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Módulo 2. Biología molecular de los tumores neuroendocrinos e investigación traslacional aplicadaTema 3. Investigación traslacional aplicadaTema 3.1. Introducción a la genómica del cáncer y sus técnicas

Dra. Ana Vivancos PrellezoPrograma Translacional. Instituto de Oncología de Vall d'Hebron (VHIO), Barcelona

A. Métodos en genómica del cáncer

1. Introducción: definición y un poco de historia

La genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. La genómica engloba, así, tanto la transcriptómica como la epigenómica.

La genómica utiliza conocimientos derivados de distintas ciencias, como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc.

2. Áreas de la genómica

Genómica:! Genotipación/SNP (single nucleotide polymorphism)/indels.! Variación en el número de copias (copy number variation [CNV]/copy number alteration [CNA]).! Arquitectura del genoma (elementos Alu/long interspersed nuclear elements [LINE]/short interspersed

nuclear elements [SINE]).Epigenómica:

! Metilación de citosinas.! Acetilación o metilación de histonas.! Unión de factores de transcripción al ADN.

Transcriptómica: ! Niveles de expresión de mARN, miARN o piARN.! Estudio de eventos de splicing alternativo.

2.1. Un poco de historia…

James D. Watson y Francis Crick fueron los codescubridores de la estructura del ADN en 1953. Utilizaron datos de difracción de rayos X generados por Rosalind Franklin y propusieron la estructura de doble hélice de la molécula de ADN1 (figura 1).

Figura 1. James Watson y Francis Crick con el modelo de doble hebra de ADN

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3. Método de secuenciación de Sanger (1977)

El método de secuenciación por dideoxinucleótidos (ddNTP o terminadores), mejor conocido como el método Sanger, se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. Esencialmente, se hibrida un cebador al ADN para secuenciar que permitirá que una polimerasa inicie la elongación de la cadena complementaria mediante adición de nucleótidos. El método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo en la reacción de elongación de una pequeña proporción de ddNTP que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que, cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. Dado que la reacción se realiza sobre numerosas moléculas de ADN en paralelo, se generan fragmentos que difieren un nucleótido en longitud. Tras resolver estos fragmentos en geles de acrilamida, se deduce la secuencia nucleotídica original del ADN estudiado2 (figura 2).

Figura 2. Esquema de la técnica de secuenciación desarrollada por Fred Sanger

4. Primer genoma secuenciado, nacimiento de la genómica (1977)

El bacteriófago PhiX174 fue el primer genoma en ser secuenciado. Se trata de un genoma viral de 5.368 pares de bases. Frederic Sanger inventó el método de shotgunsequencing (secuenciación al azar), una estrategia basada en el aislamiento de fragmentos al azar de ADN del genoma para secuenciar. Las porciones amplificadas y secuenciadas de ADN son ensambladas posteriormente a través de sus regiones solapadas para formar contigs. El paso final consiste en el uso de primers diseñados para amplificar y después ensamblar las regiones con discontinuidades para generar la secuencia completa del genoma3. Este trabajo le valió a Sanger su segundo Premio Nobel (el primero lo ganó por inventar la técnica de secuenciación que lleva su nombre).

5. Alteraciones genómicas en el cáncer

El cáncer es una enfermedad genómica. El desarrollo de un tumor es dirigido por la adquisición de alteraciones genéticas somáticas (es decir, a lo largo de la vida del individuo, contando a partir del cigoto) a muy diferentes niveles: desde cambios en residuos de la secuencia nucleotídica hasta alteraciones en el número y la arquitectura de los cromosomas (tabla 1).

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Tabla 1. Clasificación de las alteraciones genómicas halladas en el cáncer

Los genomas tumorales son heterogéneos: durante el desarrollo tumoral, aparecen y son seleccionadas continuamente poblaciones de células (figura 3). Esto provoca que cada tumor contenga un número variable de genomas emparentados o clones. Este fenómeno es conocido como heterogeneidad genómica intratumoral4-6.

Figura 3. Esquema de desarrollo y evolución tumoral

Por tanto, el estudio de la genómica de tumores es un área compleja y que requiere del uso de técnicas que permitan estudiar fenómenos a gran escala.

B. Técnicas ómicas

Se trata de técnicas que permiten el estudio a escala genómica.

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1. Microarrays y sus aplicaciones

Históricamente, el primer array para estudio de la expresión génica se comunicó en 1995. Técnicas previas para el estudio del «transciptoma» fueron el estudio de expression sequence tags (EST), de serial analysis of gene expression (SAGE) y de supression subtractive hybridization (SSH).

Un array consta de una colección de fragmentos conocidos de ADN que están unidos covalentemente a una superficie sólida (cristal, nailon o silicio) en una disposición también conocida. Estos fragmentos, o sondas (probes), pueden corresponder a regiones exónicas (estudios de expresión), a regiones genómicas con SNP (genotipación, CNV), a secuencias de exon junctions (y permitir el estudio de procesos de splicing). Los tiling arrays contienen sondas complementarias a todo el genoma y permiten el descubrimiento de nuevos tránscritos, además de la cuantificación de la expresión génica7.

La hibridación complementaria de los ácidos nucleicos es la base de detección en los microarrays. En un único experimento se realiza la hibridación de las sondas contenidas en el microarray con una mezcla compleja de ADN o ARN (dianas).

Existen dos grandes grupos de arrays, los de uno o dos canales.

1.1. Tipos de microarrays

1.1.1. Microarrays de ADN de dos canales (Agilent)

En estos microarrays se compara la señal generada por dos muestras y se obtiene un valor de intensidad relativo. Se utilizan tanto en estudios de expresión génica (mARN) como para la detección de cambios en el número de copias a nivel genómico (CNV), etc.

En los estudios de expresión génica, durante la reacción de retrotranscripción (paso de mARN a cADN), se marca cada una de las muestras con fluoróforos distintos dUTP-Cy3 o -Cy5. Se depositan las muestras sobre el microarray y estas hibridan con las sondas. El grado de hibridación es proporcional a la expresión del gen de cada sonda en cada muestra problema. Tras la hibridación, el microarray se lava de forma astringente para eliminar el material no hibridado y se escanea (dos excitaciones, dos imágenes que se superpondrán) (figura 4).

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Figura 4. Ejemplo de experimento típico para la obtención del perfil de expresión génica en el cáncer.

Muestra 1 (células tumorales) marcada con Cy3: emite en el verde. Muestra 2 (células normales) marcada con Cy5: emite en el rojo. Un punto verde es un ARN más abundante en la muestra 1. Un punto rojo es un ARN más abundante en la muestra 2. Un punto amarillo es un ARN que se expresa por igual en ambas muestras. Un punto negro es un ARN que no se expresa en ninguna de las muestras.

La intensidad de la señal de hibridación resultante (en forma de fluorescencia) es proporcional a la cantidad de mARN.

Los estudios de CNV con este tipo de arrays reciben el nombre de array comparative genomic hybridisation (aCGH). Esta técnica permite el estudio de los cambios en número de copias (amplificaciones y deleciones) en el genoma.

El ADN de una muestra problema (tumoral) y una control (tejido normal del individuo) se marca con fluoróforos diferentes, se mezcla y se hibrida a un chip de ADN. Las sondas pueden corresponder a regiones concretas o bien estar distribuidas homogéneamente por todo el genoma; existen muchas opciones en función de lo que se quiera estudiar (figura 5). La intensidad de fluorescencia de cada muestra se utiliza para deducir el cambio en el número de copias en las regiones del genoma presentes en el chip.

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Figura 5. Ejemplo de detección de variación en número de copias mediante array comparative genomic hybridisation en una muestra tumoral utilizando chips de diferente densidad de sondas genómicas.

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1.1.2. Microarrays de oligonucleótidos de un canal (Affymetrix)

Se trata de arrays de oligonucleótidos de 25 mer. En este caso, la señal no es relativa, cada muestra se hibrida y se obtiene un valor de intensidad. La presencia de numerosos controles permite la normalización entre muestras y entre diferentes experimentos.

Para los estudios de expresión génica, los arrays contienen 11-20 parejas de sondas específicas por gen. Un array puede contener, por tanto, 400.000 sondas (aproximadamente, 20.000 genes). Las sondas están representadas en parejas, una de homología perfecta (perfect match) y otra con un error deliberado (miss match).

Tras la síntesis de cADN, se lleva a cabo una transcripción in vitro con incorporación de bases biotiniladas (cARN) y posterior fragmentación. Se hibrida la muestra con el array y se tiñe con estreptavidina-ficoeritrina. Se escanea y cuantifica (software propietario de Affymetrix).

Un SNP array es el microarray de ADN de un único canal que permite el estudio de polimorfismos en una población. La variación a nivel de base única (SNP) es el tipo de variación más frecuente en el genoma. Existen alrededor de diez millones de SNP en el genoma humano y chips de SNP arrays de diferentes densidades. Esencialmente, se ubican en el array sondas específicas de alelo, que hibridarán con el ADN problema. Dado que los SNP son altamente conservados en la evolución y dentro de una población, su mapaje sirve como herramienta para la genotipación.

Los SNP arrays tienen mayor resolución que aCGH para la detección de alteraciones en el número de copias. El estudio de los SNP permite llevar a cabo estudios de asociación a enfermedades. Los SNP arrays permiten, asimismo, detectar variaciones en el número de copias y determinar regiones de LOH (loss of heterozygosity), frecuentes en el cáncer.

2. Ultrasecuenciadores, la revolución en la secuenciación

La aparición en el mercado a partir del año 2006 de los secuenciadores de segunda generación o ultrasecuenciadores ha constituido el mayor avance en el campo de la genómica desde la invención del método de Sanger o el uso de los arrays. La tecnología de NextGen o NGS (secuenciación de nueva generación) permite el estudio de cualquier molécula de ácido nucleico de la célula de forma digital (existe detección molécula a molécula) y obteniendo información de su secuencia (a diferencia de los arrays, en que se obtiene información indirecta, mediante hibridación)8.

Los ultrasecuenciadores son capaces de generar millones de secuencias cortas por carrera. El estudio de un tipo u otro de ácido nucleico (ADN, mARN, miARN, etc.) se realiza basándose en la preparación de una librería a partirde cada muestra. Dichas librerías contienen siempre unos adaptadores que permiten su posterior secuenciación.No existe limitación a priori sobre el tipo de ácido nucleico para estudiar, simplemente la preparación de la libreríadebe seguir uno u otro protocolo.

En el área del cáncer, la aparición de estas tecnologías ha permitido algo que no era posible plantearse hasta el momento: la secuenciación de los genomas tumorales9 (ver apartado 3. Los consorcios).

2.1. Ultrasecuenciación con tecnología Solexa/Illumina

Se trata de la tecnología de segunda generación más ampliamente utilizada en el mundo. El rendimiento de una carrera de HiSeq2000, instrumento con mayor capacidad, son 1.500 millones de secuencias de 2X100 bases o, lo que es lo mismo, 600 Gbases (un genoma haploide humano tiene un tamaño de 3 Gbases).

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Existen dos pasos en la secuenciación:1. Amplificación local en flowcell: la flowcell es el lugar físico donde se lleva a cabo la secuenciación. Se trata

de una superficie de vidrio recubierta de dos oligonucleótidos (P5 y P7) que permiten la amplificación localde las moléculas de las librerías. Tras este paso, cada molécula inicial genera unas 1.000 copias idénticasque están agrupadas espacialmente (clusters). Este paso permite la amplificación de la señal para suposterior detección.

2. Sequencing-by-synthesis: este es el paso propiamente de secuenciación. Tras hibridar un oligocomplementario al adaptador distal al vidrio (primer), se inician los ciclos de incorporación de nucleótidos.Los nucleótidos son terminadores (ddNTP) reversibles marcados a su vez con fluorócromos distintos. Encada ciclo se incorpora una única base y se escanea la emisión (en cuatro longitudes de onda diferentes).Para cada posición, o cluster, se llaman las bases en función de su emisión en cada ciclo.

Análisis: se obtienen muchos millones de secuencias cortas que deben ser inicialmente ubicadas en el genoma humano (alineamiento) (figura 6) para la posterior detección de mutaciones, etc. En algunos casos, en el cáncer (o cuando se secuencian genomas nuevos), se puede requerir de procesos de ensamblaje de novo, sin un genoma de referencia.

Figura 6. Millones de lecturas cortas obtenidas mediante técnicas de ultrasecuenciación

2.2. Alineamiento contra un genoma de referencia

Esta es la aplicación más frecuente. Existen diferentes softwares, basados en seeding o en indexing, como BWA (Burroughs-Wheeler aligner), MAQ (mapping and assembly with qualities), Bowtie, SOAP (short oligonucleotide analysis package), etc.10. La velocidad a que se alinee es crítica, dado el ingente volumen de datos que genera la tecnología de ultrasecuenciación.

Seeding: se divide la secuencia generada durante la secuenciación en fragmentos cortos y se usan estos para alinear contra el genoma de referencia humano (Eland, SOAP, MAQ). Existen algunos softwares que, en su lugar, dividen en fragmentos cortos el genoma humano de referencia (Bfast, Mosaik; Novoalign).

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Indexing: se crea un árbol con la secuencia de referencia del genoma (en realidad, se indexa el genoma humano en un trie, que es una estructura de datos que guarda los sufijos de una cadena). De forma simplificada, las lecturas se alinean a base de seguir las ramificaciones. Softwares que utilizan esta aproximación son Bowtie, BWA o SOAP2.

2.3. Ensamblaje de novo

Es la aplicación más demandante en cuanto a recursos de hardware. Es necesaria para generar la secuencia genómica de nuevos organismos, así como para estudiar la variación estructural en la población de individuos de una misma especie o en un tumor.

2.4. Conceptos importantes en datos de secuenciación

Coverage (X): se refiere al número de veces que una base en particular está contenida en secuencias o, lo que es lo mismo, que ha sido secuenciada. Da una idea de la profundidad de la secuenciación.

Calidades: se han adoptado diferentes medidas de calidad en las secuencias:1. Calidad de una base en una secuencia (base quality): los valores de calidad Phred (Q) (utilizado en

secuenciación de Sanger) son los más aceptados para caracterizar la calidad de las secuencias deADN. Los valores están logarítmicamente relacionados con las probabilidades de error. Q30 =probabilidad de 1 en 1.000 de error. Q40 = probabilidad de 1 en 10.000 de error, etc. En unasecuencia, cada posición tiene un valor de Q.

2. Calidad de alineamiento de una secuencia (mapping quality): desde un punto de vista probabilístico,cada alineamiento es en realidad una estimación del verdadero alineamiento y es, por tanto, unavariable al azar. Un alineamiento puede ser erróneo. Dados 1.000 alineamientos con una calidad de30, uno de ellos será erróneo en promedio. Cada secuencia alineada tiene un único valor de mappingquality (figura 7).

Figura 7. Ejemplo de alineamiento de secuencias en un genoma humano y los datos de base quality y mapping quality

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2.5. Tras alinear, depende del tipo de experimento

Existen softwares diseñados específicamente para, a partir de las secuencias alineadas, realizar distintos tipos de análisis: 1) detección de variantes: búsqueda de mutaciones, SNP, metilación de citosinas; 2) detección de picos: ChIP-seq de factores de transcripción o proteínas que interactúen con el ADN en general; 3) cuantificación de mARN; 4) detección de eventos de splicing alternativo, etc.

C. Los consorcios

Tras la aparición de las tecnologías de secuenciación, la comunidad científica se organizó en forma de consorcios para dar respuesta, a través de técnicas ómicas, a preguntas de elevado interés y que hasta el momento no habían podido ser abordadas técnicamente.

1. 1000 Genome Project (http://www.1000genomes.org/)

Se pretende crear un catálogo de variación en la población humana mediante la secuenciación completa de 2.500 individuos y que cubra todas las variantes que se encuentren en > 1 % en la población humana. Se ha publicado la primera fase del proyecto, con 1.092 genomas humanos11.

2. The Cancer Genome Atlas (http://cancergenome.nih.gov/)

Su finalidad es crear un atlas de los cambios genómicos asociados a 20 tipos comunes de cáncer. Están implicados > 100 grupos de investigación de Estados Unidos. Hasta el momento, se han generado datos de 17 tipos de cáncer12-14. Contenidos del atlas: mutaciones puntuales, indels, expresión génica, epigenómica, miARN.

3. International Cancer Genome Consortium (http://icgc.org/home)

Su finalidad es obtener una descripción de los cambios genómicos, transcriptómicos y genéticos en 53 tipos diferentes de tumores. Están implicados grupos de investigación de todo el mundo; en general, cada país se ocupa de un tipo tumoral15. Engloba, asimismo, a The Cancer Genome Atlas. Contenidos: mutaciones puntuales, indels, expresión génica, miARN.

D. Bibliografía

1. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature1953;171(4356):737-8.

2. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci1977;74(12):5463-7.

3. Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, et al. Nucleotide sequence ofbacteriophage phi X174 DNA. Nature 1977;265(5596):687-95.

4. Ding L, Ellis MJ, Li S, Larson DE, Chen K, Wallis JW, et al. Genome remodelling in a basal-like breastcancer metastasis and xenograft. Nature 2010;464(7291):999-1005.

5. Yachida S, Jones S, Bozic I, Antal T, Leary R, Fu B, et al. Distant metastasis occurs late during the geneticevolution of pancreatic cancer. Nature 2010;467(7319):1114-7.

6. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, et al. Intratumor heterogeneityand branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366(10):883-92.

7. Dufva M. Introduction to microarray technology. Methods Mol Biol 2009;529:1-22.8. Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet 2010;11(1):31-46.9. Mardis ER, Wilson RK. Cancer genome sequencing: a review. Hum Mol Genet 2009;18(R2):R163-8.10. Li H, Homer N. A survey of sequence alignment algorithms for next-generation sequencing. Brief Bioinform

2010;11(5):473-83.

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11. 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.Nature 2012;491(7422):56-65.

12. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines humanglioblastoma genes and core pathways. Nature 2008;455(7216):1061-8.

13. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of human colonand rectal cancer. Nature 2012;487(7407):330-7.

14. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature2012;490(7418):61-70.

15. International Cancer Genome Consortium. International network of cancer genome projects. Nature2010;464(7291):993-8.

Lectura recomendada:

• Roychowdhury S, Iyer MK, Robinson DR, Lonigro RJ, Wu YM, Cao X, et al. Personalized oncology throughintegrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci Transl Med 2011;3(111):111-21.Muestra la información que podemos obtener con NGS en cáncer y su posible uso en medicinapersonalizada.

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Módulo 2. Biología molecular de los tumores neuroendocrinos e investigación traslacional aplicadaTema 3. Investigación traslacional aplicadaTema 3.2. Células madre y cáncer

Héctor G. PalmerResponsable del Laboratorio de Células Madre y Cáncer. Instituto de Oncología Vall d´Hebron - VHIO. Hospital Universitario Vall d´Hebron. Barcelona

1. Heterogeneidad celular intratumoral

Muchas evidencias apoyan el concepto de que células con propiedades de células madre son esenciales para el desarrollo y perpetuación de varias formas de cáncer en humanos.

En primer lugar, muchos estudios demuestran que un gran número de células cancerosas son necesarias para que un tumor crezca1,2. Estos datos son contradictorios con el modelo estocástico tradicional del desarrollo del cáncer, el cual predice que todas las células cancerosas tienen el mismo potencial de generar un nuevo tumor, por lo que solo unas pocas de ellas serían suficientes para iniciar el cáncer. Por el contrario, evidencias recientes indican que para muchos tipos de cáncer solo una pequeña población de células cancerosas son capaces de regenerar un tumor3,4. Esta minoría de células iniciadoras de tumores dan lugar al resto de células tumorales, las cuales solo poseen una capacidad limitada de replicarse y contribuir así a la masa del tumor, pero no a su mantenimiento (figura 1)3,4.

Figura 1. Modelos jerárquico y estocástico del cáncer

Izquierda: modelo jerárquico: únicamente ciertas células de los tumores sostienen la capacidad de autorrenovación del tumor y, por tanto, de regenerarlo. Estas son las células madre tumorales, que no se comprometen con ningún programa de diferenciación. Son además capaces de dar lugar a una descendencia de células que se diferencian en los distintos fenotipos funcionales presentes en la masa tumoral. Las células madre tumorales cruzan un punto molecular de no retorno por el que se diferencian irreversiblemente em los linajes que componen el tumor heterogéneo. Derecha: modelo estocástico: otros tipos de tumores presentan un gran número de células que retienen la capacidad de regenerar el tumor (autorrenovación) y, por lo tanto, no se organizan de forma jerárquica.

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CSC: células madre tumorales.

En segundo lugar, aunque la mayoría de los tumores son clonales y se originan a partir de una única célula transformada5,6, no todas las células dentro de un tumor son idénticas. Las células cancerosas dentro del tumor presentan diferentes fenotipos y potencial proliferativo7. Este concepto se conoce también como heterogeneidad del tumor.

El cáncer es, por supuesto, una enfermedad genética en la que la acumulación sucesiva de mutaciones promueve la progresión de la enfermedad. Estas mutaciones que confieren ventajas adaptativas a las células tumorales suceden progresivamente en diferentes células dentro de la masa tumoral, generando una anatomía genética compleja que contribuye a la heterogeneidad del tumor. Cada subclón definido por un repertorio de mutaciones concreto puede, a su vez, organizarse de forma jerárquica siguiendo el modelo de las células madre tumorales (cancer stem cells o CSC) (figura 2).

Figura 2. Modelo combinado de evolución clonal y células madre tumorales

De arriba a abajo: la evolución clonal dirige la progresión del tumor. Paso 1: la primera mutación oncogénica (flecha amarilla) ocurre en una célula del epitelio sano y provoca el crecimiento de una lesión benigna genéticamente homogénea. Paso 2: una segunda mutación afecta a ciertas células de la lesión benigna, lo que provoca su transformación y el crecimiento de un clon con mayor malignidad e invasividad. Paso 3: una tercera alteración genética ocurre en células del clon maligno y provoca la adquisición de propiedades metastáticas. De izquierda a derecha: en cada paso de la evolución clonal, los tumores y sus subclones contienen células que se comportan como células madre tumorales.

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2. Células madre tumorales: definición

Entre las diferentes poblaciones de células tumorales, las iniciadoras del cáncer se encuentran en el ápice de un proceso de diferenciación dentro del tejido tumoral, de alguna manera de forma semejante a la jerarquía presente en el tejido normal a partir del cual se originó el cáncer7. Estas propiedades de las células iniciadoras del cáncer son claramente similares a las características que definen a las células madre normales. Las células madre poseen tres propiedades distintivas fundamentales: autorrenovación, es decir, después de cada división una o dos de las células hijas retienen las mismas propiedades biológicas que la célula parental; pluripotencia, es decir, la capacidad de dar lugar a múltiples linajes celulares; y la capacidad de proliferar extensamente3. Un incremento anormal de la autorrenovación, en combinación con el intrínseco potencial proliferativo de las células madre, puede ser la causa de la mayoría de lo que se considera un fenotipo maligno en cáncer3. A las células malignas con estas propiedades funcionales se las denomina «células madre tumorales» o CSC4. Además de estas propiedades fundamentales, las CSC presentan características distintivas en diferentes tipos de tumores, tal y como se resume en la tabla 1.

Tabla 1. Comprobando el modelo de las células madre tumorales

CSC: células madre tumorales.

Estas CSC poco abundantes y biológicamente distintas se encuentran en diferentes tipos de cáncer humano, afectando al sistema hematopoyético, cerebro, mama, y recientemente también en otros tipos de tumores sólidos3,4,8,9. En muchos casos, el aislamiento de las CSC se realiza basándose en sus altos niveles de expresión de marcadores específicos de superficie y son únicas en su capacidad de recapitular la formación del tumor humano original al ser inyectadas en ratones immunosuprimidos (figura 3)3,4,8,9. Este tipo de células generan esferas que crecen en suspensión cuando se las cultiva in vitro, que son capaces de autorrenovarse, de diferenciarse en cualquier tipo de célula dentro del tumor y que poseen el potencial proliferativo necesario para dirigir la expansión continua de la población de células malignas8,9.

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Figura 3. Ensayo funcional para definir células madre tumorales

Las células derivadas de los pacientes se aíslan mediante citometría de flujo (FACS) utilizando marcadores de superficie. Se inyectan cantidades limitantes de las supuestas CSC y las células tumorales no CSC en ratones immunodeficientes. Se calcula la presencia o enriquecimiento de CSC en cada población según sea la frecuencia de aparición de tumores en los ratones.CSC: células madre tumorales; FACS: fluorescence-activated cell sorter.

3. Terapias contra las células madre tumorales

Es cada vez más evidente que los tratamientos contra el cáncer que no eliminan las CSC podrían permitir las reaparición de los tumores. Las CSC pueden componer la reserva de células resistentes a los fármacos antitumorales que son responsables de las recaídas después de la remisión inducida por la quimiorradioterapia o pueden dar lugar a metástasis distantes4. Las estrategias terapéuticas que ataquen específicamente a estas CSC debieran erradicar los tumores de forma más eficiente que los tratamientos convencionales actuales y reducir el riesgo de recaídas y metástasis (figura 4).

Figura 4. Células madre tumorales resistentes a los tratamientos convencionales

Las CSC presentan diferentes mecanismos activos para resistir al tratamiento con diversos fármacos antitumorales que actualmente forman parte de la terapia convencional. El tratamiento adyuvante elimina las células tumorales diferenciadas, mientras las CSC resisten y se enriquecen, dando lugar a futuras recaídas y metástasis. Nuevas terapias dirigidas para eliminar específicamente CSC serían capaces de bloquear la capacidad de autorrenovación del cáncer y, por tanto, promover la degeneración del tumor.CSC: células madre tumorales.

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Sin embargo, las CSC poseen una mayor resistencia a la quimioterapia en comparación con el resto de células cancerosas4. De forma similar a las células madre normales, expresan niveles más altos de bombas de extrusión que les confieren resistencia a múltiples agentes antitumorales4. Su baja tasa de proliferación o quiescencia es otra característica distintiva de las células madre, que podría conservarse en las CSC. Sin embargo, la existencia de CSC quiescentes es una hipótesis muy atractiva que no ha sido confirmada para la mayoría de los tipos de cáncer humano. Esta implicaría una clara distinción entre una población de CSC quiescentes responsables de la supervivencia y autorrenovación del tumor a largo plazo y su descendencia de células proliferativas responsables del crecimiento del cáncer y la generación de la masa tumoral detectable. Esto explicaría por qué las CSC podrían escapar de los tratamientos convencionales basados en fármacos que solo afectan a células tumorales proliferativas y dar lugar años después a recaídas y metástasis. Por lo tanto, es esencial entender los mecanismos moleculares que dirigen las propiedades distintivas de las CSC para poder diseñar tratamientos más efectivos contra el cáncer.

4. Bibliografía

1. Bruce WR, Van der Gaag H. A quantitative assay for the number of murine lymphoma cells capable ofproliferation in vivo. Nature 1963;199:79-80.

2. Hamburger AW, Salmon SE. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science 1977;197(4302):461-3.3. Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells. N Engl J Med 2006;355(12):1253-61.4. Lobo NA, Shimono Y, Qian D, Clarke MF. The biology of cancer stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol

2007;23:675-99.5. Park CH, Bergsagel DE, McCulloch EA. Mouse myeloma tumor stem cells: a primary cell culture assay. J

Natl Cancer Inst 1971;46(2):411-22.6. 6. Garcia SB, Novelli M, Wright NA. The clonal origin and clonal evolution of epithelial tumours. J Exp

Pathol 2000;81(2):89-116.7. Heppner GH. Tumor heterogeneity. Cancer Res 1984;44(6):2259-65.8. O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in

immunodeficient mice. Nature 2007;445(7123):106-10.9. Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, et al. Identification and expansion

of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007;445(7123):111-5.

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Módulo 2. Biología molecular de los tumores neuroendocrinos e investigación traslacional aplicadaTema 3. Investigación traslacional aplicadaTema 3.3. Proteómica y cáncer

Dr. Javier Muñoz PeraltaJefe de la Unidad de Proteómica. Programa de Biotecnología. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). Madrid

1. Genoma, transcriptoma, proteoma y cáncer

La mayor parte de los cánceres tienen su origen en alteraciones en el ADN (por ejemplo, mutaciones, translocaciones, delecciones) que afectan a genes implicados en la regulación de la división celular. Estas anomalías suelen causar cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificante cuya función se ve afectada. Un hecho importante en pacientes con cáncer es la ausencia de respuesta a tratamiento, probablemente debido al papel que juega otra serie de factores ambientales y genéticos. De hecho, en los últimos años, una corriente de pensamiento se ha instaurado entre los clínicos e investigadores básicos en la que se sugiere que «en el cáncer no hay una enfermedad sino enfermos». Esto ha dado lugar a la idea de una medicina personalizada que propone el diseño racional de tratamientos específicos para cada paciente basados en datos principalmente moleculares1,2. Sin embargo, debido a la enorme complejidad de los sistemas biológicos, tan solo mediante el uso de tecnologías de alto rendimiento, también llamadas ómicas, podemos llegar a entender el complejo funcionamiento de las células y además identificar aquellos mecanismos moleculares responsables de una determinada patología3. Este tipo de aproximaciones posibilitan también el descubrimiento de resultados inesperados al no partir de una hipótesis inicial de trabajo.

La primera de estas iniciativas se llevó a cabo en 2001 con la consecución del primer borrador del genoma humano en el que se describieron las secuencias de los 20.300 genes necesarios para formar todos los tejidos presentes a lo largo del desarrollo de un ser humano4. Más recientemente, consorcios internacionales han descrito el llamado «genoma del cáncer», que ha permitido la identificación de miles de mutaciones con un papel potencial en el cáncer5. Sin embargo, no todos estos 20.300 genes son transcripcionalmente activos en un mismo tipo celular. El conjunto de todos los ARN mensajeros de una célula se conoce como transcriptoma. En análisis comparativos, este tipo de información se ha utilizado para intentar identificar perfiles de expresión génica que permitan una clasificación molecular detallada y precisa de distintas patologías. A su vez, el papel de los mecanismos de regulación epigenética (metilación de ADN o modificaciones de histonas)6 o de los micro-ARN (capaces de reprimir la expresión de cientos de genes postranscripcionalmente)7 también está siendo estudiado en distintos tipos de cáncer.

De forma análoga, el proteoma se conoce como el conjunto de proteínas presentes en un tipo celular concreto (por ejemplo, hepatocitos) bajo unas determinadas condiciones (por ejemplo, estimulados con factor de crecimiento) en un momento dado (por ejemplo, durante la mitosis)8. En este sentido, el proteoma representa, posiblemente, el nivel de regulación más importante para lograr entender cómo funciona una célula, ya que las proteínas son las ejecutoras moleculares de los genes, es decir, quienes realizan la función. Sin embargo, el estudio del proteoma es mucho más complejo que el estudio del genoma o el transcriptoma. Esto es debido a la propia naturaleza fisicoquímica de las proteínas, los mecanismos de procesamiento alternativo, las interacciones de proteínas y la presencia de modificaciones postraduccionales, como por ejemplo la fosforilación. Además, estos procesos son altamente dinámicos en el tiempo (algunas reacciones de fosforilación solamente duran unos segundos) y en el espacio (modificaciones que tienen una localización específica en un compartimento subcelular). El campo de la proteómica ha madurado de forma muy significativa en la última década, lo que ha permitido actualmente el análisis global de proteomas con una gran precisión en numerosos escenarios de la investigación básica9. A su vez, la proteómica posee un enorme potencial en el ámbito clínico9.

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2. Aproximaciones experimentales en proteómica

Aunque existen numerosas variaciones experimentales, un experimento típico de proteómica suele consistir en tres fases principalmente que se llevan a cabo de forma secuencial y con las que se persigue la identificación y cuantificación de todas las proteínas, modificaciones postraduccionales e interacciones de las muestras para analizar (figura 1).

Figura 1. Flujo típico de un experimento de proteómica

Tras la extracción de las proteínas de las muestras de interés, se procede a su digestión enzimática. Los péptidos resultantes son separados cromatográficamente y secuenciados mediante espectrometría de masas. Los datos de identificación y cuantificación de proteínas son finalmente analizados computacionalmente.

2.1. Preparación de la muestra

El origen de la muestra biológica puede ser enormemente variado e incluir líneas celulares en cultivo, tejidos provenientes de biopsias e incluso fluidos corporales tales como el plasma o la orina. El primer paso consiste en la extracción de las proteínas. Para ello, se utilizan soluciones que contienen detergentes (por ejemplo, SDS) y agentes caotrópicos (por ejemplo, urea), con lo que se logra la desnaturalización de las proteínas y su solubilización. En algunas muestras, tales como tejidos, la extracción de las proteínas suele realizarse mediante una lisis mecánica (por ejemplo, homogeneizador). Es importante trabajar siempre en presencia de inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la modificación artefactual de las proteínas constituyentes. El siguiente paso es la digestión enzimática de las proteínas en fragmentos de menor tamaño llamados péptidos. En el 95 % de los casos se utiliza tripsina debido a su alta eficacia y especificidad (corta en lisinas y argininas), pues logra fragmentos peptídicos de un tamaño adecuado para su secuenciación (8-20 aminoácidos).

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2.2. Análisis mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas

Una muestra de tejido contiene aproximadamente 11.000-15.000 proteínas diferentes. Tras la digestión tríptica de estas, se obtienen aproximadamente unos 1.500.000 péptidos. Además de esta complejidad, hay proteínas que son 1.000.000.000 más abundantes que otras en la misma muestra (esto se conoce como rango dinámico). Por tanto, para incrementar el número de proteínas identificadas y lograr la detección de aquellas de menor abundancia, antes de su análisis mediante espectrometría de masas, los distintos péptidos son separados mediante cromatografía líquida de alta presión10.

Los distintos péptidos son entonces secuenciados mediante espectrometría de masas11. Para ello, los péptidos deben ser primeramente ionizados (adquieren carga positiva) y llevados a la fase gaseosa en una técnica que se denomina electrospray. Una vez dentro del espectrómetro de masas en los que existe un gran vacío, mediante la aplicación de distintos campos electromagnéticos, la masa de los distintos péptidos es determinada con una alta precisión (< 0,005 Da). Esto es lo que se conoce como espectro de masas. El siguiente paso es la fragmentación de esos péptidos en los distintos aminoácidos que los constituyen mediante colisiones con gases inertes (helio, nitrógeno). A continuación, las masas de esos fragmentos son determinadas en lo que se denomina espectro de masas en tándem. Los espectrómetros de masas más modernos pueden llegar a secuenciar 50 péptidos por segundo.

2.3. Procesamiento e interpretación de los datos

La identificación de las secuencias de aminoácidos y, por tanto, de las proteínas presentes en las muestras se realiza mediante la comparación de los espectros de masas y de masas en tándem obtenidos experimentalmente con espectros teóricos determinados computacionalmente provenientes de todas las proteínas conocidas12. Para ello, se utilizan bases de datos de proteínas como Uniprot (www.uniprot.org) y The National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Un algoritmo computacional determina entonces la significación estadística de estas comparaciones. Debido al alto número de espectros que son comparados (en el rango de cientos de millones) y la consecuente probabilidad de falsos positivos, los resultados son filtrados con distintos procedimientos estadísticos (el cálculo del false discovery rate es uno de los más comunes). Tras la identificación de las proteínas, pueden determinarse los niveles de estas entre distintas muestras analizadas. Aquellas proteínas cuyos niveles están significativamente alterados son examinadas para determinar relaciones funcionales entre ellas que indiquen la desregulación de un determinado proceso biológico (por ejemplo, apoptosis) o clase molecular (por ejemplo, tirosina cinasas). Para ello, se utilizan repositorios en los que se anotan las distintas funciones de las proteínas. Una de las herramientas más usadas es Gene Ontology (www.geneontology.org).

3. Aplicaciones proteómicas en la investigación oncológica

Una de las principales aplicaciones de la proteómica es en el ámbito de la biomedicina y los entornos clínicos. El estudio del proteoma en diferentes situaciones patológicas permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se relaciona con determinados estados patológicos. Este tipo de experimentos se conocen como expresión diferencial de proteínas. Esta información es fundamental para lograr entender los mecanismos moleculares implicados en una determinada patología. Por ejemplo, en una supuesta comparación proteómica de muestras de hígado de pacientes con hepatocarcinoma y sujetos sanos, la identificación de proteínas mitocondriales diferencialmente expresadas podría sugerir un defecto en la fosforilación oxidativa y la producción de energía.

Del mismo modo, también es posible identificar proteínas que permitan diagnosticar la enfermedad o pronosticar su evolución, esto es, el desarrollo de biomarcadores13. La enorme aplicabilidad que este tipo de estudios podría tener en la clínica ha hecho que numerosos grupos de investigación hayan utilizado aproximaciones proteómicas para la búsqueda de biomarcadores en diversas condiciones patológicas. Aunque con ligeras variaciones, el flujo de trabajo en este tipo de estudios podría dividirse en dos fases (figura 2). La primera, llamada proteómica de descubrimiento (fase discovery), implica la identificación de proteínas que muestran una expresión diferencial

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entre sujetos de distintos grupos (por ejemplo, sanos frente a enfermos). Para ello, se utilizan técnicas de proteómica llamadas shotgun en las que el espectrómetro de masas está configurado para identificar y cuantificar todas las proteínas presentes en una serie de muestras biológicas. La principal limitación de esta aproximación es que no puede aplicarse a un número alto de muestras debido a que este tipo de análisis implica procedimientos experimentales que pueden durar varios meses.

Figura 2. Identificación de biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de patologías mediante técnicas proteómicas

Se utilizan distintas aproximaciones proteómicas para el descubrimiento de biomarcadores. La primera fase consiste en un estudio de expresión diferencial en un número bajo de muestras para definir una serie de proteínas candidatas a biomarcadores. La siguiente fase trata de validar esos candidatos mediante técnicas de proteómica dirigida en un tamaño muestral que permita establecer niveles de sensibilidad y especificidad. Finalmente, la presencia de esos biomarcadores puede examinarse en fluidos tales como orina y sangre para establecer métodos de diagnóstico y seguimiento de tratamientos con técnicas poco invasivas.

Por este motivo, la segunda fase en la búsqueda de biomarcadores trata de validar una serie de candidatos (derivados de los resultados discovery) en un número significativamente mayor de muestras mediante un análisis de proteómica dirigido. Es lo que se conoce como fase de validation. Para ello, el espectrómetro de masas es programado para detectar únicamente péptidos específicos de las proteínas de interés, permitiendo al investigador monitorizar de forma cuantitativa, selectiva y con elevada sensibilidad varias proteínas en un solo análisis. Este tipo de ensayo, conocido como proteómica dirigida o más específicamente selected reaction monitoring (SRM), posee numerosas ventajas respecto al uso de anticuerpos, ya que el desarrollo de un método SRM es mucho más rápido que generar un nuevo anticuerpo (minimizando los problemas de especificidad y reactividad cruzada típicos de inmuno-ensayos). El mismo tipo de ensayos puede utilizarse para la detección de biomarcadores en fluidos corporales. Esto se debe a que numerosas evidencias apuntan a que una condición patológica determinada podría verse reflejada de forma específica en la sangre o la orina de un paciente mediante la presencia o ausencia de determinadas proteínas (por ejemplo, secretadas al torrente sanguíneo por un tumor). La identificación de tales biomarcadores posee un valor enorme no solo como herramienta diagnóstica, sino que además podría ser usada en el pronóstico y monitorización de un tratamiento en procedimientos poco invasivos.

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4. Bibliografía

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Módulo 2. Biología molecular de los tumores neuroendocrinos e investigación traslacional aplicadaTema 3. Investigación traslacional aplicadaTema 3.4. Modelos animales

Laura Martín Mitjana / Dr. Oriol Casanovas CasanovasInstitut Català d’Oncologia (ICO) – Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL)

El conocimiento de los mecanismos del cáncer y del descubrimiento y desarrollo de fármacos requiere sistemas de modelos animales apropiados. La investigación básica en biología del cáncer con modelos animales ha proporcionado nuevos mecanismos y nuevas dianas para el desarrollo de fármacos contra el cáncer y ha permitido ampliar los objetivos, lo que ha dado lugar a enfoques nuevos y originales para la prevención y el tratamiento del cáncer1. Actualmente, las dianas terapéuticas contra el cáncer se basan en las propiedades (hallmarks) que hacen a una célula maligna2: el crecimiento incontrolado, la metástasis, la desdiferenciación, la plasticidad genética y la resistencia a los medicamentos. Así, agentes que tienen el potencial de interferir con el crecimiento tumoral primario o la cascada metastásica, que interrumpen bucles de crecimiento autocrinos y paracrinos, diferenciación de tumores, o revierten la resistencia a los medicamentos están ahora en desarrollo preclínico y ensayo clínico temprano.

El uso y desarrollo de modelos animales apropiados será necesario para descubrir la nueva generación de medicamentos contra el cáncer y llevarlos al estudio clínico y, por tanto, la selección del modelo experimental apropiado es crítico para obtener unos resultados reales y útiles. El valor del modelo depende de su validez, la selectividad, la previsibilidad y la reproducibilidad3. No existe un modelo tumoral perfecto para cualquier tipo de cáncer humano. Sin embargo, en la selección del mejor modelo se debe considerar la estabilidad genética y la heterogeneidad de la línea celular trasplantada, su inmunogenicidad en el animal huésped y el punto final biológico adecuado (el crecimiento local, la metástasis, la supervivencia), etc.

En general, los modelos animales de tumores se pueden dividir según sean: 1) artificialmente trasplantado, 2) de desarrollo espontáneo. Ambos tipos de modelos animales serán discutidos a continuación.

1. Modelos animales de xenotrasplante

Antes de la disponibilidad de los ratones atímicos o desnudos, los tumores humanos eran trasplantados en ratones inmunodeprimidos por irradiación, timectomía o tratamiento con esteroides4. Los primeros ratones desnudos surgieron espontáneamente en una colonia cerrada (pero no consanguínea) de ratones albinos en un laboratorio de virus en el Hospital Ruchill (Glasgow)5, y el primer xenoinjerto en ratones desnudos fue realizado por Rygaard y Povlsen en 1969 utilizando una línea celular de adenocarcinoma humano del colon6.

Flanagan describió inicialmente el componente genético de la inmunodeficiencia en este importante modelo describiendo el gen mutante (nu, para desnudo) responsable de la ausencia de pelo, además de otras anomalías, incluidos el retraso en el crecimiento, la baja fertilidad y la corta esperanza de vida5. No fue hasta 1968 que Pantelouris señaló que algunos de los ratones desnudos carecían de timocitos, aunque conservan células B funcionales7 y exhiben una mayor actividad de células T-natural killers8,9. Estas características permitieron el uso extendido de los ratones desnudos en el trasplante de tejidos y muy especialmente su uso en el trasplante de tumores humanos para desarrollar modelos de cáncer10.

El éxito de los xenoinjertos de tumor humano en los ratones desnudos y la capacidad de mantener las características histológicas y la identidad biológica de los tumores a través de los sucesivos «pases» in vivo revolucionó muchos aspectos de la investigación del cáncer, incluido el desarrollo de fármacos11. El trasplante de líneas celulares tumorales en ratones desnudos se puede hacer a través de múltiples rutas: subcutánea, intraperitoneal, subcapsular, intravenosa, intracraneal, en el bazo, etc. Cada sitio tiene sus ventajas y limitaciones específicas, pero la implantación subcutánea es el sitio predominante para el trasplante de tumor humano en el ratón desnudo debido a su simplicidad y el fácil acceso al tumor.

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Una suspensión de células tumorales se inyecta generalmente en el flanco del animal. Dependiendo del potencial clonogénico del tumor, se requieren entre 106 y 107 células para el éxito del injerto, que generalmente requiere unos pocos meses para crecer, en función de la tasa de crecimiento de la línea celular utilizada. Hasta la fecha se han establecido muchos xenoinjertos tumorales humanos, incluidos la mayoría de los tumores sólidos que afectan a los adultos. Por ejemplo, los más antiguos y con más estudios publicados son los de cáncer de colon y melanoma. En cambio, los tumores cerebrales han demostrado ser los más difíciles de mantener en ratones desnudos12,13. Sin embargo, en general, los primeros «pases» de los tumores trasplantados se parecen más estrechamente a cánceres espontáneos, pero estos «pases» iniciales muestran heterogeneidad significativa en la cinética de células y en la histología14,15.

A pesar de estas limitaciones, este tipo de modelos se ha utilizado en el descubrimiento y en el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales, porque están muy bien caracterizados y son reproducibles. De hecho, este tipo de modelos son los de mayor uso en terapéutica experimental y constituyen la base para un ensayo in vivo de descubrimiento de fármacos y en el programa de cribado del National Cancer Institute (NCI, Estados Unidos)16. Se pueden utilizar distintos métodos para evaluar el efecto de un fármaco sobre los tumores en modelos animales; el cambio de peso o volumen del tumor son los parámetros más simples y fácilmente reproducibles. Sin embargo, otros cambios morfológicos o alteraciones en las características histológicas o moleculares del tumor (necrosis, invasión, metástasis, etc.) son otros marcadores de respuesta que se pueden valorar en los modelos de trasplante17.

Es importante recalcar que los xenoinjertos subcutáneos a menudo invaden los tejidos adyacentes, pero rara vez metastatizan, quizás por el mantenimiento de algunas defensas del huésped, por ejemplo, las células T-natural killer8,9. Por lo tanto, la supervivencia del animal no es un punto final viable para la evaluación de la eficacia de los fármacos en ratones desnudos; en cambio, el retraso del crecimiento tumoral es más apropiado en este tipo de modelos. Sin embargo, es posible seleccionar los tumores primarios más agresivos o perturbar los mecanismos de defensa del huésped para desarrollar modelos que son localmente invasivos y muy metastásicos18.

Las células tumorales humanas se someten a cambios cinéticos después del trasplante y el «pase» en varios ratones desnudos. Con mayor frecuencia, el tumor trasplantado se adapta al crecimiento en los animales y tiene un tiempo de duplicación más corto que el tumor original aislado de un paciente. Las tasas de crecimiento aumentan aún más durante los «pases» posteriores19. La vascularización del tumor primario en pacientes y del trasplantado también difiere, con tumores trasplantados que muestran un peor suministro de sangre y más necrosis. A pesar de estos cambios en la cinética de crecimiento, la mayoría de los xenotransplantes de tumores humanos mantienen las características morfológicas y bioquímicas de sus tumores originales. Por lo tanto, se espera que la quimiosensibilidad sea similar tanto en el tumor humano original como en el xenoinjertado, y que esta correlación pueda predecir para ambos agentes activos individuales y combinaciones de fármacos activos.

Pero hay que preguntarse: ¿cuán predictivos de la actividad clínica son estos modelos? Se han realizado múltiples estudios para evaluar su capacidad de predicción de la respuesta antitumoral en pacientes. De hecho, se han demostrado excelentes correlaciones entre el retraso de crecimiento medio en modelos de xenotrasplante tratados con las mejores combinaciones de fármacos disponibles y las tasas de respuesta clínica completa20, y se han obtenido mejores correlaciones para xenoinjertos humanos de cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer de mama y melanoma maligno. Sin embargo, un estudio más exhaustivo ha demostrado que de los 75 quimioterápicos introducidos en ensayo clínico en el NCI entre 1970 y 1985, 24 mostraron algunas pruebas firmes de actividad en modelos animales basados en el panel de líneas celulares del NCI21. Una interpretación de estos datos es que el panel es altamente predictivo para la actividad clínica, ya que aproximadamente el 30"% de los medicamentos aceptados para ensayo clínico mostró alguna evidencia de actividad en los modelos. Pero los resultados no son homogéneos en todos los tipos de tumores: aunque los modelos son muy predictivos en linfomas (74"%) y en leucemias (35"%), se observa solo una mínima actividad frente a tumores sólidos. En efecto, el análisis mostró una pobre correlación entre el resultado preclínico in vivo y la actividad clínica en los mismos tumores21.

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El desarrollo de modelos de xenotrasplante de tumores neuroendocrinos se ha visto obstaculizado por la escasez de líneas de células humanas cultivadas de tumores neuroendocrinos. Las dos líneas que se han utilizado con más frecuencia son la línea BON1 derivada de un carcinoide pancreático humano22,23 y la línea GOT-1 derivada de una metástasis hepática de un carcinoide del intestino medio humano24,25. Más recientemente, se ha descrito la línea KRJ1 derivada de un carcinoide humano26. El desarrollo de líneas celulares derivadas de tumores neuroendocrinos ha sido un reto debido a las dificultades intrínsecas en las propiedades de crecimiento de este tipo de células.

Por otro lado, se han desarrollado varias líneas celulares neuroendocrinas de roedores, incluidas las líneas MIN-6, TC-6, TC-3, NIT-1 y HIT-T15 derivadas de ratones y las líneas RIN-B2, RIN-B6, y las líneas de RIN-38A derivadas de rata. Todas estas líneas, aunque útiles en algunos estudios, tienen limitaciones en la comprensión de la enfermedad humana al tratarse de células de origen animal.

Así, la escasez de cultivos de líneas celulares derivadas de tumores neuroendocrinos gastroenteropancreáticos humanos es una de las principales deficiencias en el estudio y desarrollo de terapias en este tipo de tumores. Por lo tanto, una necesidad crítica es el desarrollo de nuevas líneas celulares derivadas de tumores neuroendocrinos y carcinoides pancreáticos humanos con el fin de facilitar información más rigurosa en los estudios in vitro de la biología, células tumorales neuroendocrinas, bioquímica y genética de este tipo de tumores. Para llevar a cabo esta tarea, se tiene que establecer una unidad de cultivo celular ligada a un centro médico con alto volumen quirúrgico y las líneas celulares se deben desarrollar de manera no-propietaria para permitir la amplia difusión pública para su uso por parte de los investigadores de todo el mundo.

2. Modelos ortotópicos de xenotrasplante

En 1889, después de analizar las autopsias de pacientes con cáncer de mama metastásico, Paget concluyó que la metástasis no es un fenómeno aleatorio, sino que las células malignas tienen una afinidad especial para el crecimiento en el medio ambiente de determinados órganos, la famosa hipótesis de la semilla y el suelo27. Ciertamente, existen interacciones órgano-específicas que son esenciales para el crecimiento óptimo y la progresión del cáncer in vivo. El modelo de xenoinjerto ortotópico es un sistema en el que las células tumorales se implantan en el sitio del órgano de origen para proporcionar a las células tumorales un ambiente óptimo para el crecimiento y la progresión. Debido a su coste, este modelo aún no se ha utilizado ampliamente por el programa de detección de fármacos del NCI, pero sí se está empleando ampliamente para explorar su papel como un modelo de evaluación in vivo para los agentes citotóxicos específicos para sitios de órganos tales como los pulmones en el cáncer de pulmón28.

Múltiples xenoinjertos de tumores, incluidos el carcinoma de células renales, el carcinoma de páncreas, ciertos tumores cerebrales, el cáncer de próstata, de colon y de pulmón, ya se han desarrollado utilizando la implantación ortotópica en ratones desnudos29. En el caso del cáncer de pulmón, células tumorales en suspensión se inoculan a través del bronquio principal derecho del pulmón derecho en un animal ligeramente anestesiado. La respuesta tumoral se evalúa mediante el sacrificio de los animales y el crecimiento del tumor se cuantifica histológicamente o con una radiografía de tórax no invasiva. Este modelo ortotópico de pulmón está siendo explorado por el NCI para el desarrollo de fármacos28. De cualquier modo, este modelo animal demuestra que, partiendo de inóculos idénticos de cáncer de pulmón, se obtiene un tumor más agresivo si se inyecta en el bronquio (ortotópico) en comparación con la inyección subcutánea30, lo que confirma la observación de Paget y sugiere que los modelos ortotópicos siempre son más cercanos y más representativos de la situación clínica.

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3. Modelos animales espontáneos inducidos

Los modelos de tumores espontáneos inducidos intentan imitar la situación clínica más cerca. Normalmente se trata de modelos donde los tumores surgen después de un tratamiento con carcinógenos o exposición viral31. En general, los modelos tumorales espontáneos tienen su papel más importante en el estudio de la biología de la carcinogénesis, ya que normalmente carecen de la posibilidad de hacer un seguimiento de volumen tumoral en el tiempo y, por el contrario, suelen medirse solamente al final de su curso. Aunque estos modelos se parecen a los cánceres humanos en la cinética y la antigenicidad (ratones immunocompetentes), existen obstáculos significativos para el uso de estos modelos en biología y en desarrollo de fármacos. Primeramente, un porcentaje relativamente pequeño de los animales puede desarrollar la enfermedad tras la exposición al carcinógeno o virus, y los tumores pueden tener un curso natural bastante variable. Esto conlleva la dificultad para establecer una clasificación correcta, que hace que estos modelos sean cuantitativamente inadecuados para la evaluación de la respuesta a terapias de una manera uniforme. Además, su patrón metastásico no es uniforme y su respuesta a la terapia es generalmente pobre. Sin embargo, este tipo de modelos tumorales podrían ser importantes en el estudio de la prevención del cáncer y quizás ayudarán en el desarrollo de fármacos quimiopreventivos.

Se ha descrito un modelo espontáneo de tumores neuroendocrinos, aunque su uso es muy poco frecuente. Los roedores del género Mastomys, y más concretamente los de la especie Mastomys natalensis (llamado ratón de Benin), desarrollan espontáneamente carcinoides gástricos en su desarrollo. Aunque la causa originaria de esta patología en este ratón no se conoce, se ha descrito que el fenotipo se ve reforzado por el tratamiento con inhibidores del ácido gástrico32. De todos modos, aunque interesante, la utilización de este modelo ha sido muy limitada por la escasa comprensión del genoma de los Mastomys.

4. Modelos animales por modificación genética

Los modelos animales transgénicos y knock-out son ratones genéticamente modificados para desarrollar cáncer y representan un mejor paradigma para el estudio del cáncer que los modelos de xenoinjerto que se utilizan ampliamente en el desarrollo de fármacos. El cáncer en los animales modificados genéticamente se asemeja más al cáncer humano que los otros modelos descritos en varias características: 1) el tumor se desarrolla de forma espontánea en su órgano natural, a diferencia de los xenoinjertos de tumores, que por lo general se implantan subcutáneos; 2) los tumores tienen una tasa de crecimiento natural y características de formación de metástasis que se asemejan a la historia natural en los seres humanos, y 3) estos tumores son no inmunogénicos para el huésped, por lo que superan el requisito de tener que estudiar animales inmunodeprimidos33,34.

Así, los animales transgénicos que sobreexpresan un oncogén son excelentes modelos para estudiar el fenotipo oncogénico resultante de la desregulación de ese gen conocido y para probar los fármacos dirigidos a una vía molecular específica. Además, la disponibilidad de promotores específicos de órganos también hace que el desarrollo de modelos de cáncer dirigidos a órganos específicos sea más factible. Por ejemplo, un promotor del virus del tumor mamario de ratón tiene la capacidad específica para conducir al gen oncogénico a ser expresado en células mamarias, mientras que un promotor de inmunoglobulina hace lo mismo en los tejidos linfáticos. Por lo tanto, la transfección del gen myc podría conducir al desarrollo de adenocarcinoma de mama o linfoma, dependiendo del promotor por el cual sea regulado35,36. Un ejemplo práctico son los ratones transgénicos que llevan mutaciones en Ras que desarrollan tumores mamarios, que se han utilizado para la detección de la eficacia de los nuevos agentes quimioterapéuticos específicamente activos en cáncer de mama34,37, y también para probar nuevos fármacos dirigidos a la vía de Ras, tales como los inhibidores de la farnesil transferasa38.

El primer modelo animal para tumores neuroendocrinos pancreáticos fue desarrollado en 1985 por el famoso investigador Douglas Hanahan en el Cold Spring Harbor Laboratory (Estados Unidos)39. La expresión del antígeno T de SV40 bajo el control del promotor del gen de la insulina dio como resultado la tumorigénesis de células de los islotes pancreáticos en ratones. Con los años, este modelo ha proporcionado información muy valiosa sobre algunos de los eventos celulares y genéticos importantes en la progresión de los tumores neuroendocrinos40-47. Sin embargo, su carencia principal es que el antígeno T no es una fuerza impulsora en los tumores neuroendocrinos humanos, lo que impide algunos estudios genéticos de iniciación tumoral en este modelo. Más

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recientemente, la deleción dirigida del gen de la menina en ratones ha recapitulado muchas de las características claves del síndrome de neoplasia endocrina múltiple tipo 1 humano48-52. Este ratón knock-out tiene la misma mutación genética que algunos de los pacientes de tumores neuroendocrinos, y por lo tanto sí representa un modelo fisiológico importante de los tumores neuroendocrinos pancreáticos.

Por otro lado, otros ratones genéticamente modificados han mostrado inesperadamente fenotipos neuroendocrinos. Por ejemplo, los animales knock-in del gen CDK4 constitutivamente activo desarrollaron reproduciblemente tumores neuroendocrinos pancreáticos53,54. Aunque no se han identificado mutaciones en CDK4 en los tumores neuroendocrinos humanos, esta observación implica una función importante de la vía p16/ciclina D1/CDK4/pRb y la regulación del ciclo celular en este tipo de tumores. Del mismo modo, el ratón knock-out doble para p18 y p27, proteínas inhibidoras del ciclo celular, desarrolló adenomas hipofisarios y, menos frecuentemente, adenomas de paratiroides e hiperplasia de los islotes pancreáticos55.

5. Conclusiones

El uso de animales en el conocimiento de los mecanismos del cáncer y en el descubrimiento y desarrollo de fármacos contra el cáncer se ha vuelto más sofisticado y eficiente durante las últimas cuatro décadas. A pesar de los intereses y la presión para reducir el uso de animales en la investigación actual, los modelos animales jugarán un papel cada vez más importante en la investigación contra el cáncer, ya que el uso apropiado de estos modelos animales es esencial para desarrollar nuevas terapias, diseñar tratamientos eficientes y ahorrar tratamiento a ciertos pacientes que no lo necesitan.

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6. Bibliografía

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