prof. valmir f. juliano qui624 introduÇÃo aos mÉtodos cromatogrÁficos

Prof. Valmir F. Juliano

QUI624INTRODUÇÃO AOS MÉTODOSINTRODUÇÃO AOS MÉTODOS

CROMATOGRÁFICOSCROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos

CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS

Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos )

Chamados de métodos de via úmida

Gravimetria Volumetria Eletroanalítico

Propriedades Propriedades elétricaselétricas

Espectrométrico

Propriedades Propriedades ópticasópticas

Cromatográfico

Propriedades Propriedades mistas*mistas*

**SeparaçãoSeparação: interações físico-químicas.: interações físico-químicas. Identificação/quantificaçãIdentificação/quantificaçãoo: propriedades ópticas ou : propriedades ópticas ou elétricas.elétricas.

HistóricoHistórico

CromatografiaCromatografia

Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo

CaCO

3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Definição - Princípio BásicoDefinição - Princípio Básico

Cromatografia é um método físico-químico de Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. quantificação de seus componentes.

• A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.

• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.

• A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias.

• A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.


Classificação das técnicas cromatográficasClassificação das técnicas cromatográficas

• De acordo com o sistema cromatográficoDe acordo com o sistema cromatográfico

• Em ColunaEm Coluna• Cromatografia Líquida• Cromatografia Gasosa• Cromatografia Supercrítica

• PlanarPlanar• Centrífuga (Chromatotron®)• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)• Cromatografia em Papel (CP)



• De acordo com a fase móvelDe acordo com a fase móvel

• Utilização de GásUtilização de Gás• Cromatografia Gasosa (CG)• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

• Utilização de LíquidoUtilização de Líquido• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

• Utilização de Gás PressurizadoUtilização de Gás Pressurizado• Cromatografia Supercrítica (CSC)



• De acordo com a Fase EstacionáriaDe acordo com a Fase Estacionária

• Líquida• Sólida• Quimicamente Ligadas

• De acordo com o modo de separaçãoDe acordo com o modo de separação

• Por Adsorção• Por Partição• Por Troca Iônica• Por Afinidade




TécnicaTécnica PlanarPlanar ColunaColuna

FMFM

FEFE

LíquidoLíquido

LíqLíq SólSól

GásGás LíquidoLíquido

LíqLíq SólSól

CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CECP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE

ExclusãoExclusãoFaseFaseLigadaLigada

TrocaTrocaIônicaIônica

SólSólLíqLíq AfinidadeAfinidade

Tipo de Tipo de cromato-cromato-

grafiagrafia

AnalogiaAnalogiaO processo cromatográfico pode ser comparado a um O processo cromatográfico pode ser comparado a um

grupo de abelhas e moscas em sobrevoando uma certa grupo de abelhas e moscas em sobrevoando uma certa região.região.

Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.as moscas e abelhas.


Fase estacionária Analitos

AnalogiaAnalogia

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar estacionária pode ser suficiente para alterar

completamente a ordem de eluição de componentes da completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.mistura.


Fase estacionária Analitos

CromatografiaCromatografiaPrincípio BásicoPrincípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seuscomponentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Cromatografia em papel - CPCromatografia em papel - CP

A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!

Fase estacionária líquida suportada na celulose.

Fase móvelSeparação


A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de

cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.azul e amarela.

Cromatografia em papel - CPCromatografia em papel - CP

A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!


Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos

polares hidrossolúveis.

Cromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCDTeve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.iônica.


Cromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD

Termos e parâmetros técnicosTermos e parâmetros técnicos


solvente

manchaf ΔS

ΔSR

sa

Raf

sb

Rbf

sc

Rcf

c

b

a

s

CromatografiaCromatografiaCromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONÁRIASFASES ESTACIONÁRIAS

Sílica (SiOSílica (SiO22))

Alumina (AlAlumina (Al22OO33))

CeluloseCelulose

PoliamidaPoliamida

Ativação de 30 a 60 minAtivação de 30 a 60 minde 105 a 110 de 105 a 110 ooCC

Ativação de 10 minAtivação de 10 mina 105 a 105 ooCC


ANÁLISE QUALITATIVAANÁLISE QUALITATIVA

- Comparação com valores de RComparação com valores de Rff tabelados tabelados

- Comparação com padrão eluído em conjuntoComparação com padrão eluído em conjunto

- Extração e aplicação de métodos instrumentaisExtração e aplicação de métodos instrumentais


AA BB Após Eluição

Amostra não contém a espécie BAmostra não contém a espécie B

Amostra pode conter a espécie AAmostra pode conter a espécie A

Para se certificar da presença, Para se certificar da presença, eluir em outros solventeseluir em outros solventes

Conclusões:Conclusões:

Amostra


Solvente 1 Solvente 2

CromatografiCromatografia Bi-a Bi-

dimensionaldimensional

Cromatografia planarCromatografia planar


Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada

centrifugamente. Pode substituir pequenas

colunas e HPLC.

CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna


PROCESSOS DE SEPARAÇÃOPROCESSOS DE SEPARAÇÃO

ExclusãoExclusão

AdsorçãoAdsorção

PartiçãoPartição

Troca IônicaTroca Iônica

AfinidadeAfinidade


ADSORÇÃOADSORÇÃO

- Fase Móvel Líq. ou Gás- Fase Móvel Líq. ou Gás

- Fase Estacionária Sólida- Fase Estacionária Sólida

Processos de Processos de Adsorção/DessorçãoAdsorção/Dessorção

Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals


Diferença entre AbAbsorçãosorção e AdAdsorçãosorção



Fase Estacionária PolarFase Estacionária Polar

Aumento da Atividade

-CO-CO22H > -OH > -NHH > -OH > -NH22 > >

-SH > -CHO > -C=O >-SH > -CHO > -C=O >

-CO-CO22R > -OCHR > -OCH33 > -CH=CH- > -CH=CH-


63 a 200II e IIISílica Gel (Ácido Silícico)

75 a 150Silicato de Magnésio

63 a 200Celulose

Microcristalina

63 a 200

63 a 200

63 a 200

Tamanho de Tamanho de Partícula (mm)Partícula (mm)

IAlumina Ácida

I, II e IIIAlumina Neutra

Atividade*Atividade*AdsorventeAdsorvente

IAlumina Básica

*Atividade na escala BrockmannAtividade na escala Brockmann: A atividade está relacionada à quantidade de água adsorvida e é determinada em função de sua capacidade de adsorver uma série de corantes.


Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <

Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <

Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <

Acetato de Etila < Acetona < Etanol <

Metanol < Ácido Acético

SOLVENTES: Polaridade em Ordem CrescenteSOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

A função das fases móveis na cromatografia por A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo:adsorção tem sentido amplo:a) Função solvente

• Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição

b) Função eluente• Conduzir os componentes da mistura pela coluna• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)


Usos:Usos:a) Laboratórios de química orgânica separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese.b) Laboratórios de produtos naturais escala preparativa e analítica.c) Laboratórios de análises clínicas separação de esteróides de urina ou de sangue, etc.



PARTIÇÃOPARTIÇÃO

Fase Móvel GasosaFase Móvel Gasosa

Fase Estacionária LíquidaFase Estacionária Líquida

Processos de Processos de

SolubilidadeSolubilidadeO processo de partição é

intrafacial e a volta de cada

componente para a fase móvel

depende da sua volatilidadevolatilidade.


PARTIÇÃOPARTIÇÃO

Fase Móvel LíquidaFase Móvel Líquida

Fase Estacionária LíquidaFase Estacionária Líquida

Processos de Processos de

SolubilidadeSolubilidadeO processo de partição é

intrafacial e a volta de cada

componente para a fase móvel

depende da sua solubilidadesolubilidade.


TROCA IÔNICATROCA IÔNICA


Fase Estacionária SólidaFase Estacionária Sólida

Processos de Troca Processos de Troca IônicaIônica

Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo

trocador da matriz

Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio

químico de extraordinário valor em processos analíticos.


Maior InteraçãoMaior Interação

• Íons de alta carga

• Íons de menor

tamanho

TROCA IÔNICATROCA IÔNICA

Resinas Catiônicas Resinas Catiônicas e Aniônicase Aniônicas

FE altamente carregada

Flu

xo d

a F

M

A diferença de afinidade A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser entre os íons da FM pode ser

controlada por pH e força controlada por pH e força iônicaiônica


polialquiamina

amônio quaternário

ácido carboxilíco

ácido sulfônico

TrocadorTrocador

-N+ HR2Cl-Base Fraca

Amberlite, Amberlite, Dowex, Dowex,

Lewatit, Lewatit, Zeocarb, Zeocarb,

Zerolit, Zerolit,

DuoliteDuolite

-SO3- H+Ácido

Forte

Nome Nome ComercialComercial

-CH2N+ (CH3)3Cl-

-CHCOO- Na+

Fórmula do Fórmula do TrocadorTrocador

Base Forte

TipoTipo

Ácido Fraco


O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas


EXCLUSÃOEXCLUSÃO

Fase Móvel LíquidaFase Móvel LíquidaFase Estacionária em GelFase Estacionária em Gel

Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo

eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.


EXCLUSÃOEXCLUSÃO

A propriedade que distingue a cromatografia de A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.que neles são insolúveis.

- Separação de tamanhos específicos

- Separação de polímeros e proteínas

- Determinação de Massa Molar


EXCLUSÃOEXCLUSÃO

Características desejáveis para os

Géis-Inércia Química:Inércia Química:Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto.-Estabilidade:Estabilidade:O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.-Baixo teor de íons:Baixo teor de íons:Grupos carregados interferem no processo de separação.


EXCLUSÃOEXCLUSÃO

Tipos de Géis

Dextrano (Sephadex)

Poliacrilamida

Ágar e Agarose

Flu

xo d

a F

M



Fase Estacionária SólidaFase Estacionária Sólida

Propriedades

Biológicas e

Funcionais

AFINIDADEAFINIDADE


AFINIDADEAFINIDADE

Lectinas, proteínas específicas da superfície da

célulaCélulas

Antígenos, células

Proteínas trasnportadoras, receptores

Sequência de bases complementares, histonas,

enzimas específicas

Substratos, cofatores, inibidores competitivos

Possibilidade de LigaçãoPossibilidade de Ligação

Anticorpos

Enzima

Hormônios e Vitaminas

SubstânciaSubstância

Ácidos Nuclêicos

CromatografiaCromatografiaTeoria BásicaTeoria Básica

SOLUTOSOLUTO

FASE FASE ESTACIONÁRIAESTACIONÁRIA

FASE FASE MÓVELMÓVEL ⇌

⇌⇌

Sem Sem importância importância na CG, mas na CG, mas com grande com grande importância importância

na CLAEna CLAE

Teoria BásicaTeoria Básica


Coluna cromatográficaColuna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase

estacionária e na fase móvel:

FM

FEC A

AK

KC = Constante de Distribuição

[A]FE = concentração do analito na FE

[A]FM = concentração do analito na FM

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM.

MENOR MENOR RETENÇÃO !!!RETENÇÃO !!!

Volatilidade

[A]FM

Afinidade pela FE

[A]FE

Quantificação da eficiênciaQuantificação da eficiência


Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:

Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO

TEÓRICOO número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

Coluna mais eficiente

tR

wb

N

Quantificação da eficiênciaQuantificação da eficiência


ALTURA EQUIVALENTE A UM ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICOPRATO TEÓRICO (H) (H)

“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior

tipicamente elas são mais eficientes

(L = comprimento da coluna)

Valores típicos de H e N:dC df H N

0,10 0,25 0,081 370370

0,25 0,25 0,156 192308

0,32 0,32 0,200 150000

0,32 0,50 0,228 131579

0,32 1,00 0,294 102041

0,32 5,00 0,435 68966

0,53 1,00 0,426 70423

0,53 5,00 0,683 43924

2,16 10% 0,549 3643

2,16 5% 0,500 4000

Capilares, L = 30 m

Empacotadas, L = 2 m

ddcc = diâmetro da coluna em mm = diâmetro da coluna em mmddff = espessura da fase estacionária em = espessura da fase estacionária em mm

Cromatografia em fase gasosaCromatografia em fase gasosa

Fase estacionária

Fase móvel Separação


Detecção

Cromatografia em fase gasosaCromatografia em fase gasosa


Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à

temperaturas controladas

Fase móvel: gás

inerte

Detector: submetido à temperatura controlada

Injetor: submetido à temperatura controlada

Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa

AplicabilidadeAplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEISVOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos

parcialmente, nesse gás.

DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas CG é aplicável para separação e análise de misturas

cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300300ooC e que sejam termicamente estáveis.C e que sejam termicamente estáveis.

EquipamentoEquipamento

1

2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Observação: em azul: temperatura controlada


Requisitos - Gás de arraste (FM)Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas

FE

incompatíveis com DCE

H2O, O2

hidrocarbonetos

ruído no sinal de DIC


Requisitos - Gás de arraste (FM)Requisitos - Gás de arraste (FM)

CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito

caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:

He , H2DCT

DIC N2 , H2

DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

CU

ST

O

PUREZA

AB

CA = 99,995 % (4.5)

B = 99,999 % (5.0)

C = 99,9999 % (6.0)


InjetorInjetor

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Injeção instantânea:

Injeção lenta:

t = 0

t = x

t = 0

t = x


Injetor “on column”Injetor “on column”

1

2

3

4

1 - Septo (silicone)

2 - Alimentação de gás de arraste)

3 - Bloco metálico aquecido

4 - Ponta da coluna cromatográfica


Injetor “on column”Injetor “on column”

1 2 31 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.


Parâmetros de injeçãoParâmetros de injeção


TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.

Regra GeralRegra Geral: Tinj = 50oC acimaacima da temperatura de ebulição do componente menos volátil.

VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.

COLUNAAmostrasGasosas

AmostrasLíquidas

empacotada = 3,2 mm

(1/4”)0,1 mL ... 50 mL0,2 L ... 20

L

capilar = 0,25 mm 1 L ... 100 L0,01 L ... 3

L

SólidosSólidos: convencionalmente se dissolve em

um solvente adequado e injeta-se a

solução


LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microsseringa de 10 L:

Microsseringa de 1 L (seção ampliada):

corpo

guia

êmbolo (fio de aço soldado ao

guia)

agulha

Microsseringas para injeçãoMicrosseringas para injeção


ColunasColunas

EMPACOTADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 mRecheada com sólido

pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as

partículas do recheio)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida


Temperatura da colunaTemperatura da coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = fEstrutura química do

analitoTemperatura da

coluna

Temperaturada

coluna

Pressãode

vapor

Velocidadede

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃOMENOR RETENÇÃO)


Temperatura da colunaTemperatura da coluna

AU

MEN

TO

DA

TEM

PER

ATU

RA

DA

C

OLU

NA

CONTROLE CONFIÁVEL CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL COLUNA É ESSENCIAL

PARA OBTER BOA PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CGSEPARAÇÃO EM CG


Programação linear de temperaturaProgramação linear de temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:

- Componentes mais voláteis são separados

- Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos

TCOL ALTA:

- Componentes mais voláteis não são separados

- Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente


Programação linear de temperaturaProgramação linear de temperaturaA temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a

separaçãoseparação::

Consegue-se boa Consegue-se boa separação dos separação dos

componentes da componentes da amostra em menor amostra em menor

tempotempo

TEMPO

TEM

PER

ATU

RA

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

TINI - Temperatura Inicial

TFIM - Temperatura Final

tINI - Tempo Isotérmico Inicial

tFIM - Tempo Final do Programa

R - Velocidade de Aquecimento


Programação linear de Programação linear de temperaturatemperatura

a) Isotérmico a 45 ºC;b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180

ºC


Programação linear de temperaturaProgramação linear de temperatura

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade

vazão

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

Possíveis problemas associados à Possíveis problemas associados à PLT:PLT:


Fase EstacionáriaFase EstacionáriaREGRA GERALREGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível : a FE deve ter características tanto quanto possível

próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)aromático ...)

FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

FE Seletiva:

separação adequada dos constituintes da amostra

FE pouco Seletiva:

má resolução mesmo com coluna de boa eficiência


Fase estacionária sólidaFase estacionária sólida• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃOADSORÇÃO

A adsorção ocorre na A adsorção ocorre na interface entre o gás de interface entre o gás de

arraste e a FE sólidaarraste e a FE sólida

• Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

• Solutos polares

• Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)

ADSORÇÃO


Fase estacionária líquidaFase estacionária líquida• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃOABSORÇÃO

A absorção ocorre no A absorção ocorre no interior do filme de FE interior do filme de FE

líquida (fenômeno líquida (fenômeno INTRAfacial)INTRAfacial)

• Filmes espessos de FE líquida

• Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste

• Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)

ABSORÇÃO


Fase estacionária quiraisFase estacionária quirais• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros não interagem diferencialmente com os isômeros óticosóticos.

FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).


DetectoresDetectoresDispositivos que examinam continuamente o material eluído, Dispositivos que examinam continuamente o material eluído,

gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.de arraste.

Características ideaisCaracterísticas ideais:1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.7.Similaridade de resposta para todos os solutos.8.Não destrutivo.


DetectoresDetectores

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece como um PICO no

cromatograma.

REGISTRODE

SINAL

ANALÓGICORegistradores

XY DIGITALIntegradore

sComputador

es



UNIVERSAIS:Geram sinal para

qualquersubstância eluída.

SELETIVOS:Detectam

apenas substâncias

com determinada propriedade

físico-química.

ESPECÍFICOS:Detectam

substâncias quepossuam

determinado elementoou grupo

funcional em suas

estruturas

DCT DCE

DNP



DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.

DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2

+ ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.



DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): SeletivoSeletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104)

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): UniversalUniversal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104).DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universalQuase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2,

N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2,

NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 –

108).

DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): EspecíficoEspecífico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)


DetectoresDetectoresCG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.

DetecçãoDetecção

TICUniversalUniversal

Similar a DCTSimilar a DCT

SIMSeletivoSeletivo

Maior Maior SensibilidadeSensibilidade


DetectoresDetectoresCG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico.

TEMPO

CO

NTA

GEN

S

MASSA / CARGA

CO

NTA

GEN

S

Cromatograma de íons totais: TIM ou TICTIM ou TIC

Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.


DetectoresDetectoresCG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico.

TEMPO

CO

NTA

GEN

S

Cromatograma de íons selecionados: SIMSIM

Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.

MASSA / CARGA

CO

NTA

GEN

S

Oferece a Oferece a vantagem de vantagem de

registrar somente registrar somente o sinal do o sinal do

constituinte de constituinte de interesse, sendo interesse, sendo “cego” para os “cego” para os

demaisdemais.


DetectoresDetectoresCG-EM (GC-MS): Interface CG-EMInterface CG-EM.

CG

EM

Vácuo

Separador MolecularO gás de arraste leve

(He) difunde mais rapidamente que o

analito e tende a ser drenado para o vácuo.

Câmarade

IonizaçãoColun

aCapila

r

Interface Capilar Direta

Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser

drenada pelo sistema de vácuo.


Análise qualitativaAnálise qualitativa

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o

TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico

cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do

Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE

atravesse a coluna)

tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que

as moléculas do analito passam sorvidas na FE)


Análise qualitativaAnálise qualitativaColuna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mDetector FID: 250 ºCInjetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 L Como se explica esta

ordem de eluição?Mistura de benzeno, n-Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-propanona, n-propanol, n-

butanol, isobutanol e n-butanol, isobutanol e n-pentanol.pentanol.

1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade.

2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor ).

3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.


Análise quantitativaAnálise quantitativa

TEMPO

SIN

AL

O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:

• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica.• Área da banda cromatográfica.

AlturaAlturaÁreaÁrea



tempotempo

ConcentraçãoConcentração

Áre

aÁ

rea

amostraamostra



MASSA

ÁR

EA

A partir de certo ponto o

sinal não aumenta mais linearmente

O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear:

MASSA

ÁR

EA

/ M

AS

SA

0,95 S

1,05 S

Cromatografia em fase líquidaCromatografia em fase líquida

Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida

Cromatografia em fase líquidaCromatografia em fase líquida


Complete e ganhe 5 pontos:

A. Solventes

B.

C.

D.

E.

F.

G.

H.

I.

J.

K. Computador

L. Impressora

Cromatografia Líquida - CLAECromatografia Líquida - CLAE

AplicabilidadeAplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por

CLAE ?

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.molar de 32 até 4000000.

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.

DE FORMA GERAL:CL é aplicável para separação e análise de misturas CL é aplicável para separação e análise de misturas

cujos constituintes sejam solúveis na FM. cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmicavolatilidade ou de estabilidade térmica..


Tipos e Tipos e

Aplicações da Aplicações da

Cromatografia Cromatografia

LíquidaLíquida

Insolúvel em água Solúvel em água

Aumento de polaridadeAumento de polaridade

Polar não iônicoApolar Iônico

Mass

a

mole

cula

r

102

103

104

105

106

Troca iônic

a

Partição

PartiçãPartição em o em fase fase

reversareversa

PartiçãPartição em o em fase fase

normalnormal

ExclusãoPermeaçPermeaç

ão em ão em gelgel

FiltraçãFiltração em o em gelgel

Adsorção

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaEsquema de um equipamento completo Esquema de um equipamento completo

para CLAEpara CLAE

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaRequisitos dos sistemas de Requisitos dos sistemas de

bombeamentobombeamento1 – Geração de pressões até 6.000 psi

2 – Saída com ausência de pulsos

3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min

4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor

5 – Componentes resistentes à corrosão

Bomba recíprocaBomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de

diafragma)


Suportam pressões de até 7.000 psi

Volumes típicos: 5 a 500 L

Microamostragem: 0,5 a 5 L

Sistemas de injeção de amostrasSistemas de injeção de amostras

• Eluição isocrática:Eluição isocrática:• Quando a separação é feita utilizando um único

solvente de composição constante.

• Eluição com gradienteEluição com gradiente:• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que

diferem bastante entre si em polaridade.• Depois que a eluição começa, a razão entre os

solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.


A eluição com gradiente produz efeitos similares A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura aos produzidos pela programação de temperatura

na CG.na CG.

Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.polaridade requerida na separação.

Fase móvel para Fase móvel para CLAECLAE

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaEluição com Eluição com gradientegradiente

Coluna C18, 5 m, fase reversaDetector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaColunas para CLAEColunas para CLAE

As colunas geralmente são construídas de aço inox,

embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam

encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são

restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na

fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaColunas para CLAEColunas para CLAE

Pré-coluna

•Remoção de material particulado

•Contaminantes do solvente

•Contaminantes da amostra

•Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida útil da colunaAumenta a vida útil da coluna

COLUNAS TÍPICASCOLUNAS TÍPICAS

•MaterialMaterial: aço inox

•ComprimentoComprimento: 10 a 30 cm

•DiâmetroDiâmetro: 4 a 10 mm

•FEFE: Partículas de 5 a 10 m

•EficiênciaEficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaSeparação isocrática de alta velocidadeSeparação isocrática de alta velocidade

1– p-xileno1– p-xileno

2- anisol2- anisol

3- acetato de 3- acetato de benzilabenzila

4- dioctil-ftalato4- dioctil-ftalato

5- dipentil-ftalato5- dipentil-ftalato

6- dibutil-ftalato6- dibutil-ftalato

7- dipropil-ftalato7- dipropil-ftalato

8- dietil-ftalato8- dietil-ftalato

- 4 cm de comprimento- 0,4 cm d.i.- FE: spherisorb 3 m

Coluna de alta

velocidade e alta

eficiênciaFM: 4,1% EtAc em n-Hexano

100.000 pratos/metro

• Pelicular:Pelicular:• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de:

• Sílica• Alumina• Resina de poliestireno-divinil-benzeno• Resina trocadora de íons

• Partícula porosaPartícula porosa:• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicularmesmos materiais do recobrimento pelicular.


Basicamente são dois tipos de FE:Basicamente são dois tipos de FE:

Fase estacionária para CLAEFase estacionária para CLAE

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores

As características desejáveis para os As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.daquelas para CG.

Existem dois tipos de detectores: Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideaisCaracterísticas ideais:1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.6.Similaridade de resposta para todos os solutos.7.Não destrutivo.8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.


• AbsorbânciaAbsorbância

• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105

• IV

• FluorescênciaFluorescência – – S: 10S: 10-9-9 a 10 a 10-12-12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1033

• Índice de refraçãoÍndice de refração (universal) (universal) ––

S: 10S: 10-7-7 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1044


• EletroquímicosEletroquímicos: : existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.

• Amperométricos

• Coulométricos

• Condutométricos – S: 10Condutométricos – S: 10-8-8 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1044

• Polarográficos – S: 10Polarográficos – S: 10-12-12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1066


• Espectrometria de massaEspectrometria de massa - universal - universal

• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação

• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.

Interface CL-EM


• Espectrometria de massaEspectrometria de massa

TEMPO

CO

NTA

GEN

S MASSA / CARGA

CO

NTA

GEN

S

TEMPO

CO

NTA

GEN

SMASSA / CARGA

CO

NTA

GEN

S

TICTICSIMSIM

Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE

Ao contrário da CG, onde a FM se comporta Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o como um gás ideal e não contribui para o

processo de separação, a FM líquida da CLAE processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os interage tanto quanto a FE com os

componentes da amostra.componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.em CLAE um tanto mais complexo que na CG.


• PARTIÇÃOPARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e Adsorção e ligação químicaligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversaFase normal e Fase reversa.Fase normalFase normal: : FE de natureza fortemente polar (ex. água)

FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)

O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel.

Fase reversaFase reversa: : FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)

FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)

O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.


• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia Crecobrimentos é uma cadeia C88 (n-octil) ou C (n-octil) ou C1818 (n- (n-octadecil)octadecil)


Campo Misturas típicasFarmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,

analgésicos

Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios

Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais

Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas)

Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos

Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos


• ADSORÇÃOADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou aluminaFE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC.

• TROCA IÔNICATROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com FE resina com capacidade de troca iônicacapacidade de troca iônica.

• EXCLUSÃOEXCLUSÃO: líquido-gel. FE gelFE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas EXCLUSÃO DE TAMANHOEXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONSEXCLUSÃO DE ÍONS.

Para refletir e responder:Para refletir e responder:A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito?

A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?


F I MF I M

prof. valmir f. juliano qui624 introduÇÃo aos mÉtodos cromatogrÁficos

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