contribución del laboratorio al diagnóstico de la
TRANSCRIPT
Contribución del Laboratorio al diagnóstico de la Hemocromatosis Hereditaria
Nazareth del Amo del ArcoQIR 4º año. Bioquímica Clínica
INDICE
INTRODUCCIÓN y ANTECEDENTES
METABOLISMO DEL HIERRO
FISIOPATOLOGÍA HFE
DIAGNÓSTICO
TRATAMIENTO Y PRONÓSTICO
INTRODUCCIÓN
La hemocromatosis hereditaria tipo 1 es un trastorno común del metabolismo del hierro que afecta a 1 de cada 200 a 400 individuos (0.25%-0.50%) de origen nórdico o céltico
Se caracteriza por un incremento en la absorción intestinal de hierro con depósito de éste en órganos (hígado, corazón y páncreas)
INTRODUCCIÓN
El exceso de hierro induce daño tisular con fibrosis e insuficiencia funcional que puede ocasionar cirrosis y hepatocarnicoma, diabetesmellitus, miocardiopatía, artropatía, hipogonadismo e hiperpigmentacióncutánea
1865 1935 1970 1980 1996
Trousseau Sheldon Simon et al Freder et al
Primer caso de HH Herencia AR¿Gen?
Gen HFE
ANTECEDENTES
Importancia y justificación
Las mutaciones del gen HFE son comunes y pueden originar daño irreversible a órganos
Tratamiento temprano previene el daño a los órganos
Importancia de distinguir la sobrecarga de Fe debida a la HH de sobrecargas observadas en otras patologías
Clasificación de las sobrecargas de Fe
SOBRECARGA DE Fe ADQUIRIDAS
• Anemias con sobrecarga de Fe
Talasemia mayor
A. Sideroblástica
A. Hemolítica crónica
•Sobrecarga transfusional
•Sobrecarga dietética
•Hepatopatías crónicas
Hepatitis C
Hepatopatía alcohólica
Esteatohepatitis no alcohólica
Porfiria cutánea tarda
OTROS
•Deficiencia dehemooxigenasa
•Sobrecarga de Fe neonatal
•Aceruloplasminemia
•A- o Hipotransferrinemiacongénita
•Variantes de DMT1
HEMOCROMATOSIS HEREDITARIAS
•Asociada al gen HFE (Tipo 1)
Homocigosis C282Y
Heterocigosis compuesta C282Y/H63D
•No asociada al gen HFE
Tipo 2 A HH Juvenil. Mutación HJV
Tipo 2 B HH Juvenil. Mutación HAMP
Tipo 3 Mutación TfR2
Tipo 4 Mutación Ferroportina
Tipo 5 Mutación Ferritina
Clasificación de las sobrecargas de Fe
CC GG (187)(187) H63D
5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatgatCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’
GG AA (845)(845) C282Y
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatatacgtGccaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
Frecuencia de mutaciones del gen HFE entre 1076 pacientes con HH
6%1%3%3.5%2%84%TOTAL (1076)
21%1%4%7%3%60%CARELLA, ITALIA
9%2%9%4%4%72%BOROT, FRANCIA
01.5%3%5%091%JOUANOLLE, FRANCIA
1%1%1%4%1%93%CARDOSO, SUECIA
4%1%03%1%91%CONSORTIUM, R. UNIDO
00000100%JAZKINSKA, AUSTRALIA
4%0002%95%ADAMS, CANADA
8%4%8%4%15%60%BARTON, EE.UU
7%1.5%3%6%1.5%82%BEUTTLER, EE.UU
7%0.6%4%4%0.6%83%FEDER, EE.UU
-/-H63D/ H63DH63D/-C282Y/H63DC282Y/-C282Y/ C282Y
INDICE
INTRODUCCIÓN y ANTECEDENTESMETABOLISMO DEL FeFISIOPATOLOGÍA HFEDIAGNÓSTICOTRATAMIENTO Y PRONÓSTICO
Fe: elemento esencial vs tóxico
Esencial para transporte electrónico y metabolismo celular
• Fe2+/Fe3+: Capacidad dadora/aceptora de electrones. Crucial para el funcionamiento de hemoglobina y mioglobina, enzimas de citocromo de mitocondria.
• Cluster Fe-S
Formación de radicales libres• Fe2+ + H2O2 Fe3+ + 2OH . (R. De Fenton)• Daña la membrana celular, proteínas y ADN
Metabolismo del Fe: 4 puntos clave
ENTEROCITO PRECURSOR ERITROIDE
HEPATOCITOMACRÓFAGO
DMT1HEMOOXIGENASAFERROPORTINA
TrF1
HEMOOXIGENASA
INDICE
INTRODUCCIÓNANTECEDENTES
FISIOPATOLOGÍA DE LA PROTEÍNA HFEDIAGNÓSTICOTRATAMIENTO Y PRONÓSTICO
FISIOPATOLOGÍA DE LA PROTEÍNA HFE
La proteína HFE estácompuesta por:
• 3 dominios α(extracelulares), uno de los cuales (α3) se acopla a la β2–microglobulina
• Región transmembrana
• Cola citoplasmática
“MODELO DE LA CRIPTA”
Mutación C282Y:Impide la unión de la beta-2-microglobulina a la proteína HFE por la rotura del enlace disulfuro, esta no puede ser transferida a la membrana plasmática basolateral y queda en el citosol, pudiendo impedir la captación del Fe circulante mediada por los TfR en las células de las criptas y así dar una falsa señal de que los depósitos de Fe están bajos; así aumentaría la producción de DMT1 en los enterocitos de las vellosidades, captándose más Fe
“MODELO DE LA HEPCIDINA”
Péptido secretado por el hígado
Conocimiento limitado de los mecanismos que regulan la producción y secreción de hepcidina en el hepatocito. El gen de la hepcidina (HAMP), localizado en el cromosoma 19q13.1, codifica para una proteína de 64 aminoácidos. La producción y localización de su precursor (pre-prohepcidina )en los hepatocitos se supone intracelular
La hepcidina ejerce su papel regulador inhibiendo la ferroportina (enzima transmembrana que transporta Fe en enterocitos y macrófagos)
Pre- prohepcidina prohepcidina hepcidina
- 24 aa - 33 aa
25 aa
REGULACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE Fe: “MODELO DE LA HEPCIDINA”
Ferroportina
La expresión de la hepcidina está regulada por: la concentración de Fe en los hepatocitos ( ) estímulo de inflamación, demanda de Fe por los eritrocitos e hipoxia Un incremento en la producción de hepcidina conduce a una disminución de la concentración plasmática de Fe (por inhibición de la ferroportina)
ACUMULACIÓN DE Fe
REGULACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE Fe: “MODELO DE LA HEPCIDINA” II
MUTACIÓN HFE
En las HH relacionadas con los genes HFE, TRF2 y HJV, la producción de hepcidina está disminuida, la ferroportina no sufre inhibición, a pesar del hierro hepático elevado, ocasionando una absorción de Fe inapropiada. De esta forma mediante el control de la síntesis de hepcidina, HFE estámuy implicado en la homesostasis de Fe.
DIAGNÓSTICO
Manifestaciones clínicasAnálisis bioquímicoEstudio genéticoBiopsia hepáticaAlgoritmo diagnóstico
Manifestaciones clínicas
Poco específicas y tardías (hacia la 5ª década)
Astenia. Síntoma inicialArtropatía: (25-50)% casos. Depósito de cristales de pirofostato cálcicoDMHiperpigmentación cutánea: 70% casosCirrosis. Primer órgano afectado, aunque mantiene su funcionalidad hasta fases muy avanzadas. Mayor susceptibilidadMiocardiopatía: 30% casos. IC y/o arritmias por depósito de Fe en el miocardioHipogonadismo: Descenso de LH, FSH y testosterona. Impotencia en estado cirrótico (40%)
Análisis bioquímico (I)
Saturación de la transferrina (IST): Manifestación fenotípica más temprana de la HH. Sensible
[ Fe sérico (µmol/L) / CF Trf (µmol Fe/L) ] x 100
CF Trf (µmol Fe/L) = Trf (g/L) x 25.1
• Punto de corte: Controversia
• IST 45% S: 98% en identificación de homocigotos C282Y y 22% para heterocigotos
• IST 60% S: (79-86)%
• IST <45% Mínima mejora de sensibilidad. Descenso de especificidad y VPP
Análisis bioquímico (II)
Análisis bioquímico (II)
Ferritina: Reflejo de los depósitos de Fe del organismo. Poco específico
• Sexo y edad• Consumo de alcohol• Reactante de fase aguda • Punto de corte: 300 ng/ml H y 200 ng/ml M• Valores superiores a 1000 ng/ml necesaria biopsia
hepática para detectar si existe fibrosis
Hierro sérico: Poca sensibilidad y especificidad
Estudio genético
•• Solo los genotipos: C282Y/ C282Y y Solo los genotipos: C282Y/ C282Y y C282Y/H63D deben considerarse indicativos de C282Y/H63D deben considerarse indicativos de
HHHH
6%1%3%3.5%2%84%TOTAL (1076)
21%1%4%7%3%60%CARELLA, ITALIA
9%2%9%4%4%72%BOROT, FRANCIA
01.5%3%5%091%JOUANOLLE, FRANCIA
1%1%1%4%1%93%CARDOSO, SUECIA
4%1%03%1%91%CONSORTIUM, R. UNIDO
00000100%JAZKINSKA, AUSTRALIA
4%0002%95%ADAMS, CANADA
8%4%8%4%15%60%BARTON, EE.UU
7%1.5%3%6%1.5%82%BEUTTLER, EE.UU
7%0.6%4%4%0.6%83%FEDER, EE.UU
-/-H63D/ H63DH63D/-C282Y/H63DC282Y/-C282Y/ C282Y
2 Tubos con EDTA-K2
Volumen: 6 mlEspécimen: SangrePruebas asociadas: ESTUDIO DEL GEN HFE
ObtenciObtencióón ADN: KIT FLEXIGENE DNAn ADN: KIT FLEXIGENE DNABuffer de lisis: Rotura de membrana nuclearBuffer de lisis: Rotura de membrana nuclearBuffer desnaturalizaciBuffer desnaturalizacióón: Eliminar proten: Eliminar proteíínasnas
Precipitación de ADN con isopropanol
Cuantificación: Absorción a 260 nm
HFEHFE2,7 2,7 KbKb
CC GG (187)(187) H63D
5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatgatCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’
GG AA (845)(845) C282Y
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatatacgtGccaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
EXON EXON EXON EXON EXON EXON EXON1 2 3 4 5 76
210 pb 390 pb
Detectan la presencia o ausencia de un cambio de base por reconocimiento de una secuencia
específica
GATCCTAG
H63D
G T A C
C A T G
C282Y
5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtgg
atgaccagctgttcgtgttctatGATCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’
CC GG (187)(187) H63D
5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtgg
atgaccagctgttcgtgttctatGATGatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’
ALELO NORMAL: Enzima reconoce secuencia y corta2 fragmentos
ALELO MUTADO: Enzima NO reconoce secuencia y NO corta.Secuencia intacta
5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatG
ATCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’
308 pb
138 pb
70 pb
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagtacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctgg
ataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatataCGTGCcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
ALELO NORMAL: Enzima NO reconoce secuencia y NO corta.
Sin embargo existe otro lugar de restricción...
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgt
247 pb
acagggtaaacagatccctctcctcatatggatgccaaggagtcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatat
aCGTGCcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
250 pb
C282Y
RsaI
G T A C
GG AA (845)(845) C282Y
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtacttgcccaatggggatgggacctaccagggctgg
ataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatataCGTACcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
ALELO MUTADO: Enzima reconoce secuencia y corta: 3 fragmentos
acagggtaaacagatccctctcctcatatggatgccaaggagtcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccc
cctggggaagagcagagatataCGT
ACcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'
5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgt
247 pb
140 pb 110 pb
Cribado familiar
• Una vez diagnosticado el individuo, es necesario el cribado familiar y estárecomendado para familiares de primer grado
• Cónyuge: 33% probabilidad de ser portador de mutación
• Si negativo Fin. Hijos sólo serán portadores heterocigotos
• Si positivo-> Estudio genético a hijos
Cribado poblacional
HH cumple varios de los criterios de los que la OMS establece necesarios para realizar cribado poblacional:• Fase latente reconocida• Conocimiento de la historia de
la condición, incluyendo su evolución de enfermedad latente a declarada
• Disponibilidad de test de cribado fiable
• Aceptación del test por parte de la población
• Política de a quién tratar aceptada
• Ser coste/afectivo
• Baja penetrancia y prevalencia de la mutación en ciertas etnias
• ¿Métodos de cribado y protocolos a utilizar?
CONTROVERTIDO
Prevalencia de los genotipos que predisponen a HH tipo 1 es muy alta
1% Presenta genotipo compatible1‰ Homocigotos C282Y
Penetrancia bioquímica alta
>90% Homocigotos C282Y presentan IST y/o Ferritina alterados
Penetrancia clínica baja (valorada como presentación de cirrosis hepática a lo largo de los años)
10% aprox Homocigotos C282Y1% Resto de genotipos
PREVALENCIA Y PENETRANCIA DE HH TIPO 1
Biopsia hepática
Gold standard para el diagnóstico de fibrosis hepática
Debe considerarse en adición al estudio genético positivoen pacientes que cumplen alguno de los criterios:
• Ferritina > 1000 µg/L• Edad > 40 años• Hepatomegalia• Tests de función hepática alterados
Además de la cuantificación de hierro hepático
Cuantificación del Fe hepático
DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA
• Tinción de Perls´: Establecimiento de la distribución celular de Fe con azul de Prusia
• Hasta 1985 método de elección.
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA
• EAA
Coloración para hierro -Azul de Prusia (400x). Los gránulos gruesos de hemosiderina se tiñen
de azul oscuro
Aplicación clínica en el diagnóstico de HH limitada por la aparición de nuevas técnicas (RM)
MUESTRA: Cilindro de biopsia hepática obtenido por PAAF. Peso mínimo (tejido seco): 0,0010 g . Conservación: -20 ºC
PROCEDIMIENTO: Secado e hidrólisis del tejido hepático. Determinación por espectrofotometría de absorción atómica de llama.
RESULTADOS: µg Fe/g.t.s.
INDICE DE Fe HEPINDICE DE Fe HEPÁÁTICO (IHH)TICO (IHH)
HOMOCIGOTOS IHH > 1.9
HETEROCIGOTOS y otras sobrecargas secundarias de Fe IHH < 1.5
Fe hepático (µmol/g.t.s.)/ Edad
TRATAMIENTO y PRONÓSTICO
FlebotomFlebotomíías as terapeterapeúúticasticassemanales ( 500 ml) hasta que se aprecie fallo de la eritropoyesis, detectado como caída del nivel de hemoglobina y hematocrito antes de siguiente flebotomía
Recomendable monitorizar la saturación de transferrina y la ferritina ( cada 3 meses)
Niveles recomendables: IST <50% y ferritina< 50 ng/ml ( incluso 20 ng/ml)
Importancia de la detección precoz para evitar daño de órganos
Esperanza de vida similar a sanos: Solo reducida en pacientes con cirrosis, diabetes y los que no logran deplecionar el Fe tras 18 meses de flebotomías