute (non tra itée, non chauffée, sa ns ajout de phytopla ncton) afi n

de s'approcher au plus près des conditions extér ieures.

2.2.2. Suivi de la mortalité au cours d'un épisode de mortalité estivale 2.2.2.1. Suivi ponctuel en mil ieu naturel

Le 26 août, les poches placées sur estran ont été ramenées à la station de La

Trembladepourprocéderau comptage des individus morts et survivants à l'épisode de

mortalité.

141

2.2.2.2. Suivi quotidien en bassin expérimental

Chaque jour, les poches placées dans le bassi n expéri mental ont fait l'objet d'une

observation mi nutieuse permetta nt de détecter 1 es individus morts ou mori bonds. En effet,

la suite du travail s'effectuant sur i ' ADN, i l était impératif que les tissus ne soient pas trop

dégradés. Les huîtres mortes ou moribondes ont donc été stockées à -20'C jusqu'à

l'extraction d'ADN. Le 23 août 2010, l'épisode de morta 1 ité sembla nt termi né, nous avons

procédéau comptage des individus ayantsurvécu; lorsque c'était possible, 200 d'entre eux

ont également été stockés à -20'C en attendant l'extraction d'ADN à l'aide du kit

d'extracti on QiaAMP DNA Mi ni Kit de Qi agen (voi r protocol e détai Il é en annexe 1).

2.2.3. Mesure de la charge virale par PCR quantitative

La détection et 1 a quantification du vi rus OsHV-l a été réal isée par la méthode de PŒ

en temps réel développée par Pépin etaI. (2008). En rés umé, S~Ld' ADN di lué à 5 ng/~L pour

les individus morts etO,S ng/~Lpour les individus survivants ont été ajoutés au mélange

réactionnel composé de 10~Lde Mastermix 2X du kit Brillant III Ultra fast avec SYBR Green,

2~L de chaque amorce C9 et Cl0 (Rena ult et al., 2012) di 1 uées à 2m M et 1 ~L d'ea u bi

distillée. Une ga mme de 10 à 100000copies d'OsHV-l a été déposée sur chaque plaque pour

quantifier le nombre de copies d'ADN vi rai présent dans chaque échanti lion. Pour chaque

individu,2 réplicats ont été quantifiés. La PCR a consisté en un cycle de dénaturation à 9S'C,

pendant3 minutes puis quarante cycles d'hybridation/élongation alternant une phase à

9S'C pendantS secondes et une phase à 60'C pendant 20 secondes et, pour termi ner, un

cycle composé d'une phase d'l minute à 9S'C, une phase de 30 secondes à 60'C et une

phase de 30 secondes à 95'C,

2.2.4. Marqueurs moléculaires et génotypage sélectif

Les gra nds-parents FO, 1 es parents Fl a insi que 900 descendants F2 ont été génotypés

pour les 384 marqueurs SNPs développés chez Crassostrea gigas (Article 1). Ces 900

descendants ont fa it l'objet d'une stratégie de génotypage sél ectif : pour chacune des 3

familles F2, 300 individus ont été génotypés dont 150 morts au co urs de l'épisode de

morta 1 ité estivale et 150 survivants à 1 a fin de cet épisode. Parmi 1 es 384 marqueurs, 72 sont

142

des SNPs détectés invitro dans des gènes exprimés dans la gonade par le La boratoire de

Généti que et Pathologie de La Trembl ade; 5 ont été détectés pa r assembl age d'EST fournis

par GenBank (Bai et al., 2009 ); 307 SNPs ont été détectés in silico à partir du 6 ème

assemb la ge de la base de données d'EST de Crassostrea gigas (http://public

conti gbrowser.sigenae.org:9090j Crassotrea.Jligasjindex.html). Ils ont été génotypés à l'aide

de la technique GoldenGate d'Illumina s ur la plateforme de génotypage de Bordea ux. Les

données de génotypage ont été analysées via le module Génotypage du logiciel

GenomeStudio développé par Illumina.

Afi n d'a ugmenter la densité de la carte génétique et de pouvoi r la comparer avec les

ca rtes généti ques précédemment publiées par Hubert et Hedgecock(2004) etSa uvage et al.

(2010), les individus ontégalementétégénotypés pour42 marqueurs microsatellites dont

27 ont été génotypés en simplexe (Li et al., 2003; Yamti ch et a 1.,2005; Sauvage et al. 2010,

Pa rti el Ta blea u 5) et15 en multi plexes de 3 ma rqueurs (Li et al., 2010 ; Taris et al., 2005,

Partie 1 Tableau 4) .


Les génotypes ont été a na lysés à l'aide de la fonction de ca rtogra phie de régressi on

du logiciel Joi nMap4.0 (Van Goijen, 2006). Le type de popul ation utilisé est letype CP (Cross

Pollination). Un test X2 effectué par JoinMap a permis d'écarter les loci déviant

significativement des lois mendéliennes (us 0,0001). Le LGD d'i ndépendance mi nimum a été

fixé à 3.0 et 1 es autres paramètres ont été 1 aissés a ux val eurs par défaut proposées par le

logiciel. La longueurdes cartes a étécalculéeselon la fonction decartographie de Haldane.

2.2.6. Détection de aTL

La normalité des traits étudi és a été vérifiée statistiquement pa r un test de normalité

de Shapiro-Wilk grâce a u package RCommander (Fox, 2005) développé pour le programme R

(R DevelopmentCoreTeam, 2005). Lelogiciel MapQTL 5.0 (Van Goijen, 2004) a été utilisé

pour détecter des régions du génome impliquées da ns 1 a réponse a ux mortalités estivales via

letestnon-paramétriquede Kruskall-Wallis et la cartographie par intervalles. La part de

varianceexpliquéeparchaqueQTLest calculée automatiquement par le logiciel selon la

143

formul e suivante: 100 * (HO_var-va r) / va riance de 1 a population où HO va r est la vari ance

résiduelle.

2.3. Résultats 2.3.1. Suivi de la mortalité 2.3.1.1. En bass in expérimental

Les mortal ités ont commencé 1 e 3 août 2010, soit 5 j ours après 1 a mise en bassi n

expéri mental. Le nombre d'i ndividus morts a augmenté 1 entement penda nt 1 es 3 jours qui

ontsuivi. Puis, le 8 août, la plupart des 12 familles ont co nnu un pic de mortalité (Figure 35).

Au 23 août 2010, le comptage des individus survivants s'est ajouté a u comptage quotidien

des individus morts ou moribonds afin de détermi nerl eta ux de mortalité de chaque fa mi Ile

F2. Cel ui-ci s'est avéré très variable d'unefamille F2 à l 'autre. En effet, cel ui-ci éta it compris

entre 26% pour 1 a famille 15 et 95% pour 1 a famille 20 (Figure 36) . Pour 1 a suite des ana lyses

génétiques (génotypage des marqueurs molécula i res et recherche de QTLs), seules les

familles F2-18, F2-19 et F2-21 ont été retenues en raison de leurs taux de mortalités

différents (respectivement 76%, 30% et 58%).

700

600 t! 0 500 E VI ::s 400 'C :~ 300 'C .5 'C 200 QI ...

.Q 100 E 0

0 Z

Figure 35. Cinétique de mortalité du naissain de 12 familles F2 au cours d'un épisode de mortalité estivale en aaût 2010. Les familles F2 étudiées apparaissent en rouge (F2-18), vert (F2-19) et orange (F2-21). La

ligne verticale indique le pic de mortalité du 8 août 2010.

144

100

90

80

~

70 e 'QI .'!: 60 ra .... ... 0 sa E QI 40 'tl >< ::s t!!! 30

20

10

a 20 22 12 9 18 23 7 28 21 14 19 15

Famille F2

Figure 36. Taux de mortalité de 12 familles F2 au cours d'un épisode de mortalité estivale survenu en août 2010 dans un bassin expérimental. Les familles F2 étudiées apparaissent en rouge (F2 -18), vert (F2-19) et

orange (F2-21).

2.3.12. Sur estran

Pour des raisons pratiques, la date précise du début des mortalités n'est pas connue.

Cependa nt, quelques individus morts ont été observés le 9 a oût, laissant supposer un début

d'épisode de mortalité décalé par rapport à celui connu par les individus en bassin

expér i mental.Au 26 août2010, un comptage des ind ividus morts et des individus ayant

survécu à l 'épisode de mortalité a révélé un ta ux de mortalité tout a uss i va ri a bl e que pour

1 es fa milles pl acées en bassin expérimenta 1. En effet, cel ui-ci était compris entre 18% pour 1 a

fami Ile 19 et 98% pour la fa mille 22 (Figure 37). De pl us, uneforte corrélation (rpoarson = 0,85)

entre les taux de mortalité sur estran et en bassin expérimental a été mise en évidence

(Figure 38).

145

100 ,--------------------------------------------------,

90 -

80 -

~70 -~ 60

iii 1:: 50 o E 40 QJ

"'C >< 30 :::s

- -J1- 'r-=--------------j

--- f ---]:-::-----------1

~ )= rJ ]i] JUIf: M

~ ~,'-li-------------~

------~ --- :- :- ;- :-

------- ;- :- :- ~

~ :: +'-'T~U,"-,-~I rJ,L'-,-l--'-,~ rL'-Pr'-'-P-,LJ..,..r-::" :T-'-r"''-r'-'T-..c,:=-'-'-r'--'-r'--'-r--'-:=='''''''' 22 ~ 6 W n U 24 D 7 1 5 18 4 21 9 11 8 8 M ~ H

Famille F2

Figure 37. Taux de mortalité de 21 familles F2 au cours d'un épisode de mortalité estivale survenu en août 2010

sur estran. les familles F2 étudiées apparaissent en rouge (F2-18), vert (F2-19) et orange (F2-21).

100 • ~

ë 90 c::: 80 [!! .... <1\ 70 QI .... :::s 60 <1\

'QI • '1: 50 iii .... 40 .... 0 E 30 QI

'-' - /e .. /

/ • ~ ..

/ / • y

"tI 20 X • :::s la {!!.

a a w ~ W w 100

Taux de mortalité en bassin expérimental (%)

Figure 38. Corrélation entre le taux de mortalité obtenu sur estran et Je taux de mortalité obtenu en bassin expérimental au cours d'un épisode de mortalité estivale survenu en août 2010. Les familles F2

étudiées apparaissent en rouge (F2-18), vert (F2-19) et orange (F2-21).

146

2.3.2. Mesure de la charge virale

La chargeviraleestexpriméeen nombredecopies d'ADN viral par milligramme de

tiss ufrais (Ta bleau 11). Elle est significativement différente entre 1 es i ndivi dus morts (Il =

1,52.108 ± 2,16.108) et les individus vivants (Il = 1,12.10' ±3,04.10'; F = 276,8 ; P < 2,2.10-16).

EII e est éga 1 ementsignificativement différente entre 1 es fa mi Il es (F = 37,7 ; P < 2,2.10-16) et

estcomprise entre 9,46.107 copies d'ADN vi rai/mg de ti ss u frais pour la fami Il e F2 -19 et

2,86.108 copies d'ADN viral/mg de tissu frais pour la famille F2-18.

Taux de Charge Charge Charge Famille mortalité Etat virale virale virale Ecart-type

(%) minimale maximale moyenne

18 78 Mort 1,57E+05 1,20E+09 2,86E+08 2,94E+08

Vivant O,OOE+OO 1,73E+05 1,40E+04 2,93E+04

19 30 Mort 2,02E+03 9,26E+08 9,46E+07 1,57E+08


20 58 Mort 9,08E+03 7,93E+08 9,97E+07 1,26E+08


Tableau 11. Statistiques descriptives de la charge virale pour les 3 familles F2 étudiées. La charge virale est exprimée en nombre de copies d'ADN viraVmg de tissu frais.

2.3.3. Marqueurs moléculaires et génotypage

Sur 1 es 384 marqueurs SNPs, certains ont été rejetés lors de l'observati on gra phique

des profi Isfournis par GenomeStudio: 105 pourla fa mil le F2-18, 102 pour la fami Ile F2-19,

108 pour la fami Il e F2-21. Ens uite, les SNPs monomorphes ont été éca rtés pour chaque

fami Ile: 191 pour la fa mille F2-18, 180 pour la famille F2-19, 169 pour la fami Ile F2 -21. En

dépit du nombre de marqueurs de départ, seuls 88 SNPs ont été retenus pour la

cartographiedelafamille F2-18, 102 pour la fami l le F2-19 et 107 pour la famille F2-21.

Sur les 42 marqueurs microsatellites génotypés, certains se sont avérés

monomorphes et ont donc été rejetés. Ainsi, 30 microsatel lites ont été retenus pour l es

familles F2-18 et F2-21 tandis que31 ont été retenus pour la famille F2-19.

147


Pa rmi les 118 ma rqueurs retenus pour 1 a cartographie généti que de 1 a fa mill e F2 -18,

3 SNPs ont été rejetés en raison de la distorsion de ségrégation . La carte génétique de la

fa mi Ile F2-18 est donc composée de 115 ma rqueurs etsa longueur tota 1 e est de 451,18 cM

(Ta bl eau 12 b) . Parmi 1 es 133 ma rqueurs retenus pour la cartographie généti que de la famille

F2-19, 27 SNPs ont été rejetés en ra ison de 1 a distorsion de ségrégati on. La carte généti que

de 1 a fa mille F2-19 est donc composée de 106 marqueurs etsa 1 ongueurtota le est de 576,46

cM (Ta bleau 12 cl . Pa rmi 1 es 137 ma rqueurs retenus pour 1 a ca rtogra ph i e généti que de 1 a

familleF2-21,14SNPs ont été rejetés en raison dela distorsion de ségrégation . La carte

généti que de la fa mille F2-21 est donc composée de 123 marqueurs etsa longueurtota le est

de 539,68 cM (Ta bleau 12 dl. Pour la carte combinée des 3 familles F2, 169 marqueurs (129

SNPs et40 microsatellites) ontétécartographiéssur9 groupes de liaison dont la longueur

totale est de 656,87 cM (Tableau 12a et Figure 39).

Pour les 4 cartes, les groupes de liaison ont été numérotés en fonction de leur

longueur, du plus longau plus court. Les marqueurs microsatellites communs ont permis de

comparer ces cartes génétiques aux cartes précédemment publiées par Hubert et

Hedgecock (2004) et Sauvage et al. (2010) (Tableau 12a).

148

Groupe de Nombre de longueur (cM)

Espacement moyen entre les Groupe correspondant liaison marqueurs marqueurs (cM) F2-18 F2-19 F2-21 •

1, 26 119,65 4,79 l b 3e 7d V

2, 16 111,14 7,41 7b le 9d VI 3, 30 77,11 2,66 3b 2e 3d 1 et X

4, 18 68,56 4,03 5b 7e 6d Il , 5, 21 61,75 3,09 8b 4e 8d IV

6, 20 59,49 3,13 4b 6e 2d + 10d IX 7, 19 56,86 3,16 9b 8e 5d VII

8, 8 56,11 8,02 6b ge ld III 9, 11 46,21 4,62 2b 5e 4d VI et VIII

Moyenne 18,78 72,99 4,55 - - - -Total 169 656,87 - - - - -

Groupe de liaison Nombre de marqueurs longueur (cM) Espacement moyen entre les marqueurs (cM)

lb 22 62,84 2,99 2b 8 52,49 7,50 3b 12 51,74 4,70 4b 13 51,71 4,31

b 5b 12 50,11 4,56

6b 12 47,46 4,31 7b 12 45,91 4,17 8b 14 45,50 3,50 9b 10 43,42 4,82

Moyenne 12,78 50,13 4,54 Total 115 451,18 -

Groupe de liaison Nombre de marqueurs longueur (eM) E.spacement moyen entre les marqueurs (cM)

le 16 121,59 8,11

2e 14 76,20 5,86

3e 14 64,97 5,00

4e 9 64,04 8,00

5e 11 58,43 5,84 e

6e 10 57,37 6,37 7e 12 55,83 5,08 8e 12 42,90 3,90 ge 8 35,12 5,02

Moyenne 11,18 64,05 5,91 Total 106 576,46 -

Groupe de liaison Nombre de marqueurs Longueu~ (cM) Espacement moyen entre les marqueurs (cM)

1d 8 78,79 11,26

2d 21 77,01 3,85 3d 10 68,13 7,57

4d 12 60,37 5,49 5d 11 58,53 5,85

d 6d 14 57,76 4,44

7d 18 53,43 3,14

8d 11 43,21 4,32

9d 16 41,17 2,74

10d 2 1,29 1,29

Moyenne 12,30 53,97 4,99

Total 123 539,68 -

Tableau 12. Caractéristiques des cartes géné tiques combinée (0) et des familles F2-18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d). Les groupes de liaison de la carte combinée sont reliés aux groupes correspondants sur les cartes de

chaque famille et aux groupes correspondants sur les cartes précédemment publiées' (Hubert et Hedgecock~ 2004; Sauvage etai., 2010) via les marqueurs communs. Les longueurs et/es distances

sont données en centiMorgans (cM).

149

Figure 39. Carte génétique combinée de Crassostrea gigas. Les distances sont exprimées en centiMorgans (cM). Les OTLs détectés apparaissent sur la carte en violet pour la réponse aux mortalités estivales et en jaune pour la charge virale.

0.0 4.4 5.6 6.0

14.3

39.5 41.1 45.6 47.0 47.9 48.4 48.7 49.1 52.1 55.5 55.9 58.0 58.3 58.9 59.7 60.5 626 eÔ.4

1 CgSili37 snp_AM8ro03<~ 48 snpJM8611l26_196 snpjJ,'Se8054_79 snp_DlV714015_27

snp_AJ5B4625_64

UaJCg186 UaJCg151 snp_CU994090_2!6 snp_80426370_37 snp_CU9lI7112_ 458 snp_80426370_239 snp_EVV7783S0_285 snpj",18e8845_106 snp_FPOO0502_586 snp_ES789710_308 snp_CU9lI6741_195 snp_Al.18ffiI92_370 snpJPOO6935_63 snp_CU682714_339 UaJCg141 snp_Al~858380_181 1 AdrEnsJ_GISldJrot UaJCg173

1151 --tt- CgSili38 119.8 -1d-- UaJCgl50

0.0 8.8

Il.5 18.3 18.5 20.4 21.2 21.7 27.1 31.6 35.0 35.6 36.4

54.1 56.5

2 UcdCgI33 snp_CU990619_287 snp_~60852_202 snp_AF075691_1372 snp_EW77775'-L 467 snp_AM865296366 snp_B~6841_203

snp_CU9946Zl_ 455 snp_AM860304_85 UcdCgI56 snp_~54280_231

snp_Akm63490_83 Cgsili45

Sod_G1 uc_Cotrans_ l snp_Akm63107 _115

111.1 -tT--CgSili50

on 2.9 3.4

4.1

43 5.1 9n

20.8

32.4 40.1 40.6 41 .7 42n 42.8 48n 48.5 502 522 53n 54n 54.1 56.7 57n 63.7 64.4 65n 74.6 7ï.1

3 UaJCg200 snp_An122054_98 snp_AlvI8561S6_5e9 snp_E\lV779028_227 snp_8Q4261l28_115 snp_S042e92B_4O snp_A81Z20B4_98 snp_A8122064_1511 UaJCg181

snp_AlvIS69641_319

snp_CU9B4453_266

snp_AMS69641_ 406 snp_S0427174_1095 snp_CU683158_35B EST104-49 snp_SQ42e5e4_125 UaJCg180 EFl_A1pha UaJCg154 snp_CU992707 _154 snp_CU9lI8490_316 snpjJ.I857211_ 491 Gtjc:oProtE.ÏI'1_H R snp_DV736300_eo3 UaJCg126 snp_CU685863_215 snp_CU685863_5 snp_CU685B63_126 UaJCgl53 UaJCg152

150

4 5 6

0.0 -A- UcdCg1UcdCg19 0.0 Is np_S0427114_118 snp_S0427114_1!!9 0.0 -fi-snPJ>~M858867_164 1.0 s np_AM862538_2>7

1.4 15 np_CU 682177_248 5 np_C8617375_137

62 -t-t- CGE007 1 1 1.8 s np_Arv18!i0093_352 1.9 s np_EW777483_600 42 s np_EIIV779545_265

11.4 U.cdCg195 4.8 HEST36-28

15.7 H EST36-22bis 13.1 UcdCg120 5.1 Notch_3

16.9 s np_AM857816_100 s'np_EIiV779181J49 7.5 s np_AM854833_563 5 np_ EliV779181_638 10.9 L10

21.5 5 np_AM88371 0_107 16.1 s np_AM855035_382 23.3 s np_Arv1857 471 _352

232 s InpSU 682324_234 172 5 npJP089799_114 24.8 snp_AJ566645_416 17.7 s np_AM858494_211 25.8 snp_AM855277_64 26.0 UcdCg117 22.3 s np_AM85946S_105

22.8 s np_AM861154_365 32.6 -t-t-s np_AM850019_65 32.4 s np_CK172327 _436 24.1 s npJPOOOO49_190

36.3 s np_E'V'j'777736_246 272 Uc:dCg172 39.1 U,cdCg119 40.5 5 'npJ>IM865312_288 41.4 s np _ Arv1854612_119 43.1 AY321300 43.6 5 np_AM8.53e87_32 47.9 5 np_CU 986744_318

5.0.5 -t-t-s np_CU634109_2ffi 50.0 s np_Arv1855102_290 51 .7 s np_AM861 !l54_ 152 .51.8 5 np_CU681722_367 52.5 5 np_AM855102_ 431 58.1 s np_CU9!!533~540

612 isnp_AM85759.5_643 58.6 EST104-48-1 00.5 snp_EU678313334 59.0 CgSili57 68.0 snp_AM864952_331 snp"':S0426529_380 592 s np_CU9!Il225_ 417 68.6 snp_AM859!1l7_237 61.8 CgSili46 59.5 ---'t;T- 5 npJ",1861357 _f89

151

7

0.0 ----A---CgSili3

9.6 U·cdCg149

15.7 --t-t- EST36-29-2

22.7 snp_AM859871 _333 24.3 r,'a",oph'lg =_El<~ess

26.9 5 np_AM863993_300 29.0 CgSili15

32.5 Laccss=_2 33.1 5 npSU936923_ 18 5 np_AM864017 _329

37.3 -t+-U,cdCg196

46.4 U cdCg203 470 5 np_AM853680]4 47.7 Cgsili7

1 502 s npSUff.350ï6_ 185 522 U·cdCg210 54.3 5 np_CU9990ffi_97 55.4 5 np_CU997393_573 56.9 5 np_CU6834e9_37

0 .0

4 .3 6.7 7.9 9.8

17.7 182

~

8

1 1

~

snp_354416_212

snp_AM354335_518 snp_C U998228_253 UcdCg165 snp_AM366046_598

EST34-19-2 UcdCg109

.U ll.",_""",,,,,_=

9

0.0

2.3

15.7 16.3

27.4

36.5

41.5 42.1 43.7 44.9 462

~ -

.....

....,

-

-"

L1cdCg166

s lnp_ AM853792_ 146

5 np_ AM854177 _ 247 5 np_ CF3891:32_ 32li

CGEOœ

s np_ Alv1865369_ 258

Amylas'!::~Gene_A

s np_ Alv1853936 146 A:ru,y SOD F Iavin_ m,:>nc·xy_2

152

2.3.5. Détection de OTLs

Les ca ra ctéristiques des QTLs détectés sont résumées dans 1 e Ta bleau 13 et 1 es QTLs

sontlocalisés sur la carte génétique (Figure39).

2.3.5.1. Réponse aux mortalités estivales

Pour les 3 familles, des QTLs ont été détectés pour la réponse aux mortalités

estivales. Deux QTLs ont été détectés pour 1 a famille F2-18 sur 1 es GLlb et4b (Ta bl eau 12b).

Ils expliquent 13,1% et7,5% de la variance observée et ont été confi rmés par la présence de

ma rqueurs significatifs autest de Kruskal-Wa Il is (P = 0,0001), nota mment 1 e SNP nommé

« Notch 3 » détecté sur 1 e gène homologue de Notch 3 (EF999949). Un QTL a éga 1 ement été

détecté chez 1 a famille F2-19 s ur le GL 5c (Ta blea u 12c). Il expl i que 29,7% de 1 a vari a nce

observée a été confi rmés par 1 a présence de ma rqueurs significatifs au test de Kruskal-Wallis

(P = 0,0001). Deux QTLs ont été détectés chez 1 a famill e F2-21 sur 1 es GL 4d et 5d (Ta bl ea u

12d). Ils expliquent respectivement 54,3% et 4,1% de 1 a va ria nce observée et 1 e test de

Krus kal-Wallis a mis en évidence des ma rqueurs significatifs (P = 0,0001 et P = 0,05). Sur la

ca rte généti que combinée, ces cinq régions QTLs sont loca 1 isées sur 4 groupes de 1 iai son

différents (Tabl eau 12a, Figure 39).

2.3.5.2. Charge virale

Un QTL a été détecté pour 1 a cha rge vi rai e chez chacune des 3 fa mi Il es. Pour la

fami Ile F2-18, il est local isé s ur le GL 6b (Ta bleau 12b) et expl i que 28,5% de 1 a va ria nce

observée. Pour la fa mille F2-19, il est localisé suri e GL5c (Tableau 12c) et expl ique 76,3% de

la variance observée. Pour la famille F2-21, il est localisé sur le GL4d (Tableau 12d) et

expl i que 15,6% de lava riance observée. Ces trois QTLs ont été confirmés par 1 a présence de

ma rqueurs significatifs a u test de Kruskal -Wallis (P = 0,0001), notamment 1 es SNPs nommés

« EST-34-19-bis » (Code GenBank : CU682072), « Flavin_monoxL2 » détecté sur le gène

Fmo-2 FI avin-containing monooxygenase 2(Code GenBank : AJ585074) et « SOD » détecté

dans le gène de SuperOxide Dismutase (Code GenBank : EF694097). Bien que le GL SC

(Tableau 12c) ait été associé au GL4d (Tableau 12d) pour former le GL9a sur la carte

combi née (Ta blea u 12a), il n'existe pas de QTLcommun auxfa milles F2-19 et F2-21 pour 1 a

153

chargevi rale(Figure39) caries marqueurs significatifs ne sont pas les mêmes pour les 2

QTLs détectés.

154

LOD-p-Value 1

Trait Famille GL seuil Position du QTL Intervalle de Marqueurs

Marqueurs inclus LOD maximal Variance

(cM) confiance (cM) flanquants du QTL ex pliquée (%) K

du GL 1

lb 2,8 42,688 - 62,041 48,893 - 54,886 snp_AM868845_106

snp_AF075697_181 6,87 13,1 19,04 *** **** F2-18

snp AM853758 293

4b 2,6 43,587 - 51,713 47,486 - 51,713 LlO Notch_3

4,64 7,5 20,41 ******* 1

snp AM862538 267

Survie F2-19 5c 2,6 1,568 - 58,432 26,675 - 39,278 CGE009

UcdCg166 snp_AM854177 _247 13,93 29, 7 51,855 ******* 1

4d 2,7 28,945 - 60,374 28,945 - 29,945 snp_AM853792_146 - 29,62 54,3 72,438 *******

F2-21 snp AM854177 247

snp_CU999066_97 UcdCg210 5d 2,4 5, 126 - 6,411 5,126 - 6,411 2,43 4,1 8,519 •• snp AM858680 74 snp CU685076 185

F2-18 6b 2,6 0,000 - 47,460 13,260 - 16,287 snp_CU988101_315 UcdCg109

19,35 28,5 169,688 ***** ** EST-34-19-2 EST34-19Bis

F2-19 5c 45,0 41,278 - 55,278 47,278 - 51,278 snp_AM 854177_247

55,71 76,3 60,051 ** **** * UcdCg166 -

Charge snp_AM865369_256 virale

Flavin_monoxv_2 F2-21 4d 2,7 11, 945 - 60,374 50,866 - 60,374 snp_CU684465_50 SOD 8,78 15,6 111,83 *** ****

AMY snp_AM853936_146

Tableau 13. Résultats des recherches de QTLs impliqués dans fa réponse aux mortalités estivales de l'huÎtre creuse, Crassostrea gigas, sur les groupes de liaison (GL) des cartes des familles F2-18 (b), F2-19 (c) et F2-21 (d). Le LOD-seuil de chaque GL a été estimé par un test de permutations (1000 permutations, ,,~0, 05), Ja

position, le LOD maximal du QTL et la variance expliquée par Je QTL ont été es timés par cartographie par intetvalle et la significativité par Je test nonparamétrique de Kruskall-Wal/is (K et p-Value : ** ;;: 0, 05 ; *** = 0, 01 ; **** = 0,005 ; ***** = 0, 001 ; ****** = O~ OO05 ; ******* = O~OOOl).

155

1

,

2.4. Discussion

Cette étude fa itsuite a uxtravauxde détection de QTLs impliqués dans 1 a s urvi eaux

morta 1 ités estivales et 1 a cha rge vi ra 1 e en Os HV-l menés par Sa uvage et al. (2010). De 1 a

même façon qu'au cours de l'étude précédente, nous avons observé une différence

significative de 1 a chargevi raie entre 1 es familles mais éga lement entre 1 es individus morts et

les individus survivants d'une même fa mi Ile. Nous n'avons pas jugé nécessaired'util iser une

PCR permetta nt d'i dentifier précisément OsHV-l ~va r. En effet, détecté à pa rti r de 2008 en

associati on avec OsHV-l, il est le principal pathogène détecté lors des épisodes de mortal ité

depuis 2009 (Segarra et al., 2010; Rena ultet a 1., 2012). On ne sait cependant pas s'i 1 s'agit

d'un nouvea u variant a pparu suite à une mutation, si des conditi ons favora bl es ont induit

son émergence ou s'i 1 a été introduit acci dentellement sur 1 es côtes fra nça ises. Le suivi

quotidien de la mortalité en bassin expérimental a également mis en évidence une

importa nteva riabilité i nterfamiliale. Celle-ci a été confirmée pa r une forte corrél ati on entre

1 a réponse a ux mortalités estivales en bassin expérimental ets ur estran pour chaquefa mi Il e

(Figure38). Cette corrélation a permis de vérifier que les observations menées en bassin

expéri mental pourdes raisons prati ques reflétaient 1 es performances de chaquefa mille dans

le mi 1 ieu naturel. Nous pouvons doncs upposerque les conditions expérimentales n'ont pas

biaisé la détection de QTLs et que les QTLs détectés reflètent bien les zones du génome

impliquées dans la survie aux mortalités estivales se produisant sur le.terrain.

Les nouveaux marqueurs SNPs développés dans l'Article 1 ont permis d'améliorer les

cartes génétiques précédemment publiées (Hubert et Hedgecock, 2004; Sauvage et al.,

2010). En effet, 1 a carte que nous présentons i ci comporte 169 ma rqueurs dont 129 SNPs et

40 microsatellites répartis sur 9 groupes de 1 iaison. Sa longueur tota 1 e est de 656,87cM et

l'espacement moyen entre les marqueurs est de 4,55 cM (Tableau 12a). L'utilisation de

marqueurs cartographiés par Sauvage et al. (2010) a permis de comparer cette carte

génétiqueà celle précédemment publiée. Nous avons alors constaté que la plupart des

ma rqueurs 1 iés sur l'une l'étaient éga lement s url'autre.11 fut doncfaci 1 e de détermi ner des

groupes de 1 iaison homologues. Nous avons ainsi constaté que les QTLs que nous avions

détectés étaient localisés sur des groupes homologues à ceux sur lesquels avaient été

détectés les QTLs publiés. Pour deux d'entre eux, des marqueurs communs ont d'a illeurs été

156

significativement associés et la part de variance expliquée s'él ève à envi ron 29% alors qu'elle

avoisinait 1 es 9% pour l'étude précédente. Celle-ci est certainement surestimée en ra is on du

génotypage sélectif mené a u cours des deux études. Par ailleurs, les différents QTl5 trouvés

ne ségrègent pas da ns toutes les fa milles. Cela peut être dû à 1 a différence d'i nformativité

des marqueurs et/ou des QTl5 pour chacune des familles . En effet, les lignées dont sont

issus 1 es grands-parents FO ne sont pas fixées mais simplement divergentes pour le ca ractère

« survie ». Dans ces conditions, il est important de multiplier le nombre defa mi Iles ava nt de

mener des a nalyses plus précises des régions d' i ntérêt. Pa r exemple, il pourra it désorma is

être i ntéres sant d'explorer les gènes candidats potentiellement sous-jacents, en pa rti cul i er

pour 1 es deux QTl5 co-localisés pour du matériel biologique différent et da ns le contexte des

mortalités massives apparu en 2008 et, par conséquent, entre les deux études. En effet,

pourles marqueurs« invitro» (Article 1), il est possible d'étudier la fonction des gènes au

sein desquels ceux-ci ont été identifiés (Fleury et al., 2010). Le séquençage récent du

génome de Crassostrea gigas (Zhang et al., 2012) a peut-être éga 1 ement permi s d'a nnoter

des gènes da ns 1 esquels se trouvent 1 es SNPs « in s ilico » (Arti cie 1) identifiés à l'i ntéri eur de

séquences a lors a nonymes.1I fa udra donc envisager de confronter ces séquences a ux bases

de données génétiques existantes telles que BLAST (Basic Local Alignment Search Tooi ;

Altschul et a 1.,1990). L'identification de gènes candidats serait un pas suppl émenta i re vers

une sélection génique pour la résistance aux mortalités estivales.

2.5. Remerciements

Ce trava il a été soutenu par Ifremer etfi nancé pa rtiellement par l'Agence National de

1 a Recherche « Génomique animale» Programme (GAMETOGENEs project - ANR-08-GENM-

041) . Les auteu rs remercient l'ensemble des membres de l'écloserie Ifremer de La

Trembla de etde 1 a nurserie de Bouin pourl a production et l'él evage des huîtres, Christophe

Klopp et Cédri cCa bau pour les données d'assembl age d'ESTs ai nsi que Del phi ne Tourbiez

pour 1 a formati on à 1 a PCR qua ntitative.

2.6. Références

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipmon, 0.1., 1990. Basic local olignment seorch tool. Journal of Moleculor Biology, 215,403-410.

157

Bodoy A, J. Garnier, D. Razet & P. Geairon, 1990. Mass mortalities of oysters (Crassostrea gigas) duringspring 1988 in the bay of Marennes-Oléron, related to enviranmental conditions. Conseil International pour l'Exploration de la mer.

Dégremont, L., Ernande, B., Bédier, E., Boudry, P., 2007. Summer mortality of hatcheryproduced Pacificoysterspat (Crassostrea gigas). 1. Estimation of genetic parameters for survival and growth . Aquaculture. 262, 41 -53.

Dégremont, L., Bédier, E., Boudry, P., 2009. Summer mortality of hatchery-produced Pacific oysterspat (Crassostrea gigas). /I. Response to selection for survival and its influence on growth and yield. Aquaculture, 299 (1-4), 21-29.

Dégremont, L., 2011. Evidence of herpesvirus (OsHV-l) resistance in juvenile Crassostrea gigas selectedforhigh resistance to the summermortality phenomenon. Aquaculture, 317 (1-4), 94-98.

Eisen, J. -M., 2011. Sélection sur gènes et sélection assistée par marqueurs. INRA -Productions animales. 24 (4), 357-362.

FA 0, 2013. Aquaculture production: quantities and values 1950-2011 . Published electronically on the internet, available directly from http://www.jao.org/fishery/ statistics/ global-aquaculture-production/en

Fleury, E., Moal, J., Boulo, V., Daniel, J.-Y., Mazurais, D., Hénaut, A., Corporeau, e., Boudry, P., Favrel, P., Huvet, A. (2010). Microarray-based identification of gonad transcripts differentially expressed between lines of Pacific oyster selected to be resistant or susceptible to summer mortality. Marine Biotechnoloqy, 12, 326-339.

Fox, J., 2005. The R Commander: A Basic Statistics Graphical User Interface to R. Journal of Statistical Software. 14(9): 1-42.

Garcia, e., Thébault, A., Dégremont, L., Arzul, 1., Miossec, L., Robert, M., Chollet, B., François, e., Joly, J.-P., Ferrand, S., Kerdudou, N., Renault, T. (2011) . Ostreid herpesvirus 1 detection and relationship with Crassostrea gigas spat mortality in France between 1998 and 2006. Veterinary Research. 42, 73.

Hubert, S., Hedgecock D., 2004. Linkage maps of microsatellite DNA markers for the Pacific oyster Crassostrea gigas. Genetics, 168, 351-62.

Koganezawa, A., 1974. Presentstatus of studies on the mass mortality of cultured oysters in Japan and its prevention. Third United States - Japan Meetinq on Aquaculture Journal, 29- 34.

Li, G., Hubert, S., Bucklin, K., Ribes, V. , Hedgecock, D., 2003. Characterization of 79 microsatellite DNA markers in the PacificoysterCrassostrea gigas. Molecular Ecoloqy Notes. 3, 228-232.

158

Li, R., Li, a., Cornette, F., Dégremont L., Lapègue, S., 2010. Development of four EST-SSR mlultiplex PCRs in the Pacifie oyster (Crassostrea gigas) and their validation in parentage assignement. Aguaculture. 310, 234-239.

Maurer, O., Comps, M., His, E., 1986. Caractéristiques des mortalités estivales de J'huÎtre Crassostrea gigas dans le bassin d 'Arcachon . Haliotis, 15, 309-317.

Moen, T., Baranski, M., Sonesson, A. K., Kjwglum, S. (2009). Confirmation and fine-mappingof a majorOTLforresistance to infectious pan crea tic n ecrosis in A tlanticsalmon (Salmo salar): population-Jevel associations between markers and trait. BMC Genomics. 10, 368.

Pépin, J.-F., Riou, A., Renault, T., 2008. Rapidandsensitive detection of Ostreid Herpesvirus 1 in oyster samples by real-time PCR. Journal of Virological Methods. 149, 269-276.

Pern et, F., Barret, J., Marty, c., Mo al, J., Le Gall, P., Boudry, P., 2010. Environmental anomalies, en ergeticreserves and fatty acid modifications in oysters coincide with an exceptional mortality event. Marine Ecologv Progress Series. 401, 129-146.

R DevelopmentCore Team, 2005. R:A language and en vironmen tforstatistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL: h ttp:/ jwww.R-project.org.

Renault T., Moreau, P., Faury, N., Pépin, J.-F., Segarra, A., Webb, S., 2012. Analysis of cJinical Ostreid Herpesvirus 1 (Malacoherpesviridae) specimens by sequencing amplified fragmentsfrom three virus genome areas. Journal of Virologv. 86 (10), 5942-5947.

Samain, J.F., McCombie, H., 2008. Summer mortality of Pacifie oysters Crassostrea gigas. The MOREST project, Ouae Editions. Versailles. 379p.

Sauvage, c., Boudry, P., de Koning, D.J., Haley, C.S., Heurtebise, S. and Lapègue S., 2010. OTL for resistan ce to summermortality and OsHV-l loadin the Pacifie oyster (Crassostrea gigas) . Animal Genetics, 41, 390-399.

Segarra, A., Pépin, J.F., Arzul, 1., Morga, B., Faury, N., Renault, T. (2010) . Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacifie oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153, 92-99.

Soletchnik, P., Le Moine, O., Faury, N., Razet, O., Geairon, P., Gaulletquer, P., 1999. Mortalité de J'hUÎtre Crassostrea gigas dans le bassin de Marennes-Oléron. Etude de la variabilité spatiale, de son environnement et de sa biologie par un système d'information géographique (SIG). Aguatic Living Resources. 12, 131-43.

Taris, N., Baron, S., Sharbel, T.F., Sauvage, c., Boudry, P. (2005). A combined microsatellite multiplexing and boiling DNA extraction method for high throughput parentage

159

analyses in the PacificOyster(Crassostrea gigas), Aquaculture Research , 36 (5), 516-518,

Van Ooijen, J, W" 2004, MapQTL ®5: Software for the Mapping of Quantitative Trait Loci in Experimental Populations of Oiploid Species, Kyazma a, V" Wageningen,

Van Ooijen, J, W" 2006, JoinMap®4: Softwareforthe Calculation of Genetic Linkage Maps in Experimental Populations, Kyazma av, Wageningen, Netherlands,

Verrier, E. R" Oorson, M" Mauger, S" Torhy, c., Ciobotaru, c., Hervet, c., Oechamp, N" Genet, c., aoudinot, p" Quillet, E. (2013), Resistance to a Rhabdovirus (VHSV) in

Rainbow Trout: identification of a major QTL related to innate mechanisms, PL oS ONE. 8(2), e55302, doi:10,1371jjoumal,pone,0055302,

Yamtich, 1., Voigt, M. L., Li, G" Hedgecock, D" 2005, Eight micrasatel/ite loci for the Pacific oyster Crassostrea gigas, Animal Genetics, 36(6), 524-526,

Yu, Z, Guo, x, (2006), Identification and mapping of disease resistance QTLs in the Eastem oyster, Crassostrea virginica Gmelin , Aquaculture, 254, 160-170,

Zhang, G" Fang, X" Guo, X" Li, L., Luo, R" Xu, F" Yang, p" Zhang, L., Wang, X" Qi, H" Xiong, Z, Que, H" Xie, y" Hol/and, p, W, H" Paps, J" Zhu, y" Wu, F" Chen, y" Wang, J" Peng, c., Meng, J" Yang, L., Liu, J" Wen, a" Zhang, N" Huang, Z, Zhu, Q" Feng, y" Mount,

A" Hedgecock, D" Xu, Z, Liu, y" Oomazet-Los, T" Du, y" Sun, X" Zhang, S" Liu, a" Cheng, p" Jiang, X" Li, J" Fan, D" Wang, W" Fu, W" Wang, T., Wang, B" Zhang, J" Peng, Z, Li, y" Li, N" Wang, J" Chen, M" He, y" Tan, F" Song, X" Zheng, Q" Huang, R" Yang, H" Du, X" Chen, L., Yang, M" Gaffney, p, M " Wang, S" Luo, L., She, Z, Ming,

y" Huang, W" Zhang, S" Huang, a" Zhang, y, Qu, T" Ni, p" Miao, G" Wang, J" Wang, Q" Steinberg, C. E. W" Wang, H" Li, N" Qian, L., Zhang, G" Li, y" Yang, H" Liu, X" Wang, J" Yin, y" Wang, J, (2012), The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shel/ formation, Nature, 490 (7418), 49-54,

160

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

l 'obj ectif de cetravail dethèse éta it de détecter, pa r une approche QTl, les relations

qui existententrelasurvieaux mortalités estivales, l'effort de gamétogenèse et certaines

porti ons du génome de l 'huître creuse, Crassostreo gigos. Afi n d'opti miser 1 a détection de

ces QTls (Massault, 2010), un matériel biologique pa rticulier, 1 es fa mi Il es F2, a été produit.

Dès 1 e premi er été, des individus appa rtenant à ces fa mi Iles ont été suivis au cours d'un

épisode de mortalité estivale qui a révélé une forte va riabilité inter-fa mi Ile de la réponse à

ce phénomène. Au cours de leur deuxième a nnée, la ga métogenèse d'i ndivi dus préservés

des mortalités estivales a été observée. le su ivi temporel d'une partie de ce matériel

biologique pari RM a apporté de nouvelles con naissa nces de 1 a ga métogenèse de l'huître

creuse. Afi n de va lider l'utilisation de cette méthode, certa i ns individus ont été sacrifiés pour

observer la gamétogenèse par la méthode classique d'histologie. Cette méthode a

également été utilisée pour observer la gamétogenèse d'une autre partie du matériel

biologique. le développement de nouveaux marqueurs moléculaires SNPs a permis

d'augmenter la densité de la carte génétique précédemment publiée afi n d'affiner les

régi ons QTls détectées pourla survie aux mortal ités estiva les (Sa uvage et al., 2010) et de

localiser des QTls impliqués dans l'effort reproducteur.

1. Synthèse des résultats 1.1. Meilleure connaissance du caractère « effort reproducteur»

l'histologie classiquement utilisée pourobserver la ga métogenèse de l 'huître creuse

a révél é des différences i nterfa mi 1 i al es de sex-rati 0 et d'i ndi ce gonad ique. Cependa nt,

l'histologie ne permet d'esti mer ces paramètres qu'à un i nstantt puisque les i ndivi dus sont

nécessairement sacrifiés. l'avantage de 1'1 magerie par Résonance Magnétique était donc la

possibilité de suivre 1 es mêmes individus tout a u long d'une sa ison de ga métogenèse. Nous

avons ainsi pu observer des trajectoires individuelles qui n'auraient pas pu être mises en

évidence parl ' histologie(Figure 40). En effet, nous avons remarqué que chaque individu

s uivaitson propre rythme pour atteindre 1 es différents stades de maturité connus (Mann,

1979; Steele et Mulcahy, 1999 ; Normand et al., 2009).

162

'" 12000 ClJ x 0 A, > 10000 ..... ,

" 0 ~

ClJ ....... ..Cl 8000 E -\ __ A

::J / / c ~B ~ 6000 ClJ

/ /-- ~ \ Jj E C ::J

Ci 4000 ~D > ~ ... / ~ / "'CI ra - ~ .>L ~ -e- E c 2000 0 ~ ~ - ii ...... ~ I!J

ft;" ~ "'f.l -- F

0 april may june july august october

Month

Figure 40. Evolution du volume gonadique au cours des 6 sessions d'IRM de 2011 pour 6 individus (AI BI ç D, E et FJ appartenant à la famille F2-18.

De plus, nous avons réuss i à déterminer le sexe des i ndividus à parti r des images

IRM : la composition biochimique différente des gonades mâ les et des gonades femelles a

induit des niveaux de gr is différents s ur les images 1 RM. Nous avons a insi pu observer que 1 es

mâles étaient globa lement plus précoces que l es femelles . Ma lgré ces ci nétiques

i ndividuelles, la plupart des individus ont pondu au mois de juillet, comme les huîtres

sa uvages suivies par le RESea u d'observations COnchylicoles (Ifremer - RESCO) . Ceci sembl e

cohérent avec 1 a biologie de l 'espèce puisque 1 a fécondation est externe et en mi 1 ieu ma ri n.

Pour qu'i l y aitfécondation, il est nécessaire que les gamètes soient émis en même temps .

Néanmoins, l' intervalle entre deux séances d'IRM étant d'au moins un mois , il serait

intéressant de réitérer ce type d'étude en augmentant l a fréquence des séances,

notammentà partirdu moment où la majorité des huîtres semblent à pleine maturité. Ce

moment ne peut être détermi né à l'avance ca ria gamétogenèse est fortement i nfl uencée

par l es conditions environnementa les telles que la température et l a disponibilité du

phytoplancton (Fabioux et al., 2005, Enriquez-Diaz, 2009, Santerre et al. 2013) qui sont

variables d'une a nnée à l ' autre. Nous avons d'ailleurs pu le constater grâce a ux deux séances

d'IRM qui ont été réa l isées en 2012. En effet, les individus étaientglobalementplus matures

163

en avril 2012 qu'en avril 2011 mais, contre toute attente, en juin, la tendance s'était

inversée. Les données du réseau RESCO ont d'ailleurs confirmé que la ponte des huîtres

sauvages avait eu lieu en août 2012, soit un mois plus tard qu'en 2011. Il aurait été

intéressantd'ajouterdes séances IRM en 2012 pour vérifier ce constatsur notre matériel

biologique. Néanmoins, malgréun indicegonadique globalement plus faible en 2012, une

corrélation des indices gonadiques entre les deux années a pu être observée au niveau

individuel : les individus dont l'indice gonadique maximal éta it parmi les plus élevés en 2011

ont présenté un indice gonadique parmi 1 es pl us élevés en 2012 et inversement. L'I RM a

donc permis d'en apprendre davantage sur la cinétique de la gamétogenèse et le

comportement reproducteur d'un même individu sur deux sa isons de gamétogenèse.

Cependa nt, ces données ne reposent que s ur l'observation d'une seule fa mi Il e et restent

donc à confirmer sur du matériel biologique différent.

1.2. Meilleure connaissance génétique des caractères étudiés 1.2.1. Apport de cette étude à la connaissance du caractère « survie aux mortalités estivales»

Le génotypage des individus testés pour 1 a survie a ux morta 1 ités estiva 1 es pour des

marqueurs utilisés parSauvageetal. (2010) etlegénotypaged'unefamille (R*O) testée par

Sa uvage eta 1. (2010) pour les nouveaux marqueurs SNPs développés (Arti cl el) ont permis

de compa rer notre carte généti que « survie» à 1 a carte publ iée par Sa uvage et al. (2010).

Nous avons ainsi observé que les marqueurs 1 iés sur 1 a carte publ i ée éta i ent éga 1 ement 1 i és

sur notre carte. Nous avons donc pu comparer la localisation des QTLs précédemment

détectés à 1 a localisation de ceux que nous avons détectés (Figure 41). Sur 1 es 5 QTLs publiés,

nous en avons retrouvé 4 chez nos trois fa milles F2 et 1 chez la fa mi Il e R*O, dont deux sur

des groupes deliaison homologues (Figure41:GLl et GL2) et deux co-localisés (Figure 41:

GL4 et GL9). En effet, 1 es QTLs détectés neségrègent pas dans l 'ensemble des fa mi Il es. Cel a

peut proveni rdu fait que les ma rqueurs sont i néga 1 ement informatifs a u sei n de cha que

fami Ile ma is aussi du fa it que 1 e déséquilibre de 1 i aison qui existe entre un marqueur et un

QTL va rie d'une famille à une a utre. La va riance expliquée pa rl'ensemble des QTLs s'élève à

83,6%. Cette va leur est probablement s uresti mée en ra ison de 1 a stratégie de génotypage

sélectifutilisée (Darvasi etSoller, 1992; Ronin et al., 1998). De plus, nous n'avons retenu

164

queles QTLs significatifs. Or, ces QTLs à effet majeur peuvent en masquer d'autres dont

l 'effet est pl us faible mais contri bue à la part de vari ance expl i quée (La nder et Botstei n,

1989). Cependant, retrouver les mêmes QTLs pourdu matériel biologique différent et dans

1 e contexte des mortalités massives apparues depuis 2008 laisse penser que ces régi ons (1)

seraient porteuses degènes contrôlant la réponse aux mortalités estivales et que (2) une

grande partie des mécanismes mis en jeu avant 2008 par les huîtres pour se défendre

sera ient également mis en jeu après 2008, dans le cadre de l'augmentation des mortalités de

naissains observées.

1.2.2. Proximité des ans impliqués dans la survie et des aTLs impliqués dans l'effort reproducteur

Comme nous avions génotypé les individus testés pour la survie et les individus

caractérisés pourl'effort reproducteur avec de nombreux ma rqueurs SNPs communs, il nous

a été poss ible d'éta blir une carte combinée « survie/effort reproducteur » en combi na nt 1 es

groupes de 1 iaison homologues des cartes combi nées « survi e » et « effort reproducteur »

(Figure 41), nous avons pu mettre en évi dence des 1 iaisons entre 1 es régions QTLs impliquées

danslaréponseaux mortalités estivales etdansl'effortreproducteur. Nous avons ainsi

retrouvéla corrélation phénotypique observée par Samain etaI., 2007 et Huvet et al., 2010

au nivea u génotypique sans poura utant pouvoir conclure à l'origine de cette corrélation. En

effet, quatre hypothèses permettraient de l'expliquer. La première hypothèse sera it que 1 a

proxi mité des QTLs soitdue a u simple hasard. La seconde hypothèse sera it qu'i 1 existe une

rel ation d'épistasie entre les gènes impliqués dans les deux caractères étudiés . La trois ième

hypothèse serait l'existence de gènes pléiotropes qui favoriseraient la survie mais

di mi nueraient l'effort reproducteur ou inversement. Chez le porc, 1 e gène de sensibi 1 ité à

l'ha lothane, un gaz a nesthésiant utilisé en médeci ne humaine et vétéri naire, exerce un effet

pl éi otrope s ur des caractères d'i ntérêt économique tels que 1 e rendement à l 'abattage, le

ta ux de muscle (Larzul et a 1.,1997) ou 1 a sens i bi 1 ité a u stress. Ce gène est donc uti 1 isé en

sélection pour améliorer la production tout en diminuant la sensibilité au stress . La

quatrièmehypothèseserait que les gènes impliqués dans ces deux caractères soient en

déséquilibre de liaison.

165

Figure 41. Carle gfnétique combinée « Junie )) et « Elforl reproductellr ». Lu QTLr dittttés par Sauuzge et aL, 2010 pour lu caractètu « nmit» et «charge virale en OfHV-1 » apparaimnt

en Mu. Li Q TLr déleclù au coun de nol,., étude pour m m ces mêmes caractères apparaissent en jaune. Les Q TLs détectés pour l'indice gonadique apparaissent en rose et les Q TLs détectés pour le sexe apparaissent en violet. Les noms des groupes de liaison indiquent le groupe homologue sur la carte de S auvage et al. , 2010 (en chiffres romains).

GL1=V

0.0 1.4 2.5 2.9 3.0

3.8

4.2 4.5 4.8 5.0 5.5 6.3 8.3

16.4 17.2 17.6 18.2 19.1 19.4 20.1 21 .1 24.8 26.3 44.8

62.1 63.8 65.1 65.2 65.5 69.5

snp692]U60SJA01AOR6 snp_~869032_351 UcdCg173

EST~30 1 snp_BC426570 128 snp ~8628B2 512 snpS03_EX956381 snp]P091137_183 AdrenaLGland_Prot UcdCg141 snp_CU682714_339 snp_AF075697_97 snp067_EVU778122 snp_~858380_181 snp_CU986741_195 snp_~853756_293 snp_B0426370_239 snp_~868845_106

snp_EVV778390_285 EST34 21 snp_CÜ994090_266 snp_CU987112_458 snp719_CU967485 snp274_FU60SJA01AEMF UcdCg151 UcdCg186 snpS62_FU60SJA01AYNV

snp167 _FU60SJA01 B27Q snp_~868054_79 snp_~861626_196

snp_~860034_46 snp_~858880_508 CgSlli37

• 1

GL2= IX

0.0 snp_CU682053_467 0.3 snp_~886729_157 6.4 snp_B0427114_118 6.7 snp_B0427114_169 7.3 snp695_FU6CSJA01A20Z 7.4 snp_~862538_267 8.0 snp_CU682177 _248 snp_CB617375_137 8.1 snp_~856693_352 8.3 snp_EVV777483_866

10.4 snp_EVV779545_265 10.8 HEST36_28 11.0 Notch 3 11.1 HEST36-28 17.2 L10 22.9 snp_~855035_382

23.4 snp]P089799_114 snp ~858494 211 28.1 snp631 _CU685657 - -30.7 snp]POOO049_190 30.8 snp288_FU6CSJA01B023 31.0 snp_~861154_365 33.4 UcdCg172 • 34.3 snp441_FU6CSJA01D70E 39.1 snp579_B0426980

65.7 snp_AM861357 _589

1 1

1

GL3 = III 0.0 --A- CG49

5.7 6.4 6.6 8.0 9.2

11 .7 13.4 14.1 14.2 14.8 14.9 16.3 17.7 19.4 19.5 22.6

36.8 37.0 37.5

EST~19-2

EST~198is UcdCg109 snp049_FU60SJA01AR74 EST34 19bis snp_~862502_170 snp_AM654835_518 snp282_~860809

snp_CU988101_315 snp198_~858384 snp_~866046_598 UcdCg165 snp_CU99B226_258 snp455_ES789146 snp_854416_212 snp039_EVV779377

snp_~858B00_222 snp_AM853969_249 UcdCg198

1

1

166

Gl4=VI Gl5 = 1 + X Gl6 = Il

0.0 --A- CgSiliSO 0.0 -A- snp_CU685863_126 0.0 ~ snp_AMBS9907 _237 0.1 Orae3 0.4 snp AM864952 331

9.1 snp_CU992707_194 0.8 snp328_CX069134 snp_BQ426529_3BO 10.7 GlycoProtein_HR 11 .3 snp_CU9B6490_316

8.7 --tt- Galectine_1 15.8 snp194_AM85782B 19.2 snp045_CU68S09B 22.8 snp_BQ426564_125 18.4 EST34 6 23.6 EST104-49 18.8 EST~6 24.6 snp_CU683658_368 19.3 snp643]U60SJA01AQOX

36.3 snp_AM860304_BS 25.3 snp_BQ427174_1095 snp_EW779181_749 snp_AM857816_166

38.3 CgSiIi4 21 .3 snp_EW779181_638

39.0 CgSiIi43

Il 31 .0 snp_CU9B4453_266 22.9 snp_AMBS9467_449

40.4 UedCg156 23.0 snp_AMBS9033_434

44.4 snp_AM863490_B3 23.1 snp_AMB59467_518

45.0 Cgsili45 26.0 snp321]U60SJA02F4RH

46.4 snp_AM8542BO_231 42.7 snp020_AJ565717 26.3 snp332_FU60SJA01AOBO 26.8 snpS58_EX151535

55.8 snp_AM856753_332 45.1 snp295_AM867758 33.1 snpS98_FPOOB8BB 58.3 snp_AM865296366 45.3 snp237 _AM855591

60.5 snp_AM863381_54 46.8 snp054_FU60SJA01 BHI

61 .7 Sod Glue Cotrans 2 48.3 snpS05_AM854527 42.1 -++- CGE007

62.4 snp -AF075691 1372 63.5 snp=EW778458_587 Sod_Gt fotrans_1 56.4 UedCg181

64.2 snp_AM8631 07_115 58.5 snp445_FU60SJA01 BQ1 K 50.5 ::ft HEST36_22bis 69.8 snp_CU990619_2B7 62.0 snp_AB122064_98 51 .6 HEST36-22bis 75.0 snp_AM85S000_378 62.1 snp_EW779028_227 snp_BQ426928_115

62.7 snp_AMBS6186_589 57.1 1 snp_AM863710_107

82.9 ---I::i- snp_EW777756_ 467 63.0 snp_AB122064_1511 66.6 UedCg200

58.5 snp_AMBS7471_352 61 .0 snp_AMBS5277_64 62.2 snpS84_B0426822

167

Les pointillés indiquent un groupe de liaison détecté par Sauvage et al., 2010 mais dont les marqueurs associés n'ont pas été cartographiés au cours de notre étude. La position probable a été déterminée en excluant les marqueurs communs aux deux cartes mais qui n'étaient pas associés à ce QTL.

GL7= IV GL8= VII GL9 = VI + VIII GL10 0.0 -T'I- snp_CU682324_234 0.0 --A-- UedCg149

OO i

AMY 0.0 --A- snp584_B0426822 2.5 snp_AJ565506_195 • • • 2.8 SOO

6.4 EST36-29-2 • 3.5 Flavin_monoxy_2 5.9 * snp_AM86371 0_107 6.9 snp482_CU990615 •

1 4.6 snp234_CU997091 7.3 snp_AM657471_352

8.5 -++ snp_AM8551 02_431 10.6 snp132_AM656794 •

1 13.4 snp_AM859871_333 • 14.1 EST36 29 2 • 10.3 =++ snp AM865369 256 14.4 MacroPhagë_express • 11.8 snp=CU992933::132

14.9 UedCg117 17.3 snp_AM863998_300 • 17.6 snp572_AM858709 • • 17.8::ft snp169_CU987908 19.0 snp_CK172327_436 24.5 snp_CU986923_18 18.4 CGEOO9 21.6 "- snp_AM865312_288 24.7 Laccase_2 22.1 snp_EVU777736_246 25.5 snp_AM864017_329 22.2 snp_AM853687_32 28.9 UedC9196

37.7 snp470_EVV777685 24.8 UedCg119 39.4 Drac3 27.5 snp_AM854612_119 • 39.6 snp_CU683857_112

38.4 Cgsili7 28.7 EST104_43 40.0 snp_EU678313_434 39.2 snp_AM858680_74 40.4 snp_AM864952_331 41 .9 snp_CU685076_185 31.2 snp_AM854177_247 40.5 snp_AM659907_237 43.5 UedC9210 1

l 41 .1 snp328_ CXD69134

44.7 snp_CU999066_97 41.9 snp348_FU60SJA01 CBAU 46.4 snp_CU997393_573 36.5 snp140_AM860845 42.3 snp057_FU60SJA01 BA6L 47.9 snp_CU683469_37 43.0 snp558_EX151535

41.9-++ CgSiIi46 1 48.5 snp_AM657913_323 56.8 EST34 6 57.8 snp843::.FU60SJA01AQOX

59.2 snp_EVU779181_638 snp_AM857816_166

47.5 =tt snp_CU990225_ 417 • 59.8 -'d- snp661_CU995315

48.3 --U- UedCg166 1 snp_EVU779181_749

49.5 EST104-48-1 61 .9 snp_AM859467_518 63.5 snp321_FU60SJA02F4RH 70.2 snp598]P008868

168

2. Perspectives 2.1. La Nouvelle Génération de Séquençage

Ce travail a permis d'améliorer la carte génétique de Crassostrea gigas car

l'augmentation de la densité de ma rqueurs tend à réduire 1 al ongueurdes groupes de 1 iaison

et, parconséquent, l'espacement moyen entre les marqueurs. Les cartes précédemment

publ iées affichaient une longueur a liant de 770 cM pour 102 ma rqueurs (U et Guo, 2004) à

1062 cM pour80 marqueurs (Sauvage, 2008) . A partir des deux sessions de génotypage

d'i ndividus a ppartenant à nos troisfa milles, nous avons pu éta bl i r une carte génétique sur

1 aquelle figurent 216 marqueurs dont 28 microsatellites et 188 SNPs répartis s ur 10 groupes

de 1 iaison (Figure 41). La longueur de cette ca rte est de 612,23 cM et couvre 90,7% de la

longueur théorique du génome estimée à 675,04 cM grâce à la formule de Chakravarti

(Cha kravarti et al ., 1991). L'es pacement moyen entre les marqueurs a éga l ement été réduit

à 3,14 cM, ce qui permet de s'approcher des chromosomes, par rapport a ux 8,8 cM esti més

sur la carte généti que des mâles parU etGuo (2004) ou aux 12,7 cM surla carte de Sauvage

(2008). Pour ancrerces cartes génétiques, l'élaboration d'une carte phys ique à pa rti r d' un

pa nel RH a été tentée au cours du projet Ga métogènes ma is, pour le moment, celle-ci n'est

pas encore disponible. L'essor récent des méthodes de la Nouvelle Génération de

Séquençage permet d'imaginer dans un futur proche une augmentation encore plus

importa nte de 1 a densité en marqueurs de 1 a ca rte génétique (P-A Gagna ire, pers. Comm.).

En effet, des marqueurs RAD (Restriction site As sociated DNA) sont actuellement développés

sur 1 es familles F2-19 et F2-21 etseront prochai nement in tégrés a ux ca rtes généti ques de

ces familles (Projet Aquagenet ).

2.2. Apport du séquençage du génome de l'huître creuse

Au cours de cette étude, nous avons utilisé des marqueurs SNPs détectés dans des

gènes différentiellement exprimés dans les gonades d'individus sélectionnés pour leur

rés i stance ou 1 eur sensibilité a ux mortalités es tivales (FI eury et al., 2010). Il serait intéressa nt

de vérifier lafonction des gènes dont les marqueurs sont inclus dans les QTLs détectés.

Cependant, un grand nombre de ma rqueurs SNPs anonymes ont éga lement été uti 1 isés. Le

séquençage récent du génome de Crassostrea gigas (Zha ng et al., 2012) ouvre 1 a voi e à 1 a

169

recherche de gènes candidats à parti rde ces marqueurs qui étai ent a nonymes a u début de

cette étude mais qui se situent peut-être au sein de gènes annotés depuis.

2.3. Utilisation des uns détectés dans un programme de sélection

A ce jour, les QTLs détectés chez les espèces aquacoles ne sont que rarement

exploités en sélection. A notre connaissance, seuil e QTL i mpl iqué da ns 1 a rés ista nce à 1 a

nécrose pancréatique infectieuse chez 1 eSa umon atlanti que (Moen et al., 2007) est uti 1 isé

dans un programme de sél ection privé mis en place en 2007 par l'entreprise norvégienne

Aqu aGen . Pourtant, des modél isations (Azéma, 2012) ont montré l'impact bénéfique d'un

QTL expl iquant de 10 à 40 % de 1 a variance observée s ur le schéma de sél ection class ique

repos a nt sur des familles (Figure 42, ga uche) ets ur un schéma de sél ection combi na nt une

sélection sur les familles etsur les individus reproducteurs (Figure42, droite).

Size effect of the QTL"'O.2

... 0 · . . : : : . . :

. ~ ... , ", ........................ ~ ...... ~ ......... ... . , ,,, .. : : : : : : : : :

ro <') Cl 0 U

· . . . . . . . . . ..... . ; ... ·"l-···· f·· ·· .j .. ... . ~ ..... . ~ ...... ; .. ... ! ..... j' ~ Ql '" Cl 0

· . . .. . ....... . : ..... : .... .... " , ~ ..... . : .. .. , .~ .. .. . : .. . ,,:. :' . ::: . .

. " ...... ', .... ~. "0 Ql Ü 'i5 ~

i!! 0

... i . , ... ~ ..... ~ .. , .. ~ ..... ':' . . . . ~ .... '!"'" ~ ..... ~ .. ", ~ ..... + ..... ~ .... . . · .. . .

a. .... ~ ..... : ..... : ..... : ... .. L.o .. . ~ ..... ~ .... . : ..... . .. . . . . . , . . 0 · . .. · . ci · .

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Survival rate

c: cu Cl u ~ c: Ql Cl

~ 'i5 i!! a.

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Size effect of the QTL"'O.2

.. . .~ ..... : ..... : ..... ; ..... ~ .... ,.:. . " .. ~ ..... :" ", :. · . ,. .. · . . . . . ~.~ ~ . ~.

· . . · .. · . . , . ........................ . ..... . ...... H •••• . . . . . . . . . ....... ~ ..... ; .. ... ; ..... ; ..... ~ ..... . ; ...... ; .....

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Survival rate

Figure 42. Modélisation de l'effet d'un QTL dans un schéma de sélection classique (à gauche) et sur un schéma combiné (à droite). Gain de sélection attendu sur le taux de survie grâce à l'utilisation d'un QTL

expliquant 40% de la variance observée en fon ction de la fréquence initiale du QTL dans la population avant sélection (1 % en noir, 5% en rouge, 10% en vert, 20% en bleu foncé, 50% en bleu clair).

Si les ma rqueurs significativement associés aux caractères d'intérêt sont localisés

dans des gènes identifiés, une sélection directement sur ces gènes pourrait être mise en

place par le choix d'a nimaux reproducteurs porteurs des a lIèles favorables . Cependant, cette

stratégie pourrait mener à une perte de diversité génétique puisque le nombre de

170

reproducteurs est limité. Si les marqueurs demeurent anonymes, il est possible de

sél ectionner indirectement les a lIèles favorables via une Sél ection Assistée pa r Marqueurs.

Da ns 1 es deux cas, 1 e programme de sél ection sur un seul caractère expose a u risque

d'effets défavorables s ur un a utre caractère. En effet, d'une pa rt, 1 a sélection s ur un a Il èle

favorable ou une région porteuse de cet a lIèl e entraîne potenti ellement la sélection d'autres

a Ilèles défavorables en déséquilibre de 1 i aison tel que la sélection des moutons s ur le gène

PrP pour 1 a résistance à 1 a tremblante qui pourrait affecter 1 es ca pacités de défense contre

les infections (Sweeney et Hanrahan, 2008). D'autre part, la pléiotropie d'un gène ne

pouvant être vérifiée a priori, il se peut que la sélection d'un allèle favorable pour le

ca ractère cons idéré s'avère néfaste pourun autre caractère d'intérêt (Larzul et al., 1997).

L'observation récente de mortalités d'huîtres creuses adultes associées à la détection de

Vibrio aestuarianus (REPAMO, 2012) suscite cette interrogation quant à la sélection des

huîtres pou r la résistance a ux mortalités de juvéniles, 1 e pathogène associ é aux morta 1 ités

es tiva les massives dej uvéniles.11 se pourrait que cette sélection, dont l'enjeu est importa nt

pour la filière aquacole, ait favorisé la survie au stade juvénile tout en ayant

involontairement fragilisé les individus au stade adulte.

Ainsi,touten essayantdecomprendreles facteurs impliqués dans les mortalités et

1 es méca nismes de défense mis en pl ace, il sembl e perti nent de pours ui vre une sélecti on

non ciblée sur un agent pathogène en particulier, et en étudiant les corrélations

phénotypiques etgénétiques entre les survi es aux différents stades. Ce type de sélecti on

peut s'apparenter à une sélection visant à améliorer la robustesse de l 'huître. En effet,

a méliorerl a capacité de survie de l ' huître face à l'ensemble des perturbations auxquell es

elle est soumise dans son milieu naturel (variations de température, de salinité et de

ressources nutritives, diversité des pathogènes .. . )a pparaÎt un enjeu majeur pour une fi li ère

dont la production s'inscrit dans un milieu non contrôlé.

171

BIBLIOGRAPHIE HORS ARTICLES

-A-

Azéma, P. (2012). Modelling of a sel ectionscheme for a n i mproved surviva 1 rate to s ummer mortality syndrome in Crassostrea gigas. AgroParisTech, Master Thesis, 63p.

-B-

Baghurst, B.C., Mitchell, J.G. (2002). Sex-specificgrowth and conditi on ofthe Pacifi c oyster Crassostrea gigas (Thunberg). Aquaculture Research, 33,1253-1263

Beattie, J., Chew, K., Hershberger, W. (1980) . Differentiai survival of selected strains of Pacific oysters (Crassostrea gigas) during summer mortality. Proceedings of Nati onal Shellfish Association, 70,184-189.

Buroker, N. E. (1983). Sexuality with respect to 5 hell 1 ength a n group si ze in the Japa nese oyster Crassostrea gigas. Malacologia, 23, 271-279 .

-c-

Chakravarti, A., L. K. Lasher et J. E. Reefer (1991). A Maximum likelihood method for estimatinggenomelength using genetic linkage data. Genetics, 128 (1), 175-182.

Cheney, D.P., Macdonald, B.F., Eiston, R.A. (2000) . Summer mortality of Pacific oysters, Crassostrea gigas (Thunberg): in itialfi ndings on multi pie environ mental stress ors in Puget Sound, Washington, 1998. Journal of Shellfish Research.19, 353-359.

Curole,J. P., Hedgecock, D. (2005). High frequency of SNPs in the Pacific oyster genome. http://intl-pag.org/13/abstracts/PAG13_W026.html. Plant and Animal Genome XIII Symposium.

- D-

Darvasi, A., 5011 er, M. (1992) . Selective genotyping for determi nati on of li nkage between a marker locus and a quantitativetraitlocus. Theoretical andApplied Genetics, 85 (2), 353-359.

Davison, A.J., Trus, B.L., Cheng, N., Steven, A.c., Watson, M.S., Cunni ngha m, c., Le Deuff, R.M., Renault, T. (2005) . A novel cl ass of h erpesvi rus with bivalve hosts. Journa 1 of General Virology. 86, 41-53.

173

Davison, AJ., Eberle, R., Ehl ers, B., Haywa rd, G.S., McGeoch, D.J., Mi nson, AC., Pell et, P.E., Roizman, B., Studdert, M.J., Thiry, E. (2009). The order Herpesvirales. Archive of Virology.154,171-177.

Dégremont, L. (2003). Etude des bases généti ques de 1 a morta 1 ité estiva le et des rel ati ons avec la croissance chez les j uvéni 1 es de l'huître creuse Crassostreo gigos. Thèse de doctorat, Université de Caen-Basse Normandie. 333p.

Dégremont, L., Ernande, B., Bédier, E., Boudry, P. (2007). Summer mortality of hatcheryproduced oyster spat (Crassostreo gigos).1. Estimation of genetic parameters for survival and growth. Aquaculture, 262, 41-53.

Dégremont, L., Bédier, E., Boudry, P. (2010 a). Summer mortality of hatchery-produced Pa ci fic oysterspat(Crassostreogigos).11. Responseto selection for su rvival and its influence on growth and yield. Aquaculture, 299, 21-29.

Dégremont, L., Soletchnick, P., Boudry, P. (2010 b). Summer mortality of selected juvenile Pacific oysterCrassostreo gigos under laboratory conditions and comparison with field performance. Journal of Shellfish Research, 29, 847-856.

Dégremont, L., Boudry, P., Ropert, M., Sa ma in, J.-F., Bédi er, E., Sol etchnik, P. (2010c). Effects of age a nd envi ronment on survivalof summer mortal ity by two sel ected groups of the Pacific oyster Crassostreo gigos. Aquaculture, 299, 44-50 .

Dégremont, L. (2011). Evidence of herpesvirus (Os HV-l) res istance in j uveni 1 e Crassostreo gigos selected for high resistance to the summer mortality phenomenon. Aquaculture, 317 (1-4), 94-98.

Deslous-Paoli, J.M., Héral, M. (1988). Biochemical composition and energy value of Crassostreo gigos (Thunberg) cultured in the bay of Marennes-Oléron. Aquatic Livi ng Resources, 1, 239-249.

Dhei Ily, N.M., Lei ong, c., Huvet, A, Kell ner, K., Dubos, M.-P., Rivière, G., Boudry, P., Favrel, P. (2012). Ga metogenesis i nthe Pacific oyster Crassostreo gigos: a mi croa rrays-based analysis identifies sex and stage specific genes. PLoS ONE, 7(5), e36353.

-E-

Enriquez-Diaz, M. (2004). Variabilité et bioénergétique de la reproduction chez l'huître creuse Crossostreo gigos. Océanologie Biologique. Brest. Université de Bretagne Occidentale, Manuscrit de thèse, 216p.

Enriquez-Diaz, M.-R., Pouvreau, S., Chavez-Villalba , J., Le Pennec , M. (2009). Ga metogenes is, reproductive i nvestment, and s pawning behavior ofthe Pacific gi ant oyster Crassostreo gigos: evi dence of a n envi ronment-dependent strategy. Aquaculture 1 nternati onal , 17(5), 491-506.

174

Ernande, B., CI obert,J., McCombie, H., Boudry, P. (2003) . Geneticpolymorphism and tradeoffs in the early life-history strategy of the Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg, 1795):Aquantitative geneti cs study. Journal of Evolutiona ry Bi 01 ogy, 16, 399-141.

- F -

Fa bi oux, e., Huvet, A., Le Souchu, P., Le Pen nec, M., Pouvrea u, S. (2005). Temperature and photoperiod drive Crassostrea gigas reproductive interna 1 cl ock. Aqua culture, 250, 458-470.

FAO (2013) . Aquaculture Production (Quantities and values) 1950-2011. http ://www.fa o.org/fi s hery/stati sti cs/s oftwa re/fi s hs tatj/en.

Fleury, E., Moal,J., Boulo, V., Daniel,J .-Y., Mazurais, D., Hénaut, A., Corporeau, e., Boudry, P., Favrel, P., Huvet, A. (2010). Mi croarray-based i dentificati on of gonad tra nscri pts differentially expressed between li nes of Pacifi c oyster sel ected to be resistant or susceptibleto summer mortality. Marine Biotechnology, 12, 326-339.

- G-

Ga Istoff, P.S. (1964). The Ameri can oyster, Crassostrea virginica Gmelin . Fishery Bull eti n, 64, 1- 480 .

Garcia, e., Thébault, A., Dégremont, L., Arzul, 1., Miossec, L., Robert, M ., Chollet, B., François , e., Joly, J.-P., Ferrand, S., Kerdudou, N., Renault, T. (2011) . Ostreid herpesvirus 1 detecti on and relationship with Crassostrea gigas s pat morta 1 ity inFra nce between 1998 and 2006. Veterinary Research , 42,73.

GI ude, J.B. (1975). Summary report of Pacifi c coast oyster mortal ity investigations 1965-1972. Proceedings ofthe First United States - Ja pan meeti ng on Aquaculture, 1-28.

Grassé, P. (1960) . Traité de Zoologie. Tome V. Masson et Cie, Paris , 2219 pp .

Guo, X., Hedgecock, D., Hershberger, W.K., Cooper, K., Allen, S.K. Jr (1998). Genetic determi na nts of protandricsex i n the Pacific oyster, Crassostreagigas . Evoluti on, 52, 394-402 .

Guo, X., Li, Q., Wa ng, Q.Z., Kong, L.F. (2012). Genetic Mapping a nd QTL Analys is of Growth Related Traits in the Pacific Oyster. Marine Biotechnology, 14, 218-226.

- H -

Ha 1 ev, L. E. (1977). Sex determination in theAmeri can oyster. Journa 1 of Hereditv. 68, 114-116.

175

Ha ley, L.E. (1979) . Geneti cs of sex determi nation i n theAmeri can oyster. Proceedi ngs of the National Shellfisheries Association, 69, 54-57.

Hatt, P .-J., Davenel, A., El iat, P.-A., Quellec, S., 2009. Magneti c resonance i maging as a mea n to assess the body growth andthegonad development of the oyster Crassostrea gigas. Aquatic Living Resources, 22, 331-339.

Hedgecock, D., Gaffney, P.M., Goulletquer, P., Guo, X., Reece, K., Warr, G. (2005). A case for sequencingthe Pacific oystergenome. Journal of Shellfish Research, 24, 429-441.

Hedgecock, D., Li, G., Voigt, M.L. (2007). Mapping heterosis QTL in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Aquaculture, 272, 268.

Hedri ck, P .W., Hedgecock, D. (2010). Sex determi nation: geneti c models for oysters. Journa 1

of Hereditv, 101 (5), 602-611.

Huvet, A., Boudry, P., Ohresser, M., Delsert ,c., Bonhomme, F. (2000). Variable microsatellites in the Pacific oyster Crassostrea gigas and other cupped oyster species. Animal Genetics, 31,71-2 .

Huvet, A., Norma nd, J., FI eury, E., Qui lIien, V., Fabi oux, c., Boudry, P. (2010). Reproductive effortofPacific oysters:a traitassociated with susceptibility to summer mortality. Aquaculture, 304, 95-99.

- K -

Kooijman, S.A.L.M (2000). Dynamic energy and mass budgets in biological systems. Cambridge Universitv Press.

- l -

La coste, A., Jal abert, F., Mal ham, S., Cueff, A., Geleba rt, F., Cordevant, c., Lange, M ., Poul et, S.A. (2001). A Vibrio splendidus strain is associated with summer mortalityof j uvenil e oysters Crassostrea gigas i n the Bay of Morlaix (North Brittany, Fra nce). Diseases of Aquatic Organisms, 46,139-145 .

La nder, E. S., Botstei n, D. (1989). Mapping mendelian factors underlyi ng qua ntitative tra its using RFLP linkage maps. Genetics, 121, 185-199.

Lango-Reynoso, F. (1999) . Détermination de la sexualité chez l'huître creuse Crassostrea gigas (Thunberg, 1793). Thèse de Doctorat, Université de Bretagne Occidentale, 139pp.

Lango-Reynoso, F., Chavez-Villalba, J., Cochard, J.c., Le Pennec, M. (2000) . Oocyte size, a mea ns to eva 1 uate the ga metogenic devel opment of the Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg). Aquaculture, 190, 183-199.

176

La rzul, c., Le Roy, P., Guébl ez, R., Ta 1 mant, A., Gogué, J., Sell i Er, P., Moni n, G. (1997) . Effect of ha lothane genotype (NN, Nn, nn) on growth, carcassa nd meat quality traits of pigs si a ughtered at 95 kg or 125 kg liveweighUournal of ani mal breedi ng and genetics , 114,309-320.

Launey, 5., Hedgecock, D. (2001). Highgeneticload in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Genetics, 159(1), 255-65.

Le Bras, Y., Dechamp, N., Krieg, F., Filangi, O., Guyomard, R., Boussaha, M., Bovenhuis, H., Pottinger, T. G., Prunet, P., Le Roy, P., Quillet, E. (2011). Detection ofQTLwith effects on osmoregulation capacities in the rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss). BMC Genetics, 12,46.

Le Da ntec, J. (1968). Ecologie et reproduction de l'huître portuga ise (Crassostrea onguloto, La ma rck)da nsle Bassin d'Arcachon et s ur la rive ga uche de 1 a Gi ronde. Revue des Travaux de l'Institut des Pêches Maritimes, 32 (3), 237-362.

Le Deuff, R.-M., RenaultT. (1999). Purification and partial genome characterization of a herpes-likevi rus i nfectingtheJa pa nese oyster, Crassostrea gigas.Journal of General Virology, 80, 1317-1322.

Le Roux, F., Gay, M., Lambert, c., Waechter, M ., Poubalanne, 5., Chollet, B., Nicolas, J.L., Berthe, F., (2002). Comparative a nalysis of Vibrio splendidus-related stra i ns isol ated during Crassostrea gigas mortality Events. Aquatic Living Resources, 15, 251-258.

Le Roy, P. et Elsen,J.-M. (2000). Principes de l'utilisation des marqueurs génétiques pour la détection des gènes influençant les caractères quantitatifs . INRA, Productions Ani males, numéro hors série « Généti que moléculaire : pri ncipes et a ppl i cati on aux populations animales »,211-215.

Li, L., Guo, X. (2004). AFLP-based genetic 1 inkage ma ps ofthe pacific oyster Crassostrea gigos (Thunberg, 1793). Marine Biotechnology, G{l): 26-36 .

Li, G., Hubert, 5., Bucklin, K., Ribes, V., Hedgecock, D. (2003) . Characterization of 79 mi crosatellite DNA ma rkers in the Pa cific oyster Crassostrea gigas. Molecular Ecology Notes, 3, 228-232 .

Li, R., Li, Q., Cornette, F., Dégremont, L., La pègue, 5. (2010). Development offour E5T-55R mlultiplex PCRs in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and their validation in parentage assignement. Aquaculture, 310, 234-239.

Li, H., Liu, X., Zhang, G. (2012). A consensus microsatellite-based linkage map for the herma phroditic Bay5callop (Argopecten irradians) and its application in size-related QTLanalysis. PLo5 ONE, 7 (10): e46926. dOi:1O.1371/journal.pone.0046926.

177

Li povsky, V., Chew, K. (1972) . Mortality of Pa cific oysters (Crassostrea gigas) : the i nfl uence oftemperatureand enrichedseawater on oyster survival . Proceedings of National Shellfisheries Association, 62, 72-82.

- M-

Ma nn, R. (1979). Some bi ochemical and physiological aspects of growth a nd ga metogenesis in Crassastrea gigas and Ostrea edulis grown at s usta i ned el evated temperature. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 59, 95-110.

Massault, C. (2010) . Use of genomic information i n mass spawni ng fis h. Thèse de Doctorat, GraduateSchool of Wageningen InstituteofAnimal Science. 172 pp .

Maurer, D., Comps, M., Hi s, E. (1986) . Caractéristiques des mortalités estivales de l'huître Crassostrea gigas dans le ba ssin d'Arcachon . Haliotis, 15, 309 -317.

McGoldrick, D. J., Hedgecock, D., English, L., Baoprasertkul, P., Ward, R.D. (2000). The tra nsmission of microsatellite a lIeles in Australian a nd North Ameri ca n stocks of the Pacific oyster (Crassostrea gigas): selection and null alleles. Journal of Shellfish Research, 19,779-788.

Moen, T., Bara nski, M., Sonesson, A. K., Kj (Ilgi um, S. (2009) . Confirmati on a nd fi ne-mappi ng of a maj or QTL for resistance to i nfecti ous pancreati c necrosi s in Atl a nti c sa 1 mon (Sa/ma sa/ar) : population-Ievel associations between markers and trait. BMC Genomics , 10, 368.

Mori K. (1979) . Effects of a rtificial eutrophication on the meta bolism of the Japa nese oyster Crassostrea gigas. Marine Biology, 53 , 361-369.

- N -

Normand,J. (2009). Déterminismes génétiques de l 'allocation à la reproduction chez les huîtres creuses (Crassostrea gigas) triploïdes . Thèse de Doctorat, Université de La Rochelle, 226pp.

Normand, J., Ernande, B., Haure, J., McCombie, H., Boudry, P. (2009). Reproductive effort and growth in Crassostrea gigas: comparison of young di pl oi d a nd tri ploi d oysters issued from natural crosses or chemical induction. Aquatic Biology, 7, 229-241.

- p -

Petersen,J . L., Ba erwa Id, M. R., 1 ba rra, A. M., May, B. (2012) . A fi rst-generation 1 i nkage ma p ofthe Pacific lion-paw scallop (Nodipecten subnodosus): i niti a 1 evi dence of QTL for si zetraits a nd ma rkers 1 inked to orange shell col or. Aquaculture, 350-353, 200-209 .

178

Plough, L.V., Hedgecock, D. (2011). Quantitative Trait Locus Analysis of Stage-Specifi c 1 nbreeding Depression in the PacificOyster Crassostrea gigas . Geneti cs, 189, 1473-1486.

PI ough, L.V., Hedgecock, D. (2012). High genotype-dependent mortality at metamorphosis in the Pacific oyster . Integrative and comparative biology, 52 (1), 139 .

Pouvrea u, S., Bourles, V., Lefebvre, S., Ga ngnery, A., AI unno-Bruscia, M. (2006). Appl i cati on of a dyna mic energy budget model to the Pacifi c oyster, Crassostrea gigas, rea red under various environmenta 1 conditions . Journal of Sea Research. 56, 156-167.

Pouvrea u, S., Ra mbea u, M ., Cochard, J.c., Robert, R., (2006).1 nvestigation of ma rine biva Ive morphol ogy by in vivo MR i maging: first a natomical results of a promising techni que. Aquaculture, 259 (1-4),415-423.

- R-

Reece, K. S., Ribeiro, W . L., Gaffney, P. M ., Carnegie, R. B., Allen, S. K. Jr. (2004). Mi crosatellite ma rkerdevelopment a nd a nalys is in the eastern oyster (Crassostrea virginica): confirmation of nulla lIeles and non-Mendelian segregation ratios. Journal of Hereditv. 95(4), 346-352.

Roni n, V. I., A. B. Korol etJ.1. Weller(1998). Sel ective genotyping to detect qua ntitative tra it

loci affecting multi pl e traits: i nterva 1 ma ppi ng analysis . Theoreti ca 1 and Appl i ed Genetics. 97 (7), 1169-1178.

-s -

Sa ma i n, J.-F., Dégremont, L., Sol etchnik, P., Ha ure,J., Bédi er, E., Ropert, M., Moa l, J., Huvet, A., Ba cca , H., Va nWormhoudt, A., Del aporte, M., Costil, K., Pouvrea u, S., Lambert, c., Boulo, V., Soudant, P., Nicolas, J.L., Le Roux, F., Renault, T., Gagnaire, B., Géret, F., Boutet, 1., Burgeot, T., Boudry, P. (2007). Genetically based resistance to summer

mortality in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and its relationship with phys i ological, i mmunological characteristics and infection process. Aquaculture. 268, 227-243 .

Santerre, c., Pascal Sourdaine, P., Ma rc, N., Mi ngant, c., Robert, R., Ma rti nez, A. -S. (2013) . Oyster sex determination is i nfluenced by temperature - Fi rst cl ues in spat duri ng

first gonadic differentiation and gametogenesis. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A 165, 61-69 .

Sa uvage, c., Bi erne, N., La pègue, S., Boudry, P. (2007). Si ngle nucleotide polymorphisms and thei r rel ationship to codon usage bias i nthe Pacific oyster Crassostrea gigas. Gene. 406,13-22.

179

Sauvage, C. (2008). Développement de marqueurs moléculaires liés à la résistance à la mortalité estivale chez l 'huître creuse Crassostrea gigas - approche QTL. Thèse de Doctorat, Université de La Rochelle. 272pp.

Sauvage,C.,Boudry,P.,de Koning, D.J., Haley, C.S., Heurtebise, S., Lapègue, S. (2010). QTL for resi stanceto s ummer mortality and OsHV-ll oad in the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Animal Genetics, 41, 390-399.

Segarra , A., Pépin, J.F., Arzul, 1., Morga, B., Faury, N., Renault, T. (2010). Detection and description ofa particular Ostreid herpesvirus 1 genotype associated with massive morta 1 ity outbreaks of Pacifi c oysters , Crassostrea gigas, inFra nce in 2008 . Vi rus Research,153,92-99.

Soletchnik, P., Razet, D., Geairon, P., Faury, N., Goulletquer, P. (1997). Ecophysiology of maturationandspawningin oyster Crassostrea gigas: metabolic (respiration) and feedi ng (clearance and a bsorption rates) responses at different maturati on stages. Aquatic Living Resources, 10, 177-185.

Soletchnik, P., Le Moine, O., Faury, N., Ra zet, D., Geairon, P., Goulletquer, P. (1999) . Morta 1 ité de l'hurÎtre Crassostrea gigas dans le bassin de Ma rennes-Ol éron. Etude de la variabilité spatiale, de son environnement et de sa biologie par un système d'information géographique (SIG) . Aquatic Living Resources, 12, 131-43.

Steele, S., Mulca hy, M.F. (1999). Gametogenesis ofthe oyster Crassostrea gigas in southern 1 rel and. Journal of Marine Bi ological Association ofthe United Ki ngdom, 79, 673-686.

Sweeney, T., Hanrahan, J.P. (2008). The evidence of associations between prion protein genotype and production, reproduction, and health traits in sheep. Veterinary Research, 39 (4): 28.

- T-

Ta keuchi, T., Ta kemoto, y., Mats ubara, T. (1960) . Ha ematologicalstudy of baeteria 1 affected oysters. Rep . Hi roshima Prefeet. Fish. Exp. Stn. 22(1), 1-7. TransI. U.S. Joi nt Publ. Res . Serv. For TransI. Program. Bur. Comm. Fish, Milford, Connecticut (1965) .

Taris, N., Ba ron, S., Sharbel, T.F., Sa uvage, c., Boudry, P. (2005) . A combi ned microsatell ite multiplexing and boiling DNA extraction method for high throughput parentage ana lyses inthe Pacifie Oyster (Crassostrea gigas) . Aquaculture Research, 36 (5), 516-518.

-V-

Van der Veer, H. W., Cardoso, J.F.M.F., Van der Meer, J. (2006). The estimation of DEB para meters forva rious NortheastAtl antic bivalve species. Journal of Sea Resea rch, 56,107-124.

180

Verrier, E. R., Dorson, M., Mauger, S., Torhy, c., Ciobotaru, c., Hervet, c., Dechamp, N., Genet, c., Boudinot, P., Quillet, E. (2013). Resistanceto a Rhabdovirus (VHSV) in RainbowTrout: identification of a major QTL related to innate mechanisms. PLoS ONE, 8(2), e55302. doi :10.1371/journa I.pone.0055302.

-Y -

Ya mti ch, J., Voigt, M.L., Li, G., Hedgecock, D. (2005). Eight mi crosatell ite loci for the Pacifi c oyster Crassostrea gigas. Animal Genetics, 36, 524-526.

Yu, Z., Guo, X. (2006). Identification and ma pping of disease res ista nce QTLs in the Eastern oyster, Crassostrea virginica Gmelin. Aquaculture, 254, 160-170.

Yusa, Y. (2007) Causes of variation in sex ratio and modes of sex determination in the Mollusca-an overview. American Malacological Bulletin, 23, 89-98.

- Z-

Zhan, A., Hu, J., Hu, X., Hui, M., Wang, M., Peng, W., Huang, X., Wang, S., Lu, W., Sun, c., Bao, Z.(2009). Construction of microsatellite-based linkage ma ps a nd identification of sizerel ated quantitative trait loci forZhi kong scallop (Chlomys jarreri). Ani ma 1 Geneti cs , 40,821-831.

Zhang, G., Fa ng, X., Guo, X., Li, L., Luo, R., Xu, F., Yang, P., Zha ng, L., Wa ng, X., Qi, H., Xi ong, Z., Que, H., Xie, Y., Holland, P. W. H., Paps,J.,Zhu, Y., Wu, F., Chen, Y., Wang, J., Peng, c., Meng, J., Ya ng, L., Li u, J., Wen, B., Zha ng, N., Hua ng, Z., Zhu, Q., Feng, Y., Mount, A., Hedgecock, D., Xu, Z., Liu, Y., Domazet-Los, T., Du, Y., Sun, X., Zhang, S., Liu, B., Cheng, P., Jiang, X., Li, J., Fan, D., Wang, W., Fu, W., Wang, T., Wang, B., Zhang, J., Peng, Z., Li, Y., Li, N., Wang, J., Chen, M., He, Y., Tan, F., Song, X., Zheng, Q., Huang, R.,Yang, H., Du, X., Chen, L., Yang, M., Gaffney, P. M., Wang, S., Luo, L., She, Z., Mi ng, Y., Huang, W., Zhang, S., Hua ng, B., Zha ng, Y, Qu, T., Ni, P., Mi ao, G., Wa ng, J., Wa ng, Q., Steinberg, C. E. W., Wang, H., Li, N., Qian, L., Zhang, G., Li, Y., Yang, H., Liu, X., Wa ng, J., Yi n, Y., Wa ng, J. (2012). The oyster genome revea Is stress ada ptati on and complexity of shell formation. Nature, 490 (7418), 49-54.

181

ANNEXE 1 : EXTRACTION D'ADN AVEC LE KIT QIAAMP DNA MINI KIT

DE QIAGEN

La vei Il e de l'extraction, 180~Ldeta mpon de lyse des tissus (ATL) et 20 ~Lde sol ution

de protéinase K ont été ajoutés dans les tubes contenant les échantillons. Ceux-ci ont

ensuite été placés dans un bain-marie (Julabo EcoTemp 1W12) à 56·C pour 1 a nuit.

Le 1 endemai n matin, 200~Ldetampon de lyse (AL) ont été aj outés afin d'ass urer les

mei Il eures conditions pour la fixation de l'ADN s ur la membrane de silice. Puis, les tubes ont

été incubés surune plate-forme chauffante (EppendorfThermoStat Plus) à 70·C penda nt 10

minutes. Ensuite, 200~Ld'éthanol absolu ont été introduits dans les tubes. Ceux-ci ont

ensuite été passés sur un vortex pendant 10 secondes chacun puis dans une micro

centrifugeuse (SD Domi nique Dutscher, 220vac, 6000 rpm) pendant 10secondes éga lement

Le contenu des tubes a ensuite été transféré dans les tubes-colonnes (contenant la

membrane de si lice) du kit à l 'a ide d'une pipette Pl000. Ces tubes sont passés à la

centrifugeuse (Eppendorf 5417R) pourun run d'l mi nute à 6000g à température a mbia nte.

La colonne est a lors tra nsférée s ur un autretubeta ndis que 1 e premier estj eté. Puis,

500~Lde tampon de nettoyage 1 (AW1) sont introduits dans 1 a colonne ava nt une nouvelle

centrifugation (1 minute, 6000g, température ambiante). L'opération est répétée avec le

tampon de nettoyage 2 (AW2) et une centrifugation à 15000g pendant 1 minute.

Enfi n, on ajoute 100~Lde ta mpon d'élution (AE) et on centrifuge une dernière fois (2

mi nutes, 6000g, température ambiante) après une i ncubati on de 5 mi nutes à température

ambiante. L'ADN est alors stocké à -20 ·C jusqu'à son dosage.

183

ANNEXE 2: PROTOCOlE D'AMPLIFICATION DE L'ADN PAR PCR EN

SIMPLEXE

L'a mpl ifi cati on d'un fragment d'ADN requiert qu'un écha nti lion de 5 ilL d'ADN à

20ng/IlLsoit accompagné d'un mi x de PCR dont la composition est détaillée da ns le tablea u

suivant:

Réactif Volume par échantillon (Ill) Buffer 10X 1 dNTP (2mM) 1 MgCI , 0,6 Amorces (12,5mM) 0,75 de cha que amorce DiamondTaq {5U/~ 0,1 Eau bi-distillée 2

Les écha nti lions ainsi préparés sont regroupés sur des plaques de 96 puits et placés

dans un thermocycleurpour la réaction. Le programme du thermocycleurest déta illé dans le

tableau ci -dessous:

Etape du cycle Nombre de cycles Température Durée du cycle Dénaturation initiale 1 96 oC 5 min Dénaturation 96 oC 30 s

Hybri dati on 30 TL' 45 s

Elongation 72 oC 30 s Elongation finale 1 72 oC 30 min

'La température de ligation {Td est spécifique des amorces utilisées (voir Partie 1.2).

184

ANNEXE 3: PROTOCOLE D'AMPLIFICATION DE L'ADN PAR PCR EN

MULTIPLEXE

Pour amplifier3 fragments microsatellites distincts au cours d'une seule réaction de

PCR, il est nécessaire d'utiliserun kit pour PCR en multiplexe (Qiagen Type-it Mi crosatellites

PCR kit). La préparati on du mix de PCR est d étai Il ée da ns 1 e tableau suiva nt :

Réactif Volume par échantillon(lJl.) Mastermix 5 Solution Q 1 Mi x d'amorces 1 H20 sigma 2 ADN 1

Les échanti llons ainsi préparés sont regroupés sur des plaques de 96 puits et placés

da ns un thermocycleur pour la réaction. Le programme du thermocycleurest déta illé dans le

tableau ci-dessous:

Etape du cycle Nombre de cycles Température Durée du cycle Dénaturation initiale 1 95 oC 15 min Dénaturation 94 oC 30 s

Hybridation 30 Tl' 1 min 30

Elongation 72 oC 1 min 30 Elongation finale 1 60 oC 10 min

' La température de ligation (Tl) est spécifique à chaque multiplexe (voir Partie 1.2).

185

ANNEXE 4: PROTOCOLE DE DOSAGE DE L'ADN PAR MESURE DE LA

FLUORESCENCE

le Pi coGreen® étant photosensible, il est nécessaire de trava iller le pl us poss i bl e à l'abri de la lumi ère.

1. Préparer le mélange réactionnel

Mettre 1 e kit Qua nt-iT dsDNA BR Assay (Invitrogen) à temperature ambiante penda nt quelques minutes.

Di 1 uer le réactif Quant-iT ds DNA BR (200X) à 1Xà l'aide du ta mpon. Pour une plaque 96 puits, di 1 uer 100lll de Qua nt-iT ds DNA BR (200X) da ns 19,9 ml de ta mpon.

Da ns les colonnes 1 à 11 d'une plaque 96 puits, déposer 2 IlLd' ADN à doser par puits. Prévoir un témoin négatif (H,O milliQ). Ajouter 8 Illd'eau milliQ.

Da ns 1 a colonne 12, déposer 10Illd'ADN dont 1 es concentrations sontstanda rdi sées (gamme-étalon) à 0,5,10,20,40,60,80 et 100 ng/llL.

Dans chaque puits, distribuer 190 Illde Qua nt-iT dsDNA BR (lX) et homogénéiser 1 e contenu des puits par aspiration/refoulement.

Fi 1 mer la plaque avecde l 'a 1 umi ni um ad hés if. La i sser incuber pend a nt 3 mi nutes.

2. Mesurer de la fluorescence

Paramétrer l'ABI 7900 pour la lecture:

• Assay: Allelic Discrimation

• Importer la feuille de route au format .txt

• Add marker : picogreen (excitation à 510 nm, émission à 527 nm)

• Passive reference : none

Après 1 e ru n, exporter 1 es données a u format .txt.

3. Déterminer la concentration des échantillons

Copi er les données du fichierde données sous l'onglet << Source» du fi chier de calculs

fourni par la plateforme.

Soustraire la valeur de fluorescence obtenue pour le témoin H,O aux valeurs obtenues pour 1 es écha nti lions d'ADN.

Renseigner la pente de la courbe-étalon (le coefficient de corrélation doit être supérieur à 0,995).

les concentrations en ADN des échantillonsapparaissentsous l 'onglet<< Résultats» du fichier de calculs.

186

ANNEXES 5: LISTE DES 384 SNPs GENOTYPES POUR LES ARTICLES 1 ET 5

locus Séquence flanquante 1 SNP Séquence flan quante 2 Score

EST36-8bis AAACGCTCCATGAGCAGGGAGGTGAATCCGGATCCGGTGCCACCACCGAAGCTG TIC GGAAGATGAGGAATCCCTGGAGACCGGTACACTGGTCAGCGAGCTTCCTGAT 0,78

EST36-12 AGTATTTGATCGGACAAAAATAAAC TGTATTTGGTTTAACCTGTATTTTGTAGTCG T/G G GTTAGTACAGCCTCTGGTATCCTAG TG CTTGTCG TCTGCGT AA TT ATCTACAA 0,838

HEST36-22bis TGCCTCAGATGCTGGAAGTGAAGCAGGAG ATG AACCAG AA TGTGA TCA TTTTAA TIC TTTGGCCCCATTTTAAAACAACTGCCAAATATIGAAGAACTTCATYTAACATAT 0,97

HEST36-28 ATTGATGACGACAKTAACGTGGGGATCAACCTTAAGAAACTITTATTGCTTACTCG C/G TTTGTTTAAACAAGAACAATAAGGATATITTTCTYACACTCAGGAAAAATTTGT 0,758

EST36-29-1 TCCCAGAAAAATGGACGCCCGAAGTCAAACACTTCTGTCCAAATGTCCCCATTATT TIC TGGTTGGCAACAAGAAAGATACCAGAAACGACCCCAACACACAAAAAGAGCT 0,918

EST36-29-2 TCTGTCCAAA TGTCCCCATT A TTC TGGTTGGCAAC AAGAAAG ATACC AGAAACGA TIC CCCAACACACAAAAAGAGCTCAAAAAAAGCAAACAGGAACCAGTCAAATCGC 0,975

EST36-31-1 CTCAATGCTGCCAACATCCCCAACGACC AGA TGGCTCTGACTCC ACCCT ATG ACAA TIC GAGCATACACATGTGAACGACGTGGA TGTICGTGG TCCAG ATGGGTTAACTCC 0,911

HEST36-31-2 ATGATGACATGCCAAAAGCAAGCATGCCAAGGTACCCATCCCTACAACCACAGCT TIC TGTTTATCTRTGTACCCATAGCTTTAACACTAATACATTTATTYTTTACTGTTTCT 0,698

EST36-35 RGAAACCTGGCAATATGGTTCC TTCTCAATGTTGCCTACACATTCCAGCATTCTCTC TIC CCCTCAGTCCGCCCACATTCCCAAGTCGACT ACA TCCA TTG TCT AGTG CC AGAC 0,909

EST36-36-1 ACTGTCTACCTCATGTAAAGAACAAAAAACCCAAAATC TCCGAGAACCTTACG AA T A/G TCATAATACTTAAATCACATTAAAATAACTATAAAATTTTAAAAGAATTGGTGA 0,66

EST34-6 GTAAACAAATATAA TC TA TRTCTGCA TTTTG ATTAC TTTTG AT AT AT AAGG TAAATG A/C TTCAATGCCTATAGAGCAAATATACAGTATTATAGTGCTTTTTATAATICGTTTT 0,562

HEST34-8 GCATACGGAACAATTTACATGTATGCATGTTTCTTGTCACTTTTAACTCTTACCTTG TIC TCTAAAAGATTTGTTATTACTGGTAATCAATGTTAGAATAACATTTAAAACTGG 0,628

EST34-14 TCAATACATCAAATGCACAGCAGCCTGTCTTGCAATACTGTGTCAACACTICAGGG A/G GTAATACAGGTCAAGTTAGAATCCAAAATGCTGCTCAACAAAATCAGCAAGGT 0,956

HEST34-17 CATGATGATGCCCACCAATAACAATGCCAATATGCTGAACAATTTGATACCAGT TIC AATTTGGGCAACAGAAACAATG TAGCCAGG AA TGCCAA TA TGA TGAACGCCG 0,937

EST34-19-1 TGATGGCYGAAGCTGAAGGGTCAGTCAACTCGGCTTCAAGAATGCGTCGTATTTC A/G GTATACATTGTCTYATCTTTTTCAGCGGTCATGGCAGTCTCTIGCTCTTTTAAGA 0,569

EST3 4-19-2 TGATGGCYGAAGCTGAAGGGTCAGTCAACTCGGCTTCAAG AA TGCGTCGTATTTC A/G GTATACATTGTCTYATCTTTTTCAGCGGTCATGGCAGTCTCTIGCTCTTTTAAGA 0,569

EST34-19bis TAATTCATCAACAGTCCAGCCTTTTCTIACTGCTTTCATCATGGACATTCTCATATT TIC AG CATGAATTTAGCCATC TCTG AAATTCAGCAAAAATG AAATICAATGTTTCAA 0,938

EST34-20bis-1 GCGGGTTTAGGGATGGCGACCGTCGCCCTAGCGACCGTGA TGACCA TT ACT ACCC T/G GATGATGACAAAAACTACGAGCCATACCAGAAACGAGGYTACGACCGAACAC 0,935

E5T34-21 TTGAGTTTATCACCCAGCTCC TCCAG ATGCTGCTGCCAG ACRTCG TCTGACTC A/G CTGTCCGTCTCACTCTCACG RCTGCTG TTG TTCCTT AAAT AAAAAAA YA TTTCCT 0,406

EST34-23 CTATGATGATAYTCTCGGCCAGGGTGTAGGGCTCCCCCGAACCCTGGTGGGGGTC A/C ACCG GTTCCTCCGTGGTGCTGCTTTCGTTCAAGTCCG TGACA TTGTTAAG C ACT 0,523

EST34-25 CCGG CGTAACTTCTCCTATGATCG AA TA TAA TCGGGTC AAATCCGGAAAGAG TTA A/G TTATTCAGAAAGGTT AGAC TTGC TTTCT AGGCGCCCCACCT AAAAA TCTTTT ACT 0,992

HEST34-26bis GWAMAATAGTGTGTTTACCTGGA TGAG ACCCAT ACCA TGTCCTGTIGCAG AGA T A/G GTTACTTGG GATGGGATGGTYGGAAGCTTAGGTRT AAACAA TTG AGAGCA TG 0,794

EST34-30 TCTATGCTCAGTACAGATCC A TTGAACCGTA TCTGAAG AAAAAG G ATGGCAG TGA A/C AAGAACATTGGAGACAAGCAGTACCTACAAACCACAGGGGACAGGGCTAAAC 0,967

ESTl04-33 CCTTTGCCTTTCCAACAA TCTTTCTCT ATG AAAAAG TTG AAG TTG TTC ACCCTG TGA A/G AAACATCACTGGCCATAGATGTGGACCTGTTCCTAATACAGAAAAATTTGGAG 0,902

ESTl04-36 ATCTACTGGCAA TGGAACATTCC TCWA TGTTA TCGACTA TCAGAAT AGTGCC TTC TIC TCAGATTG TTTCAGACAGCATGAACCGACTT ACTCG TTTTTTGTGA TC TACAG A 0,946

EST104-40 TAAACACAATATAA TTTTAATCTAA TTGT ACAACTIA TA TTTT AT AAAG G G ACAC TT A/C TTATCCAAATTCACT AAACCACCATTCA TGTGACTCATAATTG TG AA TTCCGG A 0,794

E5T104-41 TGTTCTTTATTTTCTGTCAATTA TG GACR TGAC WGTA TGT AACATIA TA T TIC AGACATCAAAATAATG TGAATTTG AAAG ATG ATATTCTG ACAAA TA TTTT 0,454

ESTl04-43 AGGAGAAGGGATGAAATGCAGAGAGCACAGGAGGAGTATGATGCCTATGTTGC TIC GAGCATTTCCGTCGCG GAGCCATGAAA TCTCTCAC AGCCGACGAGAG AG CTG C 0,802

ESTl04-48-1 AAATTCGGGTGGGGGGTCTGTACATTTTGT ATGG RAT AT ACTGC ACTCAGCCG AC TIC GTGAAACGTAGAAAGATCCGCGTGAC ACAAGAT ATCTGGAACAAGAT ATTGG 0,83

EST104-48-2 TGTTTACCCCCACACAATTTCCAAA TTCG G G TGGGGGGTCTG TACATTTTGT ATG G A/G ATATACTGCACTCAGCCGACYGTGAAACGTAGAAAGATCCGCGTGACACAAGA 0,837

187

locus Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

EST104-49 TAGAWTGGAGTTAAAWTTTGAAATATTTTAGGTCTTTTGGGAAAATCACAA TIC CCCACTCAAGGGATGCGTCAAGGGAATGAYACWGGRACTCAGTACAGATCTG 0,885

EST54-9 TCGACCAACAAAGACTTGTGTTACCGG AAA TACG TAAGACACGTGAC ACA TACG T Aff ATCATGACATCACTGTTG TGTTTTCGA TTGG ATTA TTTACTT ACAARA TACTGTC 0,89

E5T54-40 GACTCTACTAGATAATCAGAAAATGTATGGGTAGAAAGATACAGATGAAGTAATT TIC TGTGTTCA TCTTGGTGTAAA TGA TTTGTG TTTGTTTG GTAATTGT AGT A TCTCCA 0,841

snp ABl22064_1S11 GGGGTGTGCCCCAGATTGAGGTCACATTTGACA TTGATGCC AACGG TA TCCTGAA TIC GTGTCAGCTGTCGACAAGAGCACAGGAAAGGAGAACAAAATCACCATTACCA 0,848

snp AF288678 1218 TCCCTCATCCTAGACATGGCAACTCTAACAGGTGCAATAGATGTTGCTCTCGGGG A/C AGGTGCTGCTGGTGTnTCACAAACTCAGAAAACATGTGGAACAAACTGCAAA 0,855

snp W777877 174 AGACTGGGCGGAA TCAATGAAGATGG GA TCA TTTTT ATC AGT AGCTAG AGGA TC A/G GTAGAACCTCCTGTATTCTTGGAAA TTGAG TA TAAAGGGAG ACAATCGGACAG 0,822

snp AM860298 150 CTAAACTGGTAGGAAATA TG G CTTTG ATGCCTTTAAGAACC ACTTACAAAGGTCC TIC GCTCCAAGAGATGCATCAGATTTTG AT ATTA TTG ACGAGGCT ATTTA TT ACTTC 0,958

snp AM863107 115 CTCTTGCTGCTTTCTTAAAAAAGC AAGGCAAAATG AAGA TTCC AGACTG G G CTCC TIC ATTGTGAAGCTTGCCAAATACAATGAGCTTGCTCCATATGATGATGACTGGTA 0,908

snp FP007860 242 CCGTCTTGGCCCAGCTATACACCAAGCTG AAGGAAAACAACCAAAGCATAGAAA T C/G ATCTTCGTCAG CTCG GACCG CGACGAAAACAGCTTCAAG GAG TAC TTC AATG A 0,601

snp CU987112 458 ACTCGGTGACTTTACTCAGGCAACTTCTCAGGAAACAGACTCTTATTCAGGAAGC TIC GTCCA TCG CCTACAGACGAG GACATCGCACAGCG ATG AGTTCCAGTTTGA TTA 0,972

snp AM861626_196 CTGCAGCAGAGCCAGAAACCTCTGAAAAAGCAGATGATGATTTTTCACTGGACTT TIC GGTATCAAAAAGAAAAAG AAG AAAAAG AAAGCATTTG ATATG AA TGAA TTGG 0,907

snp AM853936 146 TGTTTCTAGCGTTACAGAGCTTG AAA TGGGGCGGTCGCTA TCACCTCAGGCAAAA A/G GTCAACACAGGAATGGTGGCTCTCTGGGCCTTCAGGTTGGGATTGTTTCTGTT 0,763

snp AM855000_378 CAGCAGAAAATA TTCCAAG TGGTTCTCAAG G TCAA TTTAATCAAAGTCCTACCGCA TIC ATAATCAAAGTCCCTCTATGCAAAGAGGAAATACTTGGCCTAGTTCAAGAAAT 0,932

snp AM855000 65 TCATCTTCGATATATCTTTG ATCAT ACGTGACAGTG ATGGACAGCCGCAACAGAAT A/G CTATGGGTGGGGAA TTTATCAG AAAGAAC AAAAGAAGAAA TAC TGTACG AGT 0,887

snp AM8SS791 406 ATCAGAGGAAGTCAAGTACTGTATCTACATGCTGGAAAAATACGGAGAAGATTA TIC AAGGCCATGGCAAGAGATAAAAG AAATCATTTCCAGG ACACTCCAAAACAGA 0,968

snp AM854243 93 CCAGTTATTATCGAGGTGCGCACGCAGCTTTATTGTGTTACAGCGTAAAAAACAA A/G GACACTTTCACCATCCTGTCCCAG TACAT ATTAGAC ATTGTC ATG AACGCTGAA 0,988

snp AM854280 231 GTCAATGATGACATATCCCCG GT ACTG AA TGCCA TCACTGGCGGAGA TTTCACCCT A/C TCGGACCTCATCAGGATCATCGCTGTCG TCA TCA TTG TCA TCGGGGTG TTCTCA 0,783

snp AM854452 255 TTCACACTAGAAATGTTTTGT AT AACGAC AGTG TT ACGTC AGACTCAAAAG TGAA TIC TCTGAAAAAGAAGATGCTAAAAAAAAACCCAAATGGAAGAAGTATGGGGAAT 0,895

snp AM867131 348 TTATATATGTT AT AGAT AGTGC TGA TCAAAAG AGA TTTGAAG AAACTGGCCTAGA A/G TTATCAGAGCTATTGGAGGAGCCAAAGTTACAGGGAGTTCCTCTGTTAATTTAT 0,954

snp AM858433 293 ATCCAGCAGGATTTGCCTITG TAGAATATG AAG ACCCAAG AGA TGCTGA TGA TGC Aff GTTCGGGGCATGGATGGAACTACAA TTTGTGG TTCAAGAG TCAGAG TAG AAC 0,825

snp_AM855470 207 ACCTCAAGAATGTGATG GCAAAGAAAGAAGTGGTTCCCTTCCG TAGA TTTAG TG G A/C GGAGTGGGACGATGTG CACAGGCTAAAGCCTTT AAGCA TTCCCAAG G TCGCT 0,957

snp AM868828 23 TTATAA TGTCCTTTTTTCTGTTAAT AAC TTTTTTTCCCG TTTA TTTGTTAAAC AAG TT AIT AACAAACGTCAAATGTTAAATCATTTATAACAGTTGTTGTCATCATATAATTTAT 0,775

snp_CU994765 354 CGCCAGAAATAGGCCATCTGTAGAAG AACTTG AAGA TTTTTTGCTGCGGAATCAA A/G ATTGGATCCTACCTAAGCTGTTTAATGGAGCATCGGCCGAGATCGTrGCGCAT 0,975

snp AM864433 399 AAGGATATTTCTGCCTGAACTATCATTAAAACCTCTCACTTTTGTCATGTAAAGCCT A/G GTGCTGATGAATAAGTTTAATCTGCTCTCAAAGTGCTTATG ACAAATTG TTTTTT 0,909

snp AM856186 569 GATCAACCGGAAGTGGAAGCTAAGTG G ATC TAC TTTCCTG ACAAAAACTTTTTA TC TIC TGGTCCTACG CCTTGGTGGCG GTTTCCGGATTTCTG TCCCTG TTTGGTTCT ATG 0,949

snp AM857211 491 TCAAATACTTGTTTCA TTGGGA TGCTTTTAATTTGTTTCTT AAAAGTG TA TGTACA T T/G ATTGTATTTTTGATACCCCAACAAGTTGTAATATCAGGGAAATAAAGTTTGTAT 0,784

snp AM857480 265 CAAAAATGGACGGATCGGGACAAAACTTTGCATCATTTGGGAGCGGTCTTACCCC TIC CAGCATCAACAAAGTCCCATGATGTCACCAGCAGCTCTTAGCAGTTTTTCTTTG 0,844

snp AM857595 643 ACGCGGTCGGCGTCACGTGTTCAATCTGAGCTGCAAGCAGCCACAACCCGCTGAC A/C ACAGCATTGTTTGTTC TGATGG AAGAGCGG AG AT ATCGGG AA TCGAACCGCTT 0,852

snp AM857913 323 ATATGGAAG G G G CTAAACAAAG C AGCCA TAG CA TTGG TTTAG AGGGAGGAAAAA A/G TAACAGCACACCGATTAGTGATAGCCAATCACAGCCCTGTTCTTCCAAACAATT 0,944

snp_AM857972 567 GCTTCGACAACAAGGAGAAACTTATTG TTGAATATGTAGAGGATGAATACCAACC TIC CCGGATCTG GAATCTG CCTG GAGAAAGAACT ACA TCA TGGGAA TTG TGGT AG 0,951

snp_AM859467 449 AGAGGTGTACCAAGCAACTAAAG ACAAACAAGTTT ACAAA TGGGACAG AAACTC A/G GACCTGAAGAATGAACAACAGCAAGTCAGAACAGGCAGACAGACTTGCAGAA 0,963

snp AM859907 463 AGAAAAACTACCCCGATTTACCAATATTTCTGTTTGGACATTCAATAGGCGGCGCT A/G CAGCTTTATTAGCAGCTCTAGAAAAACCAGAATATTTCAAAGGCGTCATCATTT 0,976

snp_AM859785_261 TAGAGACAGCCCAG CTGAAATTGC TGACA TTCAGTG TAACA TACG GAAAG AAGA A/G CAGGTTCAGAGACTAATTTCTGACACAATTAAGAAG TTTGGAAAAA TTGA TTTC 0,877

188

locus Séquence f1anquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

'np CU989483 785 GAAGAAGTTGCTGAAAAAGTTGAATAAGCTTCAGTCAGGAAAGGAAG ATGGAA NG AGTAAGCAAGGACAAGAAAAAGAAGAAAAAGAAACACAGGAAAAAGTCCAG 0,965

,np_AM868440 329 TTAAGTTTAAGTCCAGAATCTAGAACTGTATTGCTCATCGCGTGGAAATTTAAAGC NC GCAACACAGTGTGAATTCACAAAAGAAG AA TTTGTC AA TGGAA TGACAGAA TT 0,96

,np_AM863641 406 AAGGTTACCCAGACTCAGAGAA TAC TTGGGAACCAGAAGCAAA TTTAGA TTGTCC A/C GACCTTATAGCAGAGTTTGAGGAGAAAAAGAAGAAAAAAGATCAAGAGAAG 0,917

'np AM866950 152 ATAAAGATCTTAAAGAAAAACT AGCAGAACTTGAAAACC AGA TACGAACTCG TAC NG AAGG CCACCA TTGCCACTCTGGAG G G CAAG GTCTCT AA TCTTGAGGAGC AGTT 0,966

snp_8N779181 638 TCTCTTTG G G GCTCTTCATGCAGG TGGTG AAGAC ATGG TAGA TAGGGG TCAAG AT NG TACTTGACAAA TCCACGA TCTCC AGCA TTG GCA TCCTTGGACC ATTTC TTG TCCT 0,927

'np EVV779181 749 TCTCCAGCTGGGAGCCACTTCCTCAT AA TCACC TTCAGGAGCTG TTTCTC TTCCAA TIC TCCTTATCCTCAGCTGTGAGTTTCAC TCCCATTTTTTCAGCCAGAGCAAG TGA TT 0,933

,np EVV779181 818 TCTCCATACGGTATCGCTGAG CAGTTACGGGGGA TG GAAGA TGGATG ACT ATC AT TIC TGCAACATGGCATCTCCAGCTGGGAGCCACTTCCTCATAATCACCTTCAGGAGC 0,964

'np AM854315 392 TTTGATGCTTCGTTTG TCCT AA TGGAAG ACAAATTTACAG TA TTTG TAAATG ATG A A/G CACCTCGTTGATTTCACACATCGTGGGAATCCTGACAACATTTCTGTTCTTGGT 0,781

,np_AM858313 325 CAGTCGGGAAAATTTTGCAA TTG ATTGT ATC ATCC ATGG AAGGCAAACCAG TGAG TIC CCTGAACAATTTAAAAAAATTAGCAGTGAAACTCTGACTGAGGATACTCTCACT 0,98

snp CU683469 37 TTCCTTGCTGATAATTA TGTACTG TTGAGG TTTGGTTGGT AT AA TTTCTTGCAGCA TIC GATTTTTGAAGGAAA TACTA TTC AACA TCTTTTG AGTCAC ATTTAGGAG AAGG 0,919

,np CU997393_573 GGACCCTTAGGGTTGTTTATTTTAATGTGCATTTCCACTTTTATCCATAAAGTGGAT NT TAGCATTTTTTTAAG TCTTTCATG ACCGATATGTGTCCCATTTTTGATCTCTATA 0,736

'np BQ426370 37 TAAGTGAGGTCTTCATA TT ATG GAACAG TCAGC TTTGT AAGAATTCAC AT AGCT AA C/G GTCTTCCACCACAGAAA TTGGCAG AA TCCCAAAGACTT ACACAGACAATTTGA 0,985

,np AM864952 331 CCTACTCGTTATGGTGACTGGGAAAGAAAGGGGCGTG TGACAG ACTTTTGAACA AIT TAATGCAATATTCAG AG CACA TT AA TAG C AGTG TCTTTC ATTTTTGGTG GA TCT 0,992

, np_AM862882 512 TCTATGCTCAGTACAGATCC ATTGAACCGTA TCTGAAG AAAAAGG ATGGCAG TGA NC AAGAACA TTGGAGACAAGCAGT ACCT ACAAACCAC AGGGGACAGGGCTAAAC 0,967

'np BQ426570 128 CTTATCAAAA TTAAGAATGAAA TGGACCCCACTCTAACTTTTCGACGA TCCTG TCG TIC GAGGGCATTTGTGGCTCTTGTTCAATGAATATTGGTGGAAGCAACACATTGGC 0,945

,np AM853758 293 TGAAGAGAATAGAAGGCGCTACAGAGATTTGCTGTTTTCAACTGACAAAAGCCTT T/G CAGAGAACATCAGTGGGGTCATCATGTTCCATGAAACATTTTATCAAAAAACC 0,943

'np BQ427044 327 ATGTCGCCGTGGCGAGGAGTGTTACCTAGA TAACGCCCGCAAAGCT AAATG TCG C/G TGTGTCGAGCAATGTACCCCAGAGCCCG ACCCCAG AT AT ATGG TGTGCAGC AA 0,757

, np_CU992694 436 TGTTTGAGAATGAATTT A TCAA TG CG AA TGA TA TGTTT ACAG AGAT ATGG AA TAC TIC GGTAGGTTACAGTGTGTTACTGAGGAG G AAA TTG AAC AAAATGG TG CT ATG A 0,791

'np CX068989 311 TG GTATGTTTTTAG CAG GCTACAAAC A TTTTTA TTTGTG TGAC AT ATC TTCC ATTAC AIT GTGTATGATGAACAACACACCAATTCCATGTATCTGTTCAATTAAGTCTCTTTTT 0,911

'np AM859871 333 TCCATCACAGCCCAGTCCACA TTCAA TGACCTCC AG GA TCT ACGGGAAC AGA TATT NG CGTGTCAAGGACACTGATGATGTGCCCATGATTCTGGTGGGAAACAAGAGTG 0,958

'np AY165040_178 CAGCCCAA TGTAAGACCCCCGGCTTACAGACTAG AA TCACTGACAGGGCCC TTG A A/G TATGCTACAGAAGTGGCTCTTGAT A TTTTG TCCAAACAAGTG ACGGGTCAGC A 0,932

,np CU682177 _248 CCAGGCGCCATAGGGGGAAATGCAAGTCTTTCCCTAAAGACGATAAATCAAAGCC A/C TGTCATTTAACGGCATTTTTGGGTTATAAAGCAGGAATGACCCATATTGTGAG 0,865

,np_AM863098_171 ACTCTTCAGTGTTCTGCTCAAGA TCCAC AAAAAC TTG CTGGAC AAGCTCC TG TCTC A/G AAGAAACCTATTTCAAAGCTGGTGCCATCAAAGGAACCTTTGTCTAAACATGT 0,983

'np CU683857 112 TCTCGTTCCGTTGTGGTGGTCAATTTACCAATGGAAAACCCATCGATTGAAAATGT A/G G CAGAAATGTTTTCCAAA TG TGGTGAAGTTTCGC TCA TAAGAA TTCTAAGACC 0,945

'np EU678313334 GTGAAGTTTCGCTCATAAGAATTCTAAG ACCGGGAAAGTCAGTGCCAC AAG ATG T NG AAGAAGCATGCCACTAAGCATCCTGAAATTGGTACAACAACCTGTGCTGTGGT 0,901

,np CU684921 209 GGACACGATTCTCCGCCCCCACACCTTGCCCATCATG TTCATG TCCTTTACCTTCCT C/G CTCGCGACCA TCGTCG CTGTGGGGTTA TTGAT AAACA TGGACT ACAAACCGG T 0,9

, np_CU988526 293 CCATATGCAGTACATGTGGAAATG ATGGAACAAGA TT AGATGCAGCT AACCTTCC T/G CAAGAAGTAAAAGATAAAATGCGGCTGATTCTGGAAGAAGAAGCCTCGCTGG 0,914

'np CU984479 305 TTTTCCGCCGCTTTCTTCAAAG TTC TTCCG ATTCTCGCACTG ATCGGA TTTG TGAGA NT TGAATGCGGGAGATGAAGACATAATTCAC AA TCCAAT ACCCAAG AGCGACTTT 0,844

,np CU994620 455 TTCGGTATG GAAAAAAA TGAG TGA TGCATTAAGAAAACTTT ATTT ATG TA TTTTTC NT TGGTCTGAAGGTAATCAAATATATGATGGAAGCGCATTGCTTTTTGATAAATA 0,596

'np FP001306 426 TGTTGA TTATACTCTCTTGTTCGTG AA TAACTA TG CA TACTT AAAG CCT ATCTGGCA AIT TTCGTGTCTTATGATTTCATTTTTTTTAGTTCGATTTTATATTTATCAATAAATAA 0,947

,np FP008781_161 ACGGTGTATATGGATTTG TGT AAA TCCGTC TTTCC TTGC AGAACTTTTGAA TT ACG TIC GCGCTTTGTTGTGATGTAATTTGTTGATGTTAAAAAAACGTCTGTTTATTAGCA 0,947

' np_ CU999925 301 AATTGAAACTATTG TGCCTTA TGAG TA TCACAAGTTTG ACTTTTGT ACTG TTGATG A/G A TCGGACTCCCCAGTGGAAAATCT AGGTC AGGTGGTG TTTGGTG AGAGGA TA 0,97

-,-nro.-C)(068955 187 GTTTAAATGGAAAT ATAA TTTCTC TCA TGA TTTTTA TGA TAATTAAA TA TAG CAATG T/G TAATTTGCTAAGAA TTTTATTTT ACA TTGAAAG AGATATCTCA TGATA TTG TGAT 0,412

189

Locus Séquence f1anquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

'np AM854801 566 mCCATCAGGACATTCAAA TTTTTA TCAC AAATGCAGCAGAC ATTA TCAGGACAT A/f TAATAGCTATGGCATGA TA TTTA TGTGAG AAC AAAAA TCGTG AGAAATTTA TC 0,937

'np CU684608 65 AAA AAA AATTCCAAAAAT ACTTA TGA TT ATG TGT AT AAGCACTGTG TAG G TGTGG TIC AAGGCAAAATTCGACAGCAA TCAACTAAAACTTGA TAAATAGGTTACTA TGTG 0,998

,np_CU685863 5 CAAAATTCGACAGCAATCAACTAAAAC TTGATAAATAGG TTACTATGTGCAGCAT A/G AAGTACTG GTAGTAGTAAACAAT ACCAAG G G GACCCG TGCCA TGAACAGTGC 0,67 ,np CU991735 307 AACATGGTGGACATTGAAGATCTGGGTGAGAAGGTCACCTATTGCAGGTGTTGG AlC GATCAAAGAAGTTCCCCCTGTGTG ATGG C AGCCACAACAAGCACAATG AGGA 0,895

snp AM868054 79 CCCCTGAACGAAAGAAACAGCTGGAGGA TTTTGG TCAG TA TGTTGGTCAG TGCCT AlG CCCAGGTATGTTCAGAAGGTGCGTCT AA TGTCTGGGGACGAG TTGGAG ATTCT 0,903 snp CU997918 398 GTGACGTTGTAGGGGTAGAAGAATTCATCAAACTTATCCAAAAAGCTGATCTTGA TIC CCAATCTATTmGCGAGCTCCTG AAAACA TGCCCTA TTAAGGA TGACGGAG AT 0,979

'np AM867415 381 GAAGATTATGCCCCTCCGAAATTTAACAAAGTGAAATCGGACTTTAATGCCTTCCC TIC GATCTTTCCAAAGCTGAGGGTAAGCTTCAG C AG CTG GT AG CAG AGATG CGGC 0,908

snp BN777711 499 ACTCACGAAGTCATCCAAACACTTCATTGCATTGAAGATTACATCATTCTCTAAAA TIC GAGAAAG CTACATATGTAAGTG CCAG TTTGAAAAA TACCG TTCCTA TCT ACTC T 0,793

'np FJ347728 1147 CTGACGCAGAGGGACGACTTATTCTGGCTGATGCTCTGTGTTATAGTGAACAGTT TIC AACCCTTCCCTCATCCTAGACA TGGCAACTC TAACAG GTGC AA TAGA TGTTGCT 0,745

,np FP008372 101 TGAACGAGATCTAGCAGACGACGCGCAATGGAAGG TAATTCAGAAAAATACC TT TIC ACCAGGTGGGCCAACGAGCACCTGAAAACTGCCAACAAGAATATTAATAACTT 0,929

'np FP090947_291 GTTTTGTGCAGTTACTTGTGAAGAAA TGTGA TTTTTTTTCTGG AGAAAGAC TTTA T TIC TAAGCACAAAGTGCCTGCCATATTAAATATCCAGGGAATTTCTCACATGTGACT 0,978

,np FP090949 87 TAGTTCACTCTTGAAAAA TAC AA TAAC AT ACACATGGAC ATG ATTTG AA TGAATTC TIC CCTTmCTTTGTTGTTCAAACAATAAATTATTGCGTTATTATGCACTTAATCAA 0,936

'np FP091149 98 G GAATGATATTATCCGGCATTA TA TGA TT AT AACCGGCATTGCA TCAAAAACAGA A/G AAACATCTCAAAATATCCACAATTAAACTCAAAATGCAAGCTTCAATTCATTTAT 0,979

,np CU995994 511 ATCAAGCACACTCTACTTAAATTACATGTAAAAGTAACAGGTTATCAAAATATTGT A/f AAAGTTCTTCTAAAG ACACAAA TGACAT AAAATGG AGGGCATTATA TATA TTTT 0,683

snp CU995994 561 TATTGTTAAAGTTCTTCTAAAG ACACAAA TGACAT AAAA TGGAGGGCA TTATATAT AlG TTTTATCTATATTG TATACTTTTTATATTCAGGATTTTGTTATAATAGAATTAAGT 0,484

'np AM858680 74 ATGmGAGACAGCCACCCTCCGGTCAGG ATTTGCTCTGCAAGACTCTGCTGGGTT TIC GCTGAGAGG GTAGAACACATGCTGAGAGAAGCCA TGAGCA TTCCTCAAGA TG 0,92

,np CB617405 591 GAATG GACATTGAAAGAGTC AACA TCGT ATTTAAC TA TGACATGCC AGAAG ACTC T/G GACACTTACTTGCACAGAGTGGCTCGTGCAGGTAGATTTGGAACAAAGGGTCT 0,964

,np_EVV778458_567 CTGAAGAAGAA TTGCCCCCACATTA TTG TTGG TAC ACCTG G TAGAA TTCT AGCCCT TIC TGCCATTCCAAAGTCCTCAACCTGAAGAATGTCAAGCAC TTTGTTCTTGATGAA 0,926

'np AF075691 1372 CTGAAGAAGAATTGCCCCCACATTATTGTTGGTACACCTGGTAGAATTCTAGCCCT TIC TG CCA TTCCAAAGTCCTCAACC TGAAG AA TGTC AAGCAC TTTG TTCTTG ATG AA 0,926

'np AF075697 181 AATACATGAACGATCAAATTTTTACTTCTCAAAATGGTGCG AGAAATG ACGCAAT A/f AAAATTGCCGTAGTGACCACAG ACGGAG AAACAAACCCAGGTGGCGCTG AT A 0,843

snp AF075697 97 ATAAAGACAAAACCGGCGTTCTCGGTGCAACAC AAAACA TCA TAC ACAC AAAAGG TIC GATGCTACTAGAACTTACAAGGCTTTGG AA TACATGAACGA TCAAA TTTTTACT 0,874

snp FP091137 183 CTTTGATACGCAG GTCCACTTTCTTTACGA TA TCTTGAGCCCC TTTGA TA TTTCTCC A/G ACAAAAACCCAGGTTGCGGCCGmCGTACAGTAACGTCATCAGACCACAGTT 0,886

'np AB122064 98 CAGCACAG CAAGCCATTG GAATAGA TCTTGGT ACCAC AT A TTCCTG TGTTGGAG T AIT TTCCAGCATGGGAAGGTGGAAATCATCGCCAACGATCAGGGTAACCGAACCA 0,891

'np BQ426928 115 AGACCTTCTCTGCTGAGGAAGTC TCATCCATGG TCCTC AA TAAAA TGAAGGAAAC TIC GCAGAAGCATATCTTGGCAAGACAATTAACAATGCCGTCGTCACAGTCCCAGC 0,832

'np BQ426928 40 TGAAACATTGGCCATTCACAGTGATCAATCAAGCAAGTAAACCCATGATCAAAGT A/C GAGTACAAAGGGGAAGAAAAGACCTTC TCTGCTGAGGAAGTCTCA TCCA TGG 0,928

snp EVV779028 227 ACGATCAGGGTAACCGAACCACCCCCAGTT ATG TAGCG TTCACAGAC ACAG AAAG A/G CTGGTCGGCGACGCAGCCAAAAACCAAGTCGCCATGAACCCCAACAACACAAT 0,804

,np AJ563464 101 TCTCTTGCTGCTTTCTTAAAAAAGCAAGGCAAAATGAAGATTCCAGACTGGGCTCC TIC ATTGTGAAG CTTGCCAAA TACAATG AG CTTG CTCC AT ATG ATGA TGACTGGT A 0,908

'np AM863710 107 TGGTTTTAGCAGTTCTGA TCAGCTTTGCTGG TT ACAG TTTGTCTGAGGAGG AGAA TIC GTTG CCAGACTACTAGCATCAAAAAA TGT ACTTAACCAGT A TTTAGTGG AAG G 0,892

,np_AM866419 269 TTGAAGATGTTGGACATTCCAA TGA TGCCAG AGAGCTG ATG AAAG ATTA TTTAAT A/C GGCGAACTTCACCCAGATGATAAAAAGGGAACATCAG TAAAGACCAACACCTC 0,965

,np CU682053 467 TGGCTTTCTCAGCCGACAACCGACAGA TTG TGTCTGGATCCAGAG ACAAA TCCA T TIC AAACTGTGGAACACTCTTGGAGTCTGTAAATACACAATTCAGGATGAGGGTCA 0,92

'np CU684465 50 AAGCGAGAGACCATGGCAAAAAGAACAAAGAAGGTGGGAATTTGCGGGAAATA TIC GGAACCCGATATGGTGCCTCTCTCCGTAAAACCATCAAAAGAATGGAAGTCTC 0,72

snI!. AJ565506 195 CTCTGGACGTCAACCATGATGGCAAAATCTCCATTGAGGACG TCGAGGAG TCCAG A/G AACAAATTCACCAACCTTCACGAGCTGGTTGGAGACAAAGCCAAAGGTGTCCA 0,904

, np_AM858800 222 AACTG TTAACAAACAA TGTTCAC TTGGTAATTTTCTAAAGTTATGTACCTG ATTT AC A/G AGTGTCCACTTACATGTAAAGACTTTAAGAAGGAAAAAGGAAATCCTGAAGTT 0,585

190

Locus Séquence flanquante 1 SNP Séquence flan quante 2 Score

'np AJ565627 213 CCGTCTTGGCCCAGCTATACACCAAGCTG AAG GAAAACAACCAAAG CA TAGAAA T C/G ATCTTCGTCAGCTCGGACCGCGACGAAAACAGCTTCAAGGAGTACTTCAATGA 0,601

'np CU998226 258 CTTCTGCAGAGCATTCAACTATACATTAGTTACCC TGACAACCATCGATCAGTACA A/C GTTCATAAAAGGTCATCTGACCACAA TT ACAGG TGGATACATCTCCTCCGGA TT 0,955

'np AM855912 584 AAGTGTAAATGTACCAA TTG C AAG AGTGACTTTG TGTA TCCA TAC AGCCTTTG AT A A/C CAGTTTTCTTGGTATTCCTGCTTG TA TT AGA TTG TTTCT ATTGTCC ACCTTTTTTT 0,913

'np AM858494 211 GGCATCTTCCTCGGACCAGGTCGGffiTACGCACAGA TAGCAG TGGCCAG TTTCTT A/G GGTGGACTTAffiCCGCAATCGTTGGAATATTGTTGATAACAC TAAGAACTCGT 0,911

, np CU683122 402 CCATGAAGGAAAAAGAAAT AGA TAAGGAT ACGGTCATTGCCT ATC ATGACTTTG T TIC CAGACTCAGATCAGGGGCGAATTAAATGGCATCTTCCTCGGACCAGGTCGGTT 0,828

,np AM853841 102 ATTTTGATAGAAA TG GCTGA TGT AGCAATG AG CGAA TT AAACCCGAA TA TTG TAA A/G GGATGAACAAGTGGCACTGGTAACACTGTCAAAGACGACAACGCAACAAGAA 0,974

'np AM853969 249 ACGCACTTTTCTCTTTTAAATCAAAAGACCCAACAAAAAGTTGAGTTTTTCAAATA A/G ATTTTAAAATTTA TG GAATCGCCCC TTC TCCCAATTTTGGAC AGAAAA TGTG AG 0,947

,np_AM860523 155 ATAffiGGTCAGATTCCTCCCATTGAGAAAATGGATGCCTCTCTTTCCACATTGGC TIC AGCTGCGAAAAATTGTCATTATCCACAAACTGCATTGAAAAAATTGCCAAC TTA 0,946

'np AM854342_374 GCCAGAAAGGCCTTTGATGAAATTAAATATGCGACAACCAAATGAAAAGATGTCT TIC TCGATTCTTGAAGGAGAACA TAG TTCC TTTAA TTA TG GAA TTTGG TTCTGAAAG 0,963

'np CU994616 9 ffiGTCTGTCGGCTCGCAGAGAACAG G AAC TGAACAGAG TT AAAAAACAATGCCT AIT TTG CATGGAAACA TTAAAGAAGAGGA TA TTTTGG TG CTG CCTTTGGA TGCTC T 0,931

,np AM857059 211 TTTTGCTTCTCCTGAGGGTACAGGAAGGTCTTTGACCAATATGCCCAGCTTCTCCA TIC GAG CGATTCCCAGCGCTTGACATCCAGG GTGAC AA TT ATCCCCCACCCTCGGG 0,758

'np CU684236 290 ATCTACGAAAAATTTGACCAAACAGCCTACAACTGTTTTATTGCAGCAGGGATTTA TIC GTCTTGTTCTTCTTTTTCTCCTGCTGTCAACAAAGAATGAACTCCAAAGCCAGCT 0,919

'np AM854469 343 GGTAACATCAGAGATATTCTACATC AGA TCT ACAG TAA TA TTTTTG TTG AGTA TG T TIC GTACGGAATCCACAGTGTGAATTAGGAC AACCAA TCACAAGTG AGCTG TTTCA 0,784

,np_CU682241 333 GTTTTCTGGGCTTTCAGGTAG AACAA TACAG ATTGTTAATAGA TTTCAGG TCTTAT T/G CAATAATGTACCTTGT AA TAG TAAATATCTGTGG ACTTTGG TG CA TTG TAATTT 0,408

'np AM854612 119 AffiAGAG CAG CTTTACAAA TTGACCAATC AGGAGA TTCG TGAC ATTACG G G CG C AIT CCTCACAAG CATG CCAAGAGAA TTTC TCACG CTCTC ACTTG G GTGAAAAAGAA 0,788

'np AM854683 330 AACAAATGCATTACAA TGTTGAGG ATCGCACAAGG ATAGAA TCCAAA TATCCTCA TIC ATG GACAG G G CTACTCTTCTCCGTCCGA ATTTCCATC ATG AGACCTCT AAAT AT 0,988

'np AM861565 95 GATATAGATCCACGATAAAGCGCACGA TGCAAGA TCACGCAG AGT ATGAG TTC AC AIT GATAATTTCAAG CTTCC AGAAAAAG CCA TAAAG GAC TTTGAGGAAT ATG G AT A 0,935

'np AM856693 352 ACCGGAGGATAGCCCCTATCATGGAGGGAGATTCTGGCTACGCATCGACTTCAC TIC GCCGACTACCCATTCCGTCCTCCAAAGATAATTTTCCTAACAAAAGTGTTCCAC 0,7

' np AM861654 152 TGAAAGGGATTTCTTACAAC TA TAAGCG ACAGCAATCATCATTTTTCAAACACTCC A/G ATTTATATTT AA TTCCGG TCAAATTCTGATG TGAAA TAA TCGCGAG TGT ATTCG 0,944

'np AM854833 563 CACCCAGAATTTCAACCAAAGTGTAAAACCAAGTACGCCCAAACTTCCGCAACCTC A/C AAGGAGTAAACCCAACACTCCAAACATGCCCCAGTATTTGAAATCTGGACTTTC 0,887

'np AM854835 518 G GGAAAATAAACCATTTTT AAAAACA TTTAC ATG TA TTGAA TTCAC AA TGAAAAAA AIT TGTACTTGTGTGAACTCCA TTG AAGATA TTT ATG TA TTTTTA TTG TCA TTCATTG 0,904

,np_AM861154 365 AAGAAATTTGTTACTGAAAGATATGGTG TT AAA TTTG ATATGTTTAGCAAAATTGA AIT GTCAATGGGAACAACGCCCACCCACTGTAC AAG TA TCTG AAG G CCAAGCAAG 0,957

, np_AM858867 164 TGGAGTTCACAGATGACGAGAT AAGAG ATG AA TT ATCAAAG TT AGGGTACAGAA T/G CATCCCTAGTGAGAGACTCCAAGAG TTTAAAAAAG ATTTG AGAGTG CTT AT AC 0,899

'np AM855102 290 CATTCAGAAAA TTCT ATG AACGTGGGG ATTTTCCAATTGCA TTGGAACA TGACAC AIT AAAGGAAACAAAA TTGCA TGGAAGGTTGAGA TTG AAAAAC TAG A TTACCA TC 0,881

'np AM855 102 431 AAACAGCACACCCCTATGAATTCTTTGCCAGACAGGGTGTTCATGATATGCTAGA A/G CATGGCGGTTCCAAAATCTTACCTGTTATACCTCAGTTAATCATCCCAATTAAA 0,962

'np AM855277 64 ATTTAGGCGCAGAAAACACTCAAAT AATG AG TTCACC TG A TGAAAGCACCAA TAA A/G CCAACAGGAGACGATGTATTCGTTAAACCAGCAACCCCTGATTTGTCCACCGCT 0,894

' np AM861389 162 TTTGAGAGTATAAGCTCAACATTTCTCCAACTGCAATTCAACGAAACTCTAAAATT T/G GGATTCTTCGAAAAGAA TTGAACAAGACAATTT AAGG AGTTTTAAGACCA TGG 0,912

,np_CU685076 185 TTACACCCGAAGATATAGCAGACGAAACTAAAAGAAAAGAGCTTCATAAACGTTT A/G GAGGAACACTTCAAAGATGAAG ACTTGA ATTCACCCAAAAA TCGAAT ACCCT A 0,895

, np AM856019 65 TTTCCAGTACCTGCCCAATGATTTTTTTGATAAAAAATGTAAAATTGTGTACATCAT TIC CGTAA TCCCAAGGACATCGCTGTGTCG TTTTACAACCA TCAC AAAAAA-CTTCT 0,96

'np FP000502 586 GGCCGACCCCCAATGATG G G CGGAA TG AGGGGTG GTATG ATG AG G G GAGGACC AIT CCACCAGTCATGAGAGGTCCCCCTCCTGGCATGGGAAGAAGATAGACA-GACA 0,841

'np AM867000 546 CTATATGGGATGAAACAGGAGATCTTCTCCAGACTGGAGATATTTGCCGCCTTAC A/G AAAG GATACTCAAATGTTTG G AAGAG TTGTCTAACTTTG TACAC TGGAAAA TC 0,683

'T1Q..AM857062 374 G G GTCAGGAAAAGTATAGA TCTCTGGCACC TA TGTACT ACAG AG GGGCATC AGC C/G G CCATTATTGTGTACGACA TCAC AAGGGAG G CCACTT AT AGAACAG TAAAGGA 0,938

,np CU684876 164 TCTGTATATTTTCCTTTCA TCAGCTGT AT AGAAC ACGA TCAATTTGG AACACCCC AA TIC TCTCAGCCAAAAAGTGCGCCAAAC AACAAGGAA TAG ACCT ACAGCCAATCATG 0,766

191

Locus Séquence f1anquante 1 SNP Séquence f1anquante 2 Score

snp AM856753 332 GAAAATCCCAGTCTTTACCAGCACACCAGGTACAGGGGGATAATACTGCTACACA A/G GCATCCTCAGACAGCAGTCCAGTCAAACGACGCAG AGGGAGACCGAGGGGG 0,956

snp AM864311 279 GACCAGACTACTICAACTCAGTTG TI ATCGA TAC ACAG TCT AAGCGAG G AAGAAG A/G AAA TCCCAGTCTTTACCAGC ACACCAGG TAC AGGGGGAT AA TAC TG CTAC ACA 0,914

snp AM864695 282 GAGACTIGGGAGGAAGTAGGTTTCTAGATCCCCGGACCAAACAGTCTITCAAATA TIC GATCATTTACGAAAAGAAGCT ACAGAGG AGCAG CCAG C TA AAG TAGACGCG G 0,973

snp CU986490 316 ACTGTCTAAAAGACGCATAAAACA TCT AGAGGAGATAACTG TA TAAGACTICAAG A/G ATTTCCCA TTTCTITIG AGCTG ACAGAAGAAA TGTGTTCA TA TTACGAAG GAAA 0,892

snp AM859119 174 AGTTTAACGCCACCACCATCAGCAG ATG TICCGCC AGAGTTAAAG ATTCCAAA TG TIC ATICAAAGAGGAAGTIAGCAACAATCCAGGCACCTTTGAAGAGCTGCATAGG 0,947

snp AM857471 352 TCAAGATGAAGTCAGACTTGCTGCAAAGGCAGCTATIGCGGTICGAAGGAAAGC TIC CTGCAGCAACTTATCCAAAAAGAG A TTGACA TGT ATG AGCAGGAACTTAGCTI 0,909

snp CU681722 367 AGGAGGACTCAAGTTTAGCTCCCACCACAACAGAAGGCGGTGCCTACCAGTICAA TIC GCCG CCGCCACCATICCACAGCAAGGATICTCCTICTGA TCTCC ACA TGTG ATC 0,623

snp AM860034 48 GTCAAAATGACGGACACTATGC TIG TICG TGCTC TI AAG GG TAAACCAAAAGCC TIC TAAACCTATGCAATAAGAAATTAG ACAAAGTGCCAAAG ATCATTGGAAAGCTT 0,929

snp AM860592 273 GAAAACAGAAAAGAGAAAAGGGAAAGAAAGATGGAAAACAAAAGAAACCATGA TIC AATGTCCTAAAGATITGTCTICCAGTG TITGGGGTGA TCA TAGCCAT AA TIG TG 0,918

snp AM857665 474 CCATCATGCCGCCAGTGATTTA TGCAGTATACA TCATCAACAACCTGGCAAACATC A/G CTTGGTIGTTTGTCTGGGACAGACAAGAGATCATIGCGTCCTTAGTIGTCATAG 0,861

snp AM857996 76 GAAATICTTCAAAAATG TITGA TGTTGCTCTGAAAAGCGCCGGTGCCCAGGTTGT TIC CTTGCTACTTCTAGTGA TGGTAATC ATCC ACCTG AAAAT ATCATTGA TGGGGAT 0,884

snp AM859846 182 CAAGTIAGAAGTTTCTTIGGCTAAAGTGG AGGCAGCAAAC AAGA TIGC TGA TCCC TIC TGGAGCTGTIGTCACCA TTT AAAAAG TTTGAAAG AAA TGGTCTGAACTTGAGA 0,9

snp AM862502 170 ATGAAAGCAAAGAAGTGAAATGCACCATGAAGTITGGCATCTTCCTACCTCCACA A/G GCTGAGAATGGAAAGTGCCCCATCCTCTACTGGCTGTCAGGAC TG ACCTGCAC 0,828

snp CU986708_332 ATITTTATCAGAGAATGCTAG ATGAAAG G G GTTG GAAAGA TCCC TGGAT AAG ATT TIC GAAGTICCTATGTGGCACAAAATTAACACAACTAGAGTCTATACATATIGGCA 0,905

snp CU987873 518 GTCATITIAAGATITTAGCTG AAATTIGG TITI AA TAAACTITCTAGGGT AAA TAA TIC TCAATITIGGAAACTGTATATGATATATGTAAGTGTAGATTGGCAGGACATGA 0,513

snp CU990109 131 TAACGGG-GGTICTGCTCAATATTACAAGC TAACCAAGGCGCA TGACG ATGGG TA TIC ATCGATTTACAGTICCAGAGACCTCCTCCCAAAGTGCCATACAAGGCTATACTG 0,913

snp AM858186 333 TGCCGTGGATATCAGGAATGATGGGGCCATCCAG TCGGCCA TGAAGG AAGCAGC A/G GACAAGTTTGGGGGGATAGATA TCCTGA TCAACAATGCCAGTGCCA TCAGC TI 0,905

snp AM858186 636 AATATGGGATGTCCATGTGCGTG TIG GGG ATG TCGGAG GAG TITAAACCTTTGTC A/G ATIGCAGTGAATGCTCTCTGGCCCCGTACTGCAATITACACTGCTGCCATGGAG 0,931

snp_CU994090 266 TICACATCTIGTTTCAAAGAAAAGGACTITTIGG TITIC TITTICAAACG ACTG AGA TIC TG AATGAAAGTGACAGAT ACG CAGA TGAATTICCC TA TCTTTCACCA TGTGG TA 0,941

snp AM858323 344 GACGTCCTCCGGCCCCCTGTACTGTAACCCCACCCTCC TTCCCTGGACATTCTTCG TIC CTGTTTCATGGTCAACATGTGCCTGAATCTGTCCTGGATCC TCCTC TITGACAG 0,908

snp CU989257 270 GCAACGAAATCATGGAAAACC TIGACAAACATAATGGAAACTGTAGCCAAGCCCC TIC TCGCCATIAGATGAAAACGACAACGACAAAAC TICGGAAAAGTCCGGAGAAT 0,859

snp AM858398 181 GGATACTCTCCCCCATACTATG TITI AGTGG ACG G CACA TITTGTCGAGCTGCA TI A/G AAACAGAAAATCAACATCAGAGAACAGCTTCCTAAATATCTAGAGGCAGAGGT 1

snp AM861624 248 A TITIACGTCAGAATG TGAAAA TGAAAG TIGC TCA TIC AG CCACGAGGAAAACTC A/G CTGAG CAAACTITICCAGTTI AT ACA TAATGCAG TGAAAAGTGTGG ACGTG TG 0,998

snp AM861624 299 ACTCACTGAGCAAACTTTTCCAG TITATACAT AA TGCAGTG AAAAGTGTGGACG T T/G TGTGTGTTTGTITICACCTG TACAGACCTGGCCG ACCTG TIG AT ACAGGCTG TG 0,96 1

snp AM858880 508 AGA TCATCACCTCCACCACCAGTAACT ATG AGACG TCAACATTCGCCTCG AAGAC TIC GAGTGGCGAGTGCGAGCTATTTCGGCCACGAACCTCCATCTCAGAACAAATCA 0,715

snp AM858511 544 TTTATIGGACGGCCCCGGCGCCCACAGGCCACATTIATTICATAGGTACCATAGT T/G AAAAACAAGACCTTGTITTGGACCAATG TICTCTCCCCGCTCA TCAAAGACG TG 0,784

snp AM858589 274 TATGAAATGTATCGTACTGATCCAATAGCTGCTAATCCATTIGCTACAGTGTTTGT A/C CATATCTTGAACCCGCCAACAGAAAACCAAG AAGCTGGGCAGTTIG ACTTACA 0,751

snp_AM860177 238 TIGCAAAAAAA-G GAGCACAGA TTTCAC AGAG TICC TCAAC ACACCGGG TIGCT TIC AAAAGGATIGCACAGTAATGTTAAACCACCAGAACCTGTCAAAGAAGAAAACC 0,978

snp_AM858743 147 GGAGTIGATAATGTICA TAGCACAGA TITICC TG GCGAG TACCCTGACTTTGATG A TIC GCATGGGATITIAAAAAGTITAAAAAGAATTTCCGCATTGACATGATAAAAAT 0,985

snp_AM864676 609 ATCAGGAAGCTGGATGATAAGTTTGAGGCCAGAGTC TGTGGCAGCTICAGGAGA A/G GTGCTGAATCCAGTGGAGATATTGA TA TIC TICTGACCC ATCCAGAC TACACC T 0,934

snp CU986923 18 ATAGATICTCTTACAG TI ACAC ATG TAAACTIGAAAACGT AAAC AAATC AAA T/G AGAAACCAGCGTAAAGCGACTAGCTGG TGTATCACCGAAGGCTCTACTTCATG 0,986

snp AM859467 518 ACAACAGCAAGTCAGAACAGGCAGACAG ACTTGCAG AAGAGCAAAGTTGTG TCT A/G GATGAAAATACG G G CAATGAA TCTG AAGGAG CC AAAACCAG AAG AAGAC AG 0,895

snp_AM859033_434 AGAGGTGTACCAAGCAACTAAAG ACAAACAAGTTI ACAAA TG G GACAG AAAC TC A/G GACCTGAAGAATGAACAACAGCAAGTCAGAACAGGCAGACAGACTIGCAGAA 0,963

192

Locus Séquence fJanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

,np CU987264 280 GGAAAAGGAATATTCTGGTGTTGTTTTCATCAAGGTGGATGTAGATGAAAATGAG A/G AAACTGCTGCGGCTTGTGAAATTTCAGCCATGCCAACATTCCATATTTACAAGG 0,985

'np AM865312 288 CCAAGCAGTGACAGATTCGTCCAAAGTGAAGGAGA TAATCG ATICTTACG ACAC A/G TATCTGTTGGATATGGATGGCACCCTTTGGGGAACAGATCACTACAGCTCTATT 0,778

'np AM859469 105 AACAGACCGCTCCATGGCTGTGAACGTGTATAGTACAAACAACCAGGCAGACAA TIC CTGAGTCG CCATGACATCCTGGCCTGGGTCAACGACAGCATCCACACAAATTA 0,877

' np AM859907 237 AATTGGATGACCAGGAAAAAACAAGGACAGCTTIGCTG TTIA TTTCCC ATGGACT T/G GGGGAACACTTTGATTATIACGA TGAGCTTGG AT ATTTTCT AGTG AA TTCTGGC 0,963

, np_AM859907 279 ATTTCCCATGGACTGGGGGAACACTTTG ATIA TT ACGA TGAGCTTGGA TA TTITCT A/G GTGAATTCTGGCTTTCGAGTTTTCACACACGATCACATCGGCCATGGGACTAGT 0,959

' np AM860238 377 AAACAGCTAAAATGTACAGAGGAGG AAAAA TTTGTCTIACTG ACCACTTC AAGCC A/C CTGTGGGCAAGAAATGTTCCTAAATTTGGAATAGCTCATGCAATGGCACTGGG 0,947

'np AM860852 202 TATGTTCAGAACAATAAAGAATCTGACAATGACTGGTTTCGCCTAGAATCTAACAC AIT GAGGGCACTCGCTGGTTCGGGAAGTGCTGGTACGTCCACGAGCTTCTCAAATA 0,905

,np AM864324 160 ATACTAAAGCCCTTG GAAGGAAGTTTG TT ATC AAAG ATTTGGATG ACAC TCAC TT A/G TTCATCTCAG CAGACATTCTCGAAACTCTTCAAGATC AAG TTG ATG GACTGA TG 0,966

'np AM860304 85 AACAAATGATTACAACAGATTGAAGAATGCTGTAAGTGCAACGGATGTGACTGCT A/G TCAGGAGATTGATTAAGGGTGG AGTTAA TGTCAA TTCACGCTCAGCTGCACAG 0,902

,np CU995085 518 AAAATGGAGAGAATCCTTGGCATAAAATTACGTGGCAAAGACAAAGGCCAACCG AIT TGGGGGG CCCCAAATAGTGAG GATATA TTTCTGGGGCCCCTG CT ATGGAG G T 0,736

,np AM863490 83 TGTTCAAAAAGATT A TC AAAAAC ATG TGAACC TTAGGCAACAGCTTGA TG CTC AG AIT TGAATGAAAATTCTTTGG TGAAAGAGGAGCTTG ATCG AGTGGAAGA TGGTGC 0,98

'np AM861320 348 CAGCAGCATTACAAGAACACCAATTTGAATATACCCCATTCATGTCAG TCTTATC TIC GAGGCAGATGTCCAATTAAAC AG AA AAG TCTIAC ACGACA TA TGTAT ATATG A 0,671

,np_AM861357 589 GGAGCCGGACAACTGGTGGACAGGATGAGGCGGTATGAACAAA TCT ACGGCGA A/G CAATTCACACCCTGCCAGCTGTT ACTGGA TCACGCG AAAG ACTCCTCCAAGAA 0,899

'np AM861494_377 TAACTCCACTCGTTGGTGATTTG ATCGGGAG TG G CAATTTTAAT AAACTTGAAG T TIC ATGGTGGATAGTGAGCTTCTGAAGTGCCTAATGGTGAACATAGAACAGCAAC 0,943

'np AM861494 473 TAGAACAGCAACCTTGGATT AAG ACTTT AGACTTGGGAG AACCCAACACCAAATT C/G TG TTTTTGGCATTCATTTTGGGAAACAAAGAATGAAGAAACTGGGGCATTGAG 0,872

,np FP008139 99 CAGCTGCAGGGAGAGGCCAGAAAAGTGGCTGGTGATTGGCTGAAAGAGGCCAA A/G CTTCTATTAGAGACTAG ACAAGCGGCCTTCGCTCTG ACAG CGTTCGC TTC AG CC 0,988

'np AM865369 184 TGCTGAAGCAGCAATGCCCAAACAGTCCCAAAATCCGCATGGACCGCAATAAGTT TIC AACGACTTTGTG CACAAGAAC TTIGAG ATG ACGGATG AAA TGA TTGTG GAC A 0,916

,np AM865369 256 AGAACTTTGAGATGACG GATG AAA TGA TTG TGGAC AGAGTTTTCCGAGCCTTTGA TIC GAGGACAATGATGGATTTA TCAATG AACTTGAG TGGGTCAAAGGGCTGTCC AT 0,989

'np AM862518 108 TTCTGATAGCTATTGACGGCAGTGAGCATTCTAAATACGCTTTIGAATGGTACTG TIC AAGTCCATGCATCTTCCAAC AGATCACGTGG TCA TGA TTCACTCCG TGGAGTIC 0,977

' np AM862538 267 AAAGGGGACCCCCTGGGAAGGAGGACTTTACAAACTAAGGATGTIGTTCAAAGA A/G GATTACCCCAGCTCTCCTCCAAAG TGCAAG TTCG AGCCCCCA TTG TTTCACCCC 0,998

'np AM863998 300 GTCATCACATATATTGTACAGACCAACCATTGGTTGGTGTTTGCAGGGATCCTCGG A/G AGTCTTGGACTCTGTGTCGCTCTCCAGACCTACAAGAACGACTACCCCACCAAC 0,85

'np CU999304 274 AGGAG CACATATCCCGTACGATG GTGAG G AGAAAA TAG TCCA TAACT ACGAG GT TIC CTAGTGTACTCGATCAAAGACCAAGGATTCGTAGACTGGCAAAAAGCTTCCAA 0,893

,np AM863641 199 G CTGTGTTCCAACTTAGTCT ACAC AA TGGACGAAAAGGC AG CAACG ATG TCGTC A/G ACAAGACCAGCCAAGGCCAAAAAAGATGAGGAAATTGTTGCAGAGCCAGCAG 0,64

,np AM863381 54 AACATGGCGATGCTTAGTTTGGATAATCCGACATTCGAAAGATTIGCATTTTACTC TIC GGCA TTGCGATCGGAAAAACCTTG TT AA TGAGTGC ACTG ACCGTCCGC TCAAG 0,979

snp AM863574 174 CAGTGATGGAGTTCTAGAAGAAT ACTC AACAG ATG AAGAAGAAGAAG TT AAACC TIC CCAGAACCAACAGTCAACCCAAAAGAACTGACTTGGATGCCTTGGTITTGGTA 0,958

'np AM865098 23 TAAACTGTCTCGGTAACACTTG AA TCTCA TTGACA TTCATTIACTTG TGACA TTCAT A/G CTAACTGTCTAAAACTIGT A TCATG AGTTTTAC TT AAATCATGACTA TA TC TG TA 0,76

,np AM864017 329 GTGGGACATTGGAGGACAACCGAGATTIAGG ACTA TG TGGGAGAGA TAC TGCCG A/G GGGGTCAATGCTA TTGTCTA TA TGGTAG ATGC TGCAGACC ATG ACAAGGTAG A 0,888

'np AM869032 351 TATGACAGAGGCCTGATATCAGAGGCTACTICAGCCCCGCTAGCAAAACCCGAGG AIT GGAG GAATACAATCCATTCAAGTTACC ACCAAAGCCAG TGAAAAGCGA TTT AG 0,96

'np CU999066 97 AGAACAACAGTGCCAAAATICTTCCTCCGCG AGAACCCGG ATCC TTTTTG GTGGG A/G AA TTATGA TTTCAAACCAACGA TTCCAACTTATTTAGAG TTG TGGCGT AAAC AT 0,956

,np CU992608_133 TGTACTATATGAA TG AA TCTGG TGACAAAG TTTAC ACTTT ACAGAAGA TGGA TCC TIC ATG G GACGACCTACCCTCTCAGCCCACCCTG CT AGA TTTTCCCCTGA TGAC AAA 0,975

'np CU998679 293 TGAGTACTACCCAGGAAAAGAG GAAT A TTCACC AGTC AT AG GACA TAGAG AAAT TIC GTGGGCCATGGAGAGATTCCCTATTACACTGACTCCTTCACTGTGCCCTGTCCG 0,97

,np CU990868 732 ATAAAACTTACGAAGCAGG ACATTG TATGCAAACAGCAATAATATAAAGTACTAA A/G TTAGTTCTTTTTTGTCATTTATA TAGTATACTCAT AAG TAAGTATAAT AAAA-C 0,428

~~_CU6836S8 368 AATGACCTTATCGCATTTTCACAAAAA TTGGAG AAAGCCTGTG TTG ACACTA TTG A TIC AGTGGAAAAATGACCAAGGACTIAGCTGGTIGTATATATGGGTTGAAGAATG 0,918

193

Locus Séquence f1anquante 1 SNP Séquence f1anquante 2 Score 'np FP001390 99 GACTTCAAACAAATTG TTTTG AGGCGAGCCTTCAAT AAGC TAGA TAAAGACGG AA T/G TGGTTTTCTGACACGTGACGAGATTTTGGACGCGGCCAGTAACG AGGCTGAGC 0,995

,np 6Q426841 203 CTGTTCAAAAGGGCATGCCACACAAGTTTTACCATGGCAAGACTGGTAGAGTTTT TIC AATGTAACTAAACACG CTG TTGG AGTCATCATCAACAAGAGAG TGAGG GAAA 0,94

,np CU686003 247 GAAGAAGAAGGTAGCAGCAGCCCCTTTGGTGGCCAAAAAAGCTGCAGAACCCAA A/G AAAGTTGTTAACCCCCTGCTGGAG AAAAGACCACGAAACTTTGGAA TTGG TCA 0,845

'np AM237651 319 CACAAGTTCCTTTTAGCAGGTGGCTGCCTGCGGCTATAATAGCTCCTACTCCTGT TIC TCATCTTTAGTTCACTCA TCAACTCTTG TAACAGCTGG AA TTTACCTTC TT ATTC 0,923

'np 6G467427 179 GGACAAGAAGTAGACTTCAGTGCTGGTGCCGGAGGTGGCGGAGAAGGCAAAAT TIC ATG GATGACGATGATGATCG CAAAA TA TTTG TTGGAAA TCTCAGTTGGGAAAC 0,757

snp FP007608JO ACAGCCATTTTGATCGAGTTGAAG ACTGC ACAATG G CGGAACAACAAG ACT ACAC A/G TACGATCAGCAAGCAAATGGAGAAGGGGGCTTTGAACAG TTCG AACAACAGC 0,841

'np 6Q427114 118 GCTGAAGAGATTGACAGTTTATTATCGGGTTCAGAACCCTCTTCTCCAAGTAGCCG A/C AGTGATG G CAACGACCCAGACTATTCTCC AT ACCAGAGCG ACAGTG AAG AGT 0,885

'np 6Q427114 169 CCGAAGTGATG G CAACGACCCAGACTATTCTCCAT ACCAG AG CGACAG TGAAGA A/G TACAAATCAAAGTCGCGTAC· TGGAGGCAAACAGAAATCAAAGAAG AGGCGA 0,817

,np AM853931 350 CCGCAAAGCTTCTCGTCAGGCCAAGCTG GA TGCCAAGCG TGGAA TCAAAACAGA T/G GCCAAGCCACCTGCAAAGAAAGCAGCAAAGGCCAAAAAGACAGCAAAGCCA 0,827

'np CU681711 212 GGTCGGAGAGAAAGTCAAAGACTCCACGTTTAAGA TCGGGGAGGAGTTCGACTC TIC GTGTCTCTGACAGGCCAGCCTCTGAAGTGC ACCGTCGCTTTGAA TGGCGAAGA 0,675

,np CU684183 570 AATAGTGGTAGATTTTGCTGCGCCGCGTGATGACTCCGAAGACGTAAAAGAGGC AIT TACGATGAGTTCTGTGGGAAGCTGTTTGCAGCGGAAAATGCGGGTCAGGGCC 0,918

,np EVV779545 265 GGCAAAACCTCAGGA TTTGGTTTAATTT ATG AT AGCTTGGAC TTTGCCAAG AAG TT TIC GAACCCAAATACAGATTACAGAGACATGGCTTAGTAGAAATTAAGAAAACCG 0,967

'np AJ564625 64 TCTTACTCCTAAA TCCA TCCCTACTTGAG AGA TT ATTTC ACCA TCGGAACTTTC AC TIC ATGGCCGAATCCCAATGTCGCCAAAA· TTACCACC AGGAGAG CG AAGC TG G CA 0,835

' np AM857816 166 AACACTGCTGGAGCTCTTAAATTCTTGCACAGCTACATGTTTGATCCGAGAACCGG A/G GGAAGAGATGACGCTAGCCATGTTGCAATCATCATCACAGACGGTAGATCACA 0,895

'np CF369132 326 CCCAACA TTTAGGTGAAAA TGTGG TCCGT ACT ATTGCT ATGGA TGGT ACTG AGGG TIC TTG GTGCGAGGAGCTCAGTGTATTG ACAC TGGTTA TCCAA TCAG AA TCCCTG T 0,948

snp AM868845 106 TAATTTCGGGCCGATTGGCAA TA TTGAATTTA TTA TCGAAAG AAA TA TGGAG TAA TIC AGTCTCAGGACTAAATTG TT AT AAAC AA TG CCAACAT ATCCTGACC AAG AG GA 0,581

,np 6Q426370 239 CGTTCTAAAACAAGTTTTCTTTTATTAAAAGGCATGTATGTGTTCTGAATGTGTGA A/G AAATCAATTCTTGTTGCAAA TGCA TCAGATCTTGTTG TCCCTTGTTGTTA TCA TT 0,956

,np DVV714015 27 CATAATAACCACTGGTCGAATCTCAAGTCAGCTTAATGCAATGTGGTCTGTATGCA TIC ACAGCGTAACTGTGTA TTGAAAG TGT ACA TTTAGCAT AA TGTCTTC ATTT ATCA 0,954

,np E5789710 308 ATGGACAACTTTGGGACTCGTACATTCTTTAGTGCTTTCAATACTTCATTTTTCAT T/G AAGAACAAAAACTATTGCTATTTTTTTATTTTCTGCTGAAAAGCATTAACATTGT 0,667

'np AM853687 32 CAAACCGAGAGCGGCATTCGATAATTCCTGTTTTGCTGCGTCAGTGAACGTACGG A/G CG G GATTGTCACAGAAGTCTTTCACGTTC TCTTTTT AACG TTTT ACAAAC TCAAC 0,944

,np EVV777736 246 TACCAGTCCATGGCTCTCTACTTCGA TCGGGACGA TGTGGCTTTGCCAGGA TTTC A TIC AAGTTCTTCAAGCACTCGTC TGACGAGG AACG TGAGCA TGCCGAGAAGTTGA T 0,928

,np EVV778209 342 TGTGGGAAACAAAAACGGATTATTGGT ACCAAGCTC AACAACAG ATCAG GAA TT A/G CAGCATATTCGCAACTCTCTTCCTG ACAG TGTCAAAATCCAGCGGGTGGAGGA 0,92

'np FPOOl154 355 GCTAGACAAAGTCGTCTTT ATC ACGTGGGTG ACGGAT AGTC TTCCAA TCAAAC AG A/G AGATGTTGTATGCCAGTAG TAA TAAAG CCCTGAGAG CCAAGA TGACGGGAAT 0,899

'np 6Q426529 380 CCTACTCGTTATGGTGACTGGGAAAGAAAGGGGCGTG TGACAG ACTTTTGAACA AIT TAATGCAATATTCAGAGCACATTAATAGCAGTGTCTTTCATTTTTGGTGGATCT 0,992

,np 6Q426564_125 ACCTGGAAGTCCAACTACTTCTTG AAAATTTC AAG CC TGTTAG ATGAAT ATCCC AA A/G G CCTTCATCGTGAA TGCTGACAA TGTCG G ATC AAAGCAGA TGCAGCAAA TCCG 0,95

'np AM862882 206 GTACAGATGGGATCCAGAAAAGCCAGG AGAT AAACCCAAG ATGCAGACA TATGA A/C GTG GATCTAAACACATGTGGTCC TA TGGTCCTTG ATGC TCTTA TCAAAATTAAG 0,859

'np CU686490 284 CAGAAATG·ATCGGAAGCATCATTGGAG TTTAC AA TGGCAAG ACCTTCAACCAGG TIC GGAAGTCAAGCCCGAGATGA TCGGCCATT ACCTTGGGGAGTTTAGCA TT ACA T 0,815

'np CU686490 340 GGAAGTCAAGCCCGAGATGATCGGCCATTACCTTGGGGAGTTTAGCATTACATAC A/G AACCTGTTAAACATGGTCG TCCAG GT ATTGGTGCC ACCCACAGCTCCAG ATTT A 0,961

,np_6Q426573 112 TTCCAGTCGGATACGGAATCCGAAAACTTCAGATCAACGCCGTTATTGAGGATGA A/C AAGATCAGCACAGACTTTTTAG AAG ATGAAA TAACAAAA TTTGAAGACTATGT 0,651

,np_EVV777483 666 TTTGCATCAGCCACTGGTGCCACCCCCATTGCTGGCCGTTTCACACCTGGAACCTT TIC ACCAA TCAGATCCAGGCTGCTTTCCGTGAGCCCCG TTTGTTGGTCG TCACCGAC 0,785

'np 6Q426663 270 CCCAGGAGGCGTGGGGGTGGACCAGGCCGTCCAAGAAGCGAGGGAGAAGAAAT A/C GATGAAGAAGAGGAAACAGATGAAGGAAAGAGACCCCCTCCTCGTCGCCCAT 0,983

'np. FP008712 168 G CTTTTGTCCCACAAGGAATCTCCA TCAAAAATG ACCTTCCG GAA TCTTTAACCGT TIC CCTGATTTGATTTCT ATGAAAACA TTGG AGCGGATTTG TGCCTG ACACAGGTG 0,724

,np_CU986744_318 GTGCCCGTGCCCAGAATGTGCAGCCAACAATC AGGGTTACG TCA TAA TGGT AGCC A/G TTATGCCCCGGATGTACAGAA TTGTC AA TCGGTCCGCC AA TGTCCAGG ACGTG 0,957

194

Locus Séquence flanquante 1 5NP Séquence flanquante 2 Score

snp CU997005 286 CAGGATTGTGCGTTGTTGCCACAC TT AGCGAAG ACACAC ATC ACA TTG ACGTIGA A/G GAATGTCAGAGACGGGGGATCGAACTGGTGACCTIACCCAAAATGTCTAAGG 0,895

snp_AM858814 476 TATTTATTATATTTGCTTTGTTIGATCCCATTCTTTTGTTGGTGCCAAAATAAGTI TIC CTATTTG CATGAAGTCA TCA TAAT ATTT AGA TCCCCCA TA TAAAGA TCAATGAG 0,906

snp EVV778242 645 ACAGTTGTAGAACCATACAATGCC ACAC TCTCTGTTCA TCAG TT AGT AG AA AAC AC A/C GACGAAACmCTGCATTGA TAACG AGGCTCTGTATGACATITGCTTCCGTACA 0,943

snp AM866729 114 ACCTTTTATCAGCGGGATGATTCCATGGTGTTATATGGAGCAATTCGTGACTACG TIC GACTAAATATGTCAACTTG TA TT ATGACACT AA TGACAAGATCA TT AA TGATGT 0,717

snp AM866729 157 ATTCGTGACTACGTGACTAAATATGTCAACTTGTATTATGACACTAATGACAAGAT TIC ATTAATGATGTGGAAA TTCAGACG TTIGGAC AAGAACTG ACCAAATCAAAGTC 0,815

snp AM866729 19 AGGTGCCGACTCCTGGAGAATGAACATCG AGGGAAACT ACGCAGAG TTTCTAAA T/G AGCAGAGGAGTGTATTGCTGTGA TGGGTCAA TTTTGCCGACCTTTTA TCAGCG 0,956

snp AJ565645 416 GGCAAGATCACCCGTCTGAG GAG G GAGTGCCCCAACGAGG AGTGTG G AG CCGG A/G GTmCATGGCCTCCCACTTTGAC AGACAA TACTGTG GAAAG TGCTG TCTGACC 0,668

snp EVV778496 139 TTGAGCCTAGTGATACTA TCGAAAA TGTIAAAGCCAAGA TTCAGGACAAAG AAGG TIC ATTCCCCCTGACCAACAGAGGCTGATTTTTGCCGGTAAACAGTTGGAGGATGG 0,947

snp_BQ427174 1095 GACCAGAAACTCCTCCAGCGTTTCAAACG ACAG CGGCA TCGTG GAG CCAGAACA A/G GAGGCAGAAAGGGTGCCAAAGAAGTGCAACAGAGGCAGAAAAGTGGGCCAA 0,645

snp AM8572 15 257 CTCATCTCTTTCAACTG ACAGAAAACCTGGGA TGTG TT ATG ACCGGCA TGG TTGC TIC GACAGTAGGTCTCAGGTGCAGCGAGCCAGGTATGAAGCAGCAAAATGGAAAT 0,782

snp_AM866192 370 CGGTCCTCATGCAGGmACAGATGGA TGGTGGA TICACGTG ACGACTACACCAG TIC GAACGGTTGTTCCAAATGGAGGACAG AnnC TGT AT ATCGA TGCCAC ACCA TT 0,778

snp BQ427368 404 CCAAGTmGGCTCAGATTGAAC TG TG G ACCAAG CAGGGTC AA TACAAAC TG G G AIT GTG CATCTCmCCCAAAAAGCTGGATG AAG CTGTCGC TG CAGCCCACTTGG A 0,864

snp EVV778390_285 GCTmGGAGCTCAGGTCCAGTGGAGCAGTTGTAACATTTTCTCTACCCAGGATTT TIC GCTGCAG CAG CCATTG CCAAGACAGGGGTTCCTG TGT ATG CATGGAAAG G AG 0,918

snp CU682324 234 TGTAACGTTAAACCCTCCAGAGG TCCA TTCC ACTTCCGGGCTCCC AGT AAAATG TT TIC TACAAGGCTGTCCGAGGAATGGTTCCCCATAAGACGAGCCGTGGGGCCGAGG 0,765

snp AM866360 263 TACAAATCAAAGTGGATG ATG ATGGAAAG AT AA TTGATGCCAAA TTC AAAAC TTI TIC GGCTGTGGATCAGCTATTGmCTAGTTCCCTAGCAACAGAGTGGGTCAAGGG 0,945

snp AM861208 421 AAACTGCCTGAAGGAGAGAmGGA TAATTTTGA TTG AAAGCCTG TGAA TGAAG A/G AAGTGATTGGTTGTAGGGACGACCCACTAATGTGCTAATCAAGTGCTTGG TCT 0,91

snp CB617375 137 AGTTGATAGACCTGGATCCAAG TCCAACAAG AAGGAG ATTGTGG AGGCGGTT AC TIC ATCmGAGACTCCACCAA TGA TGA TTGTCG GTG TG GTIGGCT ACA TTG A AACC 0,848

snp FP000071 19 ACAGATTATGACCCAG CTGACAAGACCA TTAC TCCCA TG GGAG G CTTCCCTC A TTA TIC GGAGAGGTCAACCAGGACTTTGTCATGA TCAAGGGATGCTGCATGGG ATCCA 0,902

snp CU682714 339 A TTCGTGCATGGTGACACAACCA TCACCG TCA TGA TCGT AGTTAG TG ACGAACTC T/G GTGTCAA TTTCTTCCACTGTTA TGTTG CCA TCTGCGTITTTGTCC ATG TTICCAAT 0,874

snp DV736306 319 AAAATTTCCCATACGTATGCGAG TACAGGCAAACAGCTACCACTGTCGGAACACC A/G CAGACCGTGACCCCATCTACCACACAAACCACTATTCCTACCACCACACCGGAA 0,867

snp AM853792 146 CTCTAACGGTTTGTTCGGCTGCTICAACAACTGCACACTGTGCCTTATIACTTATAT TIC GCCCCATGTTACACTGCTGGGAAAAATGCTGAGGCGGTCGGGGACTCGTGCA 0,971

snp DV736416_207 TAATTGTATGTGCAG CAG TTTTG TA TTICAATG TA TTTCTTICTIGACTGTCTTTTC A/C ATmAAATTCATGGGGGGGAAAC ATTTTG CTG TTTT AT ACAGG G GTC TCA TIG 0,961

snp CKl72327 436 GTAAATTCATTACA TTTTA TTTGCGGAAAT AA TTC TTC TTC AACTAG AAA TTAA TTT AIT CCTGTACTGCTTTGCAGAACTACTCTCGACTAACAGA TAATATTCCA TATA TT AC 0,776

snp_CU986741 195 CTATTTCAAGTCATCA TCA TTTTA TTTGGGGTTGTAGGG TTCATTTG G G G TT ACA T A/C TGTCAACAGTTCTCACAGACCATGTACATCTTACTIGCTGGATTTGCACTATCAT 0,939

snp_8N777868 135 CAAmmACAGCAATIGCT AGAAACA TCAATG AAGTIGAAAACCAGA TC TTGAC TIC AGGGA TTCTAAGGGTATCAGTG AAGACC AAATG AACGAG TTCCG TGTTTCTTT 0,883

snp CU684921 8 GCCTTTGGGACCTCCCTACTGGGTCTGGGACTICTGGTACACCTIGTGTACTTGCT A/G AAGAAAACCCCAACACTGAAGAC ATTTTCAGCTGGGGTTA TGTTT ATIGCAGG 0,937

snp FP000122 108 GAGGTTCTGCGTGGAGAACGCAATCTG TTGTTAAAAATTCAGTGAGCCGACAGAT T/G ACAAGAAACTTTGGCGATGATGTTCAAGTCGGCAGACCCATCAATGCGTGGG 0,827

snp CU686230 506 TGTTGAAACTGTGTTTTGCT ATC AA TA TGT AACTGTTGGTC AT ATTTCAGAG CAAC A/G GTCAAAATGCTmACCACCGA TTCCCGACCTCG C AGAA TTA TTG AGAT ACGTT 0,927

snp_CU984479 370 ATGAAGACATAATTCACAA TCCAATACCCAAG AGCGAC TTTCATAAA TTC ACGAT TIC CTAGGGTTACTGTTTTCCAGCATCGGTGATGCTTGTCTCATTGCAAGGGAAACC 0,889

snp CU984479 425 TCCTAGGGTTACTGTTTTCCAGCA TCGGTG ATGCTTG TCTCATIGCAAGGGAAACC A/G TGTTCA TTCCCGGAATGTTG TTC TTCTCCA TTGCGCAGGCGTGG TA TA TGTA TG 0,848

snp_FP006935 63 CATGAGATTCCGATGCATAGAACCCAGAAGTIACGATTGTGAAACAAAGACAAA AIT TTCGGAAGTATATTT AGAATGGTTTT ACCGGTGGTG ATTGCGGGAGT ACTG AC 0,836

snp AM868306 136 CTCTGTCCTCTGTCACCTGTCGTGGGCCCGGGG GTG CTG CG TCCCT AAACAG TGG A/G CCGGGGACATGGGCTTTATGGTAGGCACCAACAGGAACGGCAAGGGTGGAT 0,744

snp_AM867342_588 AGGTTCTATGGAA TCAG GTG GTTCCCTG G AT ATTCCT ATGG TTTCGAC AGGTACCC T/G AAGTGGCAACTTGGAAACCGATTCAACAA TGAATGGGAATTCTTICCTCCCAA 0,903

195

Locus Séquence f1anquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

'np CU992707 125 CGACGACGATGACATIGACCTCTTTG G CAG TGACGA TGAGG TIG ATGAGG AGGC Arr GAAAAAATCAGACAGGAAAGATTAGCAGCATATGAAGCCAAGAAATCTAAAA 0,992

snp CU992707 194 AGGAAAGATIAGCAGCATA TGAAG CC AAGAAA TCT AAAAAACCCG CCCTCATCG C A/C AAATCTAGTCTTCTTCTTGA TGTGAAACCC TG G GATG ATG AGACAG ACA TGAA 0,945

,np AM855811 199 CTAAAAAGCCACATTICCCCCCGA TAAGTG G TGACAAA TI AAC AGGAGGAAAGTC A/G GAGTICAGGAAAATCCCAATACCTAGTCACAGATACACACCTITAAAGGAAAA 0,889

' np AM856748 179 TATTIGTTIGGATATCCTCCGATCTCAATGGTCCCCAGCCCTAACTGTTTCTAAAGT TIC CTGTIGTCCATAAATGCCTTGA TGACAGATCCAAACCCAGACG ATCC ATTAATG 0,937

,np_AM858380 181 ACGGGAATGTGCTGGTITIAGA TGGGGTTA TIC AGTG TACAG AAAGAGA TGAATT TIC TCATACCAAGAGATGCTGGCCCATC TACCCTIG AACTGTC ACCCAAA TCC AAG A 0,986

'np CU684109 266 AGATGTG CAG CAAAATGGCTGAA TTIGA TTCAAAAAAG TITGCAGAACTTCA TGG TIC CAGACGGCAGGTAGTGGCAAGAAGGAAAAACAACCAAAACCAGCTGCTAAG 0,659

'np FJ669341 143 CAGTATAAGTGTAACAGTCACTGCCAATCCATCGGTTGTAGAGCGGGCTACTGTG A/G CG CAGTCACACTCTGGTIAAGATG TAC TIG TACCG ATTGT AA TGGAAAGAAGT 0,972

'np DV736300 603 GATGTGAAGGGAATICCACATTIC TGGTTGACTGTGTITAAAAATGTTGACATGTT A/G TCAGAAATGGTICAGGAACACGA TGAGCCAA TITI ACAACA TITACAGGATG T 0,989

'np AM855035 382 CCAAAGAAATATCAGCCCTAG AT AAAAGAGC ATTCTGG TCTGA TGAG G TCAAACA A/G AGAATICGATCCACTTACTITIACTTTGGAGCCAGCATTGGACTAACTGCTGCT 0,963

' np CU988483 537 ATCTAAGGCCATGCTGGGATIGGCTAGTTCCGGCTACAGACCAATCGTTIGATTG A/G CTACTTTIGAAG CAG CG GAAGCTTGTG ATTGGTTACCC AG CA TIGCA TA TTACC 0,931

,np CU685863 126 TATA TCATAGCAGAGTTTTGTG TA TIC AGCA TI AAACTTITIG A TTAATGGGT ATTT T/G AAGGGAAAAAAAATICCAAAAA TAC TI ATG ATTATGTG TATAAGCACTG TGTA 0,784

'np CU685863 215 TITICAGTICATGTTCATITIGTATATIAGCTG TATITATGTTGAG TITICTTITCAA TIC TAATTICCGTICGTTTAAA TITICCACAAGTTA TA TCA TAGCAG AGTTTTGTG TA 0,869

'np CU988574 243 AGCCGAG GCAGACAGATGGCCACACAA TGGAT AT AT AAAGAAGCTGA TICG TAA A/G GATGGGTGCTGGTACTACTTCAACAAAAGCCGAGAGTGTICCGACAAAGATGT 0,933

'np AM856944 535 TGA TCCTGTGGGGTCATACG GATCGGA TGGGTACCG AG CCCGAG G GTC AG CAGC TIC GCCATGTIACAACCTCTGTI AGA TAACCAGA TIGG TTTGAAAAACCAGCAAAA 0,92

,np CU990225 417 GGGACACAAAGGACAAGACGATGGAGTCAG TCTCG CC AACAAAAAATTIG TCA T TIC GGAGA TTICCTTGACA TIGCCATC ACACCCCCCAG AAATGAGCG ACCT AACC A 0,878

'np AM858368 354 CCCTCTGATCGAGGTCGGGAAGATGGTGCTGAACAG GAACCCCAACAACT ACTTC A/G CTGAG GTGGAACAGATCG CCTICTCCCCCG CTC ACTTCA TCCCG G G G GTG GAG 0,912

'np AM865296 466 ACCACTGAATTICCCGAGGATAAAATCG AACTIGCTGAGGATAATCCTCA TAA TCT TIC GAGTTIAACCAGAGAGTATTIG G AT ACAG TCCTGAAAG AAG TACTGATG TIG A 0,764

'np AM859710 402 TGAG GTTICCGTGAACGAGAAGG CCG CCATG ATTGTG ATG G GA TCCCGGGGTCT TIC GGCACCATICGTAGGACGCTGTIAGGAAGCGTCAGCTCTTACG TCATGTG TCA 0,661

' np AM857209 187 CTGTGGACCCCAATGTTIATCCCTGGCGCTG TITI ATCAGTTGAAATG TAAGAATG TIC CTCTGCTTIGTGAGCAGCTTTTAC AAG TCTGCGGG TGTTTTCACC TGT AGATTT 0,904

,np AM854177 247 ATITTIAA TITTTAGC AA TGGCTAG TGTTTT AT AACTTAACAG TAG TI AAC AG AA A A/G ACATCAATGATTIAG ACTGCTI ACCCA TI AGAAATTGTTAC TGAAAACC ACTC T 0,616

'np CU988101 315 AAATTICTGTAGTGTTAAACTGGATA TITACTCGA TA TITACTCAG TIGG TCTA TAT Aff TGTAGCTAAATAATAGGTTGTAATCTTCAATATTGTTGAGCCTCAGTCAGAAAA 0,569

,np CU995337 540 AAAAGTGGTCTTCTATCCTACACAAAGGCAGTAGCAAAACAAGCTGAAATAGCGG TIC CCAAG G CATCACCCTTAGTIGT AT ATG TCCCGGTTITACTGACACGGC TITIG T 0,884

,np CU992933 132 ATATCTTIGAATACAAAGAGGCGCTTGCCAAGAAAGTCCGCAAAC AGATCGCAAA A/G ATGAGGGACG GTIGACAACGTGGATAATTAAGTTCTG TITITAACA TI AAG TI 0,727

snp_AM858116 547 GGAAAAGAGATIGAAGGAAACCGGAAGTGGCTACCTAGTGGGGACCTCTITAAC Aff ATGGCGGACGTCGGCTICCTGGAGGTGCTCCTGCTGTGTGTGGAGTTIGGGG 0,878

' np FJ347724 339 AGACCCAGAGTITICCTCAGTG TI AGTGACCTG CA TIGG AAAAAG AGGAGAG G G Arr TATGATGAACTGGAGACAGTGGACAAAGGGAGAG AA TCCA TI AGAGCTGCAG 0,92

, np FP090949 223 GGAATGATATIATCCGGCATTATATGATIATAACCGGCATTGCATCAAAAACAGA A/G AAACATCTCAAAATATCCACAATIAAACTCAAAATGCAAGCTICAATICATTIAT 0,979

Cavortine TTICTATACTGTGTCAGCATCGAATIATGTCATATCACACCGA IIIIIIIICTTCGC TIC CTCAATGTGCCAGTIAAACAGCACT AAAACAAGTTA TGCAG AGTGAC TGT ACT 0,905

SQD CACCATIGGAGAACTGTACCANAATG AGCANGCCCCCAACCACGAG TAAGTCGG TIC TTIGTATICTTTTGCA TCTCTTACAGCCAAACTGGAAAAT ATTA TICTAATC TAA 0,983

Caldum_Dependant_ GAAGAG G CAAAG GTGAG NAGAATTTGA TITA TI ACCACTCCCTCG AAAATTTICC Kinase

Arr GGAATTIGTACANTCCGTGTANGTTITICAACCTITTAAATGCGGATTITCAAT 0,557

Plastin GCAGGAGCTAAGGTGTATGCACTACCAG AGGACA TTGTTGATGTTAAACAAAAA Aff TGATAA TGACCATATTIG CC TGTC TI ATGGC TCGGGAT ATG AGAAGTCAACAG 0,876

Myosin_Ught Chain G GACTCAACCCAACTCTTGAAA TCGTC AGAAAGAATGGCG GAACCGA TAAAA TG A/G G GTAAGAGTITIATAAA TITGAGGAATTITTGCCAA TCCA TGAGACAA TCA TGA 0,883

EF1_Alpha TGATCCACCAAAGGGCGCCAAGAACTTCCTTGCCCAGGTAAAACTTTACAAGAAT T/G TGATAGGCCTCAGTACATGTTGTAAAAGCA TGANAACAAACAGAA TITA TA AT 0,909

196

locus Séquence flanquante 1 SNP Séquence fJanquante 2 Score

Cytochrome P4S0 ACCCAGCGGTCAGAAAGTACGCTGANACNTTATCATTTCATTTTTTTATTGCATTG NG TATTATTTTGAGATA TGA TT ATGCAGAGTTTTCATAT ANNNA TA TTTTCAAATCT 0,728

GlycoProtein_Hormo

ne Receptor GACTCCTAAACACGCGTCAGCATCACAGTTCTCGGATGACAGACACGAACTTCAA NT CTrGTGAGAAAAGGCAAACAG TTGC TGACA TCTG TCAG TCAAA TGCCAGTG AG 0,928

Glutath ion_S_transf CACCCCAACCTGAGTGAATACCTCTCCTCCAG ACCCCGCTTTG TCGT AT AACTCGT C/G ACCTGANTCNTCAGAGCNNTGCAGGCCGTCAATACAGGCGATATACCGCGAT 0,426

erase

Ciaol like Protein AACGTGCAGTAGAGACAAAAGTG TATGGATTTGGGAAGG TAATCAACATCATGT AIT NTTTAATAATAN TAAN AGAAACTGAA TATATCT AAAT ATTGATAAT AA TGNAA 0,429

Orac3 GCCGGGGATCAGTTTACGTGTGAAAAAAGG AAA TATTT ATTGATGGAT AA TAG TG TIC GACGGAGTGAAAGGAAAGTNTACATGGGGATAAGTAGGAGGAAGTAACAGG 0,439

Adrenal_Gland_P rot

ein TTAATTGCATTTTGGA TTN AAAAA TT AA TGTTATGAAA TT AA TAGGTG ATCATATA TIC ACATATTTGTGATCATA TACATG ATACACACATATTTA TGTNN TG AA ATG TA TG 0,481

Astacin TATTTTGTTAAAGTTGCGATG AGAGAGC TAG AAAAA TAC ACATGTC TCCGA TTTA AIT ACCCAGAACCAATGAACAAGACTACGTGGATTTCATTGATGCTCAGGGGTAAG 0,939

Amylase GeneB 1 GG CTGGTTTCAGAGTGGACGCCG CTAAG CACA TGTG G CCCG GAG ATC TTCGCG C TIC GTTTTTGANAGACTGCATGATTTGAATACCGCCTATTTTACTGCAGGAACCAAA 0,62

Amylase GeneB 2 TCAGAGTGGACGCCGCTAAGCACATGTGGCCCGGAGATCTTCGCGCNGTTTTTGA T/G AGACTGCATGATTTGAA TACCG CCT ATTTT ACTGCAG G AACCAAACCC TTTA TA 0,423

IK Cytokine 1 GGTGAGTGAAATGTGCACCTNCAATGTACATGTATGAAGGGACAGGACTGTTAG TIC AATAAGCAGTGTTGTANAATAAAATAAAGCTCTAAGACTGGTACATTNACATA 0,55

IK Cytokine 2 TG AAATTCAAAGGGGTCAAATTAACAAATTTAAAGTTTTTGAAAA TT A TTCAG AAA TIC AAATCANTTTTT AT AAAAAATTACCAAAACA TAAA TTTTGG TAGCAAACTATAT 0,423

Phospholipase C 1 GAAATTCAAAGGGGTCAAA TT AACAAA TTTAAAG 1TTTTGAAAATTA TTC AGAAA TIC AAATCANTTTTTATAAAAAATTACCAAAACATAAATTTTGGTAGCAAACTATAT 0,423

BQ426586 TGGCACTrATGTATCTGACG TCA TTC ACAAAGCGTTTG TTGAGGTCAACGAGG AG NG GCACGGAAGCCGCCGCTGCTACAGCAGTAATGATGNGACTNATGTGCATGCC 0,647

Amylase Gene A CTGGTCAGCTrGGTGGATCTrAAACTTTCAAAGGACTACG TTCG TGACTCCA TCGC NG GGATATTTGAATCACCTG ATN AGTTTGGGTG TGGCTGG TTTCAG AGTGGACGC 0,425

l accase 2 CCGGATATTGTCGTCTATGAAGGTCAAACG TTG ATTGTCC ACGTCACAAACAG TTT NG GCATCTGATTCCGTCACTATTCATTGGCACGGNTTGCATCAGACGGGGACCCC 0,836

Macrophage express GTGGATTTTTGGGACTGAGACAC TG CTG TGACAA TT ACAA TGTC TACGGG AGCGC TIC AAATATCAGTCATTCTGGTGCGTTGCGCAAGGTCACGTNGATCAGCAATCTGG 0,913

Notch_homoloL3_v GTTTTG GAG CCATTTAAATCG AAATATTTAGACGAG TGTGAAAAGAATTG CTC TA A/G TGATAACGTGNGTGTTCCTATTCAAAACAATTTCCATTGTTACCCAAAGAAATA 0,633

arianty rotein

HA114 1 TAGGGCATATATCTATCAAGATGCAG ATCAT AA TGCAA TGAACCCT AAAATTTGTT NG TTATAAATCAACTTTAAATCATGGAGANTAAGACTNAAACTATTTGCCTTTGTT 0,838

KazaUypeyroteina TTAGTCAAAGATTACATTTACCATAATTTCTGTTGGATCATTTTCCATGTTTCATCAT

se inhibitor T/G TTCATTCTTAAGCTTTATGTTGG AGCCAGCAATTAGTAACAAAAAAATGAATCA 0,961

AY321300 TGATGAGTGGGGAACAGGACTrGACGCCA TGCAN ATAGCCCTCCAACTGG AGAA A/G AGTGTCAACCAA TCCCTG CTTG ACCTTCACAAGTTGGCNGAN G N TCACCG CGA 0,828

BMP GTCTGACATTACTCAGGTATGCATTTGATAACTTACAAACATTTGATAGGACACAA A/C CCGATATACTAGCGTTACTG TAGA TTCCT ATTT AAACGCAAAGGAA TT AA TATA 0,793

AJ557014 NTACAAACATTGCTTNGCTTCACTGTG AGAGGTG ACTAATGTAAGACTTGTATATT TIC CAGGCCATGCTGGATGTGAGTGCAGACGAGGGCTGGCTAGTCACCTCCCTAC 0,832

BQ427193 TTAGTCAAAGATTACATTT ACCATAATTTCTGTTGGA TCA TTTTCCATG TTTCA TCA T T/G TTCATTCTrAAG CTTT ATG TTGG AGCCAGCAA TTAG TAACAAAAAAA TGAATC A 0,961

Glycogen_Phosphor CTCAAGCGTGACCCAAACCAGGCCTTrG TTCCC AGGACTA TCA TGGTCGGAGGAA

ylase AIT GGCAGCTCCTGGCTATCACATGGCCAAAC TGA TCA TCAAGC TGA TCAACAGTG 0,753

Bel2 AGAGTTGGAGGCATCTCATTCGGT AAGGACTCGGCCTC TAGCGGAAT ATGGCG T TIC TTTTCCAACTGGTANCACCAGATCGCGCATCTGATTG TCTCCGGGCAGAATGA 0,471

Galectine 1 CGAGTACAACGATGCCTTrAGAACAATGG TCA TGGAAAGCCCTTrG TAA TTTC NT CTCACAGAACAGACTTCAGGAAGGGCAAGTTTC TCGTTCTGCG AGAAGG AGCT 0,924

sodium-Elucose_cot

ransporter 1 CGTTACTGAACTACAACAATGCCAGCTATCCGTACTGGAAGTGCGGTATACCCCC C/G GAGAACTCGATGAACCTGGTGAGGGCCTANGACGACGGCTCCCTGCCCTGGC 0,876

197

Locus Séquence fJanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score sodium...,glucose_cot

ransoorter 2 GGGCCTANGACGACGGCTCCCTGCCCTGGCCCGGCATCTTCTTIGGACTGACCAT TIC TCCNCTGTCTGGTACTGGTGTICTGATCAAG TCA TIG TCCAG AGAGCTCTIGCC 0,742

1RAF TIAAACAAATCAACAAGCA TGT ACAC ATG TAGAAT AGAGA TAAAN C AAACAACTG TIC TIACAGGTAATITIGTTGCACCTAAATTICACCTCAAGAGGACTAAAACGAATG 0,542 .

Ficolîn GAGCAGCGACTCTIGGGGCAGGAAATGGTGTCTCTAGCTACCAGAGTIGATACTC TIC NTIAAACAAAAGCGAAACCAATAATTIGATGAAATGCGAAAACGTITIAGACG 0,786 Ravi n _m 0 noxygen ase_l GTTIGACCCACTTCCGCCTGTCCTG GAG ATGA TGTGGG ATG ACGTCA TGGA TGAG A/C G GTACATGAACCTCCCGAACTGTAACACN TITGACTA TGAGA TCACAGGACCA 0,906 Ravin _ m onoxygen ase_2 GATGTGGGATGACGTCATGGATGAGNGGTACATGAACCTCCCGAACTGTAACAC T/G TTIGACTATGAGATCACAGGACCACAGTCCTACCGCTGTCTGAACCCCGAGGG 0,962

Deshydrogenase TTTTTTTGGATITAAACAAGTGTTACACAAAAAAATIGAGCCTAGAACTCGACAGT TIC CATCGTCGCAGCGACATCTCTTCTGGCTI AGA TA TGAAAA TAACTGCTACTA TC 0,942

,np EW778176 747 AGAAGTICATGAG G GATCCTA TCCGAATCTIG G TCAAG AAGGAAGAATTGACCCT AIT GAGGGTATCAGGCAGTICTACATTCAAGTGGAAAGAGAGGAGTGGAAGCTIG 0,948

'np AM854876 196 TCTGCCCACCACCCTG CATTICGACCCTC ACAC AA TACAG TCCTTG CCCACGCTGC C/G GGCATCCACACAAGTCAAGGGGCAGTATTCCCAGTAATGAGGACGCGGACAG 0,696

snp W777756367 GAGCCAAGCCTTICAAGTGCAAGGTTIGCGACCGCTGTTTCGCCCGCTCTGACCA TIC CTIGCTCTICACATGAAACGTCACGAGCCCAAATCCAAG TGAACACTCTICTCT 0,844·

,np BQ427052 349 CAAGAAAAGGAAGAAGAAGAATIACACCACACCCAAGAAGAACAAACACAAGAA A/G AAGAAGGTCAAGCTTGCAGTICTCAAATACTACAAGGTGGATGAGAATGGCA 0,932 i

,np CU682725_836 CTCCAGTCCAACAA TCTGTA TAAACTGCCATG G TGAAACTGTAAT AAAT ATG TAC A A/G TTICAATAAAAAATTIAGAGACAGTCAAACCCTCGTIAAACCATTCATGCAGGC 0,694

'np 854416 212 TITIGCTTCTCCTGAGGGTACAGGAAGGTCTTTGACCAATATGCCCAGCTTCTCCA TIC GAGCGATICCCAGCGCTIGACATCCAGGGTGACAATIATCCCCCACCCTCGGG 0,758 i

,np AM858631 462 TAAGATITIATGAG AAG TITGGATTTGAGA TIG TG GAAGAGAAAAAGAATTA TI A TIC AAGCGAATAGAACCAGCTGATGCATATGTGTIACAGAAATCATTCCGCAAAAA 0,988 1

,np AM859984 177 AAAGATIAGGGACAAGTACCCAG AGAGAATTCCTGTAATCGTGGAGAAAG ACCC A/G AAA TCCCAGATICAGGACAT AGACAAACGC AAG TICCTGGTTCCCAA TGA TA T 0,948

snp_AM860393 128 ACAACCTGCACAAGCCTGACCACCGCGTGATCCTGCTGC ACGTG ATGGAG AA TCT A/G ATIAATGTCAAGGACATG AGTCCGGGGCGT A TTA TTGAGCTCCAACGAG AGG 0,977 1

snp AM862312 607 ATAATIACCTACAACGATTCATICAAGGAAAAACGGACTATGGGTCTIGGTTTGA TIC TACACTCTG GAAATGGAGAGA TTTA TGGAGAG TCACCCG GA TTA TC CT ATCC A 0,969 1

'np AM863611_261 TTIGAAAACCAGAGAAGA TCTCC TAAAG GAC TIG ATG G AG GAAGCC AGACAG AG A/G CTGAGTAAAATCACAAAGG ACAAGCCC AAG TACAAGAAA TICATGGAGGG AC 0,996

snp AM863641 319 GAGGAAGAGGAAGAAGAATACACAG TIG AGAAAGTG G TGGACTCCAGGA TGAA A/G GGAG GTCGTAAAGAGTACCTICTG AAA TG GAAAGGTTACCCAGACTCAG AGA 0,991

snp AM866046 598 ACGCTCGAGTCGAAGTCCCTCTCCACATTGTCCCCAGCTCAGGATIAGGAAAAGC A/G TGTTIGGAATCTCTGATTGAACTTCCCAAGATCCTCTGTCAGGAGGAAGAGGA 0,991 •

snp AM869106 166 GATATAATCCGGACTCTTTICG TGTCAT AAG TGATG AAGCTGAAACAACTCG TGA A/G AGATICTCAGGAAATCCA TACT ACAGCCCACCGTCACCAGAG AGGTTIGAG AA 0,977

snp_BQ426574 124 GATATIACCAAATITTTGGCTTGTAACACCCATCTTGGAGCCACCAATGTCGACTA TIC CAGATG GAACAATATGTCTTCAAGAGGAAGCCTG ATGG TGTA TAC A TTCTAAA 0,997

snp CU681648 376 ACTTIAGAAATCAACCCCAGACA TCCTTTGATTAAAG AG CTGAAA TCACG AGTTGA T/G GCCAATGCTGACGATCAGA TIGCCAAAGACC TG G CTG TAG TCA TGTTIG AGAC 0,938

snp CU984453 266 CGAAAAGATCACGCTATA TTCG CAAAA TGAAA TITGTTGAAA TGGAAAG CGAG GC A/G GACAGACTIATICAAGAAAA TCAG AAGATGCGA TI AAAG AT AGAGGAG ATGG 0,972

snp CU988230 566 TGGATCTCGAATICGATICTAAAAA TGGCACCGGT ACGGGTGAACTC ATTITAG A A/G TGCGAAACTGTIGACCATCTTCCTGTCAGCGGAGGGTITATCACAGAAGCCCA 0,95

snp CU990619 287 AAGGAGCAAAGAAGACCACTAAGGCCAAGAAGTAGATGATTTTCTIGCAGACAT TIC TICACAATCCAGGGATTICCTCA TCAG TCA TCGTG TAGACCTAG ATTICCACCC 0,998

snp EF687775 1672 AG G CGCACCTCGACTCCGTCAG CAA TGTGAG CAAAATC AACGTGG TITTGAA TGG TIC GTCAAAATGTCGGATAAA TAAAACTCCAG TTGTAC TAAAGCAAAAGGAAGGAT 0,984

snp_FP000049 190 AACAAATACCACAAATGG TACAA TI ATACAAATTAG ATG TG ACAG AAAAAG AAGC A/C TATGCAAAGCTGAGAGAAGAA TITGCCAAGAACAAACATGTG ACAGA TITACG 0,917

snp FP000500 24 ATITICAGAACCTACAG AA TA TIGCAGCTGTGG TGCAGCA TAG TAAAGATAAACC TIC TIGTCAGTG CGAATIrnCGG AA TGAAAAAGAA TTI AACGT AACTCT AACACCC 0,994

snp FP001079 116 GGACAGACAACAATITIATATGATCTTCAGAGATGGCTTCCAAAAGGAAAGCTGC A/G AGTACTAAG GGAGCTGAATCAGACG AAGAAGCAAA TGGTG TIGA TAATTCAG 0,991

snp FP001634 190 CAGTGATGGAGTICTAGAAGAATACTCAACAGATGAAGAAGAAGAAGTIAAACC TIC CCAGAACCAACAGTCAACCCAAAAGAACTGACTIGGATGCCTTGGTTTIGGTA 0,958

snp_FP089799_114 GGTCT§ATGAGGTCAAACAAAGAATTCGA]CCACTIACTTTTACTTIGGAGCCAGC ~I§ TIGGACTAACTGCTGCTACTGCTGTGGCCATTGCCAGAACTCCTGCTCTAATGA 0,97

198

ANNEXE 6: ANNOTATION DES 384 SNPs GENOTYPES DANS lES ARTICLES 1 ET 5

N" Annotation Référence Nom duSNP

d'accession

AY551098 sodium ~Iucose _ cotransporter_1 Huvet,A. , Herpin,A. , Samain,J.F. and Cunningham,C. Gene. 2004 Dec

sod ium ...,glu cose_cotrans porter_1 8;343(1):21 1-20.

EU678320 Laccase_2 Faury,N., Renault,T., Barbosa-Solomieu,V., Brunetiere,C. and Moreau K Laccase_2

Submitled (09-APR-2008)

Unpublished 2008 Tanguy,A , Bieme,N. , Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme,F., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l. , Cancela,L.,

E5l34-6 AM 856073 NIA Dossat,e. , Favre,P., Huvet,A. , Jarque,S., Jollivet,D.,

Klages,S., Lapegue,S. , Leite,R. , Moal,J., Moraga,D.,

Reinhardt, R. , Samain,J.F., Zouros, E. , Canario,A.

ESl34-19bis CU682072 identique au précédent Unpublished Davey,G.2008

Macrophage express AAR82937 Macrophage_express Kanipes ,M., Holder,L. and Guenry,P. Infect Immun. 2004 Apr,72(4):2452-5.

CKl72342 Adrenal_Gland_Protein Huvet,A., Herpin,A., Degrem ont,L., Labreuche,Y., Samain,J .F ,

Ad renal_Gland _Proten Cunningham,C. Gene. 2004 Dec 8;343(1):211-20.

EU678312 immunog!obulin damain cell adhesion molecule Faury, N., Renault, T ., Barbosa-Solom ieu, V., Brunetiere, C. and Moreau, K.

Bel2 Submitted (07-APR-2008)

ESl36-3 1-1 CU683708 Neurogenic locus notch homolog protein 2 Unpublished Davey,G.2008

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bierne,N . , Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme,F ., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l., Cancela,L.,

E5l36-12 AM854726 Toll-like receptor 4 precursor Dossat,C. , Favre, P. , Huvet,A. , Jarque,S. , Jollivet,D.,

Klages ,S., Lapegue,S. , Leile,R., Moal,J., Moraga,D. ,

Reinhardt,R. , Samain,J.F. , Zouros,E., Canario,A.

ES136-8bis CU684209 Alpha tubulin 84B mRNA Unpublished Davey,G. 2008

199

Nom du SNP N'

d'accession Annotation Référence

SNPC1_HUMAN (016533) snRNA-activating Unpublished 2008 Tanguy,A., Bieme,N., Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

protein complex subunit 1 (SNAPc subunit 1) Bonhomme,F., Baudry,P., Boulo,V., Boutet,!., Cancela,L.,

ESTlO4-48-2 AM 858 621 (snRNA-activating protein complex 43 kDa subunit)

Dossat,C., Favre,P., Huvet,A. , Jarque,S., Jollivet, D., (SNAPc 43 kDa subunit) (Sm ail nuclear RNA-activating complex polypeptide 1) (Proximal Klages,S., Lapegue,S., Leite,R ., Moal,J ., Moraga,D.,

sequence element-binding transcripti Reinhardt,R., Samain,J.F., Zouros,E., Canario,A.

Amylase GeneS 2 ? Amylase GeneS 2

Cavortine CK172 31 5 Cavortine Huvet,A., Herpin,A. , Degremont,L., Labreuche,Y., Samain,J.F,

Cunningham ,C. 2004

EST34-30 CX069267 Succinate dehy drogenase David,E., Tanguy,A., Pichavant,K., Moraga,D. (2006)

SOD AY55109 5 SOD Huvet,A. , Herpin,A., Samain,J.F. and Cunningham,C. (12-2004)

Efl Alpha AB122 067 EF1_Alpha Yoshihiro Yokoyama Submitted (09-0CT -2003)

HA114 1 HAll 5 HA114_1 Duan,Z. , Zhao,K., Peng,Z., Li,J., He,S. and Zhao,X. Submitted 2009

GlycoProtein Hormone Receptor AJ 549 813 Gly coProtein_Horm one_Receptor Unpublished Herpin,A. and Favrel,P.

ES134-20bis-l CU683250 NIA Unpublished Davey,G. 2008

Amylase Gene A AJ496 597 Amy lase_Gene_A Unpublished Submitted (25-JUL-2002) Van Wormhoudt A.E

AJSS7014 AJ557 014 activating signal cointegrator 1 complex subunit 3 Unpublished Submitted (22-APR-2003) Herpin A

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bieme,N. , Saavedra,C. , Pina,B. , Bachere,E.,

Bonhomme,F., Boudry,P. , Boulo,V., Boutet,L, Cancela,L. ,

HEST34-8 AM856617 MAP Kinase-activated protein Dossat,C., Favre,P., Huvet,A., Jarque,S., Jollivet,D., Klages,S.,

Lapegue,S., Leite,R., Moal,J ., Moraga,D., Reinhardt, R .,

Samain,J.F ., Zouros,E., Canario,A.

Galectine_l BQ426390 Galectine_1 Gueguen Y, Cadoret JP, Flament D, Barreau-Roumiguière C, Girardot AL, GarnÎer J, Hoareau A, Bachère E, Escoubas JM.(Gene. 2003 Jan 16;303:139-45.)

200

Nom du SNP N"


Unpublished 2008 Tanguy,A., Bieme,N., Saavedra,C., Pina,B. , Bachere, E.,

Bonhomme, F., Baudry, P., Boula, V., Boutet,l., Cancela, L.,

ESTl04-43 AM858104 ENKUR_MOUSE (Q6SP97) Enkurin Dossat,C., Favre,P., Huvet,A.,Jarque,S., Jollivet,D. ,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J ., Moraga, D.,

Reinhardt ,R" Samain,J.F., Zouros, E. , Canario,A.

Unpublished 2010 Lucas ,S., Rokhsar,D., Wang,M. , Lindquist,E.A,

Ficol in HS 13 5 94 2 Ficolin Hedgecock,D.,

Boudry,P., Gaffney,P., Guo,X., Reece,K., Warr,G., Cunninghan

,Co

Flavin monoxygenase 2 AJ 585 07 4 Flavin monoxy genase 2 Boutet l, Tanguy A, Moraga D. Biochim Biophys Acta. 2004 JuI13;1679(1):29-36.

Cytochrome P4S0 AF075693 Cy tochrome_P450 Lopes,E. , Ohresser,M.C.P. and Cancela,M.L. (1998)

HEST36-28 CU683323 Chitotriosidase-1 precursor Unpublished Davey,G. 2008

TRAF BQ426742 TRAF

MyosÎn light Chain AJ563459 Myosin_Light_Chain Unpublished Kausland,AH. , Herpin,A, Favre!, P. and Cunningham,C.

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bieme,N., Saavedra,C., Pina,8., Bachere, E.,

Bonhomme, F., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l., Cancela,L. ,

ESTl04-36 AM856765 Oy ster-!lonadal-TGFb-like Dossat, C., Favre, P. , Huvet,A., Jarque,S., J ollivet, O.,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J., Moraga,D. ,

Reinhardt, R" Samain,J. F. , Zouros, E. , Canario,A.

EST36-35 CU686145 Suppressor of cy tokine signaling Unpublished, Lindeque,P. 2008

Astacin AF075684 AstacÎn Unpublished Lapes, E. , Ohresser,M.C.P. and Cancela,M.L. (1998)

Huvet AI Herpin A, Dégremont l , labreuche Y, Samain JF, Cunningham C. Gene. sodjum~ucose_cotransporter_2 AY551 098 sodium-9lucose_cotransporter_2 2004 Dec 8;343(1):211-20.

-- - --

201

Nom duSNP N"


EST54-40 FPOO 9463 Cam K4 (FA oxidation) Unpublished Pascal Favrel cDNA library Genoscope 2009

Amylase GeneB_l AJ496603 Amy lase_GeneB_1 Unpublished Sellos ,D.E. Submitted (25-JUL-2002) Van Wormhoudt A E

Phospholipase_C_l EF999947 Phospholipase_C_1 Sauvage,C ., Bieme,N., Lapegue,S. and Boudry,P. Gene 405 (1-2),13-22

(2007)

Glutathion 5 transferase AJ577235 Glutathion_8_transferase Boutet,l., Tanguy,A and Moraga,D. Mar. Biol. 145 (1), 53-54 (2004)

AY3213 00 AY321300 Ferritin Gueguen Y, Cadoret JP, Flament D, Barreau-Roumiguière C, Girardot AL, Garni er J, Hoareau A, Bachère E, Escoubas lM . Gene. 2003 Jan 16;303:139-45.

BQ427193 BQ427193 NA Gueguen Y, Cadoret lP, Flament D, Barreau -Roumiguière C, Girardot Al, Garn ier J, Hoareau A, Bachère E, Escoubas JM. Gene. 2003 Jan 16;303:139-45.

BMP CU98 652 4 BMP Unpublished Pascal Favrel cD NA library Genoscope 2009

Unpublished 2008 Tanguy,A , Bieme, N., Saavedra ,C., Pina,B .. Bachere, E. ,

Bonhomme,F. , Baudry,P .. Boula,V., Boutet,l. , Cancela,L. ,

Notch_homoloG-3_variant"'protein ? Notch_homolog_3 _v ariant-protein Dossat, C., Fav re ,P. , Huvet ,A.,Jarque,S . , Jollivet,D., Klages,S.,

Lapegue,S. , Leite,R., Moal,J ., Moraga,D., R einhardt, R .,

Samain,J. F ., Zouros,E. , Canario,A.

SNPC 1_HUMAN (Q15533) snRNA-activating Unpublished 2008 Tanguy,A , Bieme,N., Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

protein complex subunit 1 (SNAPc subunit 1) Bonhomme, F., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l., Cancela,L.,

AM85862 1 (snRNA-activating protein complex 43 kDa subunit)

Dossat,C., Favre,P. , Huvet,A., Jarque,S., Jollivet,D., EST104-48-1 (SNAPc 43 kDa subunit) (Small nuclear RNA-activating complex polypeptide 1) (Proximal Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J. , Moraga,D.,

sequence e lement-binding transcripti Reinhardt, R ., Samain,J. F., Zouras , E ., Canario,A.

G lycogen_P h os phorylase AY496065 Gly cogen_Phosphory lase Bacca H, Huvet A, Fabioux C, Daniel JY, Delaporte M, Pouvreau S, Van Worrnhoudt A, Moal J. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2005 Apr;140(4):63S-46 .

Drac3 BQ427 024 Drac3 Gueguen Y, Cadoret JP, Flament D, Barreau-Roumiguière C, Girardot AL, Garnier J, Hoareau A, Bachère E, Escoubas JM . Gene. 2003 Jan 16;303:139-45.

CiaolJike_Protein AY339886 CiaoUike_Protein Choi,D.S., Doh,E.J ., Kim,J .D.,Ahn,W.K. , Ahn,B.M. and Oh,S.E. Submitted

(1 1-JU L-2003)

202

N" Nom duSNP

d"accession Annotation Référence

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bieme,N ., Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E. ,

Bonhomme,F., Boudry,P., Boulo, V., Boutet,l., Cancela,L. ,

ES134-14 AM854479 NIA Dossat,C., Favre,P., Huve!,A.,Jarque,S., Jollivet,D.,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R. , Moal,J. , Moraga,D.,

Reinhardt,R., Samain,J.F., Zouros,E., Canario,A.

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bierne,N., Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme,F., Boudry,P. , Boulo,V. , Boute!, 1. , Cancela,L.,

ESTlO4-41 AM858002 NIA Dossat,C., Favre,P., Huvet,A., Jarque,S., Jollivet,D. ,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R ., Moal,J., Moraga,D.,

Reinhardt, R.. Samain,J. F. , Zouros,E., Canario,A.

HEST34-26bis CB617381 CD109 antigen précursor Boutet, 1. , Tanguy,A., Moraga,D. Gene 329: 147-157 2004

ES136-29-2 CU683194 Ras-like GTP-binding protein Unpublished Davey,G. 2008

Deshydrogenase BG467415 NADH Deshydrogenase Rafferty,G.P., Powell,R. J. Molluscan Stud. 68 (4): 397-399 2002

EST36-36-1 CU684879 Ras-like GTP-binding protein Unpublished Davey,G.2008

Unpublished 2008 Tanguy,A. , Bieme,N., Saavedra,C., Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme,F. , Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l. , Cancela,L.,

HES134-17 AM854673 Heat shock 70 Kda protein Dossat, C., Favre, P., Huvet,A. , Jarque,S., J ollivet, O.,

Klages ,S., Lapegue,S. , Leite,R., Moal,J., Moraga,D.,

Reinhardt, R., Samain,J.F., Zouros, E. , Canario,A.

EST36-29-1 CU683194 Ras-like GTP-binding protein Unpublished Davey,G.2008

203

Nom du SNP N"


Unpublished 200S Tanguy,A., Bieme,N., Saavedra,C. , Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme,F" Boudry,P., Boulc,V., Soutet,I., Cancela,l. ,

ESTlO4-40 AMB57B57 NA Dossat,C., Favre,P., Huvet,A., Jarque,S. , Jollivet,D., Klages,S. ,

Lapegue,S., Leite,R., Moal,J., Moraga,D., Reinhardt , R.,

Samain,J.F., Zouros,E., Canario,A

ES134-23 FP091069 Dopam ine receptor U npublished H uvet,A. 200S

Unpublished 2008 Tanguy,A. , Bieme,N., Saavedra,C., Pina,B ., Bachere,E.,

MSRA2_ANASP (OSYWDS) Peptide methionine Bonhomme,F., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l. , Cancela,L. ,

AMB5B7BO sulfoxide reductase msrA 2 (EC 1.S.4.6) (Protein-

Dossat,C., Favre,P. , Huvet,A. ,Jarque,S. , Jollivet,D., EST104-49 methionine-S-oxide reductase 2) (Peptide Met(O) reductase 2) Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J., Moraga,D. ,

Reinhardt, R., Samain,J. F., Zou ras, E., Canario,A.

Plastin AF07 5 691 Plastin Lopes,E., Ohresser,M.C.P. and Cancela,M.L. (199S)

BQ426586 B0426586 leukocyte elastase inhibitor-like Gueguen Y, Cadoret JP, Flament D, Barreau-Roumiguière C, Girardot Al, Garnier J, Hoareau A, 8achère E, Escoubas JM . Gene. 2003 Jan 16;303:139-45 .

ES134-21 CU6S3279 Tetratricopeptide repeat protein 2S Unpublished Davey,G.200S

Unpublished 2008 Tanguy,A. , Bierne,N ., Saavedra,C ., Pina,B., Bachere,E. ,

Bonhomme, F., Baudry, P. , Boula, V., Boutet, 1., Cancela, L.,

ESTlO4-33 AM8562 4 9 Neuropeptide Y receptor Dossat,C ., Favre,P., Huvet,A. ,Jarque,S. , Jollivet,D.,

Klages ,S., Lapegue,S., Leite,R. , Moal,J., Moraga,D. ,

Reinhardt ,R., Samain,J .F., Zouros,E, Canario,A.

Kazal ~pe"'proteînas e inhibitor CB61733B KazaL!y peJlroteinase_inhibitor Boutet, 1. , Tanguy,A. , Moraga,D. Gene 329: 147-157 2004

E5134-19-2 CU6S2072 identique au précédent Unpublished Davey,G.200S

204

Nom du SNP N"


Unpublished 2008 Tanguy,A. , Bieme,N., Saavedra,C ., Pina,B., Bachere,E.,

Bonhomme, F., Baudry, P., Boula, V., Boutet,l. , Cancela, L. ,

IK_Cytokine_2 AM857010 1 K_Cy tokine_2 Oossat,C. , Favre, P., Huvet,A.,Jarque,S., Jollivet,O.,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J., Moraga,O.,

Reinhardt,R., Samain,J.F., Zouros, E., Canario,A.

Calcium_Dependant_Kinase AY713401 Calciurn_Dependant_Kinase Unpublished Huvet,A. , Fabioux,C., Bacca,H., Le Moullac,G.,

Herpin,A.,Cunningham,C. and Van Wonmhoudt,A.

EST34-19-1 CU682072 NIA Unpublished Oavey,G.2008

IK_Cytokine_l ? IK_Cytokine_1 Sauvage,C., Bierne,N., Lapegue,S. and Boudry,P. Gene 406 (1-2), 13-22

(2007)

EST34-25 CXD68896 Cy tochrome C oxidase subunit 1 Oavid,E., Tanguy,A., Pichavant ,K., Moraga,O. J. Biol. Chem. 2004

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bierne,N ., Saavedra,C., Pina,B. , Bachere,E.,

Bonhomme, F., Boudry,P., Boulo,V., Boutet,l., Cancela,L.,

HEST36-22 bis AM857760 Superoxide dismutase [Cu-Zn] Oossat,C., Favre,P. , Huvet,A., Jarque,S. , Jollivet,O. ,

Klages,S., Lapegue,S., Leite,R., Moal,J., Moraga,O.,

Reinhardt, R. , Samain,J. F. , Zou ras, E., Canario,A.

Flavin monoxygenase 1 AJ585074 Flavin monoxygenase 1 Boutet 1, Tanguy A, Mor~ D. Biochim Biophys Acta. 2004 JuI13;1679(1):29-36.

Unpublished 2008 Tanguy,A., Bierne,N., Saavedra,C., Pina,B. , Bachere,E.,

Bonhomme,F' I Boudry,P., Boulo,V., Boutet,L, Cancela,L. ,

EST54-9 AM854810 inhibitor of kappab kinase epsilon Dossat,C., Favre,P., Huvet,A., Jarque,S., Jollivet,D., Klages ,S. ,

Lapegue,S. , Leite,R., Moal,J., Moraga,O., Reinhardt, R.,

Samain,J . F. , Zouros, E., Canario,A.

HEST36-31-2 CU683708 Neurogenic locus notch homolog protein 2 Unpublished Oavey,G.2008

205

ANNEXE 7 : PREPARATION DES LAMES D'HISTOLOGIE

1. Composition du fixateur de Davidson modifié

Réactifs Quantité pour lLde Davidson (mL) Ea u de mer fi Itrée 300 Ethanol 95% 300 Formaldéhyde 36% 200 Glycérol 100 Aci de a céti que (à ajouter a u derniermornent) 100

2. Les bains pour l'inclusion en paraffine

Réactifs Temps de balnéation (minutes) Ethanol 70% 60 Ethanol 95% 30 Ethanol 95% 30 Etha no1100% 15 Etha no1100% 30 Etha no1100% 60 Xylène 60 Xylène 60 Paraffi ne 45 Paraffi ne 45

3. Les bains Dour la coloration a l'hematoxvhneleoslne . . .

Réactifs Tempsde balnéation (minutes) Xylène 15 Xylène 15 Etha nol 100% 15 Ethanol 100% 15 Eau courante 5 Hématoxyl ine de Harris 1,5 Eau courante 5 Eosi ne Y 19/L 4,5 Ethanol 100% 1 Ethanol 100% 1 Ethanol 100% 1 Xylène 1 Xylène 1

206

ANNEXE 8: LISTE DES 384 SNPs GENOTYPES DANS L'ARTICLE 4

lD<us Séquence f1anquante 1 sNP Séquence f lanquante 2 Score

snp_EVV777756_467 CACGGGAGCCAAGCCITTCAAGTGCAAGGTTTGCGACCGCTGTTTCGCCCGCTCTGACCA TIC CTTGCTCTTCACA TGAAACGTCACGAGCCCAAATC CAAGTGAACACT CTTCT CTCT CCA T 0,844

SOC CTGTGACACCATTGGAGAACTGTACCANAATGAGCANGCCCCCAACCACGAGTAAGTCGG TIC TTIGTATTCTTTTGCATCTcrrACAGCCAAACTGGAAAATATTATTCTAATCTAAGAAAT 0,983

EST36_29 2 ACAeTICTGTCCAAATGTCCCCA TT A TTCTGGTTGG CAACAAGAAAGATACCAGAAACGA TIC CCCAACACACAAAAAGAGCTCAAAAAAAGCAAACAGGAACCAGTCAAATCGCAAGAGGG 0,975

HEST36_22bis TGACGATGCCTCAGATGCTGGAAGTGAAGCAGGAGATGAACCAGAATGTGATCATTTTAA TIC TTIGGCCCCA TITI AAAACAACTGCCAAAT A TTGAAGAACTTCA TYT AACA T ATGGAGTCA 0,97

Flavin_monoxy_2 GAGATGATGTGGGATGACGTCATGGATGAGNGGTACATGAACCTCCCGAACTGTAACAC T/G TTTGACTATGA GATCACAGGACCACAGTCCTACCGCTGTCTGAACCCCGAG GGAATCAAA 0,962

EST34_14 AAGGTCAATACATCAAATGCACAGCAGCCTGTCTTGCAATACTGTGTCAACACTTCAGGG A/G GTAATACAGGTCAAGTTAGAATCCAAAATGCTGCTCAACAAAATCAGCAAGGTGTTGTAC 0,956

Deshydrogenase 11 111 111 111 GGATTTAAACAAGTGTTACACAAAAAAATTGAGCCTAGAACTCGACAGT TIC CA TCGTCGCAGCGACA TCTCTTCTGG CTT AGATATGAAAAT AACTGCTACT AT CACGACA 0,942

Astacin ACCAGTATTTTGTTAAAGTTGCGATGAGAGAGCTAGAAAAATACACATGTCTCCGATTTA AIT ACCCAGAACCAATGAACAAGACTACGTGGA TTTCA TTGATGCTCAGGG GTAAGGC 0,939

EST34_19bis GATTAATTCATCAACAGTCCAGCCTTTTCTTACTGCTTTCATCATGGACATTCTCATATT TIC AGCA TGAA TTT AGCCA TCTCTGAAA TTCAGCAAAAATGAAA TTCAA TGTTTCAACA TITI 0,938

HEST34_17 CATGATGATGCCCACCAATAACAATGCCAATATGCTGAACAATTTGATACCAGT TIC AATTTGGG~CAGAAACAATGTAGCCAGGAATGCCAATATGATGAACGCCGT 0,937

GlycoProtein HR CCAGTGACTCCTAAACACGOGTCAGCATCACAGTTCTCGGATGACAGACAOGAACTTCAA AIT CTTGTGAGAAAAGGCAAACAGTTGCTGACATCTGTCAGTCAAATGCCAGTGAGCGAAGCC 0,928

Galectine 1 CGAGTACAACGATGCCTTTAGAACAATGGTCATGGAAAGCCCTTTGTAATTTC AIT CTCACAGAACAGACTTCAGGAAGGGCAAGTTTCTCGTTCT GCGAGAAGGA GCTGTATACT 0,924

M acrophage_express TCANTGTGGAnnnTGGGACTGAGACACTGCTGTGACAATTACAATGTCTACGGGAGCGC TIC AAA TATCAGTCA TTCTGGTGCGTTGCGCAAGGTCACGTN GATCAG CAATCTGGATT CCAG 0,913

EST36_31_1 ACACCTCAATGCTGCCAACATCCCCAACGACCAGATGG CTCT GACTCCACCCTATGACAA TIC GAGCA T ACACATGTGAACGACGTGGATGTTCGTGGTCCA GATGGGTT AACT CCCCT GA TG 0,911

EF I Alpha AAAAATGATCCACCAAAGGGCGCCAAGAACTTCCTTGCCCAG GT AAAACTTTACAAGAA T T/G TGATAGGCCTCAGTACATGTTGTAAAAGCATGANAACAAACAGAATTTATAATAACAT 0,909

EST36 35 TGCRGAAACCTGGCAAT ATGGTTCcrrCTCAATGTTG CCTA CACA TTC CAGCA TTCTCTC TIC ceCTCAGTCCGCCCACATTCCCAAGTCGACTACATCCATTGTCTAGTGCCAGACATTGTA 0,909

ESTl04_49 TAGA~GGAGTTAAA~GAAATATITIAGGTcnnTGGGAAAATCACAA TIC CCCACTCAAGGGATGCGTCAAGGGAATGA YAONGG RACTCA GT ACAGATCT GGGA TTT A 0,885

Sod...,gluc cotrans_l T ACAACGTTACTGAACTACAACAATGCCAGCT ATCCGT ACTGGAAGTG CGGT AT AC CC CC C/G GAGAACTCGATGAACCTGGTGAGGGCCT ANGACGAC GGCT ceCTG cecr GGC CC GGCA T 0,876

HAl14_1 TGGCT AGGGCA T AT ATCT ATCAAGATGCAGATCA T AATGCAATGAACCCT AAAA TTTGTT A/G TTATAAATCAAonTAAATCATGGAGANTAAGACTNAAACTATTTGConTGTTTNAACA 0,838

ESTl04 48 2 A TTCTGTTT ACCCCCACACAA TTTCCAAA TTCGGGTGG GGGGTCTGT A CA TTTTGT ATGG A/G AT AT ACTGCACTCAGCCGACYGTGAAACGT AGAAAGATCCGCGT GACACAAGATATCT GG 0,837

AJ557014 ATCANTACAAACATTGCTTNGCTTCACTGTGAGAGGTGACTAATGTAAGACTTGTATATT TIC CAGGCCA TGCTGGATGTGAGTGCAGACGAGGG CTGG CT AGTCA CCTCCCT A CGAATCACT 0,832

ESTl04 48 1 TTTCCAAATTCGGGTGGGGGGTCTGTACATITIGTATGGRATATACTGCACTCAGCCGAC TIC GTGAAACGTAGAAAGATCCGCGTGACACAAGATATCTGGAACAAGATATTGGAATTCCA 0,83

AY321300 GACCGTGATGAGTGGGGAACAGGACTTGACGCCA TG CANAT AGCCcr CCAACT GGAGAA A/G AGTGTCAAC~ TCCCTGCTTGACCTTCACAAGTTG GCN GANGN TCACCGC GATGCT CAG 0,828

ESTl04_43 TTGATCAGGAGAAGGGATGAAATGCAGAGAGCACAGGAGGAGT ATGATGCCTATGTTG C TIC GAGCATTTCOGTCGCGGAGCCATGAAATCTCTCACAGCCGACGAGAGAGCTGCAATTCTC 0,802

ESTl04 40 TTTTAAACACAATATAATTlTAATCTAATTGTACAACTTATATTTTATAAAGGGACACTT AIC TT ATCCAAA TTCACT AAACCACCA TTCA TGTGACTCA T AA TTGTGAA TTCCGGAG CCACT 0,794

BMP A TTTGTCTGACA TT ACTCAGGTATGCA TTTGAT AACTT ACAAACA TrrGATAGGACACAA AIC ceGATATACTAGCGTTACTGTAGATTCCTATTTAAACGCAAAGGAATTAATATATAAGAA 0,793

HEST36 28 GATTGATGACGACAKTAACGTGGGGATCAACCTTAAGAAACTTTTATTGCTTACTCG C/G TTTGTTTAAACAAGAACAAT AAGGATA nnnTCTYACACTCAGGAAAAA TTTGTA TTTCA 0,758

Sod...,gluc cotrans 2 GGTGAGGGCCT ANGACGACGGCTCCCTG CC CTGG CCCGGCA T CTTCTTT GGACTGA CCA T TIC TCCNCTGTCTGGTACTGGTGTTCTGAT CAAGrCA TTGT CCAGAGAG CTCTT GCCGCCAAG 0,742

HEST36_31_2 CACAGATGATGACATGCCAAAAGCAAGCATGCCAAGGTACCCATCCCTACAACCACAGCT TIC TGTTT ATCTRTGT ACCCA TAGCTTTAACACT AA TA CA TTT ATTYTTT ACTGTTTCTTT CT 0,698

EST36_36_1 ACTGTCTACCTCATGTAAAGAACAAAAAACCCAAAATCTCCGAGAACCTTACGAAT A/G TCATAATACTTAAATCACATTAAAATAACTATAAAATTTTAAAAGAATTGGTGAAG 0,66

207

looJs Séquence flanquante 1 SNP Séquence f1anquante 2 Score

Notch 3 TGAGTGTTTTGGAGCCATTTAAATCGAAATATTTAGACGAGTGTGAAAAGAATTGCTCTA A/G TGATAACGTGNGTGTICCT A TTCAAAACAA TTICCA TTGTIACCCAAAGAAATACCAGTG 0,633

EST34 6 TACGTAAACAAATATAATCTATRTCTGCATTTTGATTAcnnTGATATATAAGGTAAATG A/C TTCAATGCCTATAGAGCAAATATACAGTATTATAGTGcnnnTATAATTCGrrnnTACG 0,562

Adrenal Gland Prot GGAATTAATTGCATTTTGGATTNAAAAATTAATGTTATGAAATTAATAGGTGATCATATA TIC ACATATTTGTGATCATATACATGATACACACATATTTATGTNNTGAAATGTATGACTNTGT 0,481

Drac3 ACAGTGCCGGGGATCAGTTI ACGTGTGAAAAAAGGAAAT A TTT A TTGATGGATAAT AGTG TIC GACGGAGTGAAAGGAAAGTNTACATGGGGATAAGTAGGA6GAAGTAACAGGCCAGTTC 0,439

Amylase GeneB_2 TGGTTTCAGAGTGGACGCCGCTAAGCACA TGTGG CCCGGAGA T crrCG CGCNGTTTTT GA T/G AGACTGCATGATTTGAATACCGCCTATTTTACTGCAGGAACCAAACCcnTATATACCTG 0,423

EST34 21 TTGAGTTIATCACCCAGCTCCTCCA6ATGCTG CTG CCAGACRTCGTCTGA cre A/G CTGTCCGTCTCACTCTCACGR CTGCT GTIGTT cm AAAT AAAAAAA VA TTICCTT 0,406

snp_A~861624_248 TAATTATTTTACGTCAGAATGTGAAAATGAAAGTTGCTCATTCAGCCACGAGGAAAACTC A/G CTGAGCAAAcnnTCCAGTTTATACATAATGCAGTGAAAAGTGTGGACGTGTGTGTGTTT 0,998 snp A~862538_267 GGCAAAAAGGGGACCCCCTGGGAAGGAGGACTTTACAAACTAAGGATGTTGTTCAAAGA A/G GA TTACCCCAGCTO"CCTCCAAAGTGCAAGTT CGAGCCCCCA TTGTIT CAC CCCAATGT G 0,998 snp_CU990619_287 AAAGAAAGGAGCAAAGAA6ACCACTAAGG CCAAGAAGTAGATGATTTICTTGCAGACAT TIC TTCACAATCCAGGGA TTTCCTCA TCAGTCA TCGTGT AGA CCTAGA TTT CCACCC CTCT CT 0,998

snp_CU992707 125 TGATGACGACGACGATGACATTGACCTCTTTGGCAGTGACGATGAGGTTGATGAGGAGGC AIT GAAAAAATCAGACAGGAAAGATTAGCAGCATATGAAGCCAAGAAATCTAAAAAAOCCGC 0,992 snp A~864952_331 CCTGAACCTACTCGTT ATGGTGACTGGGAAAGAAAGGGGCGTGTGACA GAcnnTGAACA AIT TAATGCAATATTCAGAGCACATTAATAGCAGTGTcnTCATnniGGTGGATCTGAACTG 0,992

snp_A~863641 319 AAGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAATACACAGTTGAGAAAGTGGTGGACTCCAGGATGAA A/G GGAGGTCGTAAAGAGTACCTTCTGAAATGGAAAGGTTACCCAGACTCAGAGAATACTTG 0,991

snp_A~866046 598 ACAGT ACGCTCGAGTCGAAGTCCCTCTCCACA TTGT CCC CAGCT CAGGA TT AG GAAAAGC A/G TGTTTGGAATCTCTGA TTGAACTTCCCAAGATCCTCTGT CAGGAGGAAGAGGAAGAG TAC 0,991

snp_A~865369 256 GCACAAGAACTTTGAGATGACGGATGAAATGATTGTGGACAGAGTTTTCCGAGCcnTGA TIC GAGGACAATGATGGATTTATCAATGAACTTGAGTGGGTCAAAGGGCTGTCCATTTTCCTG 0,989

snp_OV736300_603 AGAAGATGTGAAGGGAATTCCACATTTCTGGTTGACTGTGTTTAAAAATGTTGACATGTT A/G TCAGAAATGGTTCAGGAACACGATGAGCCAATTTTACAACATTTACAGGATGTCCAAGTC 0,989

snp_A~8S8631_ 462 TGCAATAAGATTTTATGAGAAGTITGGATTTGAGATTGTGGAAGAGAAAAAGAATTATTA TIC AAGCGAATAGAACCAGCTGATGCATATGTGTTACAGAAATCATTCCGCAAAAAGGACAAA 0,988

snp A~858380_181 AACTTACGGGAATGTGCTGGTTTTAGATGGGGTTATTCAGTGTACAGAAAGAGATGAATT TIC TCA T ACCAAGAGATGCTGGCCCA TCT ACCCTTGAACTGTCA CCCAAATCCAAGAAAGGTG 0,986

snp_AM858743 147 ACATGGAGTTGATAATGTTCATAGCACAGATTTTCCTGGCGAGTACCCTGAcnTGATGA TIC GCATGGGATTTTAAAAAGTTTAAAAAGAATTTCCGCATTGACATGATAAAAATGAACGAT 0,985

snp BQ426370_37 GGATTAAGTGAGGTCTTCATATTATGGAACAGTCAGCTTTGTAAGAATTCACATAGCTAA C/G GTCTTCCACCACAGAAATTGGCAGAATCCCAAAGACTTACACAGACAATTIGAATTGAAA 0,985

snp AM858313 325 ACAAACAGTCGGGAAAATTTTGCAATTGATTGTATCATCCATGGAAGGCAAACCAGTGAG TIC CCTGAACAA TTTAAAAAAA TTAGCAGTGAAACTCTGACTGAGGA T ACTCTCACTGTCA TA 0,98

snp_AM863490_83 CAAGCTGTTCAAAAAGATTATCAAAAACATGTGAACCTTAGGCAACAGCTTGATGCTCAG AIT TGAATGAAAATTcnTGGTGAAAGAGGAGCTTGATCGAGTGGAAGATGGTGCCAATGTA 0,98

snp_AM863381_54 ATAAAACATGGCGATGCTTAGTITGGATAATCCGACATTCGAAAGATTTGCATTTTACTC TIC GGCA TTGCGATCGGAAAAACCTTGTT AATGAGTGCACTGACCGT CCGCT CAAGGCTT A CA 0,979

snp_AM869106 166 T AATCGATATAATCCGGACTCTTTTCGTGTCA T AAGTGATGAAGCTGAAACAACTCGT GA A/G AGATTCTCAGGAAATCCATACTACAGCCCACCGTCACCAGAGAGGTTTGAGAAGGGAATA 0,977

snp_CU984453 266 AGCCTCGAAAAGATCACGCTATATTCGCAAAATGAAATTTGTTGAAATGGAAAGCGAGGC A/G GACAGACTTATTCAAGAAAATCAGAAGATGCGATTAAAGATAGAGGAGATGGAAACTCT 0,972

snp CU987ll2 458 AACTGACTCGGTGAcnT ACTCAGGCAACTTCTCAGGAAACAGA CTCTT A TT CAGGAAGC TIC GTCCATCGCCTACAGACGAGGACATCGCACAGCGATGAGTTCCAGTTTGATTACGATG TG 0,972

snp_A~8S3792_146 A TTCTCTAACGGTTTGTTCGGCTGCTTCAACAACTG CACACT GTGCCTTA TT ACTT AT AT TIC GCCCCATGTTACACTGCTGGGAAAAATGCTGAGGCGGTCGGGGACTCGTGCATCATGGT 0,971

snp FP089799_114 TTCTGGTCTGATGAGGTCAAACAAAGAA TTCGATCCACTTACTTTT ACTTTG GAGCCA GC A/G TTGGACT AACTGCTGCT ACTGCTGTGGCCA TT GCCAGAA CTCCTGCT CT AATGAAT A TTG 0,97

snp AM862882 512 CAACTTCTATGCTCAGTACAGATCCATTGAACCGTATCTGAAGAAAAAGGATGGCAGTGA A/C AAGAACATTGGAGACAAGCAGTACCTACAAACCACAGGGGACAGGGCTAAACTGGACG 0,967

snp_EVV779545 265 AGGAGGCAAAACCTCAGGA TTTGGTTT AA nT ATGAT AGCTTGGACTTTGCCAAGAAGTT TIC GAACCCAAATACAGATTACAGAGACATGGCTTAGTAGAAATTAAGAAAACCGGCCGAAA 0,967

snp_AM864324 160 GGATGATACTAAAGCCCTTGGAAGGAAGTTTGTTATCAAAGATTTGGATGACACTCACTT A/G TTCATCTCAGCAGACA TTCTCGAAACTCTTCAAGATCAAGTTGATGGACT GA TGGACAAA 0,966

snp AM866419_269 AGCATTTGAAGATGTTGGACATTCCAATGATGCCAGAGAGCTGATGAAAGATTATTIAAT A/C GGCGAACTTCACCCAGATGAT AAAAAGGGAACATCAGT AAAGACCAACACCTCTTT CAAT 0,965

snp_CB617405_591 TAGAGGAATGGACATTGAAAGAGTCAACATCGTATTTAACTATGACATGCCAGAAGACTC T/G GACACTTACTTGCACAGAGTGGCTCGTGCAGGTAGATTTGGAACAAAGGGTCTTGCTATA 0,964

snp_AM854342_374 GAAAAGCCAGAAAGGCcnTGATGAAATTAAATATGCGACAACCAAATGAAAAGATGTCT TIC TCGA TTOTGAAGGAGAACA T AGTTCCTTT AA TT ATGGAA TTTGGTTCTGAAAGAGCA TG 0,963

208

Locus Séquence f lanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp_AM85503S_382 GGCCTCCAAAGAAATATCAGCCCTAGATAAAAGAGCATTCTGGTCTGATGAGGTCAAACA A/G AGAA TTCGATCCACTT AmTI ACTTIGGAGCCAGCA TTGGACT AACT GCTG CT ACT GCT 0,963

snp AM859901_237 AATGGAA TTGGATGACCAGGAAAAAACAAGGACAGCTTIGCTGTTTA TITCeCA r GGACT T/G GGGGAACACTTTGATTATTACGATGAGCTTGGATATTTTCTAGTGAATTCTGGCTTTCGA 0.963

snp_AM859467 449 TCCAGAAGAGGTGTACCAAGCAACTAAAGACAAACAAGTTTACAAATGGGACAGAAACTC A/G GACCTGAAGAATGAACAACAGCAAGTCAGAACAGGCAGACAGA CTTGCAGAAGAGCAA 0,963

snp_AM855102_ 431 GTGTGAAACAGCACACCCCT ATGAA TTCITTGCCAGACAGG GTGTT CA TGAT ATGeT AGA A/G CA TGGC6GTTCCAAAATCTT ACCTGTT ATACCTCAGTT AATCA T CCCAA TT AAAAATGCA 0,962

snp_AM861624_Z99 GGAAAACTCACTGAGCAAAcnnTCCAGTTTATACATAATGCAGTGAAAAGTGTGGACGT T/G TGTGTGTTTGTITICACCTGT ACAGACCTGGCCGACCTGTTGAT ACAG GCTGI GGG GAGA 0,961

snp_AM8S6019_65 GTATTTCCAGTACCTGCCCAATGATTnnTTGATAAAAAATGTAAAATTGTGTACATCAT TIC CGTAATCCCAAGGACA TCGCTGTGTCGTITT ACAACCA TCACAAAAAA-cTT CTGGAGTA 0,96

snp_AM868440 329 AGATTTAAGTTTAAGTCCAGAATCTAGAACTGTATTGCTCATCGCGTGGAAATTTAAAGC AIC GCAACACAGTGTGAATTCACAAAAGAAGAATTTGTCAATGGAATGACAGAATTAAACTGT 0,96

snp_AM869032 351 GAATGTATGACAGAGGCCTGATATCAGAGGCTAOTCAGCCCCG CTAGCAAAACC CGAGG A/T GGAGGAATACAATCCATTCAAGTTACCACCAAAGCCAGTGAAAAGCGATTTAGACAAAG 0,96

snp_AM859871 333 CTACTCCATCACAGCCCAGTCCACATTCAATGACCTCCAGGATCTACGGGAACAGATATT A/G CGTGTCAAGGACACTGATGATGTGCCCATGATTCTGG TGGGAAACAAGA6TGATCTGGA 0,958

snp AM863574_174 TCATTGCAGTGATGGAGTTCTAGAA6AATACTCAACAGATGAAGAA6AAGAAGTTAAACC TIC CCAGAACCAACAGTCAACCCAAAAGAACTGACTTGGA TGCCTTG GTTTTGGTA TTA CTTT 0,958 1

snp_AM855470_207 AAAATACCTCAAGAATGTGATGGCAAA6AAAGAAGTGGTTCCCTTCCGTAGATTTAGTGG AIC GGAGTGGGACGATGTGCACAGGCTAAAGCCTTTAAGCATTCCCAAGGTCGCTGGCCAAA 0,957

snp_AM861154 365 AAT AAAGAAA TTTGTT ACTGAAAGAT ATGGTGTT AAA TTTGAT ATGTTT AGCAAAA TTGA A/T GTCAATGGGAACAACGCCCACCCACTGTACAAGTATCTGAAGGCCAAGCAAGGC GGCAC 0,957

snp CU986744_318 ACTCAGTGCCCGTGCCCAGAATGTGCAG CCAACAA TCAG GGTTACGTCA T AA TGGTAG CC A/G TT ATGCCCCGGATGT ACAGAA TTGTCAATCGGTCCG CCAATGT CCAGGA CGTG CTGTATG 0,957

snp AM856753 332 AAGAAGAAAATCCCAGTCTTTACCAGCACACCAGGTACAGGGGGATAATACTGCTACACA A/G GCATCCTCAGACAGCAGTCCAGTCAAACGACGCAGAGGGAGACCGAGGGGGACCCCAA 0,956

snp_CU999066 97 GTCCAAGAACAACAGTGCCAAAATTCITCCTCCGCGAGAACCCGGATCCITTTTGGTGGG A/G AA TT ATGA TTTCAAACCAACGA TTCCAACIT A TTTAGAGTTGTGGCGT AAACA TGGCGA C 0,956

snp_CU998226_258 TGATCITCTGCAGAGCATTCAACTATACATTAGTTACCCTGACAACCATCGATCAGTACA AIC GTTCA T AAAAGGTCA TCTGACCACAA TT ACAGGTGGAT ACA TCTCCTCCGGA TT CTGGA C 0,955

snp_DW714015 27 GCAGCATAATAACCACTGGTOGAATCTCAAGTCAGCITAATGCAA TGTGGTCTGTA TGCA TIC ACAGCGTAACTGTGTA TTGAAAGTGTACA TTTAGCA T AATGTCITCA TTT ATCA TCCGTT 0,954

snp ~26S64_125 GTCAACCTGGAAGTCCAACTACTTcrTGAAAA TTTCAAGCCTGTT AGATGAAT ATCCCAA A/G GCCTTCATCGTGAATGCTGACAATGTCGGATCAAAGCAGATGCAGCAAATCCGCCAGGCA 0,95

snp_AM856186_569 ATCTGATCAACCGGAAGTGGAAGCT AAGTGGATCT ACTTTCCTGA CAAAAACITTTTATC TIC TGGTCCTACGCCTTGGTGGCGGTTT CCG GA TTTCTGT CC CTGTTT GGTTCT AT GTGTGGT 0,949

snp_AM859984_177 GTCCACAAAGATTAGGGACAAGTACCCAGAGAGAATTCCTGTAATCGTGGAGAAAGACCC A/G AAATCCCAGA TTCAGGACA T AGACAAACGCAAGTTCCTGGTTCC CAATGATATCTCT GTG 0,948

snp_CF369132 326 A GTTGCCCAACATTT AGGTGAAAA TGTGGTCCGT ACTA TTGCTATGGATG GT A CTGAG GG TIC TTGGTGCGAGGAGCTCAGTGTATTGACACTGGTTATCCAATCAGAATCCCTGTAGGAAGA 0,948

snp_AM853969_249 TTGAACGCAcrnTCTcnnTAAATCAAAAGACCCAACAAAAAGTTGAGTTTTTCAAATA A/G A TTTT AAAA TTT ATGGAATCGCCCCITCTCCCAA TTTTGGACAGAAAATGTGAGACCCGA 0,947

snp AM866360_263 GAAACTACAAATCAAAGTGGATGATGATGGAAAGATAATTGATGCCAAATTCAAAAcnT TIC GGCTGTGGATCAGCT A TTGCTTCT AGTTCCCTAGCAACAGAGT GGGT CAAGGGGAAGAA 0,945

snp ~26570_128 TGCTCIT ATCAAAA TT AAGAATGAAATGGACCCCACTCT AACTTTTCGACGATCCTGTCG TIC GAGGGCA TTTGTGGCTCTTGTTCAATGAATA TTGGTGGAAGCAACACA TTG GOT GTCT A 0,945

snp_CU683857_112 TCCGTCTCGTTCCGTTGTGGTGGT CAA TTIACCAA TGGAAAACCCA TCGA TTGAAAATGT A/G GCAGAAATGTITTCCAAATGTGGTGAAGTTTCGCTCATAAGAATTCTAAGACCGGGAAAG 0,945

snp CU992707 _194 CAGACAGGAAAGA TT AGCAGCA TATGAAGCCAAGAAATCT AAAAAACCCGCCCTCA TCG C AIC AAATCT AGTCTTCTTCITGATGTGAAACCCTGGGATGATGAGACAGACA TGAAGAAGATG 0,945

snp_AM853687_32 CAAACCGAGAGCGGCATTCGATAATTCCTGTTTTGCTGCGTCAGTGAACGTACGG A/G CGGGATTGTCACAGAAGTCTTTCACGTTCTCITTTTAACGTTTTACAAACTCAACAACAT 0,944

snp_AM857913 323 CAGTCATATGGAAGGGGCTAAACAAAGCAGCCATAGCATlGGTTTAGAGGGAGGAAAAA A/G TAACAGCACACCGA TTAGTGAT AGCCAATCACAGCCCTGTT CTTCCAAACAA TT AACTTG 0,944

snp_ AM861654_152 ACTnGAAAGGGA TTTCTT ACAACT ATAAGCGACAGCAATCA TCA TTTTTCAAACACTCC A/G ATTIATATTTAATTCCGGTCAAATTCTGATGTGAAATAATCGCGAGTGTATlCGTCATAC 0,944

snp AM853758_293 AA TTCTGAAGAGAAT AGAAGGCGCT ACAGAGA TTTGCTGTTTTCAACTGACAAAAGCCTT T/G CAGAGAACATCAGTGGGGTCATCATGTTCCATGAAACATTTTATCAAAAAACCAAGGATG 0,943

snp_AM861494 377 AGAGGTAACTCCACTCGTTGGTGATTTGATCGGGAGTGGCAATTTTAATAAACTTGAAGT TIC ATGGTGGATAGTGAGCTTCTGAAGTGCCTAATGGTGAACATAGAACAGCAACCTTGGATT 0,943

snp_EVV778242_645 AGATACAGTTGTAGAACCATACAATGCCACACTCTCTGTTCATCAGTTAGTA GAAAACAC AIC GACGAAAccrrcrGCA TTGA T AACGAGGCTCTGT ATGACA TTTG CTTCCGTACACT CAAA 0,943

snp_CU994090_266 AATTTCACATCTTGTTTCAAAGAAAAGGACITTTTGGTTTTCITTTTCAAACGACTGAGA TIC TGAATGAAAGTGACAGATACGCAGATGAATTTCCCTATcnTCACCATGTGGTAGAGAAA 0,941

209

LDeus Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp_SQ426841_203 TGGAGCTGTTCAAAAGGGCATGCCACACAAGTTTTACCATGGCAAGACTGGTAGAGTTTT TIC AATGTAACTAAACACGCTGTTGGAGTCATCATCAACAAGAGAGTGAGGGAAAGGGTCAT 0,94

snp CU986741 195 ACAGCT A ITTCAAGTCA TCA TCA TnT A TITGGGGTIGT AGGGTTCA TrTGG GGTT ACA T AIC TGTCAACAGTTCTCACAGACCA TGT ACA. Tm AcrTGCTG GA TTIGCA CT AI CA TGCA TT 0,939

snp_AM857062_374 CACAGCGGGTCAGGAAAAGT AT AGATCTCTGGCACCT ATGT ACTA CAGAGGG GCA TCAG C C/G GCCATTATTGTGTACGACATCACAAGGGAGGCCACTTATAGAACAGTAAAGGACTGGGTC 0,938

snp EVV779181 749 GGCA rCTCCAGCTGGGAGCCAcrrcCTCA T AATCA cm CAGGAGCT GTTICT mCCAA TIC TCCTTATCCTCAGCTGTGAGTTICACTCCCA TTTTTTCAG CCAGAG CAAGTGA TTT creT 0,933

snp_AM85S000_378 AGCCCAGCAGAAAATATTCCAAGTGGTTCTCAAGGTCAATTTAATCAAAGTCCTACCGCA TIC AT AATCAAAGTCCCTCT ATGCAAAGAGGAAAT ACTTGGCCT AGTTCAAGAAATCAACA TG 0,932

snp_AM858186_636 GGCCAAAT ATGGGATGTCCA TGTGCGTGTTGGGGATGT CGGAG GAGTTT AAACCITT GTC A/G A TTGCAGTGAATGcraCTGGCCCCGT ACT GCAA TTTACACT GCTG CCA TG GAGATGTT A 0,931

snp_AM860034 48 AACAGCGTCAAAATGACGGACACT ATGCTTGTTCGTGCTCTT AAG GGT AAACCAAAAGCC TIC TAAACCTATGCAATAAGAAATTAGACAAAGTGCCAAAGATCATTGGAAAGCTTGATTGTG 0,929

snp FP008372 101 AATGACTGAACGAGATCTAGCAGACGACGCGCAATGGAAGGTAATTCAGAAAAATACCTT TIC ACCAGGTGGGCCAACGAGCACCTGAAAACTGCCAACAAGAATATTAATAACTTGGATTCT 0,929

snp BQ426928_ 40 CGACATGAAACATTGGCCATTCACAGTGATCAATCAAGCAAGTAAACCCATGATCAAAGT AIC GAGTACAAAGGGGAAGAAAAGACCTTCTCTGCTGAGGAAGTCTCATCCATGGTCCTCAAT 0,928

snp_EVV777736 246 CACA T ACCAGTCCA TGGCTCTCTACTTCGAT CGGGA CGATGTG GCTTTG CCAG GA TTTCA TIC AAGTTCTTCAAGCACTCGTaGACGAGGAACGTGAGCATGCCGAGAAGTTGATGAAATAC 0,928

snp EVV779181_638 TGATTTCTCTTTGGGGCTCTTCATGCAGGTGGTGAAGACATGGTAGATAGGGGTCAAGAT A/G TACTTGACAAATCCACGATCTCCAGCA TTGGCA TCCTT GGAC CA TTTCTIGT CCTT aCA 0,927

snp EVV778458 567 TGTTCTGAAGAAGAA TTGCCCCCACA TTA TTGTTGGT ACACCT GGT AGAA TTCT AG CC CT TIC TGCCATTCCAAAGTCCTCAACCTGAAGAATGTCAAGCACITTGTTCTTGATGAATGTGAC 0,926

snp_AM856944_535 CAGTTTTGATCCTGTGGGGTCA T ACGGATCGGATGG GTAC CGAGC CCGAG GGTCA GCAG C TIC GCCATGTTACAACCTCTGTTAGATAACCAGATTGGTTTGAAAAACCAGCAAAACGTCCAG 0,92

snp AM858680_74 AGTCA TGTTTGAGACAGCCACCCTCCGGT CAGGA TTTG CTCTG CAAGACTCT GCTG GGTT TIC GCTGAGAGGGTAGAACACATGCTGAGAGAAGCCATGAGCATTCCTCAAGATGCCAAAAT 0,92

snp CU682053 467 GAGTGTGGCITTCTCAGCCGACAACCGACAGATTGTGTCTGGATCCAGAGACAAATCCAT TIC AAACTGTGGAACACTCTTGGAGTCTGTAAATACACAATTCAGGATGAGGGTCACACCGAC 0,92

snp_AM860592 273 TGAAGGAAAACAGAAAAGAGAAAAGGGAAAGAAAGATGGAAAACAAAAGAAACCATGA TIC AATGTCCTAAAGATTTGTCTTCCAGTGTTTGGGGTGATCATAGCCATAATTGTGGCATAT 0,918

snp CU683658 368 AAACAATGACCTTATCGCATTTTCACAAAAATTGGAGAAAGCCTGTGTTGACACTATTGA TIC AGTGGAAAAATGACCAAGGACTT AGCTGGTTGTAT AT ATGGGTTGAAGAATGT AAAACCC 0,918

snp EVV778390 285 CACAGCTCTTGGAGCTCAGGTCCAGTGGAG CAGTTGTAACA TITI CTCT A CC CAGGA TTT TIC GCTGCAGCAGCCATTGCCAAGACAGGGGTTCCTGTGTATGCATGGAAAGGAGAGACAGA 0,918

snp_AM863641_ 406 ATGGAAAGGTTACCCAGACTCAGAGAATACTTGGGAACCAGAAGCAAATITAGATTGTCC AIC GACCTTATAGCAGAGTTTGAGGAGAAAAAGAAGAAAAAAGATCAAGAGAAGAAAAGAA 0,917

snp AM865369 184 ACAGATGCTGAAGCAGCAATGCCCAAACAGTCCCAAAATCCGCATGGACCGCAATAAGTT TIC AACGACTTTGTGCACAAGAACITTGAGATGACGGATGAAATGATTGTGGACAGAGTTTTC 0,916

snp_AM861389 162 TCAGTTTGAGAGT AT AAGCTCAACA TTTCTCCAACTGCAA TTCAACGAAACTCT AAAA TT T/G GGA TTCTTCGAAAAGAA TTGAACAAGACAA TIT AAGGAGTTTT AAGACCA TGGA TTCTGA 0,912

snp_AM858494 211 AAATGGCATCTTCCTCGGACCAGGTCGGTTTTACGCACAGATAGCAGTGGCCAGTTTCTT A/G GGTGGACTTATTTCCGCAATCGTTGGAATATTGTTGATAACACTAAGAACTCGTCATGTA 0,911

snp_AM861208_ 421 TACAGAAAACTGCCTGAAGGAGAGACTTGGATAATTTTGATTGAAAGCCTGTGAATGAAG A/G AAGTGATTGGTTGTAGGGACGACCCACTAATGTGCTAATCAAGTGCTTGGTCTAGATATT 0,91

snp AM857471_352 AAAA·TTCAAGATGAAGTCAGACTTGCTGCAAAGGCAGCTATTGCGGTTCGAAGGAAAGC TIC CTGCAGCAACTTATCCAAAAAGAGATTGACATGTATGAGCAGGAACTTAGCTTACTGGGT 0,909

snp_AM858323_344 GGAAGACGTCCTCCGGCCCCCTGTACTGTAACCCCACCCTCCTTCCCTGGACATTCTTCG TIC CTGTITCATGGTCAACATGTGCCTGAATCTGTCCTGGATCCTCCTCITTGACAGAGAACA 0,908

snp_AM867415_381 TCCTGAAGA TTATGCCCCTCCGAAA TTT AACAAAGTGAAATCGGACTTTAATGC CTTCCC TIC GATCTTTCCAAAGCTGAGGGT AAGCTTCAGCAGCTGGT AG CAGAGATGC GGC CC GCA TC C 0,908

snp AM861626 196 GGCACCTGCAGCAGAGCCAGAAACCTCTGAAAAAGCAGATGATGA TTTTT CACTG GACTT TIC GGTATCAAAAAGAAAAAGAAGAAAAAGAAAGCATTTGATATGAATGAATTGGAAGACAA 0,907

snp AM858814 476 TTAATATTTATTATATTTGCTTTGTTTGATCCCATTCITTTGTTGGTGCCAAAATAAGTT TIC CTATTTGCATGAAGTCATCATAATATTTAGATCCCCCATATAAAGATCAATGAGGAGAGA 0,906

snp_AM858186 333 GCCTGTGCCGTGGATATCAGGAATGATGGGGCCA TCCA GTCG GCCA T GAAGGAAGCAG C A/G GACAAGTTTGGGGGGATAGATATCCTGATCAACAATGCCAGTGCCATCAGCTTGACCGGG 0,905

snp AM860852_202 TAAGTATGTTCAGAACAATAAAGAATCTGACAATGACTGGTTTCGCCTAGAATCTAACAC AIT GAGGGCACTCGCTGGTTCGGGAAGTGCT GGT ACGT CCA CGAGCTT CfCAAAT ACGA GTTT 0,905

snp AJ565506 195 CAACTCTCTGGACGTCAACCATGATGGCAAAATCTCCATTGAGGACGTCGAGGAG TCCAG A/G AACAAATTCACCAACCTTCACGAGCTGGTTGGAGACAAAGCCAAAGGTGTCCAGGTCAAT 0,904

snp_AM854835_518 AACAGGGAAAATAAACCATTTTTAAAAACATTTACATGTATTGAATTCACAATGAAAAAA AIT TGTACTTGTGTGAACTCCATTGAAGATATTTATGTATTTTTATTGTCATTCATTGCCAAT 0,904

snp_AM86734~~5~ GGGT AGGTTCT ATGGAATCAGGTGGTTCCCTGGATA TTCCT ATGGTTT CGACA GGTACCC T/G AAGTGGCAACTTGGAAACCGATTCAACAATGAATGGGAATTCTTTCCTCCCAAGGAAATT 0,903 -

210

"""" Séquence flanquante 1 SNP Séquence f lanquante 2 Score

snp_AM868054J9 AGTGTCCCCTGAACGAAAGAAACAGCTGGAGGA TITTGGTCAGTATGTT GGTCAGT Geer A/G CCCAGGTATGTlCAGAAGGTGCGTCT AATGTCTGGG GACGAGTI GGAGA neT GATCCA T 0,903

snpAM8603048S AATGAAACAAATGATlACAACAGATTGAA6AATGCTGTAAGTGCAACGGATGTGACTGCT A/G TCAGGAGATTGATTAAGGGTGGAGTTAATGTCAATTCACGCTCAGCTGCACAGGATTGGA 0,902

snp FPOOOO71_19 AGCCACAGA TTATGACCCAGCTGACAAGACCA TlAcrec CA TGGGAG GerT CCCTCA TTA TIC GGA6AGGTCAACCAGGACTTTGTCATGATCAAGGGATGCTGCATGGGATCCAAGAAGAG 0,902

snp_EU678313_434 ATGTGGTGAAGTTTCGCTCATAAGAATTCTAAGACCGGGAAAGTCAGTGCCACAAGATGT A/G AAGAAGCATGCCACTAAGCATCCTGAAATlGGTACAACAACCTGTGCTGTGGTTGAATTT 0,901

snp AM8S8867 164 ATGATTTGGAGTTCACAGATGACGAGATAAGA6ATGAATTATCAAAGTTAGGGTACAGAA T/G CATCCCTAGTGAGAGACTCCAAGAGTTTAAAAAA6ATTTGAGAGTGCTTATACAACATGA 0,899

snp AM861357 589 CTCCACGGAGCCGGACAACTGGTGGACAG GATGAGG CGGT ATGAACAAATCTA CGG CGA A/G CAA TTCACACCCTGCCAGCTGTT ACTGGATCA CGC GAAAGACTCCT CCAAGAAA TTC CA T 0,899

snp A~857816_166 TACCAACACTGCTGGAGCTCTTAAATTCTTGCACAGCTACATGTTTGATCCGAGAACCGG A/G GGAAGAGATGACGCTAGCCATGTTGCAATCATCATCACAGACGGTAGATCACAGAACAA 0,895

snp AM859467 518 AATGAACAACAGCAAGTCAGAACAGGCAGACAGACTTGCAGAAGAGCAAAGTTGTGTCT A/G GATGAAAATACGGGCAATGAATCTGAAGGAGCCAAAACCAGAAGAAGACAGG GACCAA 0,895

snp_CU685076 185 ACCA TTT ACACCCGAAGAT AT AGCAGACGAAACT AAAAGAAAAGAGCTTCA T AAACGTTT A/G GAGGAACACTTCAAAGATGAAGACTTGAA TTCACCCAAAAATCGAAT ACccr ATGGATAT 0,895

snp CU99700S_286 TGGGTCAGGA TTGTGCGTTGTTGCCACACTT AG CGAAGACACA CA TCACA TTGA CGTTGA A/G GAATGTCAGAGACGGGGGATCGAACTGGTGACCTTACCCAAAATGTCTAAGGACA CTGT 0,895

snp_A~8SS277 64 TGATTATTTAGGCGCAGAAAACACTCAAATAATGAGTTCACCTGATGAAAGCACCAATAA A/G CCAACAGGAGACGATGT A TTCGTT AAACCAGCAACCCCTGA TTT GTCCACCGCTGAGAAA 0,894

snp AM863710 107 ACTGTTGGTTTT AGCAGTTCTGATCAGCTTIGCTGGTT A CAGTTTGT CTGAGGAGGA GAA TIC GTTGCCAGACTACTAGCATCAAAAAATGTACTTAACCAGTATTTAGTGGAAGGCAGGGAT 0,892

snp ABl.22064 98 CAAGCCAGCACAGCAAGCCATTGGAATAGATCTTGGTACCACATATTCCTG TGTTGGAG T AIT TTCCAGCATGGGAAGGTGGAAATCATCGCCAACGATCAGGGTAACCGAACCACCCCCAGT 0,891

snp A~864017 329 AAGCTGTGGGACATTGGAGGACAACCGAGATTTAGGACTATGTGGGAGAGATACTGCCG A/G GGGGTCAATGCTATTGTCTATATGGTAGATGCTGCAGACCATGACAAGGTAGAACCCTCA 0,888

snp_AM8S4833 563 CACCCACCCAGAATTTCAACCAAAGTGTAAAACCAAGTACGCCCAAACTTCCGCAACCTC AIC AAGGAGTAAACCCAACACTCCAAACATGCCCCAGTATTTGAAATCTGGACTTICTCCTAG 0,887

snp A~855000_65 AAAATCATCTTCGATATATCTTTGATCATACGTGACAGTGATGGACAGCCGCAACAGAAT A/G CTATGGGTGGGGAATTTATCAGAAAGAACAAAAGAAGAAATACTGTACGAGTTATTCTTA 0,887

snpJP091137 183 TAACTTTGATACGCAGGTCCACTTTCTTTACGATATCTTGAGCCCCTTTGATATTTCT CC A/G ACAAAAACCCAGGTTGCGGCCGTTTCGTACAGTAACGTCATCAGACCACAGTTTCAATTC 0,886

snp_80427114 118 CTCTGCTGAAGAGA TTGACAGTTT A TTATCGGGTTCAGAACCCT CTTCT CCAAGT AG CCG AIC AGTGATGGCAACGACCCAGACT A TTCTCCA TACCA GAG CGACAGTGAAGAGT A CAAATCA 0,885

snp AM857996_76 TTGAAGAAATTCTTCAAAAATGTTTGATGTTGCTCTGAAAAGCGCCGGTGCCCAGGTTGT TIC CTTGCTACTTCTAGTGATGGTAATCATCCACCTGAAAATATCATTGATGGGGATCAGGAG 0,884

snp_CU995337 540 CCACAAAAAGTGGTCTTCTATCCTACACAAAGGCAGTAGCAAAACAAGCTGAAATAGCGG TIC CCAAGGCA TCACCCTT AGTTGT AT ATGTCCCGGTTTT ACTGA CACGG CITTTGT CCAGAA 0,884

snp AM855102 290 AACAGCA TTCAGAAAA TTCT ATGAACGTGGGGA TTTTCCAA TTGCA TTGGAACA TGACAC AIT AAAGGAAACAAAA TTGCA TGGAAGGTTGAGA TTGAAAAACT AGA TT ACCA TCACT ATCTT 0,881

snp AM858116 547 GCCCTGGAAAAGAGA TTGAAGGAAACCGGAAGTGGCT ACCT AGTGG GGACCTCTTT AAC AIT ATGGCGGACGTCGGCTTCCTGGAGGTG CTC CTG CTGTGT GTGGAGTTT GGGG GCGA CGA 0,878

snp_CU990225 417 ATGTGCGGGACACAAAGGACAAGACGATGGAGTCAGTCTCGCCAACAAAAAATTTGTCAT TIC GGAGA TTTCCTTGACA TTGCCA TCACACCCC CCAGAAATGAG CGAC CT AACCAACG GAGA 0,878

snp AM859469_105 AAAAAGAACAGACCGCTCCATGGCTGTGAACGTGTATAGTACAAACAACCAGGCAGACAA TIC CTGAGTCGCCA TGACA TCCTGGCCTG GGTCAACGACAGCA T CCACA CAAA TT ACGG CAAA 0,877

snp CU682714_339 TGTGAATTCGTGCATGGTGACACAACCATCACCGTCATGAT CGTAGTTAGTGACGAACTC T/G GTGTCAATTTCTTCCACTGTTATGTTGCCATCTGCGTTTTTGTCCATGTTTCCAATGATC 0,874

snp_AM861494 473 GAACATAGAACAGCAACCTTGGATTAAGACTTTAGACTTGGGAGAACCCAACACCAAATT C/G TGTTTTTGGCATTCATTTTGGGAAACAAAGAATGAAGAAACTGGGGCATTGAGGATAGCT 0,872

snp_CU685863 215 ATTTTTCAGTTCATGTTCATTTTGTATATTAGCTGTATTTATGTTGAGTTTTCITTTCAA TIC TAATTTCCGTTCGTTTAAATTTTCCACAAGTTATATCATAGCAGAGTTTTGTGTATTCAG 0,869

snp_DV736306_319 GCACGAAAATTTCCCATACGTATGCGAGTACAGGCAAACAGCTACCACTGTCGGAACACC A/G CAGACCGTGACCCCA TcrACCACACAAACCA CT A TTCCT A CCACCACACCGGAAAcr GAC 0,867

snp_CU682177_248 GCGcrCCAGGCGCCATAGGGGGAAATGCAAGTCTTTCCCTAAAGACGATAAATCAAAGOC Ale TGTCATTTAACGGCArnnTGGGTTATAAAGCAGGAATGACCCATATTGTGAGAGAAGTT 0,865

snp 80427368 404 CACCAACCAAGTCTTGGCTCAGATTGAACTGTGGACCAAGCAGGGTCAATACAAACTGGG AIT GTGCA TCTCCTTCCCAAAAAGCTGGATGAAGCTGTC GCTG CAGCCCACTTGGAACA TCTC 0,864

snp_AM857665 474 CTTCCCA TCATGCCGCCAGTGA TTTATGCAGTATA CA TCA TCAACAACCTGG CAAACA TC A/G CTTGGTTGTTTGTCTGGGACAGACAAGAGATCATTGCGTCCTTAGTTGT CATAGCTCTGA 0,861

snp CU989257 270 CGAAAGCAACGAAATCATGGAAAACCTTGACAAACATAATGGAAACTGTAGCCAAGCCCC TIC TCGCCATTAGATGAAAACGACAACGACAAAACTTCGGAAAAGTCCGGAGAATGCAATCTT 0,859

snp_AM857595_643 CCGGT ACGCGGTCGGCGTCACGTGTTCAAT CTGAGCTGCAAG CAGCCA CAACCCGCT GAC AIC ACAGCA TTGTTTGTTCTGATGGAAGAGCGGAGAT ATCGGGAATCGAACCGCTT GAATCGT 0,852

211

""'" Séquence flanquante 1 SNP Séquence f lanquante 2 Score

snp AM863998 300 CTCAGTCATCACATATATTGTACAGACCAACCATTGGTTGGTGTTTGCAGGGATCCTCGG A/G AGTCITGGAcrcrGTGTCGCTCTCCAGA CCTACAAGAACGACTACCCCA CCAACTA CA TG 0.85

snP_A81.22064 1511 ACCCAGGGGTGTGCCCCAGATTGAGGTCACATTTGACATTGATGCCAACGGTATCCTGAA TIC GTGTCAGCTGTC6ACAA6AGCACAGGAAAGGAGAACAAAATCACCATTACCAATGACAA 0.848

snp_CB617375_137 A6A6AAGTTGATA6ACCTGGATCCAAGTCCAACAAGAAGGAGATTGTGGAGGCGGTTAC TIC ATCCTTGAGACTCCACCAATGATGA TTGTCGGTGTGGTT GGCT A CA TTGAAACCCCCAAG 0.848

snp CU686003 247 AAGGGGAAGAAGAAGGTAGCAGCAGCCCcnTGGTGGCCAAAAAAGCTGCA6AACCCAA A/G AAAGTTGTT AACCCCCTGCTGGA6AAAA6ACCACGAAACTTTGGAA TTGGT CAAGATA TT 0,845

snp AF075697 181 TTTGGAATACATGAACGATCAAArnnTACTTCTCAAAATGGTGCGAGAAATGACGCAAT AIT AAAATTGCCGTAGTGACCACAGACGGA6AAACAAACCCAGGTGGCGCTGATAGTTATAC 0,843

snp_FPOOOS02_S86 CAGGAGGCCGACCCCCAATGATGGGCGGAATGAGGG GTGGTATGATGA GGGGAG GACC AIT CCACCAGTCA TGAGAGGTCCCCCTCCTGG CA TGG GAAGAAGAT AGACA-GACAG TGT ATG 0,841

snp]P006935 63 GTAATGCATGAGATTCCGATGCATAGAACCCAGAAGTTACGATTGTGAAACAAAGACAAA AIT TTCGGAAGT ATA TTT AGAATGGTTTT ACCGGTGGTGA TTGCGGGAGT ACT GACCA CAGTC 0,836

snp AJ S64625 64 AAAATCTTACTCCT AAATCCA TCCCTACTTGAGAGA TT A TTTCACCA TCGGAA CTTTCAC TIC ATGGCCGAATCCCAATGTCGCCAAAA·TT ACCACCA GGAGAGC GAAGCTG GCA TCAACCG 0.835

snp_80426928_115 AGAAAAGACCTTCTCTGCTGAGGAAGTCTCATCCATGGTCCTCAATAAAATGAAGGAAAC TIC GCAGAAGCA TATCTTGGCAAGACAA TT AACAATGCCGTCGTCACAGT CCCAG CTTA TTTC 0.832

snp AM 862502 170 CAGTCATGAAAGCAAAGAAGTGAAATGCACCATGAAGTTTGGCATCTTCCTACCTCCACA A/G GCTGAGAATGGAAAGTGCCCCA TCCTCT ACTGG CTGTCA GGACTGA CCTG CACAGAACAG 0.828

snp_CU683122 402 GTTCGCCATGAAGGAAAAAGAAATAGATAAGGATACGGTCATTGCCTATCATGACTTTGT TIC CAGACTCAGATCAGGGGCGAATTAAATGGCATCTTCCTCGGACCAGGTCGGTTTTACGCA 0,828

snp FPOOO122 108 ACTTAGAGGTTCTGCGTGGAGAACGCAATCTGTTGTT AAAAA TTCAGTGAGC CGACAGAT T/G ACAAGAAACTTTGGCGATGATGTTCAAGTCGGCAGACCCA TCAATG CGTGG GGACCTCAA 0,827

snp_EVV777877 174 GGATAAAGACTGGGCGGAATCAATGAAGATGGGATCATnlTATCAGTAGCTAGAGGATC A/G GT AGAACCTCCTGT A TTCTTGGAAA TTGAGT ATAAAGGGAGACAATCGGACAGCC Cf CT G 0,822

snp_80427114_169 AAGTAGCCGAAGTGATGGCAACGACCCAGACTATTCTCCATACCAGAGCGACAGTGAAGA A/G T ACAAA TCAAAGTCGCGT AC·TGGAGGCAAACAGAAA TCAAAGAAGAGGCGATCTGGT CC 0,817

snp_AM866729_1S7 AGCAATTCGTGACTACGTGACTAAATATGTCAACTTGTATTATGACACTAATGACAAGAT TIC ATTAATGATGTGGAAATTCAGACGTTTGGACAAGAACTGACCAAAT~GTCAGATGGA 0,815

snp EW779028 227 CGCCAACGATCAGGGTAACOGAACCACCCCCAGTTATGTAGCGTTCACAGACACAGAAAG A/G CTGGTOGGCGACGCAGCCAAAAACCAAGTOGCCATGAACOCCAACAACACAArnnTGAT 0,804

snp_AM854612 119 CAAATATTTAGAGCAGCTTTACAAATTGACCAATCAGGAGATTCGTGACATTACGGGCGC AIT CCTCACAAGCA TGCCAAGAGAA TITCTCACGCTCT CACTTG GGTGAAAAAGAAGATGACC 0,788

snp EVV777483_666 GAAGTTTGCA TCAGCCACTGGTGCCAOCCCCA TT GcrG GOCGTTTCA CACCT GGAAccn TIC ACCAATCAGATCCAGGCTGCTTTOCGTGAGCCCCGTTTGTTGGTCGTCACCGACCCOCGA 0,785

snp_AM857211 491 AGTTCAAATACTTGTTTCATTGGGATGcnnTAATTTGTTTCTTAAAAGTGTATGTACAT T/G ATTGTArnnTGATACCOCAACAAGTTGTAATATCAGGGAAATAAAGTTTGTATTTAACC 0,784

snp_CU685863_126 AGTIATATCATAGCAGAGTTTTGTGTATTCAGCATTAAAcnnlTGATTAATGGGTATTT T/G AAGGGAAAAAAAA TTCCAAAAAT ACTT ATGA TT ATGTGTATAAGCACTGTGTAGGTGTGG 0,784

snp_AM854280_231 GCTGGTCAATGATGACA T ATCCCCGGT ACTGAATGCCA TCACTG GCG GAGA TTTCAC CCT AIC TCGGACCTCA TCAGGATCA TCGCTGTCGT CA TCA TTGT CA TCG GGGTGTTCTCA TT CTTG 0,783

snp AM 866192 370 GCCAGCGGTCCTCATGCAGGCTTACAGATGGATGGTGGATTCACGTGACGACTACACCAG TIC GAACGGTTGTTCCAAATGGAGGACAGA TTTTCTGT AT ATCGATGCCACA CCA TTATGAAC 0,778

snp_CK172327 436 CGTGT AAA TICA TI ACA TTTT A TTTGCGGAAAT AA TTCTTCTTCAACT AGAAA TT AA TTT AIT CcrGTACTGCTTTGCAGAACTACTCTCGACTAACAGATAATATTCCATATATTACACACT 0,776

snp CU682324 234 GAGATGT AACGTTAAACCCTCCAGAGGTCCA TTCCACTT CCG GGCT CC CAGT AAAATGTT TIC T ACAAGGCTGTCCGAGGAATGGTTCCCCA T AAGACGAG CCGT GGGG CCGAGGC CA TGGA 0,765

snp AM865296 466 TTTCACCACTGAA TTTCCCGAGGAT AAAATCGAACTTGCTGAGGAT AATCCTCA T AATcr TIC GAGTTTAACCAGAGAGTATTrGGATACAGTCCTGAAAGAAGTACTGATGTTGATGTACCA 0,764

snp_8S4416_212 TATGTTTTGCTTCTCCTGAGGGTACAGGAAGGTCTTTGACCAATATGCCCAGCTTCTCCA TIC GAGCGATTCCCAGCGCTTGACATCCAGGGTGACAATTATCOCCCACCCTCGGGTCGCGCT 0,758

snp 80427044 327 GAAGACA TGTCGCCGTGGCGAGGAGTGTT ACCT AGAT AAC GCCCG CAAAGCT AAATGTCG C/G TGTGTCGAGCAATGTACCCCAGAGCCCGACCCCAGATATATGGTGTGCAGCAACAAAAAC 0,757

snp CU99508S 518 CTGGCCAAAATGGAGAGAATCCTTGGCATAAAATTACGTGGCAAAGACAAAGGCCAACCG AIT TGGGGGGCCCCAAAT AGTGAGGAT ATA TTTCTGGGGCCC crGCT AT GGAGGTG GAAGTG 0,736

snp CU997393 573 ATGGGACCCITAGGGTTGTTT A TTTT AATGTGCA TTTCCAcnnT ATCCA T AAAGTGGAT AIT TAGCATTnnTTAAGTCTTTCATGACOGATATGTGTCCCATTnTGATCTcrATAGTGAA 0,736

snp_CU992933 132 GAGTGATATcnTGAATACAAAGAGGCGCTTG~GAAAGTCCGCAAACAGATCGCAAA A/G ATGAGGGACGGTTGACAACGTGGATAATTAAGTTCTGTnnTAACATTAAGTTATTGCAT 0,727

snp_CU68446S_S0 ATAAGCGAGAGACCATGGCAAAAAGAACAAAGAAGGTGGGAATTTGCGGGAAATA TIC GGAACOCGATATGGTGCCTCTCTCCGT AAAACCA TCAAAAGAATGGAAGTCT CTCAG CA T 0,72

snp AM858880 508 GGACGAGATCATCACCTCCACCACCAGTAACTATGAGACGTCAACATTCGCCTCGAAGAC TIC GAGTGGCGAGTGCGAGCTATTTCGGCCACGAACCTCCATCTCAGAACAAATCACATCTAT 0,715

snp_AM856693_352 CCTTGGAOCGGAGGATAGCcccr ATCA TG GAGGGAGA TT CTGG CT AC6 CA TCGACTTCAC TIC GCCGACTAOCCATTCCGTCcrCCAAAGATAATTTTCCTAACAAAAGTGTTCCACOCCAAT 0.7 ---

212

",,"' Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score 1

snp_CU995994_S11 TTTCATCAAGCACACTCTACTTAAATTACATGTAAAAGTAACAGGTTATCAAAATATTGT AIT AAAGTTCTTCTAAA6ACACAAATGACATAAAATGGAGGGCATTATATATATTTTATCTAT 0,683 1

snp CU681711 212 ACAGTGGTCGGAGAGAAAGTCAAAGACTCCACGTn AA6ATCGGGGAGGAG TTCGA crc T/C GTGTCTCTGACAGGCCAGCCTCTGAAGTG CACe GTeG CTTTGAATG GCGAAGAAATGACC 0,675

snp AJ565645 416 A6AATGGCAAGATCACCCGTCTGAGGAGGGAGTGCCCCAACGAGGAGTGTGGAGCCGG A/G GTCTTCA TGGCCTCCCACTTTGACAGACAATACT GTGGAAAGTG CTGTCT GACCTAT GT A 0,668

snp_ES789710 308 TITCA TGGACAAOTTGGGACTCGT ACA TTCTTIAGTGCITT CAATACTTCA TTTTT CA T T/G AAGAACAAAAACT A TTGCTA TTTTTTTA TTTTCTGcrGAAAAGCA TTAACA TTGTAAAA T 0,667

$OP 80427174_1095 AAACAGGACCAGAAACTCCTCCAGCGTTTCAAACGACAGCG GCATCGTGGAGCCAGAACA A/G GAGGCAGAAAGGGTGCCAAAGAAGTGCAACAGAGGCAGAAAAGTGGGCCAATCTTCAA 0,645 1

snp AM854177_247 AGGAATTnTAATnlTAGCAATGGCTAGTGTTTTATAACTTAACAGTAGTTAACAGAAA A/G ACA TCAA TGA TTT AGACTGCTT ACCCA TT AGAAA TIGTI ACTGAAAACCACTCTCAGGGA 0,616

snp CU994620_455 TIGTTTCGGT ATGGAAAAAAATGAGTGATGCA TT AAGAAAACTTT ATTT ATGT A TTTTTC AIT TGGTCTGAAGGT AATCAAATATATGATGGAAGCGCA TTGCTTTTTGATAAAT ACCCCGCC 0,596

snp AM858800_222 ACAAACTGTTAACAAACAATGTTCACTTGGTAATTTTCTAAAGTTATGTACCTGATTTAC A/G AGTGTCCACTT ACA TGT AAAGACTTT AAGAAGGAAAAAGGAAATCCTGAAGTI AGAGGA 0,585

snp_AM868845_106 ATTTCTAATTTCGGGCCGATIGGCAATATIGAATTTATIATCGAAAGAAATATGGAGTAA T/C AGTCTCAGGACTAAATIGTTATAAACAATGCCAACATATCCTGACCAAGAGGAGCGAAC- 0,581

snp_aJ988101 315 TTTAAATTTCTGTAGTGTIAAACTGGATATTTACTCGATATTTACTCAGTTGGTCTATAT AIT TGTAGCTAAATAATAGGTTGTAATCTTCAATATTGTTGAGCCTCAGTCAGAAAACATAAT 0,569

snp aJ987873_518 ACTGGTCATTTTAAGATTTTAGCTGAAATTTGGTTTTAATAAACTTTCTAGGGTAAATAA T/C TCAATTTTGGAAACTGTATATGATATATGTAAGTGTAGATIG6CA6GACAT6ACAAAAAG 0,513

snp418 CU99S683 TTTAATGTATAGTAC6CAATCTAGTCAGTGTTTGACCAATCGTAGGGAAGGTTATAGATG A/C CGTTGGATGTAACATIGCTGCCATACGCATTTTGAATACCTTATATAAATIAATATATAA 1

snp618_FU6OSJA01B GGAGGTCAACAGAAAGTTCCAGAGGATCTGGTGGAATTCTGGGTAGAGTTACTTGGTCG T/C T ACCCA TCAGTCGTTGCCA TCA TTGACCCAATGAG GAAACAGGAGAAGGAGCA CTGGAT 0,995

42EZ

snp466JU6OSJA01C GACCT AGGGGGCGAATACGCGCA TATCAAAGTCTGTGAT ACT GT ACC CAAAGAATGTGAA A/C AAGCGGCGACATCAAAAGCTTCACCGGAAAAGAAATCAGAGGAGAAGAAGGAGGAGGA 0,994

1MU9

snp440_FU6OSJAOlA OSMN

GTTGGATGACATCAATAATTTCGGAGCAGTGAATGAAGTGTATGCTAAArnnTCCAGAA A/G AGTTTTCCAGCACGAGCAGCTTATCAAGTTGCAGCCTTACCAAAGGGGGCCAAAGTGGAG 0,992

snp297_CX739431 CTGCCCGTGCGAGCCTGGCCTCAC GTG CGTG CCCA CAGTCCAGGG CTCGT CCTTTGTT AC T/C A TTT AT6GT AGATGT AAACCGGTIGGCA TGACGACGGAAGAAGCCGGT A CGACG GAAGC 0,991

snp476 UJ683318 GCCTGTTCA TAAGACAGccrACAA TTTCCCAT ACA TTTCGATGT GA TIGGG CTTTT CAGG A/G CTTCATATGCTTGTTTCATCTCTAACA6GATTGTAAAGTTTGCITAATAATAATCAATlT 0,99

snp629 E5789178 AGGAATCATTTATGATGTGATTGTGGAACCTCCAAGTATTGGATCTACAACAGATGAAAG A/G GGAAATTCAAAGCCAGTTGCCTTTATGCCATACAGAGTTAATGGTCAATACATTATGGAA 0,99

snp088_BQ427368 ATCACTATTCATTTTATGAAATCATGACTTTCCTATCATTAACATGTGGTTTACATCAAC AIT AAGTGCTGATGGCGTTGATGCATGAAGCGTTCATATGTTAAACACTTTAACATATAGATA 0,989

snp406_AM866923 CTGT ATCTCA TTT ATGT ACTACCGGT AA TTGATGGACACAACTTTGCTT GCCCAGAGG CT AIT T AA TTTTGAGTCTTGTCA TTTCA TTCCTCA T AACA TTA TTTGTGTGCAGTGTTGA CCTG G 0,989

snp292_CU987286 GTCCCTTCTTTCATCATTTACTGTAATAGCAGTGCCAAGGCAATACTGGAACAACCCCTG AIT AGATCAAACCATATCACGGATATGCCAAACTGATAATTAGAACAAAAGATGCAGACATTT 0,988

snp3S4_UJ994465 TTAGCTAAAAGGTTATTTTTTTCTCTTTGAAATAGCTAGATTTTTGGAACAAGTTTTGAC A/G CATGTATTGACTCACCGTGATGCACTATCTGTGATTAAGAATTAAGGTCATTTGATCTCC 0,988

snp312_FU6OSJA02G GAAA TTTGCCA TCTTAGAAGAGAAAGTGATGCTGTCT AACA TCTTT AGAAA TTTCACCGT AIT ACCTCAAAGCAGAGCCGAGAGGAACTGTTTCCCATTGGAGACCTCATAATGAGGCCAGA 0,987

X6U7

snp438JU60SJAD18

"IKI. C6ATTTGTTATTGATGTAACAATATCACAAACGGAG6AGTGTGTTGTTACAACATTGGTT AIT AGGGATGTGATTTGCTGAAGGAAGCTTGTTGTAGAGATATAGCAGGTCTATATACGGGTT 0,987

snp132_AM856794 AAATACAGTACTCAGGATGAATACGGAACTGCGGCTTACAAGACAGTGGAGCTAGACAC A/G T ACCTGGA TGACGTCCCCGTACAGCACAGAGAAGTT CAAGGTCA CGAGTCA GATCTCTT C 0,986

snp427 CU995796 GATCGGATCAGCACAGCT AGCCTTTGTIT ACTTCACGGACGAGA CGTCTT ATGT AAGCT C A/G GTCGTCCAGACT AGTGGGAGCAATGGATGGCAAGACTGGA CCG GAAACA T ACCCTCAGG 0,986

snp56S CU993288 GTAAGAATTTATCGTTGTGAATAATCCATGATTATAGAAAGGCATGTATTGTATTGTCAC AIT CTTGAT AATCGGAGTCAGCCTGGTGCTTGACGG GCAGTGTTTTTCTTGA TTT CTGTT GTG 0,986

snpS74_CU682020 TTTGGAAACA T AT AATGAACTTCAAGACA TGGAGATCCCGGCAACA TTGAT ACT AGATGC AIT GCAGTTGGAT ATGT AATGGAGAAAGTGGACA TGGTGCTGGTGGGAGCAGAAG GTGTTG 0,986

snp274_FU6OSJAOlA EMFB

ACGAT ACTGGGTCCTTGAT ACAGACT ACACTACTCACAC CA TGATCTACT CCT GCT CGGA T/C ATCCTCGGACTGTTTCA T AT ATCGT ACGCA TGGATCTTAAGCCGTGAAAGGA CACTTGAT 0,985

213

""'" Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp482_CU990615 AGCGAAATTCGTGTCCAAAGAAGGAGAAGCAGGGGAGGCAATCGTTGCCATAGCAGAAA A/G A6AAAAAGCCAATCTGATTGTTACCGGAACTAGAGGAATGGGCAAGCTCAGACGAACCT 0.985 snp273_FU605JAOLA

CATTCGAGTGGATAATATAGGAATCGAAAATGGCGAGAAAAAGGAAGCAGTTGGTGACG C/G CT ACA TTCCAGATCCAAAAT AGCCA TCTCGACrTGGAGTTCGA neT CAAATCTIGCT cc 0,984 EMFB

snp334_ES789659 CT ACGTCACCGACA TCAAAAATCAGGGTCACTGCGG crerT GCTG GTccnCT CAGCCAC AIT GGTTCACTIGAAGGTCAACATTICAAGGCCAGCAAGAAACTAGTGTCCcrcrCAGAACAG 0,984

snp380 AM858009 TGATGcnTGGACG08TGGGACTAAAGA6ATATTGTTGCAGGAGGATGCTATTGTCTCA TIC GTTGACCTCA TTGAAAAACTTCTCAACTACGCACCA TTAGAAAAGTGATGT ACGGT A cr A 0,984

snp567 JU6OSJA018 7B7M

TTACCTTITGCCAGAAGGAGTCCCGAACTCAATAAGTGTATAATCTCCAATGGCGTTTGG AIT TAATTAAGCCAAAAAAAAAAAAAAAGAAATGAAAGCAAAAAACCCAAACATTAAACAAG 0,984

snp096]U6OSJAOlB XHAW

AGCGGCAGCA TICCACCCAAGAGAA TICCA T AAOTGA TTTTTGGAA TI CTCT A TIn CT T/G TGGGTGCCATCTGGTInOTGTGCTGGTIATATATICATIGTGTAACOTCATGTIGTA 0,983

snp140_AM860845 GCTAGTTGAAAAGGAAATTATTGTGAGAATTTGGGAAGCATAATGCAGTTGAOTGCCGT A/G ACA TGTTGAACCTTTT ACT ATGAACTCTOTGAAT AAGTTCTTGGT AA TInCAGATGTA 0.983

snp187_FU605JAOIB GTTCCAAACCCACAAAGAGAGAATGCAGGAAAAGGAGGCATTACGGCTGGGAGAGTTCA C/G CAAATTACCCAAAAATAAGAAGGCCAATAACAAGGAGAAAAAGAAGGCTCTCACGTCAG 0,983 l7QG

snp505 AM858862 TGCAAGTGCAATCAAAAAAAAAAAAAAGCGCACGGGGACTAACGATCGGAACAGTAAAG A/G ACGACAAAATGGCCAACAAACTCCAGGCATTACTTCTOT AACGGTAG CTGTTTTT GTIG 0,983

snp066_CU683187 GACATOTATGTGTGTGCAGATGAATATTOTGGrrnnTAGGGTTTTGTInGGTACAG AIT TAAGCCTGGOTGAACAAACAGGGAAAAAGGAAAGGAAACAAAATInGAGTGATATAA 0,982

snp067 EVV778122 CAGAGACCAGTTTGCCCAGCTGGTGAGAGAGGTTG CTTCCCCTGATGTTG GT AAGATGGG A/G ATTGAAGTTCTCAGTTTCACCATCAAGGACATCAACGACAGAGTGGA GTACCTGTCCTCC 0,982

snp361_CB617520 CAACA TCGTGTGCTGCAACCA TT ACA TCAACGTCACTG GAACCTG CA TGCTTA TTGCTGA A/G GCTGCCAACTACAAACAAGATCTGATAGA08TCTGCAGGCCGGTCTCCTGGGATAGATA 0,982

snp237 _AM855591 CTGTAGTGTGTATATATCGGCCTGTGGTCAGTCCGGGTTTATGAGAGATTACTGCAAGAA A/G ACA TGTGGTGAATGTGACCCTCCTACCCCT A CAGAAATCGGAAAGTCAATG GTITT AGG C 0,981

snp033_OJ989658 AGAAACTGGCATCATGAAGAAGAAGTTCATTAGCCAGCAGCGTGAAATTGATGACCACAA A/G GAGGAGATCAACAGATTCAAATCTGAGGTGTCTAAACTGAATGGTGAGAAGGAGAAGAT 0,98 snpl04_FU605JAOlC

AAGGGAAAGGGAAAGGGAAGGGAAAACGTCGGCGGCGCAGACGGCGCATGCGTAATAA A/G AGAACTAACGAAAATAACCGAATACAGCCGTTTCTTGTGATCAGTACTAGATATCGACAT 0,98 VZUM

snp169_OJ987908 ACAGGAAAGGGAGCCAGAGACCAGCAAGGGAACATCATACCACCTAGTGTAAAACCAGG T/G GATGAAGTGCTCCTGCCAGAAT ATGGAGGCACCAAGGTTGT CCT GGAGGATAAGGAGT A 0.98

snp445JU605JA018 ACCTCTGGGAGACACAATGTGGTGGATCTATGAA TTCCTATGCAAACTT CTGT GTT AACT A/G GGAGGGGGATCTGAGTTTT AATCA T AGTT A TTT A TTGATCTTTATCAGCTCCCTICA TG C 0,98 QlK2

snp245_AM862902 ATGGAATACCCAGTGGTGCAAGACAGTACAACAGCTAAAGACAGAATGACAAATGAAGA A/G AAGCGAGCTCTGGATAGGGCCAATAATTACATTTACCAGGAAGTCAGGCAAGCTGCTGA 0,978 snp499_FU605JAOIA

ATTTAATGTATTTTTAGTTGGGTTTTTATCCATCTCTGCGTACACTTTCTATGTGTTTGT A/G CCAGCGCATGTTGTCCAGATTTATGAGCTAATnnTGGACTTCGACAAGTACCTGCTGCG 0,978 1 691Q snp536JU6OSJA018 1

DPM8 TCTTTCCGAACAGCAGGAAGTGAATATGAAACAGGAAGAGGAAGTTGATTATCAAAAAGA A/G GATCCGCCCAGAATGGAAGTGCCACAATGTGACAAAGTCAAAATAGCTCTGCAGACACGT 0,978 ;

snp2S0_FU605JA01A AGTCTT ACTGGCCACAGACACACCCTCCT GATGACCCCGCAGT CAATACT AT AGCAAC CG A/G CAGGAAATGGCTGGATCGTAACAGTGCAGCAAATGTGTCTTATGTCAAGGCATTCTGATC 0,976 1

HR83

snp605.-AM854527 CCAGAGT AAACAA TGCACCCCTGT AGCT AAAGTGACTGGAGTT ACACAAGT AAAGAAAGG A/G GATGAAGGGGACCT AAAGATCGCCGTGT ACAGACAGCCAGT GGTGACAG CGGTAGAT GC 0,975

snp091_OJ990044 GCGGAGGTGAATGCGGTGGCAGATCACGCAGTGCGGTGTATGATGAGGTACCTTAAGGA T/C ACTGACGCGGTGTTCAATCCAACCAACCTGCT A CAGGCAGT GATAGAGGAAAACCCCC GA 0,974

snp190 ~27188 CA TTGTT ATCA T AACA TITCA TGAAA TT ATCACTGCTTCGATGTTTTCACTT ATCTCTT G T/C GTGTCTCCGATGTAAGTATCCGGAGGAGGAAATTGTTGTCCGTGTCAAAGCAAGTCTTTT 0,974

snp392_BQ427259 ATAACTCTTTGGCAAGTTTTCTTCAGAGAGTTGAGA TTTCTTCCCTTT CGAAGTCGCTT G A/C TTGGTTTCGAAATAATTGATATGGACTGAGGATTTACAATCCAAATAACTTTCGACCATT 0,974 snp648_FU605JAOLA

TCAACCATCAAGCTAAGTCAAGTCAGCAGAAATTGACGATTCTGAGGTTTGACATTAATT AIT AGGGGCTGTTGTACTTGGCATTCGCCTTTTGCCACTGATATTGTATGAATTTATCTGTCT 0,974 7KNi snp221_CU681678 GCATATGGTCTIGGTTGGCCTCTGGTGACTATCGCGTGGACGCTAAAATCACAGATACAA A/G T ACCGGAGAAGAGGTTGCGTGTT ATCACGTGGAGGTrrCCG CCAC CCAG CCCCCA T GTAG 0,973

-- ._-

214

Locu; Sequence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score snp348_FU6OSJAOIC

GGCTCCCCCACCAGAAACGGAAGACAGTGTCCGG GATGC GTCAGAA TTlTIGA CAAGGA TIC GGT ACTGGAT ATGTT AGCGCTTCCGAGCTGAGACA TGTTIT GACG CA TTIGGG GGAAAAG 0,973 BAUQ

snp561_CB617510 TGGAGGGGGATATTATCATTATTCATACTCAGTTGTCAGAGGCTGTGACAGAATCGTTCC A/G GTTGA TA TTI ATGTACCAGGCTGCCCCCCTACAG CAGA6G crer ccr CTACG cern CT A 0,972

snpl84_AM865725 GGATACAGCG6ACATTTAACTTCGTCGCAGAAACAGAACAGAAAACATGGCTAACCCAGA A/G AGAACAGTTGTTGTAGCTATGGACGGTAGTGACTACTCTAATTATGCATTTGACTGGTAC 0,971

snp248_CU999018 TAAAGTGGATGATGTCATCAAATATGTAAGA6AAAACCACCCATATGATGTTGCAGAGGT T/G ATTAGTGTCAAGATTGACAATGGAAATCCGCCATACTTAAAATGGATTGATGAAGTCGTG 0,971

snp328 CXQ69134 CGGTTTCATCAGCGCCGCTGAATTACGTCACGTGATGACAAATTTAGGAGAAAAACTTAC A/C GATGAG6AGGTCGACGAAATGATCAGAGAGGCTGATTTAGACGGTGATGGACAAGTCA 0,971

snp402_FU6ClSJAOlA CTGTGTCAGTTCCAGAGTCCTGTTGCCGTGGCAAATATGTGGATTGTTATACGGAGGCGA A/G TAACAATGCTACCAAGAGTTATAAATCTTTGAACACTGAGGGGTGTTTGAATAGTCTGCA 0,971

V7T4

snp186_CU99470S AAACTCCAGCCATGCAGTAAGAGCATCGGACCCACTCCCAAATGTAAACACACCTGTGAA A/G CAGGTTACAATGTCACCTATGAGAAGGACAAACACTATGGAAGTTCTGCCTACAGTGTAC 0,97

snp233JU6OSJAOIA 2K37

TGTGACCTTGGTAGTCCTGACTGTIGTTGGACT CA TCA TCGGCT A CTTCTG CTGGAAG GC TIC AAGTGCAAGAAAGAGAAAGTAGAGCCCAGGAAAGGACTTCCACCGACCAGTACAGGTAT 0,97 i

snp640J U6OSJA018 BEXH

CCCCCTCATGAAGATATTGATGTCTGAGGAACAGGAACACACTGATCAATAACCTTGTAT TIC TCGGTGTGTAAGCCTGTATGAATGAAATATCAATCGGAGCAGGATTTCCGCTGATTGTAG 0,97

snp668_FU6OSJAOlA 97KP

GTITTCTTTGGACGGAGAATCAAAGGACT AT ACACTCCA TGTCGG CACGT A CTCAGGAA C A/G GCAGGTGACTCCTTT AA TT ACCCACAATCCAGTTTGCT GAGC CA TT ACAACCA CCG GTTC 0,97

snp713]POO2214 GTCATTTACGAGGTTTTGTAGAATGCTTCATGAAAACGGTAATTGGGTTGTCATGATTTC AIT TTTATGAAATTCAAAATTACCGTTCATAGCTGTTAAAATATGTGTTGCAAATACTCAATA 0,97

snp719 CU987495 GGTCAAAACTGTCGCGCAGACACTTCTGTCG CGTGAGAACT CTGT CAGTTCTT CCAC CTT C/G TCGACAACACGCCTTTCAAAAGCTGTT ACAAAGGCCGAGTCCAAACTC GGCT GT AGCTG C 0,97

snp049] U6OSJAOlA R741

AAAGACTGA TT AGACCTAGGCAGAGATGGGACTGGTCCTCTCTAG GACT ACGGAGACAAC TIC GCACTGTGTGTGGGTCTCGGACTGTACG CCT GT ATGTACTTGT AT GTT AAGCT CCACAAG 0,969

snpOS4_FU6OSJA018 GTCT AACCACGGCGTGAGTT ACGTTGCCT CTACA TTG CACTGG GGACCGGA TT A TICA CA 1T18

TIC AACGCTT ACfACCfCACACACAGCGGGAAGCACT CAAATGGCG GAGACTGG CACG GA TG 0,969

snp057 J U6OSJA018 A.LB

AA TIGAAGTCAACAGCGCCAGTCTTCGTGT ACTGTCA TTTAAAAGGAGAGGAAGTGA CA T AIT TGTTGTCTGTGTCTCAAAATCCfGCGCA TTCAACTTCAAT ACA GATCfGTT AG CAGAAGG 0,969

snp090_AM8663S3 GGCATCAAACAAAATAAAGCTAAGCTTGAGAAACGGAAACAGGAAGAGAAGATGAAACG A/G GACCAGTTCAACGACCAGTATCTGGACTTGGTGGAAAAGCAGAGACTGTATTTCAAAACT 0,969

snp70S AM8S4n2 TCTTTGTACAGcnniCITCTACGTIGAGATTGGTTGAAAAAGGGGGGAAAAAATGCfAG A/G CAATGTTTGTTTGTGCCA T ACTTCAACACTTCTGT ACA T ACA TACCA TI GAAT ATCTCTA 0,969

snp084_AM866212 GAAAGCA TGTCTTGAA TT AACA TGTACA TGT A TT AACA TTGT ATGTCA TTGCAGTGTGTT A/G CAAGAAGAATGCTGGTGGAA TTGTCA TGT AAAT ATCCCAATGAAAAAAAA TTGTCCTCCC 0,968 snp603_FU6OSJAOlA

IEKZ GCGACAGAATATGCCATGAAAATCAAGCCGCTTATTCCCAAAACATAGCTTCTCATATAA A/G CAATGATACGAAGCGAACAAGATGGAATCATTCCTTAGTTGTGCATATGTCTTAAATGCC 0,968

snp491_FU6OSJA01A CGTTGAGATGAACGCATACATGAGTTTCCACTATTACAGAAAAACTGGTATGATATACGC A/G GTGTCCCCTGGGA TTTTCf ACACACTCC GGTACCCT CGCT AT GA TCTT A TTGAG GTCAAT 0,967 TGZH

snpS34JU6OSJAOIC ACAACGAAATCAACGACAGTAACTAAAGCAACAACAATTAAACAAATGACTACCTCAACC IDl . C/G CGAAACCAACAACATGGACAACCAGACGCACCTCATTAAACTCAACTCCGTCAACAAGAA 0,967

snp641 FPOOS212 ACCAGTGCGTACTACAGAGGAGCCGTCGGGGCCTTACTAGTGTACGACATCGCGAAACAC TIC TAAOGTACGAAAACGTAGAGAGATGGTTAAAAGAACTCCGAGATCACGCG6ACAACAAC 0,967

snp643_FU6OSJAOIA QOXL

AGAAAATGTAGTTCAACCATTGTTAGTTAGCACTAGTGCTATTCATCTGGCAACAGAGAC T/G GTCAAAAGCATTATGAAAATTGATGATATTGTTAACTGTGCAAGATAAGAGGATTGATAG 0,967

snpOS8 CU99S743 AGCTGGGAGAACGGCITCTCGCCAAATCGCTCGCAGGAAGGCGTCCAGTCAAGTGTACAA A/G GAGCCAGAGAAATACAATCTACCAGATGTTGACGATACGTTCTTGAACCCACACAAATTC 0,966

snp266_CX069061 TATCATGATCTTIGTACCTGTCCCCCAGCTCAGAGCCfACCAGAAAATCCAGACAAGACT AIT GTGAGGGAGCTGGAAAAGAAATTCAGTGGAAAACATGTAGTATTTATTGCACAGAGGAG 0,966

snp295 AM86TIS8 TTCAA TTrGATCTGTGTCAGAAcnniGAT AT A TTCACCCAGTCTCAAT A TTGAGGA CGT A/G ATAAGTTGAACAAATGGTGAATTAATACGTGTGTAGTGTTGTGTTCACACTTGACTTGGA 0,966

215

Locu; Séquence f lanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp530 BQ426757 GTGCCAGCGCCGAGGCTGTTGAGGAGTT GAGA CG CCGT ATG CAGG CTAAACTGAATGA6 A/G CCGAGCAGAATCITGAGGCTGCT AATGCCAAGATCAGTCAACTCGAGAA GG TCAAACTC C 0,966

snp07S_EVV778595 AGTCCAGCCAGTGGACGGT AT AGCCTCGTG GT ACGA TTAC GAGAACA.ACAAGTTCAAG CC A/C ACCTGGTCCATCTTCACAACCAAGGAAACCTCCAAGTCAGTCAAGACCCTCAGTGAGAAG 0,965

snp455 E5789146 AA6CATGTGAAGATGCTACATAAGAAGCTGATAGACATTCAGAAGGAGAAGGAGATAGA A/G CTTCAACAGAGGAACAACATGATCGCTCACTTCAAGGAOCAGCTGCAGGAGATGAAGGC 0,965

s~72 AM858709 AAGAA~TAAAGAAGATGCAGTTCTGGGACGTGAAGGAGGAATGTAGTAAATATGAC A/G TAAACCACAACGTCCGTCATACGACGAAACACGTATTTATTGGGCAGCGGTGAAATGTGA 0,965

snp614_CU994483 GTTTGTCACAGATGAAGATGGCAAAGACGCTCATGATGTCATTTCCCTTAAGAACACGCT A/G ( CA TATCCCATTGCA T ACAAAGTAAAGACAACA TCACCAGAGAAATACAAAGTICGACCA 0,965

snpl38 EW779134 AACGAAAAGATTGCTGTACATTGCACCGTGAGAGGAGCCAAAGCAGAGGAAATTCTGGA A/G AGAGGACTCAAAGTTAGAGAATATGAATTAAAAAAGAACAAcnnTCTGACACCGGAAAC 0,964

snplO9_AM860572 GGTGGTGGTCCGTGGTAACAGCATCATACTACTGGAAGCTCTAGATCGGATTGGGTGAAG T/C GTAAAAGTCAGTGGAGTAAATGGGCAGCAATGAAGAATGGACTTCAATTTTATTGATGA 0,963

snp583_0W713882 CAAAT ACAACAGCAAGGAAGCAAAACAACTGGCCCAGGCCT AACTCT AGTACT CTGTGT G T/C AGGGAAATGTCTGCAGAGTCAGACAAAACTGACTGAAACACCTTGAACACTAGCAAAACT 0,963

snp355 CU994465 TGCT AACTTT ACCACA TTCTGCA T AGACCAGTCA TTTTTTCTCGTGAAAACA TTTCAACC T/C CAAGATCCCAAAAAGGGACCTACAGTATGTACCGGTACATTTATATTGAAAGTAAAACAA 0,962 snpl90_FU605JAOIB

ATTGGTATATCCGACATGATAGAGGAAGGCAGATGGATATACACCTCGAAT~CGTC A/G TACAAGTGAATGGATGGAATCCAGGAGAACCGGACGGACACAC~CCAAAACTGCGTA 0,962 GLY5 snp525_FU605JAOlA

AAGAAAATGCAGATTGGTGGAAGGAAGTTTCAAAGATTGCTCCTCAAATTAAAAGAAAAA R'GT

AIT AATGGAAGACGGATCAATGATGATTGGATATAATCCTCTTACAACAAAAGGATACGTCAA 0,962

snp346JU6OSJAOlA GTACTTTCTCAAAGTCACCATCATGACATTGCITTAGCTGTGGATAGGACCTTTGATTTG A/G TTGATTTCAACCCCAAGGACGGTAACCTACAATACCAGGAGCTTAGCATGGGATTCGATT 0,961 H7EW

snp069_CX069262 GTGACTGGAGGCCA TAAcrTGGGGCGAGTGGGT GTGA TTCAG (A CC GAGAGAGACA T CC A/G GGGT(A TTCGACA TTGT ACACA TCAAGGACTCTGTGGG CCACA CA T ACG CCAC CAGA TTG 0,96 snp441JU6OSJAOID

70EP ACATTAAAGGCAOGTGTGGCTGTGGAGAAAGCTTCAATGTATGACCCATATATTGGGATT T/C TCTGTGA T ATGGTCTGTGAGTGTGGA TTTTCTT ATCOGTGTTGAATGTGA TT AT ATGT AC 0,96

snp512JU6OSJAOlA Q6QN

AAGCTCAGAAATGATGAAAGA TTGTCGGAGTTTTTCT AAGCTGTGGTCTCCCACCA CTCT T/C TTCGTCTTGTGTTTTGTTGAACTCGGTCAAGAACTGTCCGTCCAGAGAAATTCCGTTACA 0,96

snp621_A~854967 GAAAAATCACTCGCITGTTTICAACTGGCGACTTTGAACCCA TAG GAATAGGTTCA TGT A C/G ATCAGGCGATcnnTAGTTTGCCTGTATAATTCAAAAGACATTTTCGGGAAAGTTGTCAA 0,96

snp690_FU605JAOlA TACTTTGTTAA TT AGTGAAGAGAAGATCCCTGA TCCTTATCTA TTCCTGGTG CCAAAGGA T/C GTGCTATGTCATTT AAGCTGT AGATCTcr AGTTGT ATGTGAAGACT AGTGGG CAGA TT AT 0,96

613X

snpl79_A~861877 ATTTGTATTATAATTATTGTACAGGAATAATAAAATCGACATTACGGATAACGGCCTGcr A/G TOGT AAAGATGGCAGGTTTT AcrTGTAGAT A TTTTTA TTGTTGCAAAGTGCTGCCT GTTT 0,958

snp558_EXl51535 T AAA TT AACTGTTACTGTTTGGGGGGGGGGGTCT AGA TTTTCAATGAGGA nT AcrTTGA A/G ACCAAAA TTGTGATGCTGGAAA TTAACCA TATCCAGATCTGAACAATCCGTCcrT ACAAA 0,958

snp029 CU984277 TGTGATATGACGACCAATTTGAATTClIII i IIIIIAGAGATTCATTTTGGTTATTTTTA T/C TGCA T A TTCCGTCCA TGGAACTGACTT AGCGTTAAAAAAAAGCAAGGATCTTTTTITCG G 0,957

snp072_CU987877 GAATGGTCCTTGCAATGCTGCACTTTGTGGAcrTAAGCCCCAGCCTcrTCAGGCCACTTG T/C GTCGTCTGTAATGGTATCCACTCTGACGTAAGGTCCTGTACCCAAGCTGCCACCTGTCCA 0,957

snp285 AM857413 GCTGTCCACGGCCCCAGGCTT CAATCAAAACTTGA TTGTTT GTTGCTTI AGCTAG CTGT C T/C CA TTGGCTCCCA TTT AT AGCTCACCAGGAAGCGAG GGAGGAAA TTCCAAATCCAGACGAT 0,957

snp631_CU68S657 AATGACCCTGGACAGTGAGGATTTTGTAAAGATGTTCAAAGGAGAATTGAAAGCAGTGTC A/G GCTTTCATGTCCGGGAAGTTAAAGATCCAAGGCGATATGGGACTGGCCATGAAGTTAGA 0,957

snp503_EX956381 AAGCAATTGAAGTAATTTAGCGTAGAATGCATATAGGGTTGAAACTCATTTTAGGTAATA A/G AACTGCCGTTTCAATCTTCAAAAATCTCGGAATTCAAGTCAAAGTATCGATTATATGTAC 0,956 snp562_FU6OSJAOlA

YNVA TTGGTGACAAAATGTCCTATcnnTTAGATTTTACTATTCATACATTGAATATCGTGAGT T/G TGGCGGATGTAAGAGcnnnTTCATTGGCTGTTGTAGGATATCATAGC GCTGTACAGAAT 0,956

snp070 AM856912 AGGAGGAGAAAGCAAAGGAAAACGAATCCACCAAGGAGGAAGAGAAAGCAAAGTAAAC A/G GAGGGAAGCAATCGCCGAGATGAGAAAGCGG CCATGGATGGATATCCTTCGAAATGTGC 0,955

snp227 AM855775 T ACTACGACAGCCAACGGAGTCTGAT AT ATCTGGACGAcrTGAACA TTA TTI A CGTGTTI T/C TGGCCACTTTGGTTCTGTCGGTGATGGTTG CCTTT GT AGCCTCGTT ATCA TTIGAGG CG C 0,955

snp464_FU6OSJAOlA ATTGCAGAAAAAGTTAGAAGAATCCAAGGCTGAAACTGAAGAGGAAAAGGGCAAGCTAG C/G CAAnTAGCGAAAGCAGAAAAAGACATCGAGGAAGCTAACTCAAGGGCTAGTAAACTCG 0,955 OWlC

216

"'rus Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp728_FU605JAOIE CGTCCGACGACAAGATGGGGTACTTGTACACAAAACATTGGATTACAAAGCTCTCCATCA BEAO

AfT CATCAGGACTCTGTTTAACAAAAGTGTAAAATTTTACCAATTTGTCGGATAATCGTCAGA 0,955

snp200_FU6OS1A01A TCTCGACAACATTTAACGCAAAGTGTGCTGACAAATTCAACGCAGAGGAGTATCAAATCA A/C AACAAAAT AACAACAGCGCCGACAAAAGACT A TTTGTIT A TTCT AGTCGGAGcrrGTGGA 0,954 Y700

snp2n_FPOOS529 TGGTGTTAAAAGGAACAGAGAACTAACAGCTTATGAAGCTGTGTACCAGGAGGATCAAAC AfT AGAATTAAGATGGCACTGA~TAAACAAAGATATTGCCTGGCTCAAATATTATGAC 0,954

snp332_FU6OSJAOlA 6ATCAAGTGCTAAGCCAACAAGCTGAAGTTTTGAAGAAGATGAGAGCAGAAGAGAACAA A/6 AAGGAGGAGAAATTGAAAAAGCAGGGAATGGTAAATGGGGGTTGAAGGCTTGGAAGG 0,954

OBOT

snp4n CU990159 GAAGCCTCGA TTAA ITTTTTGACA ITTGGAACTGT ACACAAACACTGCTTCTT GTGAATC TIC GATGCTGTTGTCACAA TTGACA TCCA TGCAGTTGCAAGGATCAGAACT CT AGTTTG erre 0,954

snpS81 AM858017 AAAGTGAAGAAGAGGATGATGAAATGAAAGAGATCAGAAAAACAGCACGGAAGATCAG A/6 GAAAAAAGAAAT A TT A TT ATGCTGGAA TCT AAAGAAAAGAGAAGAGT AGAAAAACCAAA 0,953

snp599 AM854319 ATCAAGAGCATGGAGCITGAATTGAAGCTGAAGAAAGGATTGCGACTAAAGAAACCAGA A/6 CATTGTGATGATGTGTTCTACAAAATCATGAAGAGATGTTGGACATATGAATCAGAAAAA 0,953

snp703_AM854722 CA TGAGTCT AAACTTCGGCTTCTTCA TCGGGGCA GGGG CGG CTCT CTTCAGT CTTGTT GC AfT GCTGTAATGCTGTGGATACAAGCCTGTTGCACATACTGCCATCTCCGGAACGTCAGGTAC 0,953

snpl13JPOOI009 GAGTTGATGGGGGAGAGAGAGGAGGATGAGAAAGGAGCcnTGACATTCCAATCTTCAC C/6 GAGGAATTCCTGGACCATAATAAAGCACGGGAAGGAGAGCTGAGACAGCTGAGGAAAC 0,952

snp222_CU682416 TAGAAGGCAGTGACGTCATCAACGGTTCAGGGGACTGTGTCAAACCATCACAAACCTATG TIC TAACGAATTGTAACAATTTCTGA~ACAAGAGTGTCCTTAAAGCATGonnTCAATAT 0,952

snp251 CU989355 CAAGTCCGAAATTATCCAACGAGAAAATGGAAATGATGATCTTGTTGACATTGGTGATAT TIC GTCGAGAAAGACCTAAACCACCTGACTGAATCTCTGGGTATCT CGCA GGGAA TTCA TAAT 0,952

snp417_FU605JA01~ AAAACGTTGTCAAGGAAACCCCGCT AGATGTCGCAGCAAACACT CTGCAGA CAAAAGTGA A/C GAGTTCTCAGTTTGCCA TTGCACTTGAT AAAAAAGTGTTCCCAAATA TTCCTG CCA TG GT 0,952

99Q

snp699 CF369227 AACAGAT AACTCCA TT ATCA TTTTCCTGGATGACGTCAACTGT ACTGGAGAG GAGTC CCA TIC ATAGCTCAGTGT ACT AAGATCGGGGACTGGGGTCTCCA T AACTGTGACCACAGAGAG GA 0,952

snp151_FU6OSJAOlA GAACACTTGGAGTGGGCT ATGCAGCTGT AGACAA TCCCA T CTTCTT CAAGCAGAACA CCA

ON8Q A/6 CATGTTGCTTGGTGATGCCAAGAAAACTTGTGATGcnTACTGACGAAAATCAAGGAGCA 0,951

snpl51_AM86S845 AGGAAAGGTCGACCTCCGGAAACT AGGCACAAGTCCTAGAAGT CTTCTT AT CAGTGGAG TIC ATTCAGCCAAGCACTGCTGTGGAGATTTCCAGCATGATGAGCGT CGATGCGTTTGTGACG 0,951

snpS98JP008888 GTTTGTCA TTccnACCTTTTTTAT AT AACAGGATAccnGATGCA TCTT GGAACACTT C A/6 AA TTTTCTTTTTTACAGATCCA TAAAATGcrrGT AACAAATGTTcnTGCA TGAAGAAAG 0,951

snp074_EE6n610 ATCACA TCAGA TGGTTTTTCGACA TTTA TT AAGGCTTCTGCACAATGA TCAGTTTA TT CA A/6 AAGCTCGCAGATAGCCGGCCTATAAGGCTCGCAGCCAAATATACTGTAGGAATCTTCCAC 0,95

snp078_AM868481 AGTTTCCCAAACA TCAGAA TTGcnTCTGTA TTGTTTTGGGGGGAAAGGG GAGCCT AACT T/6 TGCCTGCCTAGTTTCAGATTACAGTTTGTTTAATCGAAACACCACAAAGTAAATGGGATT 0,95

snp146_FU6OSJAOlA TCA TGACA TTGCGCAGATAGTCGACACAGCGTTTCTC CGG CTAGATCTT CAccer AAAGA

lCSX TIC GGCCTTCTGGAAATGAACGAATTAACAACTArnnTACACAACGGGATACAGACGGAAAT 0,95

snp234_CU997091 AGCTTCAATGGATCTGA TTGGTTGCCCT ATGGTCAC CGATGACITTGTTGTT AGT GGCA C TIC TGTTCAGAACAAATGTATGGCATGTGTGAGTCAGTATGGGAACCCAACATGGAT CCCCAG 0,95

snp278_AM867827 ACGTGATAAATATGTGCATTTACAGATAAAAGATGCATGCTTGcnTGGAATTCAATAAT TIC CCTAGGCA T ATCA TCTTCAACAACAAATGGT A TTGTGTCAcnTGrnnTGTTT cnTGT 0,949

snp426_CU995796 TGAAACCT ACAACACTCAAGTGACT ACCTCCGTT ACT A TTTCA TG CAA TTTIGAAA TTGG A/6 TTCTGTCTGAACAACTACGCAGACAACTACGTGGACTTTAATTTGTACAACTCTTICACG 0,949

snp079 CU682322 GAAGAGGAATCTGAGCCAAGAAATCTGAGGAAGGAAAGGATAAAGCTGAGGACAAGA A/C AGATGAGAAGGAGAACAGCGAAGAGGAAGAGAAGAAGACAGAGGACAAGGAGGAAGT 0,948

snpl83 AM858635 TGTTGCTCTGGcnnTGCAGGTTTGACAGCAGATGCTCGAATTCTGATCAACAGAGCTCG TIC GTGGAGTGTCAGAGTCACAAACTCACTGTAGAGGACCCTGTGACACTGGAGTACATCACA 0,948

snp522 AM237632 CAAAAAACAGTGGCAAACTCTACACTACTGATTTTGGACGGACATTTTATTAATGTTTCT T/6 CTTCTCTCTGCCGTTAGTGACTTCACAGACCGAGT crr ACGA CAGTGTT AA TTC CTGTTG 0,948

snp661_CU995315 CACCACCCAGGACAGATTTGACGATCCCAAGGGAAAAACCATTACCGTCAATGTTAATGA A/6 TAGCTGTGAATGCTGAGCAAAATTCAGTAGTACAATCAGCACATAGTCTTGACTTGTTTT 0,948

snp039 EVV779377 TACTCCCAAATATGGGCTTATCITTCACTCCACATTCATTGGTCGAGCTGGA GCCAAAAA TIC AAGGGAAGGAT ATCT AGAT ACa AGCCAACAAGTGTTCCA TTGCCTCT CGT A TTGA CTGC 0,947

snp276 CF369223 AAGGAGGTGlACACTGTCAGTGATGAAAGGAAAGAAGACCAAGTGGCTGTTGATAAACA A/6 A TTCTGGATGTGATCCGCAAGAAT AAAGAGAAAAAGTTGTTGTTTGGTT ACCTGGGCT CC 0,947

snp020 AJ565717 GGAAGACITGATCCACGAGATCTACACAGTTGGACCCAACTT CAAGTATGCT GCCAA CTT TIC TTGTGGCCATTCAAACTGAACACACCTAATGGTGGATGGAGAAGGAAGTACAACCACTTC 0,946

217

""'" Séquence flanquante 1 SNP Séquence flanquante 2 Score

snp098 ES789122 6AGCTTGATGAGGTATAATGATTTTACTCATGACCCATTATCTCGGTGCAACTGTACTCC A/G CCCfACAGTGGAGAAAA TIa A rnCTGCTCGCTGTGA CCTGAACCCAG CCAATGGAAC C 0,946

snp116 AMB53761 GACTCAGCCAAGAcnnTCTAGACCTTGGTAATATGGAGCACCAATGATAAACATGACCA TIC CATTTACATGTAACAACAAATGTGAAGCTCCATGTACACTGATTGGTTTGAGTTTTCATG 0,946 snp433_FU6OSJAOIA

GCCA TGTCTTATGGTGGncrcrcCTGTT AGTT GCG GeeerC GTGACT GCTGTT mG CT TIC TCCTGGTGTTTTGAGTTIGTTTTcrTI AAATCACGAGCTTITCAA TT CGTCCA T ACC CAA 0,946 194Q

snp468_CU988734 TA TITcrcrn A TTGTT AGGCA TGTCTCTGTcrrGTGCT A CTACACAG GA TT A lTTTTTT TIC TGTGTTAAACATGTCGCTCCAAGTTTGATACAGAGGlGAGATTTGACCATTTGCACATCT 0,946

snp015_FU6OSJAD1A TACGGTTTTCGCCACTGCTGATAAAAACACAAATGGAGTGCTTGATTTTGGA6AGTTTGA TIC AGCTACATGAGAACAGTCATCTACAACAATGTCTGATTCACAGCTATACAATGTATTATG 0,945 547.

snp656_AM 858965 GACCAGGACCCTGACGCCTAGGTCTGAGGGGTGG6GGGAACCAGTCTACGGTCAACACG A/G AGGGAGAATATTGATTGTGATGGGAACGCTGAATGTGATATTGTCAGCTGTGCCTAAATG 0,945

snp694_ES789681 TTTTT ACTGGA TTGAT A TTT ATGGTCGTTGGGTCTGCTGTCA TGTTGGGTTTTTCAGA TT AIT ATGCCA T ACTGTATCCT ACTTGCT AAATGAGAAAAAAGAGTTT A TTTGGCCTGCTT ACT G 0,945

snp724 AM862897 AATTTCAGACATCGAGTTTGGCTATCTAGAGTATGCTATCACAAGGTTCGATGGCTATTT TIC GCAAAGAAAGAGTCCAATAAAAGGGAGGAACTCATCTAAGAAATCCCTCGCAC~GT 0,945

snp040_EVV779377 ACTGTTGTTCAAGCCAAAGTGGCCAAGAAAGAGAAAAAGAAGAAGAAGAAAGAAAAGA A/G AATGTCCTCTGCCAATGATGATACCCTGGATACTACACAGGAAGCAGACACCACTCAAGA 0,944

snpI73_CX068872 GTACAGCAGACCCTGGCCCAAGGGGAACTACTGCATCGCCAAGAAGTTTAACTGTCCCTC TIC GGATTCAGCACCGGATATCTACACTGGGATGATGAAGATGGTAACAACGAGAACAGTCA 0,944

snp198 AM858364 AATGTTGTCTCA TCAAAAAATCCAAACAGCGTAAAATGTGGCGAGTACA TCTGTACTTCA A/G TCGTGTCA TCTGAATCTGTT AAA TT AATGACTTGATGTTTTCTGCTTTC CGTGACA CAAA 0,944

snp282_AM860809 GTTGATcnnTAAATTTGAAAGTTAATGAAGACATTCATAGCTAGATGTTCCTGTGTTAC TIC GAATCTGTGCAAATGGATAATTTGCATGATTTTTGTATATTATAGTGCTAAATTAGACAA 0,944

snp042_FU605JA01A ATCATGAATTTATTCGATTAAAGAAACAAATACACGTCAACAGTATAAGGGAGTCGCATT A/G CAAGACTAGTCCTAAATCGACAAAATCGTTGTGATATATCATTCTCTGTGAGAACAAATC 0,943

16QQ

snp045_0J685096 GAAAAGGAAACAACAACTGAGGAAGTTCAGGCTGTTGAGACCACAGAAAC~GAAAC A/C AAGACAAAGGAAGTCAAAGAAGTAGAAAAAACGGAAGAGAAAGAGGAGGAGACCACC 0,943

SnpS42 BQ427103 TTGAAonTGGAGGTATTGCCCTGATGTGGAGAGGAGGCTGCATCATTAGAAGTG TTTTC TIC TAGGTAACATCAAGCAAGCTTTCGACAAGAACCAAAATCTCAGTAATCTCTTATTGGACG 0,943

snp709_AM862331 GTTTGCTCAACTGCTCCGGGACTCT AAGAT AAACGG CACAGT AAAGAGTGTT CA TTCA TC A/C AGTCCAGGAGAGGGGATCTGT AAGA TTGCCAAGGAAGTGAACGCC GACCT GA TTA TT AC 0,943

snp175_FU605JAOIB TTTGATCCTCATTATGACGTCACAACACATGCAAGAGAGGAAATGACAAACGTTGAAACA AIT CGACGCAAGCAGTGACAAAAATATCTCCGCAAGCTGTATCAGTCGCAGACAATTCAACAG 0,942

OYCN

snp195 ~867738 TACAAATGAACTATGTTCCAAAATATACTCAAAAGCTATGCAGATGGGATTATTCATTCA A/G TCCTTTCTTGAAAGAAATTCAGTCAATTATTTTCAAATATGTTTTCTTGACGGAAGTATG 0,942

snp298_EVV777395 GTTTCCAAAAGTTGAAGCCAGCGATTCTCCTGACGCAGAGAAAGAATGGAAGATGATTGA TIC GACTTCTTCAAGAAGATGCTCATGCATGGTGTGCCACATTGGCACGTGATTGAATTACCC 0,942

snp579_BQ426980 ACGTCTTGTCAGAA TTGGTGTGTTGGATGAAGGCAAAATGAAACTCGA TT ACGTG CTGGG AIT TTGAAACTGGAAGACTTCTTGGAGAGAAGACTGCAAACACAGGTCTTCAAACTGGGTCTT 0,942

snp470_EVV777685 TCAGCCATTGAACAGAATCGACACCTTGCAGATCAAGGGTGATGTCCGATTAACTCAAGT TIC CGCTTTCAGTAATGACGTAATCGCCAGACGACATCTGCTTCCGAACGTGTAGACATTAAT 0,941

snp549_AM854538 CATGGATGTGAGGGAGGTCTGATGGACGCCGCCTTCAAGTATATCCACGACGTGGGAGG A/G ATCGAGAGTAACGCT AGTT ACCCGTACAAACCCGCGGA GGAAAAATGCAAGTTCAACAA 0,941

snp584 BQ426822 AOGTAACGGCAGAAAAAGAAATTCGAGAGAAAGCAAAGCCAGTAGAATCCAAAGACAAA TIC CAGAAAATGAAGTGGAAAAGAAACAAAGAGGTAGAAAGAAAGACCAAACTAAAGTACC 0,941 snp692_FU6OSJA01A

ACATAACCTTGCTAAGGAAAGGAGGATAACTCTTCTGGTTTGGAAGAATCATCACAACAT T/G TAGTTATTGATTTGACAGTGTGCAAGTGTCAGTGAATGATTGACAGGGAGATTCATATAT 0,941 OR68

snp695_FU605JAOIA 20ZA

ACTGGGAACGAGAAGGCAGACGATGACCAGACACTGGCCATCTGTGGAAGGTTACTCAT A/G GTGAAGACGATAAAGAAACTGGCCGAAAATAGTGAGAATACACTGGTCAGCTTTATGAA 0,941

snp321_FU6OSJA02F <RH4

CGGCGATGGTAATATGCATGGATAGGAAGTTCCAACTATTTGATTGTCCAGAGAAAAGGA AIT AGCAGAGAGAGCGTATTTCAACACACCGCTCCCGCCACACGATCGGTGCCGAGCAGAAG 0,94

snp180_AB122067 ACCGGCGAAGA TCAA TCTCTGCTGATCTGGGGGAA TT cm CTTTGT CCTG GA TCTTG GC TIC TTGACA TTTTCAATGGTGTCTGAGGGCTCCACTTCCAGTGTGATG GTTTIG CCAGT CAGT 0,939 snpI66_FU6OSJA01A

TTTTGCTGGTATCGTTTGTACTAGCAGCGTTATGGCTGTATAAACGCAAAACATCAGACA A/G TAACAAGAAGATTACACTCCACAATTTGAGAAATTACTTTAGAAGTAGGAGTATAGATTC 0,938 87N6

218

""'" Séquenœ flanquante 1 SNP Séquence f1anquante 2 Score

snp586_E5789600 AAGCATCACAATGAACAAGTCCAGAAGACCCGGGA6ACTAACAGGACGGCCGAGGAAGC A/T TTCAAGAAAGATAGGGATACCACACAGCCCGGGGGAGAGTGGGAGAAAATATGCAGAA 0,938

snp290JU6OSJAOIC AGCTGCTTCAGCAACGTAAACAGCACCAACAATTAGACGTCCAATCAACAGAATCTCCTT TIC TTGTCCACTGGAGAGACCGCCATTAGTATGGCTCCGGCGGTGAAGATGAAGCTAGCCATC 0,937 USQE

snp342_A~86746S AAGGCCCAGATGGATCAGATGTCAAGACTGT A TTCACGGTCGT CAGTGA CAGTGAAAT AA A/G AGAAGACGAGAAGACCAATTTTGAAGACGGCAAAGATCGGTcnnTGTCATTACACGAAA 0,937

snp671_FU605JAOlA GTCCATGCTAAATCCTGGAAAAATGGAGGACACAGACAATCTGATTGCTCAGAAAGATGC T/G GAGATACAACGAATGCAGGAGATGTTAGCCAA6ATGCAGGCCCAGCTACAGACCAACCC 0,937

6DJF

snpS82_AJ547618 CATTCATCATAATTCAAGA6ACATTTTAAAATTCGCGCAACGCAAATTATAAATGATGAT A/T CAGAGACTCTATTCCGAAATTICCCITGTACAGATTAmATTITTGTTATITATAATGT 0,936

snp673_FU6OSJA01A TGGTTACCAAGGCAACAGCTACAACACCAGAGGAAATTCTGGATACAACAATCGAGGAGG A/G GGGT ACAACAGAGGGGGCTACCAGCAGCGGT CTTTCGAG TGA TTTGAGGA CA TGGCTGT 0,936 T3ZD

snp320_AM862409 TTTTTATTAGGGAGACAATCCTATACTTATCATTCATATTTATCTCGATTTGTCCTGAGT A/G TGAGGTGTTTAGGTGTGAATTATCCCTTATTATCATGTGTTCTTTGTAGATATGGAAAAT 0,935 snp531_BQ426757 TGAGGCTGCTAATGCCAAGATCAGTCAACTCGAGAAGGTCAAACTCCG CA TGGGACA GGA A/G ATGGAAGACCTGGTTATTGAAGTTGAAAGAGCCAACTCCAATG~CAACTTGGAGAA 0,935 snp607_CU682656 TTCAACAACTACAGTCTGGAAAGCAACCTTGAGACATCTCACTCCATGAGAATCACAGGT A/G GTAAAATTAATTTAGCAACGACATTCCCAGCTGTCAAATTCATAGAATTAGCCATAAATC 0,935

snp270_EVV779445 CTCCTACAGATAAGACAAGAAACAGGCTTGAGAATGGTAGAGAAGGTGTTCGAGCAAGA TIC GATAAGCCAAGCAAGTGGTGGCTGTGTTTTGCTAAAAGAAAGTTTATGGAGAAAAGTCTC 0,934

snp630_CU685657 GCTGACAAGAAAGAGCTCGGAATACACAGGGAACTTCGCCATTGATGACGAGGTTCTGAC C/G AGTGCAGGAGTT AATGACCTTGATCAGT ACGCCTGGGT CCCAG GT AGT ACCTTGCT CC CT 0,932 snp288]U6OSJA018

0232 CGTGGAGTACACCCAA TTCTGCGATGAAGTGGAGTCCA TTTTT ACCT TCAAGGAG CT AGA A/G AAGGCACCGCTCCAGGAGGTGGTCCCATTCAAACCTCCAGAGGAGTGGAAGCAAAATGC 0,931

snp645_BQ426333 TACTCCA TGGGTGGATCGAAATGCTAACTACA TTACAGTCAA TGTTGAGACTGAAAAGG C AIC ATTGGAGATGAATACACCACACTTAAGGTGTACAAAAGGCTTCAGGAACTGAGAGAGAA 0,931 snp035]UGOSJA018

AAGATGTCATAAAGCTGGATGAAGAAGAAGAGGAAGACTCGAAGGAAGACCAAGAAAC A/G GAAGAAAAGACAGAAACAACAGCAGAGGACACTAAGAAAGAAGACAAAGAAGAAAAA 0,929 ! 4HRR snp194 AM857828 TGAAGGAAATGAAACAATTACAGTCGAATTCAACGTGAACAATGCAACAGACTTGGTGGA A/G GAAGATTTGAAATCGGAGGAAGGTATGCCACACATGATATGCAGACCACCATTTATTGTA 0,929

snp303]POOO183 GCAGAGGAACTGAAAAAGCAACAAGAAGCTGAGGAAAAAAGAAAAGCTGAAGAAGAGG A/G AAAGAGAAAAGCTACAGAGAAAGCTGAAAAGGAAGCTAAAGAAAAGGCTGAAAAAGAA 0,929

snp283_ES789127 CAAGAAATCCTACT ACCTGGGAGTGAACCAGTTcrCTGATO" GAAACA TGAAGAGTTTGT A/G AAATACAATGGCCTGAAGAAGACCTCITTAAAAGATGGAGGATGTTCAAGCTACCTTGCT 0,928

snp333 GTOS3596 GCCGACCGCGGGGACTACAGCTTCTGGCTGGGAATGAACGAGTATGGAGACATGACCAA TIC GAGGAGTTCCGTAGTACCATGAACGGCTACAAGATGAGGAACGGCACTAGC CGCGGATC 0,928 1

snp156_AF075688 CTTCACCTACCTTGACACCACTGGACGCCCCGTCATTGTCATCCACAAATCCAACCTAGT TIC GAGCAGCACA TCCAGGACTTCCAGCTCCA CT ACACcnCCAGAAGCTGTT GTTGTT ACA G 0,926 1

snp217 ru991986 CTGTTTATTGACCTATAGCTGTGTATCATATCATGGTACTGATCAAAATACAGGGTAGAA A/T GTCT AGTGGCCTAGGGT ACACAACAAAACT AATGGTT ACAACTGTGA TTTCA TTACA CCG 0,926

snp487 AM866663 CTTATTTT~GTAATTTTGGGGAAAAAAAACAAAATGATTTCAGGAAAAAAATTAAT A/G CTGTGTGGATTGAATTTATTTGTGGATTTGTCACGTTTGGTAGTATCATTGTAAAATACA 0,926 snp725_FU605JAOlA

ACACAA TTTAGTCGCCGATAAClT AA TGACAAAAGACTATCCCAGCA TCAAGGCA TGG CA A/G AAGGAAAACTACCACAAATCCATGATGCATTTCAAGGAAACAAAAGAGCTTGAGGAAGG 0,926 POLO

219

VALORISATION DES TRAVAUX DE THESE

1. Article soumis

Flahauw, E., Quellec, S., Davenel, A., Dégremont, l., La pègue, S., Hatt, P.-J., 2012. Gonad volume assessment in the oyster Crassostrea gigas: Comparison between a histologicalmethod anda magneticresonanceimaging (MRI) method. Aquaculture. 370-371,84-89.

La pègue, S., Harrang, E., Heurtebi se, S., Flahauw, E., Donnadieu, c., Gayra l, P., Ba Il enghi en, M., Genestout, l., Barbotte, l., Mahla, R., Haffray, P., Klopp, C .. Development of SNP genotypi ng a rrays i ntwo s hellfishs pecies. Molecular Ecology Resources, 14, 820-830.

2. Article en préparation

Flahauw, E., Lapègue, S., Quellec, S., Davenel, A., Quillien, V., Fabioux, c., Hatt, P.-J.. Tempora 1 monitoring ofthe ga metogenesis i nthe Pacifie oyster, Crassostrea gigas, by Magnetic Resonance Imaging (MRI) - en préparation.

Flahauw, E., Heurtebise, S., Boury, c., Hatt, P.-J., Lapègue, 5 .. Detection of QTLs for reproductive effort in Pacifie oyster, Crassostrea gigas - en préparati on.

Gagnaire, P.-A., Flahauw, E., Dégremont, l., Heurtebise, S., Cornette, F., Pontreau, B., Martins, F., Bierne, N., Lapègue, 5 .. Detection of QTLs for survival to summer mortality in Pacifie oyster, Crassostrea gigas -en préparation.

3. Présentation orale

Flahauw, E., Hatt, P.-J., Davenel, A., Quellec, S., Heurtebise, S., Dégremont, l., La pègue, 5 .. Temporal monitoring of the gametogenesis in Crassostrea gigas by Magnetic Resona nce 1 maging a nd detecti on of qua ntitative tra it loci (QTL) for reproductive effort. Physiomar 12, Santiago de Compostela (Spain), 4-8 sept. 2012.

4. Poster

Flahauw, E., Davenel, A., Quellec, S., Quillien, V., Dégremont, l., La pègue, S., Hatt, P.-J.. Evaluation of the gonad volume throughout Magnetic Resonance Imaging in Crassostrea gigas and comparison with the histological method. Physiomar 12, Santiago de Compostela (Spain), 4-8 sept. 2012. (voir page suivante)

221

Evaluation of the gonad volume throughout Magnetic Resonance Imaging in Crassostrea gigas and comparison with histological method

Emilie ElAHAUWI Armel DAVENEL2, Stéphane QUELLEC2, Virgile QURUENl,Uonel DEGREMONTl • Sylvie LAPEGUE' , Philippe-Jacques HATTI

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IntroductIon

ANR E"'j~EI'ION ~ OltOU 1 C arentes

~-""--"'''

Biological pOl'Ome.te:rs of the cupped oyster Crassosfreo gigassuch as growth, reproductive effort (durotion of the gometoge.nesis, dote of spcwning. and fecundity) diHer widety among oysters in the Sorne location. FUI'thermore, mast of the traditionol me.thods, like hi5tol09icol observations, could leod 1'0 lorge voriobility on the observations ot\d the meosurements of these traits, and lorge uncertalntie.s on thei,. changes ove,. tlme. These con be dr'GSticolly reduced by u'ing Mognetic Resonance Imoging (MRI) which Is a non invasive methad ollawlng ta measure the some individuol during its develapment.

Materlols & Methods

• 300 oystus abserved far 6 MRI sessions (fig. lA):

• !5 during gometogenesJs ( .... prit. Moy. June. July ..... ugust)

• 1 susian after gometagenuis

y Ganad ar~ and volume estimated by number of vaxel, in grey levers higher thon 166

. 40 aysters socrificed far histalagy cf ter 3 AARI sessians (fig. 19):

· la in April,

· ta in Moy,

020 ln June.

)0 Gonad orea meosured on hlstolagicol s!ides by number of pixels campasing ganodic cells

Figure 1: Sections of one ayster by MRI CA) and by histolagy (9) Gonod (a) appeors ln hlgher greyscole on MRI slite and in do.rk purple an histolagital slide. On bath pictures. yJsteral ma5S (b) and gills (t) tM olso be obsuycd.

~

~

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0 , " , " "" 'w 'w

Gonad "'~ 11',' HlII<>tOIrf

Fioure 2: Gonod surface on hi5tologlcol sllde and gonad surface by use of MRI.

Results

~

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:~ l~ ,

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"' ~. ,~ "" '00 Oon",j ilell b~ 1'1><100\/)'

Figure 3: Gonod surface on histaloglcol slide ond ganad volume by use of MRI.

This highly s ignificont line.ar rdationShip between the two methods (R 1 :0.84)oIJows us ta use MRI Inste.ad of histology ta monitor reproduttivc cffort of oystcrs.

This highly signifitlll\t lineor reJotionship between the Iwo methods (R 1: 0.68) dcmoMtrofe that MA.! is appropriate ta a5sess the reprodut tiYc effort of Pacific oystcrs.

ConclUSIOn & Perspectives

MRI Is a nan-destructive method which makes it possible ta ossess individual evolution of reproductive effort ond ta compore individuols with a precisIon level oS goad os with traditianal and destructive method of histology.

However. It remairlS ta reduce measurement uncertolnties due moinly ta the voxel size: a vaxel might cantoin gonadic and somatlc cells (tg vesiculer cells). This con therefore lead ta an overestimation of gonad volume.

Results from this study will allow us ta try ta detect ports of the gename (QTLs) carrelated ta reproductive effort of CI'Q$srJstrœ gigas.

222

A BSTRACT

The Pacifie oyster, Crassostrea gigas, is a major aquacultured species whose production represents an economic interest at worldwide, european and french levels. However, this s pecies undergoes summer morta lities recorded from the beginning of the 20th century and, since 2008, this phenomenon increased and threatens mainly juvenile oysters. Aquaculture production of oysters suffers consequences of mass mortalities, that's why this phenomenon has been studied for many years. In France, the bacterium Vibrio splendidus and the Ostreid virus Herpes Virus 1 (OsHV-1) are often associated with mass mortality outbreaks of juveniles oysters and it was demonstrated that selected individua Is for resista nce to summer morta lit Y were able to slow the increasing in vira Iload OsHV-1 in their tissues and then to decline it. These same individuals also present a lighter reproductive effort tha n i ndividuals selected for their sensitlvity to s u mmer m orta lity.

ln this context, this study aimed to improve the knowledge of genetic architecture of reproduction of C. gigas by identifying some regions of the genome called QTLs (Quantitative Trait Loci) involved in reproductive effort and highlighting possible genetic relationships between reproduction and survival; QTLs involved in survival beingalreadydetected.

To characterize the reproductive effort, it was necessaryto develop a set ofnewtools. From a biological point of view, 21 F2 families were produced from lines selected for their contrasting response to summer mortality. From a molecular point of view, new SNPs (Single Nucleotide Polymorphis m) were developed to increase density of the genetic ma pal ready ava i la ble for C. gigas . On a technical point of view, Magnetic Resonance Imaging (MRI) allowed to observe the gametogenesis of 300 individuals of the same family F2 during eight sessions over two years while previous studies were limited to a one-time observation because of the conventional methods of observation of ga metogenes is leading necessa rily to the death ofthe anima Is. A strong correlation was found between observations by MRI and observations bythe conventional method ofhistology.

ln addition to the estimation of gonadic index (index traditionally used to characterize the reproductive effort), MRI also revealed individual variations in kinetics of gametogenesis and differences between males and females, the sex being identifiable on MRI images. In parallel, 300 individuals from two F2 families were sacrificed to estimate the gonadic index by histology. This approach enabled the detection ofQTLs involved in many gametogenesis traits.

Individuals from the three families characterized for F2 reproductive effort were characterized for survival during a summer mortality outbreak. This study was able to detect QTLs involved in the tra it "s urviva 1." These QTLs correspond to some ofthose detected in a previous study. ln addition, these QTLs are often collocated with QTLs involved in reprodu ctive effort. Although the reproduction of the Pacifie oyster is a complex trait to follow, the new tools used in this thesis allowed acquiring new knowledges. The sequencing of genome of Crassostrea gigas and Next Generation Sequencing technologies may be able to help to refine the detected QTL regions .

Keywords: Pacific oyster, Crassostrea gigas, summer mortality, survival, reproductive effort, Magnetic Resonance Imaging, histology, microsatellites, SNPs, Linkage mapping, QTL detection.

224

RESUME

L' huître creuse, Crassostrea gigas, est une es pèce dont la production aquacole représe nte un intérêt économique tant au niveau mondial qu'aux ni vea ux europée n et frança is. Cependant, ce tte espèce subit des mortalités estivales enregistrées dès le début du 20'm, siècle et, depuis 2008, ce

phénomène s'est amplifi é et menace essentielleme nt les huîtres juvén iles. La production aquacole d' huître creuse sub it les conséque nces de ces mortalités massives; c'es t pourquoi ce phénomène est

étudié depuis de nombreuses années. En France, la bactérie Vibrio splendidus et le viru s Ostreid Herpes Virus 1 (OsHV-1)sont le plus souve nt associés aux épisodes de mortalités massives d'huîtres creuses juvéniles et il a été démontré que les indi vidus sélectionnés pour leur résistance aux

mortalités es tivales étai ent capables de ral ent ir l'a ugmentation de la charge vi rale en OsHV-1 dans leurs t iss us puis de la faire régresser. Ces mêmes individus présenteraient également un effort reproducteur plus modeste que des individus sélectionnés pour leur sens ibilité aux mortalités

estiva les.

Ce travail de thèse s' insc ri t dans ce contexte et a donc eu pour principal objectifd'améliorer

la conna issance de l'a rchitecture gé nétiqu e de la reproduct ion de C. gigas en identifiant des régions du génome ou QTLs (Quantitat ive Trait Loci) impliquées dans l'effort reprod ucteur et de mettre en

évidence d'éventuelles relations génétiques entre survie et reproduction, des QTLs impliqu és da ns la

survi e ayant déjà ét é détectés.

Afin de caractériser l' effort reproducteur, il a été nécess aire de développer un ensemble de nouvea ux outils. D' un point de vue bio logique, 21 fami lles F2 ont été produi tes à partir des lignées sé lecti onnées pour leur réponse contras tée aux morta lités es tiva les. D'un point de vue molécula ire,

de nouveaux marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphi sm)ont été développés afin d'augmenter la densité de la carte gé nétique déjà disponible pourC. giga s. D'un point de vue technique, l' Im age ri e par Résonance Magnét ique (IRM) a permis d'observe r la gamétogenèse de 300 individus d'une

même famille F2 au cours de huit sessions réparties su r deux années alors que les études précédentes étaient limitées à une observation ponctuelle; les méthodes classiques d'observation de la gamétogenès e entrainant nécess airement la mort des animaux. Une forte corrélat ion a été

mise en évidence entre les observations par IRM et par la méthode classique de l'hi sto logie.

En plus de l'es timat ion du rapportgonado-somatique (indice traditionne llement utilisé pour ca ractériser l'effort reproducteur), 1' 1 RM a éga lement permis d' observer des va riati ons individuelles

de la cinétique de la gamétogenèse ainsi que des différences entre les mâles et les femelles; le sexe étant identifiable sur les images obtenues par IRM. Parallèl ement, 300 individus de deux autres

fa milles F2 ont été sacrifiés pour esti mer le ra pport gona do -somatique pa r histologie . Cette approche

a ainsi permis de détecter des QTLs impliqués dans de nombreux traits concernant la gamétogenèse.

Des individus proven a nt des troi s fa milles F2 ca ractérisés pou r l' effort reproducteur ont été

ca ractéri sés pour la survie à un épisode de mortalit és es tivale s. Cette étude a permis de détecter des QTLs impliqués dans le caractère « survie ». Ces QTLs correspondent, pour certa ins, à ceux détectés

au cou rs d'une étude précéde nte. De plu s, ces QTLs sont parfo is co loca lisés avec des QTLs impliqués

dans l'effort reproducteur.

Bien que la reproduction de l' huître creuse soi t un caractère complexe à suivre, les nouveaux

outils utilis és au cou rs de ce travail de thèse ont permis d'acquérir de nouve lles connaissances. Le séquençage du gé nome complet de Crassostrea gigas ainsi que les nouve lles méthodes de

séquençage pourront peut-être permett re d'affiner les régions QTLs détectées.

Mots clés: Huître creuse du Pacifique, Crassostrea gigas, mortalités estivales, survie, effort reproducteur, Imagerie par Résonance Magnétique, histologie, marqueurs microsatellites,

marqueurs SNP, cartographie de liaison, détection de QTl.

225

caractérisation génétique de l'effort reproducteur de l'huître

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