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Controle de Qualidade Físico-Químico

Continuação : Métodos Instrumentais de Identificação

- Espectrometria de Massa

- Métodos Cromatográficos

A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química.

ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio

1) Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons

ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-

2) O íon formado se fragmenta:

ABCDE.+ AB. + CDE+

ABCDE.+ AB+ + CDE.

ABCDE.+ A+ + BCDE.

3) Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:

Massa molecular de cada fragmento = formação dos picos = descoberta / identificação da amostra

A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no espectro.

AB

UN

DÂ

NC

IA

MASSA / CARGA

O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito

ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio

Ilustração das quatro etapas básicas na análise por Espectrometria de Massas.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

No espectrômetro de massas as moléculas são bombardeadas com um feixe de elétrons de alta energia. As moléculas ionizam-se e dissociam em muitos fragmentos. Cada espécie de íons possui determinado valor da razão da massa pelo número de carga, ou o valor m/z.

http://em.iqm.unicamp.br/

Finalidade: Os espectros de massas são utilizados em geral para identificar um composto.

- Método bastante caro: aquisição e manutenção do equipamento.

- Extremamente útil na caracterização de uma molécula. - Devido ao seu alto custo, a espectrometria de massa não é utilizada rotineiramente no Controle de Qualidade.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

CROMATOGRAFIA

Método físico-químico de separação de componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases (sistema heterogêneo bifásico) estão em contato íntimo:

1) Fase Estacionária (FE)

2) Fase Móvel (FM)

APLICAÇÃO:

- Identificação de compostos (análise qualitativa)- Quantificação de compostos

- Separação (isolamento/purificação)

Cromatografia analítica

Cromatografia de purificação

Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida) e uma FASE MÓVEL.

- As fases móvel e estacionária são IMISCÍVEIS.

CROMATOGRAFIA: Principio Básico

CROMATOGRAFIA: Principio Básico

FE : Líquida ou sólida

FM: Líquida ou gasosa

Separação dos componentes da

amostra

Componentes da amostra separados

Princípios do Mecanismo de separação em Cromatografia

Para desenvolvimento de uma análise cromatográfica:

1) A amostra é introduzida como uma única alíquota numa das extremidades do sistema cromatográfico.

2) Um solvente (eluente – Fase Móvel) é adicionado para fluir através do sistema. As moléculas se alternam entre FM e FE. 3) Os componentes da amostra são distribuídos entre as duas fases, onde uma fase permanece estacionária (FE) enquanto a outra elui / caminha (FM) entre os interstícios ou superfície da Fase estacionária (FE). O movimento da Fase Móvel resulta numa migração diferenciada dos componentes da amostra.

4) Os componentes da mistura são “arrastados” em velocidades diferentes, dependendo da afinidade relativa pelas duas fases. Substâncias que se movimentam vagarosamente são aquelas que ficam mais fortemente presas a FE, enquanto que as que se movem rapidamente gastam uma menor fração de tempo na FE, devido a uma menor solubilidade ou afinidade por esta fase.

5) Componentes são totalmente ou parcialmente separados, de acordo com a eficiência do sistema cromatográfico.

A separação ocorre em função das diferenças de afinidade que as diferentes substâncias tem por uma fase móvel ou pela fase estacionária. Essas afinidades diferenciadas podem ser

exploradas para fins analíticos e de identificação

CROMATOGRAFIA: Classificação

FM = Líquido

FM = Gás

CromatografiaLíquida

CromatografiaGasosa

Em CG a FEpode ser:

Sólida

Líquida

CromatografiaGás-Sólido (CGS)

CromatografiaGás-Líquido (CGL)

Fase Móvel

Considera-se em geral, pela forma física:

- Forma física do sistema: a) FE em coluna: Cromatografia líquida de Clássica (CLC)*

Cromatografia Líquida de alta eficiência (HPLC)*, Cromatografia gasosa (CG).

b) FE sobre superfície planar: Cromatografia em papel (CP) e Cromatografia em camada delgada (CCD)*

- Estado Físico da Fase Móvel empregada:a) Gás: Cromatografia gasosa (CG ou GC), CSCb) Líquido : HPLC e CLC

- Estado Físico da Fase Estacionária:Sólido, Líquido ou quimicamente ligada.


a) FE Líquida: simplesmente espalhado sobre suporte sólido ou imobilizado por meio de ligações.

b) FE quimicamente ligada: suportes modificados são considerados separadamente,, por diferirem dos demais por outros mecanismos de separação.


- Classificação pelo modo de separaçãoa) Separação por adsorçãob) Separação por partiçãoc) Troca iônicad) Mistura desses mecanismos

Os dois sistemas mais simples e utilizados de cromatografia são a Cromatografia Planar (CP ou CCD) e a Cromatografia Líquida Clássica. Estas duas técnicas são normalmente empregadas de forma manual e ou semi automatizadas (não constituem verdadeiramente técnicas instrumentais)

- CP e CLC são as versões mais simples e baratas de cromatografia.

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

1) Aplicação da amostra (aprox 1,0 cm da base inferior da placa)2) Ds1: Distância percorrida pela subst.13) Ds2: Distância percorrida pela subst. 24) Dm: Distância percorrida pela FM Rf: Fator de retenção. Seus valores ideais são 0,4 – 0,6

Placa Cuba

- Geralmente são placas de vidro (Existem placas / lâminas prontas de alumínio ou plástico) - FE: Sólida (Sílica gel - mais utilizada, alumina, terra diatomácea ou celulose). - FM: Líquida (dentro da cuba)

Rf : Ds Dm

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/47/Tlc_sequence.png


Rf : É constante para uma dada substância, e corresponde a uma propriedade física daquele composto. O valor de Rf pode, então, ser usado para identificar um composto desconhecido, mas como muitas substâncias podem ter o mesmo valor de Rf, assim com podem ter o mesmo ponto de fusão, métodos adicionais devem ser utilizados para identificação inequívoca do composto.

-Utiliza-se, ao mesmo tempo, padrão da substância para comparação de resultado

- Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, após a separação das substâncias, é necessário um processo de revelação para analisar o resultado.

- As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, etc.

- É um método simples, rápido, visual e econômico.


Cromatografia Líquida Clássica (CLC)

- O CLC foi o primeiro modo de cromatografia que surgiu.

- Colunas de vidro, sob pressão atmosférica, com fluxo de fase móvel devido à força da gravidade.

- FE: Sílica ou alumina são as mais utilizadas.

- A FM que passa pela coluna pode ser captada na saída por um becker ou erlenmeyer.

- Já as frações de interesse são coletadas em frascos ou tubos de ensaio

Introdução da amostra

Cromatografia Líquida Clássica (CLC)

- Para análise das amostras obtidas, pode-se utilizar análises químicas auxiliares, CCD ou análise espectrofotométrica.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)

- Técnica analítica mais utilizada no Controle de Qualidade pelas Indústrias Farmacêuticas

- É utilizado como ensaios de doseamento, identificação de compostos e ensaios de impurezas orgânicas

- Otimização da coluna clássica: emprego da pressão torna a separação mais eficiente.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) Modelo Esquemático

Reservatório de FM

Sistema de Bombeamento

Cromatogramas

Válvula p/ amostra


a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector , f) registrador.

Fase Móvel: - Alto grau de pureza – livre de gases dissolvidos e O2.- O solvente (FM) que se encontra no reservatório é bombeado com auxilio da bomba até a coluna cromatográfica.

Bomba: - Vazão contínua, sem pulsos, não interferindo na eluição da FM.-Método mais eficiente que o a cromatografia líquida clássica (CLC), pois o emprego da pressão torna a separação mais eficiente.

Colunas: - Geralmente de aço inoxidável, diâmetro interno de 0,45 cm para separações analíticas e 2,2 para preparativas.- Comprimento da coluna é variável (10 - 25 cm para colunas analíticas e de 25 - 30 cm para colunas preparativas)


- O “recheio” da coluna cromatográfica é a FE, a qual pode ser sólida ou líquida. A FE sólida é a mais utilizada.

Detectores:- O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta (Absorção da luz na faixa UV – visível), sendo também empregados detectores de fluorescência, eletroquímico e de massa.

Registro de dados: - Pode ser feito através de um integrador, registrador ou computador

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)


Bombeamento ISOCRÁTICO ou por GRADIENTE

- Composição da Fase Móvel Constante: HPLC ISOCRÁTICA

-Alteração da Fase Móvel durante a Análise: HPLC com programação de Gradiente.

- A eluição com gradiente é muitas vezes usada quando os componentes da amostra possuem polaridade muito diferentes.

Mecanismos das separações em CLAE

As separações em CLAE podem ser: - Adsorção, - Partição - Ambos

- O suporte mais comumente utilizado é a sílica.

O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária. O uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.

Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa.

As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos.

Cromatografia na fase normal: a fase estacionária é mais polar que a fase móvel.

Cromatografia em fase reversa: a fase móvel é mais polar.

HPLC Equipamentos empregados para efetuar a cromatografia a líquido (HPLC) são chamados de cromatógrafos a líquido.

Colunas cromatográficas

A resposta do detector é traduzida em um gráfico, denominado CROMATOGRAMA.

CROMATOGRAMA

Cromatograma: demonstração gráfica da separação obtida por alguma técnica cromatográfica, que permite utilizar os dados para análise quantitativa e/ou qualitativa.

Cromatograma CLAE - UV

Cromatograma

Cromatogramas

Cromatogramas

Tempo de retenção: Tempo necessário para eluir as substâncias, desde o instante da injeção até o máximo do pico.

Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC

Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida

Clássica

Cromatografia Líquida Alta Eficiência

Cromatografia Líquida Clássica


A FM é arrastada pela coluna por ação da gravidade

A FM é submetida a uma bomba de alta pressão para a sua eluição pela coluna, devido a baixa permeabilidade pela coluna cromatográfica


Cromatografia Líquida Clássica


O recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível

Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável.


Coluna Clássica CLAE

Barata Alto custo de operação e manutenção

Recheio descartado Coluna cara, mas realiza muitas análises

Precisa-se coletar frações Rapidez e automação (detecção contínua)

Detecção mais demorada (cada fração)

Maior resolução, sensibilidade e repetibilidade

Depende da experiência do analista para ter repetibilidade (técnica manual)

Necessita de experiência do analista

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