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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
DETECCIÓN DE FITOPLASMAS EN PAPAYA POR MEDIO DE
HIBRIDIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS CON SONDAS NO
RADIOACTIVAS, Y SU CARACTERIZACIÓN MEDIANTE RFLP’S
PROYECTO FODECYT No. 023-2007
MÉLANY DAMARIS VELÁSQUEZ GÓMEZ
Investigador Principal
GUATEMALA, ENERO DEL 2009.
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT- a través de la línea de financiamiento FODECYT.
OTROS AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Universidad del Valle de Guatemala, y en especial al laboratorio de
Protección Vegetal a cargo de la Licda. Margarita Palmieri, ya que gracias a sus
instalaciones, así como del equipo y parte de los materiales y suministros de laboratorio,
la realización del proyecto de investigación fue posible.
ÍNDICE
Descripción Página
Listado de Figuras i
Listado de Cuadros iii
RESUMEN v
ABSTRACT vi
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala 4
I.2. 2 Justificación 4
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General 6
I.3.1.2 Específicos 6
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización 7
I.4.2 Las Variables
I.4.2.1 Variables dependientes 7
I.4.2.2 Variables Independientes 7
I.4.3 Indicadores 7
I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.3.1 Población y Muestra 7
I.4.5 El Método
I.4.5.1 Extracción del ADN 8
I.4.5.2 Cuantificación y pureza del ADN extraído 9
I.4.5.3 Diagnóstico de fitoplasma en muestras frescas por PCR y
nPCR
9
I.4.5.4 Electroforesis en gel de agarosa de lo productos de PCR 12
I.4.5.5 Hibridización de ácidos nucleicos (dot blot) usando sondas no
radioactivas
12
I.4.5.6 Validación del método de hibridización de ácidos nucleicos (dot
blot) usando sondas no radioactivas
14
I.4.5.7 Polimorfismo de longitud de fragmentos restringidos (RFLP’s) 14
Descripción Página
I.4.5.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida para visualización de
productos de RFLP’s
15
1.4.5.9 Clonación de verdaderos positivos 18
1.4.5.10 Desecho de los materiales de laboratorio 23
I.4.6 La Técnica Estadística 23
I.4.7 Los Instrumentos a utilizar 25
PARTE II
II.1 MARCO TEÓRICO
II.1.1 Descripción botánica de la papaya (Carica papaya L.) 27
II.1.2 Importancia económica de la papaya 28
II.1.3 Comercialización y oportunidades 30
II.1.4 Enfermedades de la papaya 31
II.2.1 Los fitoplasmas 32
II.2.2 Técnicas de detección e identificación de fiitoplasmas 34
II.2.3 Enfermedades causadas por fitoplasmas en papaya 38
II.3.1 Pruebas estadísticas para la validación de técnicas de diagnóstico 39
II.3.1.1 La validez de una prueba diagnóstica: Sensibilidad y
especificidad
39
II.3.1.2 La seguridad de una prueba diagnóstica: Valores predictivos 41
II.3.1.3 La influencia de la prevalencia 41
II.3.1.4 Razones de probabilidad 42
PARTE III
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1 RESULTADOS
III.1.1 Extracción y cuantificación de ADN 44
III.1.2 Detección de fitoplasma mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) la reacción en cadean de la polimerasa anidada (nPCR)
46
III.1.3 Estandarización y Validación del método de Hibridización con
sondas no radioactivas para la detección de fitoplasma en papaya
III.1.3.1 Marcado de sondas 49
III.1.3.2 Temperatura de hibridización 49
III.1.3.3 Límite de detección 50
III.1.3.4 Corrida de muestras en membrana de nitrocelulosa y de papel 51
III.1.3.5 Pruebas estadísticas 53
Descripción Página
III.1.4 Caracterización de fitoplasmas encontrados en las muestras
mediantes RFLP’s
54
III.1.5 Análisis de costos de la prueba de hibridización con sondas no
radioactivas
56
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.2.1 Extracción y cuantificación de ADN 57
III.2.2 Detección de fitoplasma mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) la reacción en cadean de la polimerasa anidada (nPCR)
57
III.2.3 Estandarización y Validación del método de Hibridización con
sondas no radioactivas para la detección de fitoplasma en papaya
III.2.3.1 Marcado de sondas 59
III.2.3.2 Temperatura de hibridización 59
III.2.3.3 Límite de detección 60
III.2.3.4 Corrida de muestras en membrana de nitrocelulosa y de papel 60
III.2.3.5 Pruebas estadísticas 62
III.2.4 Caracterización de fitoplasmas encontrados en las muestras
mediantes RFLP’s
64
III.2.5 Análisis de costos de la prueba de hibridización con sondas no
radioactivas
65
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES 67
IV.2 RECOMENDACIONES 69
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71
IV.4 ANEXOS 74
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 85
i
Listado de Figuras
No. Descripción Página
1 Diseño de los cristales A y B para el proceso de electroforesis
vertical
15
2 Fotografías de la planta de papaya (Carica papaya) 28
3 Proceso de amplificación de ADN por PCR 36
4 Digestión con enzimas de restricción y separación de moléculas por
electroforesis
37
5 Productos de la amplificación de fitoplasma para muestras de papaya
mediante PCR utilizando la combinación de iniciadores universales
P1/P7
47
6 Productos de la amplificación de fitoplasma para muestras de papaya
mediante nPCR utilizando la combinación de iniciadores R16F2n/R2
para la región exterior y fU5/rU3 para la sección interna
47
7 Membranas empleadas para la medición de la eficiencia del marcaje
en la sondas
49
8 Membranas utilizadas para la etandarización de la temperatura de
hibridización
49
9 Comparación de las dos sondas utilizadas para la detección de
fitoplasma en muestras de papaya
50
10 Diluciones en agua de ADN extraído para diversas muestras
positivas y reveladas con las sonda del producto de PCR
50
11 Resultados obtenidos para la presencia de fitoplasma en papayas de
variedad hawaiana, criolla y maradol empleando membranas de
nitrocelulosa y papel, mediante hibridización de sondas no
radioactivas
51
12 Resultados obtenidos para la presencia de fitoplasma en la población
de cultivo de papaya criolla muestreada, mediante hibridización de
sondas no radioactivas
52
13 Migración de las muestras positivas para fitoplasma en gel de
agarosa
54
14 Gel de agarosa empleado para visualizar RFLP’s de los fitoplasmas
amplificados por nPCR
54
15 Gel de poliacrilamida al 6% empleado para visualizar RFLP’s de los
fitoplasmas amplificados por nPCR con las enzimas de restricción
Tru9 I y Alu I
55
16 Gel de poliacrilamida al 6% empleado para visualizar RFLP’s de los
fitoplasmas amplificados por nPCR con las enzimas de restricción
Tru9 I, Rsa I y Alu I
56
ii
17 Distancia de migración del ADN en función de la masa molecular
par el marcardor molecular de 50bp (Promega)
81
iii
Listado de cuadros
No. Título Página
1 Descripción de los lugares de colecta de muestras 8
2 Mezcla de reacción para detección de fitoplasma mediante PCR
empleando el juego de iniciadores P1/P7
10
3 Programa del termociclador para los productos de PCR 10
4 Secuencias de de los iniciadores empleados para PCR 10
5 Mezcla de reacción para detección de fitoplasma mediante nPCR
empleando los juegos de iniciadores R16F2n/R2 y fU5/rU3
11
6 Programa del termociclador para los productos de nPCR 11
7 Secuencias de de los iniciadores empleados para nPCR 11
8 Mezcla de reacción para RFLPs de productos de PCR 14
9 Enzimas de restricción empleadas en el laboratorio para el estudio
de fitoplasmas y
15
10 Preparación de la solución de bind silane 16
11 Nombre de los reactivos y sus respectivas cantidades utilizadas en
la elaboración del gel de acrilamida.
16
12 Condiciones de corrida del gel de acrilamida 17
13 Preparación de la solución de nitrato de plata 17
14 Preparación de la solución de carbonato de sodio 18
15 Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de agar LB 19
16 Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de caldo LB 19
17 Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de caldo SOC 20
18 Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de agar LB-
ampicilina
21
19 Otras Soluciones empleadas par el proceso de clonación 22
20 Descripción de los resultados obtenidos en la prueba evaluada con
respecto a la prueba de referencia
23
21 Resultados de la prueba y la existencia de la enfermedad 24
22 Equipo de laboratorio empleado durante la ejecución del proyecto 25
23 Clasificación taxonómica del papayo (Ibar, 1986) (Tung, et al,
2003)
27
24 Detalle de las importaciones y Exportaciones de papaya realizadas
por Guatemala, según año y país, expresadas en US$ y
kilogramos (período 2000 – 20005)
28
iv
No. Título Página
25 Detalle de las plantaciones de papaya establecidas y la generación
de jornales para el año 2006 según los datos del Ministerio de
Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) y el Proyecto de
Desarrollo de la Fruticultura y Agroindustria (PROFRUTA) de
Guatemala, así como las predicciones para el año 2007
30
26 Relación entre el resultado de una prueba diagnóstica y la
presencia o ausencia de una enfermedad
40
27 Valores de absorbancia obtenidos para las muestras trabajadas
mediante espectrofotometría UV, así como el respectivo cálculo
de pureza y concentración
44
28 Determinación de presencia de fitoplasma en las muestras de
papaya colectadas y los controles positivos, mediante nPCR
48
29 Valor de prevalencia de fitoplasma para muestras colectadas en
Retalhuleu
48
30 Resultados del diagnóstico de fitoplasma mediante hibridización
con sondas no radioactivas tomando como prueba de referencia, el
diagnóstico de fitoplasma mediante nPCR
52
31 Valores de las pruebas estadísticas realizadas para la validación de
la técnica de hibridización con sondas no radioactivas pre –
prueba (sin relacionar la prevalencia del patógeno a los parámetros
estadísticos), tomando como prueba de referencia, el diagnóstico
de fitoplasma mediante nPCR
53
32 Valores de las pruebas estadísticas realizadas para la validación de
la técnica de hibridización con sondas no radioactivas post –
prueba (relacionando la prevalencia del patógeno a los parámetros
estadísticos), tomando como prueba de referencia, el diagnóstico
de fitoplasma mediante nPCR
53
33 Tamaño aproximado ( bp) de las bandas obtenidas en las muestras
de papaya luego de 3.5 horas de digestión con enzima Tru9I. Ver
regresión lineal usada en Anexo D.
55
34 Comparación de costos entre el método evaluado (hibridización) y
el método de diagnóstico empleado como referencia (PCR)
56
35 Descripción de los patógenos causantes de enfermedad en papaya
según la American Phytophathological Society (Nishijima, W.,
1999)
72
36 Información sobre las muestras trabajadas 75
v
RESUMEN
La papaya es un cultivo de importancia económica en Guatemala, debido a su
comercialización tanto dentro como fuera del país. Anualmente se producen alrededor
de 3,093.42 toneladas para exportación, que representan 5,767,008 quetzales de ingreso
para el país, además de una generación de jornales de 108,318. El cultivo se ve
amenzado por una gran variedad de plagas y enfermedades. Algunas de éstas, como el
virus del anillamiento anular de la papaya (PRSV), han estado presentes en el país desde
hace algún tiempo. Sin embargo, existen enfermedades emergentes causadas por
fitoplasmas, que no han sido muy investigadas en Guatemala. En este proyecto se
deseaba desarrollar un método de diagnóstico para fitoplasmas, basado en la
hibridización de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas. Hasta el momento se
logró la estandarización de la técnica de hibridización en membranas de nitrocelulosa, a
partir de controles positivos y algunas muestras de papaya criolla, hawaiana y maradol.
Sin embargo, estadísticamente el método no es recomendable para la detección del
patógeno, teniendo un alta sensibilidad (95%) ante el fitoplasma, pero un vaolor
predictivo positivo (VPP) 34%; además de una baja especificad (30%) con un valor
predictivo negativo (VPN) de 94%. La razón de verosimilitud negativa (RV-) y positiva
(RV+) fue de 0.16, 0.17 y 1.35, 1.36 respectivamente. Asimismo, se intentó caracterizar
la(s) especie(s), de fitoplasma(s) que afectan los cultivos de Carica papaya L. (variedad
comercial maradol, hawaiana y criolla), en la región sur de Guatemala mediante el
polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción (RFLP’s). No fue posible
obtener patrones de bandas característicos para cada muestra positiva (que permitieran
diferenciarlas), siendo las posibles razones para ello: Presencia de contaminantes de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que inhiban a las enzimas de restricción,
tiempo de digestión muy prolongado o un producto de PCR inadecuado para la
caracterización. También se realizó la clonación de los controles positivos, con la
finalidad de almacenarlos para crear un banco genético de los fitoplasmas propios del
país. Este último esfuerzo está orientado a conectar el trabajo de laboratorio con la
situación fitosanitaria real de Guatemala.
Palabras clave:
Fitoplasmas, papaya, marcadores moleculares, RFLP’s, métodos de detección,
hibridización, ácidos nucleicos, clonación.
vi
ABSTRACT
Papaya (Carica papaya L.) is a crop of remarkable economic relevance in
Guatemala, due to its commerce both locally and internationally. The annual production
for exportation is of approximately 3,093.42 tons which represent Q.5,767,0008 of
incomes for the country and a generation of 108,318 work days. The crop is threatened
by a large variety of pests and diseases. Some of these, such as papaya ring spot virus
(PRSV), have been present throughout the territory for quite some time. However, there
are emerging diseases caused by phytoplasma, that haven’t been well studied in
Guatemala. The purpose of this project is the development of a diagnostic method for
phytoplasma detection, based on nucleic acid hybridization with non radioactive probes.
Until now, it has been possible to standardize the hybridization technique on
nitrocellulose membranes, by the use of positive controls and some criolla, hawaiana and
maradol papaya samples. However, the method is not stadistically recommended for the
detection of the pathogen, showing sensibility of 95% for phytoplasm detection but a
predictive positive value (VPP) of 34%; likewise a low specificity (30%) with a
predictive negative value (VPN) of 94%. The negative likelihood ratio values (RV-)
were 0.16 and 0.17 while positives values (RV+) were 1.35 y 1.36. Attempts to
characterize the species of phytoplasms that affect papaya crops (commercial varieties:
Hawaiian, maradol and criolla) of the southern Guatemalan have been done by
restriction fragment length polimorfisms (RFLP’s). It was not possible to obtain a
characteristic band patterns for each positive sample (to differiantiate each one); this is
probably due to several factors such as chain polymerase reaction (PCR) contaminants
that inhibit the restriction enzyme activity, a digestion period too long or an inadequate
PCR amplification product used for characterization. Also, the positive controls were
cloned in order to create a local phytoplasma gene bank. This last effort will connect the
laboratory work with the actual phytosanitary situation of Guatemala.
Keywords:
Phytoplasm, papaya, molecular markers, RFLP’s, detection methods, hybridization,
nucleic acids, clonation.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
Los marcadores moleculares se han utilizado en los últimos años en el ámbito
científico con el fin de llevar a cabo la caracterización genética de varias plantas.
Además, resultan de gran utilidad en los estudios de comparativos de poblaciones, así
como para la comparación de variedades dentro de una misma especie. El uso de los
marcadores genéticos ha tenido un efecto revolucionario a nivel de la biología molecular,
debido a que sus múltiples aplicaciones permiten establecer relaciones filogenéticas de
forma más práctica.
La ejecución de este trabajo fue uno de los primeros pasos para impulsar el
estudio de los fitoplasmas en los cultivos de Guatemala, principalmente en papaya. En
la actualidad no exiten investigaciones de fitoplasma realizadas en este tipo de cultivo,
aunque sí se ha detectado con anterioridad en muestras con sintomatología. Actualmente,
puede realizarse la detección de estos patógenos por medio de la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores específicos, que amplifican para la región
intermedia entre los genes 16S y 23S, teniendo como limitante el número de muestras
que pueden ser procesadas simultáneamente y el tiempo requerido para llevar a cabo el
procedimiento.
El obje tivo de este estudio fue hacer una caracterización por medio de la técnica
del polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción (RFLP’s) de los fitoplasmas
asociados con enfermedades de papaya en Guatemala. Además, se deseaba diseñar un
método de diagnóstico, más sencillo y menos costoso, para la detección de estos agentes
patógenos, en las variedades de papaya de mayor importancia comercial para el país.
La papaya pertenece a la familia Caricáceas, siendo su nombre científico Carica
papaya, es una fruta nativa de Centroamérica, posiblemente entre el sur de México y el
norte de Nicaragua. La humedad y el calor son las condiciones esenciales para el buen
desarrollo del papayo, ya que Guatemala es un país tropical, su clima es propicio para el
cultivo de la misma. La importancia económica de ésta radica en variedades tales como
Maradol, Criolla y Hawaiana, que pueden cultivarse a nivel centroamericano, e
incentivar así su exportación. La papaya es ampliamente usada en la industria del
alimentos, pieles, fármacos, etc.. De ahí, que resulte de gran importancia el estudio de
los agentes causantes de enfermedades en las plantaciones de dicho cultivo, así como
también los métodos de detección de éstos en Guatemala, y más aún de la búsqueda e
implementación de tecnologías capaces de mejorar las actuales.
2
En la actualidad se conoce que los fitoplasmas pueden causar pérdidas en
diferente grado en las plantaciones de papaya, pudiendo ser totales. En Guatemala no se
cuenta con información sobre los daños causados por estos patógenos en los cultivos de
papaya, ni de la severidad de las cepas presentes en el país. El conocimiento de los tipos
de fitoplasmas que afectan a la papaya permitirá la implementación de estrategias de
control, que aumenten la calidad y rendimiento de las plantaciones. Por otro lado, será el
primer paso para impulsar el estudio de los fitoplasmas en los cultivos de Guatemala,
principalmente en papaya, permitiendo así, conocer los vectores involucrados, los
reservorios, estudios de monitoreo, etc.. Con este trabajo, también puede establecerse un
pequeño banco de los fitoplasmas aislados, a fin de que puedan emplearse como
controles positivos en las técnicas de detección y para futuras investigaciones en el área.
En este estudio se propuso la validación de un método de hibridización de ácidos
nucleicos empleando sondas no radioactivas, para la detección de fitoplasmas. La
implementación de este tipo de técnica conlleva una serie de ventajas, dentro de las que
pueden mencionarse: Una disminución en el tiempo y costo de diagnóstico, un
procedimiento más simplificado que permite el procesamiento de un mayor número de
muestras, mayor facilidad al momento de colectar las muestras debido a que pueden
fijarse sobre membranas a temperatura ambiente, evitando así procedimientos rigurosos
de transporte y almacenaje necesarios para otras técnicas de detección.
Por otro lado, esta técnica implica un menor riesgo de contaminación de la
muestra, ya que el proceso conlleva un menor contacto con ésta, a diferencia del
diagnóstico por PCR. Todas estas ventajas permiten la obtención de resultados más
confiables, ya que se reduce el tiempo de deterioro de los fitoplasmas que puedan estar
presentes en las muestras. De forma adicional, la estandarización de esta técnica
permitirá introducir modificaciones en el procedimiento, que lo conviertan en una
técnica más versátil, capaz de ser implementada en el diagnóstico de estas bacterias
fastidiosas en otros cultivos.
Así, el estudio de los agentes causales de enfermedades en la papaya nacional,
posee también una repercusión económica, ya que existe costumbre de consumo del
fruto y derivados en América tropical y Europa, por lo que hay posibilidad de aumentar
el mercado para la papaya y productos industrializados, obtenidos a partir de ésta. El
diseño de un método de detección basado en sondas de hibridización de ácidos nucleicos
(dot blot) facilitará cuantificar los daños ocasionadas en las plantaciones de papaya por
estos patógenos, así como beneficiará a los productores, puesto que el conocimiento de
los fitoplasmas permitirá tomar medidas preventivas o estrategias de control para evitar
la propagación de la enfermedad y las pérdidas de los cultivos.
Es importante entender que no debe subestimarse la naturaleza de los
fitoplasmas, que conforman un grupo de micrcoorganismos díficiles de aislar, identificar
y trabajar (debido a su labilidad); por lo que esta nueva búsqueda de metodologías que
nos permitan conocer más a cerca de los mismos, de su prevalencia en los cultivos
comerciales del país (en específico en variedades comerciales de papaya), de su
patogenicidad y de la magnitud de los daños que puedan causar, darán a luz información
de origen valioso para estudios más profundos.
3
De esta forma, aunque este proyecto conforma en realidad sólo un pequeño
avance, por ser un estudio preliminar de fitoplasmas en papaya, dará a conocer además
otras posibles rutas de investigación que puedan ser de interés en el país, y permitirá
expandir los conocimientos de las limitaciones en la versatilidad de las técnicas
moleculares aplicadas en el área agronómica de Guatemala, así como también de sus
ventajas.
4
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
La papaya es un cultivo cuyo mercado ha sido de gran interés en los últimos
años, lo que ha permitido que su producción se incremente de forma considerable en el
país durante las últimas décadas. Existen muchas propiedades que pueden explotarse a
nivel industrial, pero que en la actualidad no se aprovechan, siendo la venta del fruto en
sí, la principal forma de mercadeo.
Desafortunadamente, a pesar de ser un país eminentemente agrícola, la
investigación a nivel de laboratorio de esta rama es limitada, teniendo poca inversión la
promoción de estudios acerca de patógenos en cultivos propios de Guatemala. Este
estudio conforma un ánalisis preliminar de la infección por fitoplasmas en los cultivos de
las variedades comerciales de papaya en el país, ya que no se cuenta con datos previos
que brinden información de esta bacteria fastidiosa con relación a la producción agrícola.
A pesar de que ya se ha trabajado con la técnica de hibridización de ácidos
nucleicos con sondas no radioactivas con anterioridad en el país, como lo es para la
detección de Begomovirus (Ortiz 2007, datos en proceso de publicación), aún no se han
realizado estudios de este tipo para la detección de fitoplasmas. Hasta el momento, la
detección de fitoplasma en laboratorios moleculares sigue siendo un desafío, ya que aún
cuando se ha logrado implementar su detección por PCR, la labilidad del
microorganismo sigue siendo un problema, es así como la búsqueda de nuevas técnicas
que faciliten el proceso puede ser de gran utilidad en el campo de la investigación.
I.2.2 Justificación
Este proyecto busca establecer un método sencillo y económico para la detección
de fitoplasmas presentes en la papaya, al mismo tiempo que desea caracterizar los
fitoplamas que afectan las variedades de importancia económica (hawaiana, maradol y
criolla) en la región suroccidente del país. Este aspecto resulta de gran importancia,
puesto que algunos de los tipos de fitoplasmas que afectan a la papaya, pueden llegar a
causar la pérdida de hasta el 100% de la producción. En la actualidad no se cuenta con
información acerca de la frecuencia con que estos agentes patógenos atacan los cultivos,
tampoco se han realizado estudios que den a conocer los grupos de fitoplasmas asociados
con las siembras de papaya hawaina, maradol y criolla dentro del país. Con este
trabajo, también puede establecerse un pequeño banco de los fitoplasmas aislados, a fin
de que puedan emplearse como controles positivos en las técnicas de detección y para
futuras investigaciones en el área.
La detección de fitoplasmas puede realizarse mediante la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores específicos, que amplifican para la región
intermedia entre los genes 16S y 23S. Sin embargo, este método de detección implica un
cuidado más riguroso en cuanto a la recolección, transporte y manipulación de muestras,
5
así como una mayor inversión de tiempo y costos para realizar el diagnóstico. La
validación de un método para la detección de fitoplasmas basado en la hibridización de
ácidos nucleicos permitirá la generación de resultados en un menor tiempo, así como una
manipulación más sencilla de las muestras, lo cual generará un menor costo al emplear
membranas de papel, y un menor riesgo, puesto que se trabajará con sondas no
radioactivas. Por otra parte, encaminará estudios posteriores que pueden dar a conocer
los períodos de incubación, vectores y reservorios, entre otros, que podrán realizarse de
forma más efectiva gracias al empleo de este nuevo método, que facilitará el
procesamiento de un mayor número de muestras. Este tipo de métodos resuelve de
forma eficiente problemas tales como el transporte de muestras, ya que éstas pueden
fijarse en la membrana durante el trabajo de campo, evitando también los problemas de
almacenamiento de la muestra mientras se envía al laboratorio.
Así, el estudio de los agentes causales de enfermedades en la papaya nacional,
posee también una repercusión económica, ya que existe costumbre de consumo del
fruto y derivados en América tropical y Europa, por lo que hay posibilidad de aumentar
el mercado para la papaya y productos industrializados, obtenidos a partir de ésta. El
diseño de un método de detección basado en sondas de hibridización de ácidos nucleicos
(dot blot) facilitará cuantificar los daños ocasionadas en las plantaciones de papaya por
estos patógenos, así como beneficiará a los productores, puesto que el conocimiento de
los fitoplasmas permitirá tomar medidas preventivas o estrategias de control para evitar
la propagación de la enfermedad y las pérdidas de los cultivos. Idealmente, el método
propuesto puede modificarse para ser implementado en la detección de fitoplasmas de
otros tipos de cultivos.
6
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 Generales
Caracterizar los fitoplasmas de Carica papaya L. presente en las variedades maradol,
hawaina y criolla en la región suroccidental de Guatemala.
Diseñar un método de diagnóstico para fitoplasmas en papaya mediante hibridización de
ácidos nucleicos usando sondas de ADN no radioactivas.
I.3.1.2 Específicos
Generar información sobre el porcentaje de plantas que son positivas para la presencia
de fitoplasmas en muestras con y sin sintomatología externa típicas, mediante la técnica
de PCR.
Clonar las muestras positivas para fitoplasmas y generar controles positivos que faciliten
la detección de estos microorganismos.
Diseñar y estandarizar la metodología para caracterización molecular de fitoplasmas en
papaya empleando RFLP’s en relación con controles positivos para las variedades
identificadas.
Generar un árbol filogenético del (los) fitoplasma(s) encontrados a partir fragmentos
característicos para cada variedad de fitoplasma a partir del uso de RFLP’s.
Validar el método de hibridización de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas
mediante la determinación de la sensibilidad, especificidad y valores predictivos
positivos y negativos de forma analítica y epidemiológica.
Validar la técnica de detección por hibridización con sondas no radioactivas con los
resultados de PCR seguido de electroforesis.
Comparar la especificidad y sensibilidad de la hibridización realizada en la membrana de
papel, con relación a la membrana de nitrocelulosa.
Comparar los costos del método propuesto con el usado actualmente (PCR seguido de
electroforesis) para la detección de fitoplasmas
7
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización
El proyecto comprendió la colecta de muestras de tejido foliar (hojas) del cultivo
de papaya, en los departamentos productores de papaya en el área suroccidental del país,
específicamente de Retalhuleu y Escuintla (Ver coordenadas geográficas en la sección de
estrategia metodológica, recolección de muestras). El trabajo de laboratorio se realizó en
las instalaciones del laboratorio de Protección Vegetal del Instituto de Investigaciones de
la Universidad del Valle de Guatemala (sede central).
I.4.2 Las variables
I.4.2.1 Variables dependientes
Las variables dependientes en este estudio fue el perfil genético de la o las
especies de fitoplasma aislados a partir del tejido foliar de papaya, así como las sondas
diseñadas para la detección del patógeno mediante el proceso de hibridización.
I.4.2.2 Variables Independientes
Comprenden los fitoplasmas que se detectaron en las muestras de papaya
infectadas, así como la técnica de hibridización con sondas no radioactivas.
I.4.3 Indicadores
En el caso de la caracterización mediante el uso de RFLP’s, se empleó como
indicador el patrón de bandas obtenidas a partir de la digestión enzimática de los
productos de PCR para reconocer si se trataba de la misma especie (la misma cantidad de
bandas y del mismo tamaño) o de diferente (bandas de diferente tamaño, la misma o no
cantidad de bandas).
Para la técnica de hibridización se compararon los resultados obtenidos con los
obtenidos mediante PCR, y de esta forma se determinó la especificidad de las sondas
propuestas. De igual forma se hizo una serie de diluciones a partir del ADN extraído
para conocer el límite de detección de la técnica.
I.4.4 Estrategia metodológica
I.4.3.1 Población y muestra
Descripción de la muestras
Las muestras utilizadas para este estudio corresponden a secciones de tejido foliar
(hojas) de plantas de papaya, con o sin sintomatología aparente de infección por
fitoplasmas. Las muestras fueron colectadas a partir de plantaciones de variedades
comerciales de papaya del país que abarcan hawaiana, maradol y criolla.
8
Recolección de muestras
La estandarización del método se hizo a partir de controles positivos de
fitoplasma de papaya, obtenidos de muestras de campo por medio de contacto directo
con los productores, previo a la colecta de las muestras antes mencionadas.
El material vegetal provino de las principales regiones productoras de papayas
hawaina, maradol y criolla del suroccidente del país, consistiendo en un total de 71
individuos distintos con y sin presencia de síntomas. Se realizó una sola gira de campo,
en la que se colectaron papayas de la variedad criolla (65 muestras), ya que las otras
variedades no presentaban problemas típicos del patógeno o eran muy jóvenes. Las otras
dos variedades fueron colectadas en un pequeño grupo de 3 individuos de cada una
(maradol y hawaiana). La colecta permitió determinar el porcentaje de muestras
positivas para la presencia de fitoplasmas, a partir de la técnica de PCR. El material
fresco se utilizó para la validación del método de hibridización de ácidos nucleicos.
Cuadro No. 1
Descripción de los lugares de colecta de muestras Código
de finca
Cultivo Departamento Municipio Altura
m SNV
Coordenadas
Longitud Latitud
A Papaya criolla Retalhuleu San Andrés Villa
Seca
46.1 0.00000 0.00000
B Papaya hawaiana
red venus
Retalhuleu Retalhuleu 95 14.45179 91.78229
B Papaya hawaiana
golden
Retalhuleu Retalhuleu 95 14.45179 91.78229
C Papaya maradol Escuintla La Gomera 70 14.15018 91.02636
D Papaya criolla Escuintla Nueva Concenpción IND 0.00000 0.00000
E Papaya criolla Escuintla Nueva Concenpción IND 0.00000 0.00000
F Papaya criolla Escuintla Nueva Concenpción IND 0.00000 0.00000
I.4.5 El método
1.4.5.1 Extracción del ADN
El protocolo utilizado es una modificación del método propuesto por Doyle &
Doyle (1990), para la extracción de ADN de aserrín de palmeras para optimizar la
detección del fitoplasma causante del amarillamiento letal del cocotero (ALC)
empleando buffer de extracción con CTAB (cetiltrimetilamonio), sin embargo también
ha resultado ser exitoso para la detección general de fitoplasma por PCR en papaya.
Para ello se requirió de 0.1g de tejido vegetal que se colocó en un tubo plástico de
centrífuga de 1.5ml, y luego fue macerado utilizando nitrógeno líquido hasta obtener un
polvo fino. Posteriormente, se agregó 800ul de buffer de extracción general con CTAB
(CTAB 2%, NaCl 1.4 M, EDTA 20mM, Tris – HCl 100mM, pH 8.0 y mercaptoetanol
0.2%; todo en concentración final) calentado a una temperatura de 60ºC y mezclado
mediante vortex. Una vez en buffer, las muestras fueron incubadas a 60ºC por 20
9
minutos, mezclando varias veces durante este período de tiempo con un vortex. Luego
de la incubación se hizo una separación de las proteínas usando 600ul de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), mezclando de nuevo con vortex y centrifugando a
velocidad máxima por 5 minutos, el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo al que
se le adicionó un volumen de isopropanol frío y 0.1 volúmenes de acetato de amonio 5
M, y se dejó reposar a -20ºC toda la noche. Luego se purificó el ADN centrifugando las
muestras previamente mezcladas, con las mismas condiciones descritas anteriormente
descritas, y empleando etanol al 80% para lavar el precipitado que luego se dejó secar a
temperatura ambiente. Por último se realizó la resuspensión en agua ultrapurificada
(entre 75 y 125ul), y se alamacenó a 4ºC para su posterior utilización.
1.4.5.2 Cuantificación y pureza del ADN extraído
Se realizó mediante espectrofotometría, utilizando un factor de dilución de 100
que corresponde a 10μl del ADN resuspendido en 990μl de agua. Se empleó una celda
de cuarzo para realizar lecturas de absorbancia a las longitudes de onda de 260, 280 y
320nm, usando agua como blanco. La determinación de la pureza del ADN extraído se
calculó mediante la razón (A280/A320) / (A260/A320). La concentración se calculó
empleando la fórmula (A280/A320)*factor de dilución (100)*50ng/μl. La pureza
adecuada deberá estar entre 1.8-2.0 y la concentración adecuada debe encontrarse en un
rango de 50-150 ng/μl. En caso de que la concentración fuera menor pero tuviera una
pureza adecuada se empleó el ADN ajustando un volumen adecuado para la realización
del proceso de PCR, mientras que para la hibridización se empleó el extracto puro. Si la
concentración era menor a 25 ng/µl y la pureza inferior a 1.6, el procedimiento de
extracción fue repetido.
1.4.5.3 Diagnóstico de fitoplasmas en muestras frescas por PCR y nPCR
Se utilizaron dos métodos de reaccción en cadena de la polimerasa, ambos
detallados a continuación y comprendiendo la amplificación del ARN ribosomal (ARNr)
del fitoplasma comprendido entre los genes 16S y 23S.
Receta de PCR para la detección de fitoplasmas empleando los iniciadores
universales P1/P7
Se preparó una mezcla de reacción, con un volumen final de 25.0μl por muestra,
empleando los reactivos citados en el cuadro a continuación y mezclando los
compuestos en el orden estipulado.
10
Cuadro No. 2
Mezcla de reacción para detección de fitoplasma mediante PCR empleando el juego
de iniciadores universales P1/P7
Componente Concentración stock Volumen para
1 reacción (µl)
Agua destilada desionizada 13.8
Buffer 5x (GoTaq Flexi buffer de Promega) 5 x 5.0
Cloruro de magnesio 25 mM 2.0
Primer P1 (Invitrogen) 100 mM 1.0
Primer P7 (Invitrogen) 100 mM 1.0
dNTPs 2.5 mM c/uno 1.0
Taq ADN polimerasa (GoTaq de Promega) 5 U/µl 0.2
Muestra de ADN 25 – 100 ng/µl 1.0
TOTAL 25.0
Se colocaron las muestras en el termociclador, siguiendo el siguiente programa:
Cuadro No. 3
Programa del termociclador para los productos de PCR
Paso Nombre Tiempo Temperatura
1 Desnaturalización 1 min 94 ˚C
2 Desnaturalización 90 seg 94 ˚C
3 Apareamiento (“Annealing”) 55 seg 55 ˚C
4 Extensión 2 min 72 ˚C
5 Repetir 34 veces los pasos 2 al 4
6 Extensión 8 min 72 ˚C
7 Finalización 24 h 4 ˚C
Los primers universales P1/P7 amplifican desde el extremo 5’ del gen 16S hasta
el extremo 5’ del gen 23S del ARN ribosomal (ARNr) del fitoplasma respectivamente
(Schneider et al., 1995), es decir amplifica tanto al gen 16S como la región intergénica
16S-23S. La mayoría de los fitoplasmas trabajados con este PCR amplifican un
fragmento de 1.8 kb aproximadamente. La secuencia de los primers o iniciadores se
presenta a continuación:
Cuadro No. 4
Secuencias de los iniciadores empleados para PCR
Primer Secuencia
P1 5’- AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT -3’
P7 5’- CGTCCTTCATCGGCTCTT -3’
Receta de Nested PCR (nPCR) para la detección de fitoplasmas empleando los
iniciadores R16F2n/R2 para la región exterior y fU5/rU3 para la sección interna
Se preparó una mezcla de reacción, con un volumen final de 40.0μl por muestra,
empleando los reactivos citados en el cuadro a continuación y mezclando los compuestos
en el orden indicado.
11
Cuadro No. 5
Mezcla de reacción para detección de fitoplasmas mediante nPCR empleando los
juegos de iniciadores R16F2n/R2 y fU5/rU3
Componente Concentración stock Volumen para
1 reacción (µL)
Agua destilada desionizada 23.2
Buffer 5x (GoTaq Flexi buffer de Promega) 5 x 8
Cloruro de magnesio 25 mM 4.0
Primer R16F2n (Invitrogen) 100 mM 1.0
Primer R2 (Invitrogen) 100 mM 1.0
dNTPs 2.5 mM c/uno 1.6
Taq ADN polimerasa (GoTaq de Promega) 5 U/µl 0.2
Muestra de ADN 25 – 100 ng/µl 1.0
TOTAL 40.0 ***Para el segundo PCR (nested), se empleó la misma receta de PCR pero adicionando los primers fU5/rU3 en
lugar de los colocados en la tabla anterior.
Cuadro No. 6
Programa del termociclador para los productos de nPCR
Paso Nombre Tiempo Temperatura
1 Desnaturalización 1 min 95 ˚C
2 Desnaturalización 30 seg 95 ˚C
3 Apareamiento (“Annealing”) 1.15 min 55 ˚C
4 Extensión 1.30 min 72 ˚C
5 Repetir 35 veces los pasos 2 al 4
6 Extensión 8 min 72 ˚C
7 Finalización 24 h 4 ˚C ***Para el segundo PCR (nested), se empleó el mismo programa del termociclador
Los primers R16F2n/R2 son inciadores universales para la detección de
fitoplasma (Lee et al. 1993) y los primers fU5/rU3 amplifican una región intergénica
entre el gen 16S y 23S del ARNr del fitoplasma (Lorenz et al., 1995). Los productos de
la amplificación correspondían a tamaños de aproximadamente 1.4kb y 900 bp
respectivamente. La secuencia de los primers se presenta a continuación:
Cuadro No. 7
Secuencias de de los iniciadores empleados para nPCR
Primer Secuencia
R16F2 5’- ACGACTGCTGCTAAGACTGG -3’
R16R2 5’- TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG -3’
fU5 5’- CGGCAATGGAGGAAACT -3’
rU3 5’- TTCAGCTACTCTTTGTAACA -3’
12
1.4.5.4 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR
Para visualizar las muestras positivas obtenidas con la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa, se hicieron migrar los productos de la amplificación a través de
un gel de agarosa 1% en buffer TAE 1x. Para ello, se cargó en una cámara de
electroforesis horizontal 7μl de producto de PCR con 1μl de buffer de montaje. Se
utilizó marcador de masa molecular y controles tanto positivos como negativos. El gel
se corrió con un voltaje constante de 90volts por 60 minutos. Las bandas se visualizaron
mediante la tinción con bromuro de etidio por 2 minutos y se retiró el exceso lavando
con agua por otros 3 minutos. Posteriormente fue expuesto a luz UV para visualizar de
las bandas. La presencia de una banda a 1.8 kb aproximadamente se puede considerar
como una prueba positiva para la detección de fitoplasmas con este método en el caso
del uso de los iniciadores P1/P7 y de 900 bp para el nPCR realizado con los iniciadores
R16F2n/R2 para la región exterior y fU5/rU3 para la sección interna.
1.4.5.5 Hibridización de ácidos nucleicos (dot blot) usando sondas no radioactivas
Para la técnica de hibridización se emplearon sondas de dioxigenina, cuyo
marcaje y revelado se hizo mediante el uso del kit “DIG high prime DNA labeling and
detection starter Kit I” (Roche Molecular Biochemicals, Alemania) según las
especificaciones del fabricante. El ADN proveniente de las muestras fue colocado sobre
una membrana de nitrocelulosa y de papel, habiendo sido desnaturalizado con
anterioridad (10 min a 96ºC y luego 5 en hielo). Posteriormente se fijó usando luz UV
durante 30 minutos. Tanto el proceso de hibridización como el de revelado se hicieron
según las especidificaciones del fabricante. La estandarización del método se llevó a
cabo mediante el uso de controles positivos pertenecientes a fitoplasmas de plantaciones
de papaya de procedencia indefinida. Después de esto, se realizó la gira de campo y se
colectaron las muestras usadas en el estudio. Por este motivo, los controles positivos no
se incluyen dentro de las muestras recolectadas pero sí dentro de los análisis estadísticos
de la validación del método.
Diseño y marcaje de sondas
Las sondas utilizadas fueron obtenidas a partir de controles positivos (muestras
de papaya que eran positivas para fitoplasma mediante PCR). La sonda se elaboró a
partir del producto de PCR de los controles purificados empleando el kit Wizard® PCR
Prep. DNAS Purification System (Promega, Madison WI). Una vez purificados fueron
cuantificados empleando un factor de dilución de 200ul en un volumen final de 1ml, a
fin de utilizar una concentración de 30ng/ul para el marcaje de sonda. Las sondas
utilizadas fueron obtenidas tanto del producto de PCR de los inicidadores P1/P7, como
del producto final del nPCR obtenido a partir de los primers externos R16F2n/R2 e
internos fU5/rU3. Una vez realizado el marcaje se comprueba que éste se haya llevado a
cabo por una serie de diluciones y el revelado de las mismas, según las especificaciones
del fabricante, obteniendo un margen de detección de por lo menos 0.1pg como
eficiencia. De forma paralela a este proceso, se utilizó un control positivo para marcaje
13
incluido en el kit, a fin de corroborar que el proceso de revelado era el adecuado.
Después de comprobar que el marcaje de la sonda fue eficiente se hizo una solución de
la sonda a una concentración final de 6.5 ng/ ml de solución de DIG Easy Hyb.
Cálculo de la temperatura de hibridización (Tm)
Se obtuvo mediante la búsqueda de secuencias del gen 16S del ARNr de 3
fitoplasmas diferentes, mediante la herramienta de bioinformática GenBank del NCBI.
A partir de la secuencia de nucleótidos se calculó un Tm teórico mediante la fórmula
lCGTm /600()(%41.082.49 , donde % G+C representa la suma de los
porcentajes de guaninas y citosinas presentes en la secuencia, y l es el número total de
bases en la secuencia. A partir del promedio de los Tm y su posterior variación se
obtuvo una temperatura óptima de 46.18 ºC ≈ 46 ºC para realizar el proceso de
hibridización.
Proceso de hibridización con sondas marcadas con dioxigenina
El ADN extraído de las muestras es fijado en membranas de nitrocelulosa y papel
mediante el uso de UV. Posteriormente la membrana se colocó en un recipiente cerrado
y se dejó incubando en solución de prehibridización (DIG Easy Hyb) por 40 minutos al
Tm de 46 ºC y movimiento constante; luego de lo cuál se cambia dicha solución por la
solución de la sonda y se deja hibridizando toda noche bajo las condiciones antes
descritas. Una vez finalizado este tiempo se siguieron los siguientes pasos con la
membrana:
1. Lavar dos veces por 5 minutos en una solución de 2xSSC, 0.1% SDS a temperatura
ambiente y con agitación.
2. Lavar dos veces por 15 minutos en una solución de 0.5xSSC, 0.1% SDS precalentado
entre 65-68 ºC y con agitación.
3. Lavar por 5 minutos con buffer de lavado 1X (Ácido maleico 0.1M, NaCl 0.15M, pH 7.5
(20 ºC), Tween 20 al 0.3% (v/v))
4. Incubar por 30 minutos en solución de bloqueo 1X (dilución de solución de bloqueo 10X
en buffer de ácido maleico (ácido maleico 0.1M, NaCl 0.15M, pH 7.5 (20 ºC)) y con
agitación.
5. Incubar por 30 minutos en solución de anticuerpo (buffer de bloqueo 1X con Anti-
Dioxigenin-AP diluído 1:5000) y con agitación.
6. Lavar dos veces por 15 minutos en solución de lavado 1X y con agitación
7. Equilibrar la membrana por 5 minutos en buffer de detección (Tris-HCl 0.1M, NaCl
0.1M, pH 9.5 (20 ºC)) y con agitación
8. Revelar en solución de sustrato (100ul de NBT/BCIP por cada 10ml de buffer de
detección), colocar en un recipiente obscuro y en reposo. Se revisa cada media hora si
ya existen cambios en la membrana, generalmente se logra visualizar los resultados en
aproximadamente 3 horas.
14
9. Detener la reacción de revelado empleando buffer TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM,
pH 8.0) en agitación constante durante 5 minutos.
10. Dejar secar la membrana sobre servilletas y apuntar los resultados cuando aún está
húmeda.
1.4.5.6 Validación del método de hibridización de ácidos nucleicos (dot blot) usando
sondas no radioactivas
El proceso comprendió una evaluación de la sensibilidad y de la especificidad de
las sondas diseñadas. Para evaluar la sensibilidad se emplearon diferentes
concentraciones de cada una de las sondas diseñadas, y se determinó la mínima
concentración con la que podía llevarse a cabo la detección. La evaluación de
especificidad se hizo bajo un aspecto analítico y epidemiológico, para el primer caso se
trabajó con dos membranas de hibridización (nitrocelulosa y papel), cuyos resultados
fueron comparados con los obtenidos por la técnica de PCR; mientras que en el segundo
caso se hizo un análisis estadístico. La comparación de dos tipos de membranas permitió
corroborar si la especificidad y sensibilidad propia de la hibridización en membrana de
nitrocelulosa, coincidía no solamente con los resultados obtenidos con PCR, sino
también con aquellos obtenidos con la membrana de papel.
1.4.5.7 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP’s)
Se realizó en base a los trabajos descritos anteriormente por Lee et al. y
modificados por Mejía F. 2006 (Protocolo para análisis de productos de PCR por
RFLP’s, Laboratorio de Protección Vegetal, Universidad del Valle de Guatemala). Se
emplearon las enzimas de restricción AluI, RsaI, Tru9I (MseI) y TaqI, seleccionadas a
partir de una lista de endonucleasas previamente usadas en 1993 para la clasificación de
fitoplasmas por Lee et al.. A partir de los productos de amplificación obtenidos por
nPCR (iniciadores externos R16F2n/R2 e internos fU5/rU3), y corroborados por
electroforesis en gel de agarosa, se preparó la mezcla de reacción para cada muestra
positiva, cuidando de no hacer burbujas al homogenizar por pipeteo y empleando el
buffer y la temperatura recomendada por el fabricante (ver cuadro No 8).
Cuadro No. 8
Mezcla de reacción para RFLP’s de productos de PCR
Reactivo Volumen (ul) Concentración final
Buffer 10X para la enzima 2 ul 1X
BSA acetilado (10mg/ml) 0.2 ul 0.1 mg/ml
Producto de PCR 14 ul ----
Enzima de restricción (10U/ul) 2 1 U/ul
Volumen final de reacción 20ul
15
Cuadro No. 9
Enzimas de restricción empleadas en el laboratorio para el estudio de fitoplasmas y
sus sitios de corte
Enzima de
restricción
Fabricante Buffer
utilizado
Temperatura óptima de
incubación
Sitio de
restricción
Alu I Promega B 37 ºC AG▼
CT
Rsa I Promega C 37 ºC GT▼
AC
Taq I Promega Multicore 65 ºC T▼
CG A
Tru9 I Promega Multicore 65 ºC T▼
TAA
Las mezclas de reacción fueron incubadas de 3.0 a 3.5 horas con agitación y
temperatura constante, luego de lo cual se detuvo la digestión por medio del
calentamiento a 96ºC por diez minutos y se almacenó a -20 ºC hasta su utilización. Los
fragmentos obtenidos fueron separados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
ya que no se tuvo éxito con la matriz de agarosa al 3%, donde se espera que los
fragmentos obtenidos sean de tamaños variables pero menores a 900 bp.
1.4.5.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida para visualización de productos de
RFLP’s
Se realizó en base a los protocolos para geles de secuenciación del Laboratorio de
Protección Vegetal, Universidad del Valle de Guatemala, y moficados por Yurrita 2008.
Preparación de cristales o placas de vidrio
Se utilizaron dos cristales que se muestran en la figura No. 1. El cristal A tiene
un tamaño de 34.5 x 45cm. En tanto que el cristal B tiene una tamaño de 34.5 x 43cm.
Figura No. 1
Se sumergieron los dos cristales (uno grande y uno pequeño) durante al menos 2
horas en una solución de hidróxido de sodio (Merck) al 10%. Posteriormente se lavó los
cristales con detergente común, mediante la utilización de una esponja. Luego se
enjuagaron ambos cristales con agua destilada y alcohol al 70%, para dejarlos secar a
temperatura ambiente. Una vez seco, se le aplicó al cristal pequeño, una dilución de
solución adherente bind silane de Sigma (6ul de bind silane en 1ml de agua destilada),
16
usando un Kimwipe (toalla de papel absorbente que ayuda a la eliminación de grasa y
previene rayones) para su dispersión. Esta aplicación se realizó dos veces. Al vidrio
grande ser aplicó 2 ml de solución Sigmacote de Sigma. Ambas soluciones colocadas en
los vidrios se dejan secar por al menos 15 minutos. Luego de que se secan, se colocaron
3 separadores plásticos de 0.4mm de espesor, en los bordes entre los cristales, colocando
las caras preparadas hacia el interior, alineado uno frente al otro. Ambos cristales se
sujetaron con pinzas, a lo largo del borde, sobre los separadores pero dejando libre la
parte superior para verter en esta área la solución de acrilamida.
Cuadro No. 10
Preparación de la solución de bind silane
Reactivo Cantidad
Etanol al 95% 15 ml
Ácido acético glacial, grado reactivo (Merck) 75 ul
Metacriloxipropil-trimetoxisilano 75 ul
Preparación del gel de acrilamida
Los reactivos y las cantidades utilizadas para elaborar 75 ml de gel de poliacrilamida
al 6% y urea a 7.5 M, se muestran en el cuadro a continuación.
Cuadro No. 11
Nombre de los reactivos y sus respectivas cantidades utilizadas en la elaboración
del gel de acrilamida.
Nombre del reactivo Cantidad utilizada
Urea (Merck) 30 g
Amortiguador TBE 5X 15 ml
Solución de acrilamida (Merck) 40%, 19:1 10 ml
Solución TEMED 99.92 ul
Solución APS (Persulfato de amonio) 312.12 ul
Agua destilada Aforar a 75 ml
Las soluciones de TEMED y APS se añadieron justo antes de verter el gel entre los
dos cristales para su polimerización. Al agregar la solución entre los cristales debe
tenerse el cuidado de hacerlo en forma constante, evitando la formación de burbujas.
Inmediatamente después se colocó un peine invertido de dientes de tiburón, en la parte
superior para delimitar una línea superior del gel, y se dejó polimerizar la acrilamida
durante 40 minutos, luego de lo cuál se retiraron las pinzas, se limpiaron los vidrios de
residuos de acrilamida polimerizadas, se retiró el peine y el separador inferior, y se
colocaron los cristales en una cámara de electroforesis vertical (ThermoElectron EC
1600). Se volvió a colocar el peine de dientes de tiburón, pero esta vez los dientes
posicionados a tal manera que penetren 0.4 mm aproximadamente del gel. El peine
utilizado consta de 50 pozos, y su tamaño es de 30.5 cm de largo y 0.4 mm de espesor.
Inmediatamente después se vertió 1.5 l de amortiguador TBE 1X (Tris 0.89 M, ácido
17
bórico (Merck) 0.89M, EDTA 0.025M) en los sitios respectivos de la cámara de
electroforesis. (Avalos, 2004)
Preparación de muestras de ADN
Se precalentó el gel durante 30 minutos (pre-corrida). Mientras se realizaba dicho
procedimiento, se preparó las muestras agregando a cada muestra la solución
desnaturalizante (NaOH 10mM, Formamida (Merck) 95%, Azul de bromofenol (Merck)
y naranja G (Merck) al 0.05%) en una relación 1:1 con el volumen de muestra. Las
muestras fueron desnaturalizadas en un termociclador marca Eppendorf Mastercycler
personal a 94 °C por 5 minutos. Se cargó cada pozo con un volumen final de 6 ul de
mezcla de producto de amplificación y solución desnaturalizante a cada pozo, además de
colocar como guía 6 ul de marcador molecular estándar de 50 pb (Invitrogen).
Cuadro No. 12
Condiciones de corrida del gel de acrilamida
Fase V mA W Tiempo
Pre-corrida*** 1435 44 60 30 minutos
Corrida 1400 56 50 2 horas
Post-corrida 1300 38 50 45 minutos
Una vez terminado el tiempo de post- corrida, se drenó el amortiguador de la cámara
de electroforesis y se removió los cristales con el gel. Se separaron ambos cristales, y el
pequeño (que poseía adherido el gel), se sumergió en solución de ácido acético glacial
(Merck) al 10% durante 30 minutos, con agitación moderada y constante.
Tinción del gel con nitrato de plata
El ácido acético empleado en la etapa anterior se guardó para su uso posterior. Se
lavó el gel tres veces con 1 l de agua destilada y agitación moderada, siendo cada lavado
de 3 minutos. Luego se colocó en solución de nitrato de plata (previamente enfriada)
durante media hora, con agitación constante y velocidad moderada durante 30 minutos.
La solución empleada se describe en cuadro a continuación.
Cuadro No. 13
Preparación de la solución de nitrato de plata.
Reactivo Cantidad
Nitrato de plata (Merck) 1.5 g
***Formaldehído al 37% (Merck) 2.25 ml
Agua destilada 1.5 l ***Se agregó justo antes de su utilización
Mientras, se preparó la solución de carbonato de sodio, mostrada en el cuadro 14. Al
terminar los 30 minutos en nitrato de plata, se lavó el cristal con el gel, sumergiéndolo
durante 1 minuto en agua destilada.
18
Cuadro No. 14
Preparación de la solución de carbonato de sodio
Reactivo Cantidad
Carbonato de sodio (Merck) 30 g
***Tiosulfato 2% (Merck) 2.5 ul
***Formaldehído 1.5 ml
Agua destilada 1 l ***Se agregó justo antes de su utilización
Inmediatamente luego que se agregó el formaldehido y el tiosulfato, se vertió la mitad
de la solución de carbonato de sodio, sobre el gel. Se agitó manualmente hasta que la
solución empezó a oscurecer y en el gel se comenzó a distinguir las bandas de ADN. En
este momento se desechó la solución de carbonato de sodio, vertiéndola sobre la
solución de nitrato de plata previamente utilizada a fin de que precipite y pudiera
desecharse sin riesgo. Se adicionó la solución restante de carbonato para permitir que
terminara de visualizarse las bandas de ADN de las muestras y al oscurecer la solución
se retiro el exceso de la solución, y al restante se le agregó la solución de ácido acético
guardada, con el objetivo de detener la reacción mediante el proceso de neutralización.
Se dejó el cristal con agitación constante y moderada durante 10 minutos y luego se
enjuagó con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Se empleó un
escaner para visualizar de forma electrónica la migración de los productos de digestión.
1.4.5.9 Clonación de verdaderos positivos
El proceso descrito a continuación se realizó en base a los procedimientos para la
creación de bacterias transformadas con insertos de ADN provenientes de productos de
PCR, descritos en los protocolos del Laboratorio de Protección Vegetal, Universidad del
Valle de Guatemala, y moficados experimentalmente en base a Maniatis, T. et al. 1989.
Los controles positivos fueron clonados con el kit Quick Protocol for Cloning
PCR Products with pGEM–T® y pGEM–T® Easy Vector Systems de Promega, según
las especificaciones del fabricante. El procedimiento hace uso de plásmidos pGEM–T y
pGEM–T Easy Vector, que luego de ligarse se introdujeron en células competentes de E.
coli pertenecientes a la cepa DH5 alfa, empleando la técnica de electroporación para
inducir la transformación. Para ello fue necesario la reactivación de las bacterias y
preparación de alícuotas electrocompetentes, como se describe a continuación. El
crecimiento de las bacterias se realizó en medio SOC y la selección de las bacterias
transformadas se llevó a cabo usando el medio LB/ampicilina/IPTG/X-gal, en el que las
colonias transformadas presentaron una coloración blanca. Por último se realizó una
prueba que permitiera verificar la presencia del plásmido mediante PCR. Se tomó con
un asa de punta un fragmento de las colonias transformadas. Las bacterias
trasnformadas fueron colocadas en caldo LB y almacenadas a -40ºC para su
conservación como controles positivos.
19
FASE 1: Reactivación de las células electrocompetentes (i.e. E. coli DH5α)
Las E. coli DH5α con que se trabajó, fueron preparadas para transformación por
choque de calor, y datan de 2001. Las bacterias ya habían sido previamente activadas
para la transformación (competentes), se empleó una segunda generación reactivada tal
como se describe a continuación.
DÍA 0: Preparación de materiales
Preparar para el DÍA 1:
14 placas LB (ver receta en cuadro 15)
Asa y soporte
Mechero de alcohol
Campana de flujo laminar o mesa de trabajo (desinfectarla con cloro 10% y etanol 95%)
Cuadro No. 15
Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de agar LB
Agar LB 1000 ml 350 ml
Triptona 10 g 3.5 g
Extracto Levadura 5 g 1.75 g
NaCl 5 g 1.75 g
NaOH 1 ml 1N 0.35 ml 1N
Agar 15 g 5.25 g
Se sirvió de 20 a 25 ml de medio a 50 ºC en cada placa. Las 14 placas se
incubaron por 24 horas a 37 ºC para asegurarse de que no crecieran microorganismos
como consecuencia de alguna contaminación. Las cajas que no se utilizaron para la
primera siembra de bacterias se almacenan a 4 ºC, debidamente selladas con parafilm y
empacadas en papel de envoltura para disminuir los riesgos de contaminación.
DÍA 1: Siembra
Preparar para el DÍA 2
Caldo LB (ver receta en cuadro 16)
Esterilizar 10 tubos corning de 15 ml
10 tubos corning de 15 ml
Esterilizar gradilla
Cuadro No. 16
Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de caldo LB
Caldo LB 1000 ml 60 ml
Triptona 10 g 0.6 g
Extracto Levadura 5 g 0.3 g
NaCl 5 g 0.3 g
NaOH 1 ml 1N 0.06 ml 1N
20
Se sirvieron 5ml de caldo LB en los 10 tubos, y se incubaron a 37 ºC por 24 horas
para descartar contaminación. Se almacenaron a 4 ºC debidamente sellados con parafilm
hasta el momento de utilizarlos.
Preparar para el trabajo del día
3 cajas petri con agar LB
Asa y soporte
Mechero de alcohol
Campana de flujo laminar
Una vez preparado el material detallado con anterioridad se llevaron a cabo los
siguientes pasos:
1. Desinfectar la campana de flujo laminar con cloro10% y etanol 95%.
2. Descongelar 3 tubos de E. coli DH5α almacenadas a –20 ºC en LB. Calentar hasta
temperatura ambiente.
3. Esterilizar el asa en llama, dejar que enfríe e insertarla en el primer tubo, tratando de
pescar trozos del LB. Esparcir los trozos en un sector de la caja petri, esterilizar de nuevo
el asa y trazar líneas a manera de obtener colonias aisladas (esterilizar el asa luego de
cada trazo). Repetir el procedimiento con los otros 2 tubos. Al final del día se habrán
sembrado bacterias provenientes de 3 diferentes alícuotas, a fin de asegurar el
crecimiento en alguna de las cajas de bacterias.
4. Incubar a 37 ºC por 24h.
DÍA 2: Overnight
Preparar para el día 3
10 tubos corning de 50 ml
Hielo
Centrífuga
500 ml de medio SOC (ver receta en cuadro 17)
Cuadro No. 17
Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de caldo SOC
SOC 1000 ml 500 ml
Triptona 20 g 10 g
Extracto
Levad
5 g 2.5 g
NaCl 0.58 g 0.29 g
KCl 0.19 g 0.095 g
MgCl2 1M 10 ml 5 ml
MgSO4 1.2 g 0.6 g
Glucosa 3.6 g 1.8 g
Guardar a temperatura ambiente, estable por años si está bien sellado y aislado.
Preparar para el trabajo del día
3 tubos corning de 15ml con 5 ml de caldo LB
Asa y soporte
21
Mechero de alcohol
Campana de flujo laminar
Tubos corning estériles de 15 ml
Una vez preparado el material detallado con anterioridad se llevaron a cabo los
siguientes pasos:
1. Preparar un cultivo inicial. Esterilizar el asa, picar una sola colonia de bacterias e
introducirla en un tubo con 5 ml de caldo LB. Hacer lo mismo con las dos placas y los
dos tubos restantes. Al final del día se contará con 3 tubos inoculados con células.
2. Incubar a 37 ºC toda la noche a 250 rpm.
3. Esterilizar las placas con bacterias y descartarlas.
FASE 2: Preparación de alícuotas de células electrocompetentes (i.e. E. coli DH5α)
DÍA3: preparación de las células electrocompetentes
Los reactivos a utilizar en esta etapa, así como las cantidades empleadas durantes este
experimento, se encuentran listados en el cuadro 18.
Cuadro No. 18
Reactivos y cantidad a emplear en la preparación de agar LB-ampicilina
Agar LB 1000 ml 120 ml
Triptona 10 g 1.2 g
Extracto Levadura 5 g 0.6 g
NaCl 5 g 0.6 g
NaOH 1 ml 1N 0.12 ml 1N
Agarosa 15 g 1.8 g
Ampicilina 1 ml 100mg/ml 0.12 ml 100mg/ml ***La ampicilina se agrega justo antes de vaciar el medio a las placas petri
Preparar para el trabajo del día
Medio SOC
Tubos corning 50 ml
Meter la centrífuga al cuarto frío 30 min antes de usar
Electroporador
Celdas para electroporar
Una vez preparado el material detallado con anterioridad se llevaron a cabo los
siguientes pasos:
1. Inocular 1 ml del overnight en 200 ml de LB, incubar a 37 ºC agitando a 300 rpm,
monitorear la OD600 hasta obtener un valor entre 0.5 a 0.6 (aproximadamente 7-9 horas).
2. Dividir el volumen del cultivo en 4 tubos corning de 50 ml previamente enfriados en
hielo y almacenar a 2C (hielo) por 15 min.
3. Centrifugar los 4 tubos por 20 min a 4200 rpm, en cuarto frío.
22
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las bacterias precipitadas en 500µL de agua
fría. Agregar 50 ml de agua fría y mezclar bien. Repetir el paso 3.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender las bacterias precipitadas en el líquido
remanente. Las bacterias no forman una pastilla firme, por eso se debe descartar el
sobrenadante de manera rápida. Agregar 50 ml de agua fría y repetir el paso 3.
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender las bacterias precipitadas en el líquido
remanente.
7. Juntar el contenido de dos tubos en uno solo y centrifugar 10 min a 4200 rpm.
Eliminar el sobrenadante, estimar el volumen del precipitado celular y finalmente
agregar un volumen de agua fria. Almacenar en hielo.
8. Hacer alícuotas de 35 ul de bacterias, colocar en tubos de 0.5 ml, mantener en hielo.
9. Resuspender el plásmido (CONTROL CRINI) en 25 ul de agua UP.
Electroporación
Para este proceso se siguieron los pasos listados a continuación, empleando cada
una de las muestras a clonar:
1. encender el electroporador.
2. Colocar en hielo
Plásmido
Bacterias
Celdas del electroporador, por 5 min
Preparar pipeta con 1 ml de SOC
3. Agregar 1ul de plásmido a un tubo con bacterias. Mezclar suavemente con la pipeta,
mientras transcurre un minuto.
4. Transferir el ADN y las células a la celda fría. Bajar la mezcla hasta el fondo de la
celda.
5. Limpiar la celda de agua o hielo con un kimwipe antes de colocarla dentro del aparato.
6. En el electroporador seleccionar un voltaje de 1800V.
7. Presionar PULSE/PUSH2x dos veces para iniciar el ciclo de carga/descarga (toma 8
segundos).
8. Retirar la celda y agregar inmediatamente 1 ml de SOC. Transferir el ml de SOC con
las bacterias a un tubo de fondo cónico de 15 ml previamente enfriado. Lavar la celda
con un segundo ml de SOC frío y colocar en el mismo tubo.
9. Colocar en hielo.
10. Repetir de 3 a 9 si hay varias muestras a trabajar.
11. Incubar las bacterias 1 hora a 37 ºC con agitación moderada y sembrar bacterias en
placas de agar, para su posterior tamizaje. Las placas empleadas cotenían agar LB con
ampicilina, X-Gal e IPTG (ver cuadro 19 para la preparación y utilización de estas
soluciones), a fin de reducir al mínimo el crecimiento tanto de otros microorganismos
como de bacterias no transformadas. Las bacterias tranformadas presentan coloración
blanca.
23
Cuadro No. 19
Otras Soluciones empleadas para el proceso de clonación
Reactivo Solución
Stock
Solución de
trabajo
Observaciones
Ampicilina 100 mg/ml
------- Se agregó de forma directa al agar preparado
antes del vertido, calculando una
concentración final de 0.1mg/ml. Almacenar
a -20 ºC y en un recipiente obscuro
IPTG 100 mM
100 mM
Se agregaron 40 ul de la solución de trabajo
sobre las cajas de agar LB/ampicilina 1 hora
antes de la siembra. Almacenar a -20 ºC y en
un recipiente obscuro. X-Gal 200 mg/ml
de DMF
20 mg/ml
de DMF ***DMF (dimetilformamida). Datos obtenidos de forma experimental en el proyecto FODECYT 023-2007,
luego de probar diferentes concentraciones de cada reactivo, basados en Maniatis T. et al 1989 y el sitio web
http://www.k-state.edu/hermanlab/protocols/AntibioticUsage.html.
1.4.5.10 Desecho de los materiales de laboratorio
El Departamento de Protección Vegetal de la UVG cuenta con un sistema de
desecho de sustancias potencialmente nocivas, contemplando sus características
químicas y biológicas, por lo que todo el material de desecho será descartado de acuerdo
a los protocolos propuestos por dicho laboratorio. Se cuenta con reservorios designados
para el descarte de solventes orgánicos que posteriormente son incinerados. El trabajo
con material vegetal, no conlleva los mismos riesgos para la salud de los investigadores
que trabajar con sustancias o fluidos corporales de mamíferos u ovíparos, y las
instalaciones de laboratorios poseen un nivel de seguridad adecuado para desarrollar
estas actividades (i.e. laboratorios de nivel de bioseguridad I). Los laboratorios del
departamento minimizan el riesgo de convertirse en fuentes de fitopatógenos tratando
todo material descartado con cloro e incinerando todo material vegetal excedente.
I.4.6 La técnica estadística
A partir de las muestras recolectadas al azar, se evaluó la validación del método
de hibridización de ácidos nucleicos mediante sondas no radioactivas. Para esto se
usaron los indicadores estadísticos básicos para evaluar el desempeño de un
procedimiento de diagnóstico: sensibilidad, especificad y valores predictivos de una
prueba positiva y negativa y la razón de verosimilitud positiva y negativa. Cada uno de
estos parámetros, será determinado en comparación con los resultados obtenidos con el
método de detección para fitoplasmas, mediante PCR. Para esto se hizo uso de una
matriz como la mostrada a continuación (ver cuadro 20) y las fórmulas
correspondientes.
24
Estimación de sensibilidad y especificidad (S y E)
Suponiendo una población de sujetos N, de los que se conoce su estatus
verdadero (enfermo o no) y se les ha practicado el test o prueba que se está evaluando y
cuyo resultado puede ser inequívocamente positivo o negativo, en base a un segundo test
de detección patrón. Estas características pueden entonces estimarse fácilmente a partir
de una tabla de 2x2 como se muestra a continuación (Pita S. y Pértigas S. 2003):
Cuadro No. 20
Descripción de los resultados obtenidos en la prueba evaluada con respecto a la
prueba de referencia
(Servicio Gallego de Salud S.F.)
Donde (Servicio Gallego de Salud S.F.): a = número de individuos con la enfermedad diagnosticados como "positivos" por la prueba.
b = número de individuos sin la enfermedad diagnosticados como "positivos" por la prueba.
c = número de individuos con la enfermedad diagnosticados como "negativos" por la prueba.
d = número de individuos sin la enfermedad diagnosticados como "negativos" por la prueba.
Valor predictivo positivo y negativo (VPP y VPN)
Puede apreciarse que cada celda de la tabla refleja una característica que también
suele calificarse de la manera siguiente (Servicio Gallego de Salud S.F.):
a = Verdaderos positivos (VP)
b = Falsos positivos (FP)
c = Falsos negativos (FN)
d = Verdaderos negativos (VN)
Con estos términos, la tabla puede expresarse así:
Cuadro No. 21
Resultados de la prueba y la existencia de la enfermedad
(Servicio Gallego de Salud S.F.)
25
Por tanto, los estimadores de las probabilidades descritas son, naturalmente, los
siguientes (Pita S. y Pértigas S. 2003):
Prevalencia P (E)
La prevalencia de la enfermedad puede ser estimada por los valores de la prueba
de referencia usando la siguiente fórmula (Pita S. y Pértigas S. 2003):
, donde N es el tamaño total de la muestra analizada.
La razón de verosimilitud (RV)
La definición y, a la vez, la expresión matemática que parece más conocida es la
siguiente (Pita S. y Pértigas S. 2003):
Al recordar las definiciones básicas de S y E se tiene (Pita S. y Pértigas S. 2003):
Esta expresión responde a la pregunta: ¿Cuántas veces más probable es que el test
sea positivo en los enfermos que en los no enfermos? De este concepto es evidente que
se desprende el complemento inverso: la respuesta a la pregunta ¿cuántas veces más
probable es que el test sea negativo en los enfermos que en los no enfermos? La
respuesta es el cociente, llamada razón de verosimilitud para resultados negativos (lo que
explica el signo negativo en la expresión anterior) (Pita S. y Pértigas S. 2003):
26
Sin embargo, debido a que deseaba hacerse el cálculo de éstos valores empleando
un límite de confianza, se hizo uso de la página http://www.seh-lelha.org/pdiagnos.htm,
correspondiente al tema de valoración de pruebas diagnóstica de la asociación de la SHE
(Asociación de la Sociedad Española de Hipertensión).
Así, todos los conceptos estadísticos explicados en ésta sección, fueron utilizados
cómo instrumentos para analizar los datos obtenidos del análisis de las muestras, y
permitieron generar conclusiones sobre la utilización del método evaluado (hibridización
de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas para la detección de fitoplasmas en
papaya).
I.4.7 Los instrumentos utilizados
Cuadro No. 22
Equipo de laboratorio empleado durante la
ejecución del proyecto
Sistema de captura de imágenes en UV
Cámara de electroforesis horizontal
Fuente de poder para cámara de electroforesis
horizontal
Destilador de agua
Suavizador de agua
Ultrapurificador de agua con UV
Termociclador
Campana para PCR
Instalaciones (lab. Biología molecular)
Horno de convección (hasta 250 °C)
Refrigerador
Congelador -20 °C
Congelador -80 °C
Centrífuga
Macerador
Incubadora
Equipo de cómputo (computadora, impresora,
scanner)
Balanza analítca
Microondas
Electroporador (Aparato para shock térmico)
GPS
27
PARTE II
II.1 MARCO TEÓRICO
II.1.1 Descripción botánica de la papaya (Carica papaya L.)
La papaya pertenece a la familia Caricáceas y al orden Parietales (Infoagro 2002)
otros nombres alternos son papayo, papayero, mamón, fruta bomba (Infojardín 2006).
La papaya cuyo nombre científico es Carica papaya, es nativa de Centroamérica,
posiblemente entre el sur de México y el norte de Nicaragua. La primera mención de la
misma fue en el año 1535 y se le atribuye a Gonzalo Fernández de Oviedo (historiador
español, (1478-1557)), quien informó a los reyes de España haber visto plantas de
papayas creciendo en dicha región (Pestano 2001).
Cuadro No. 23
Clasificación taxonómica del papayo (Ibar, 1986) (Tung, et al. 2003)
Dominio Eukaria
Reino Vegetal
División Antophyta
Subdivisión Angiosperma
Clase Dicoteledónea
Subclase Chrisopétala
Orden Apriétales
Familia Caricacea
Género Carica
Especie Carica papaya
Se le ha considerado como una herbácea gigante más que un árbol debido a su
tallo blando casi herbáceo y a su corta duración. Son muchas las variedades conocidas y
continuamente aparecen otras nuevas; en cada zona de cultivo existen variedades propias
adaptadas a sus condiciones climatológicas. Entre las variedades más conocidas a nivel
mundial están: Solo, Bluestem, Graham, Betty, Fairchild, Rissimee, Puna, Hortusgred,
Higgins, Wilder, Hortus Gold, Petersen, Zapote, Pusa, Maradol (Sánchez, M. et al.
1995). La figura 2 muestra la planta de papaya y sus frutos.
Su llegada al Caribe y a Suramérica se debió a los marinos españoles y
portugueses. Su distribución en todo el resto del mundo tropical se logra durante el siglo
XVI (Pestano 2001). Actualmente se cultiva en Florida, Hawai, África Oriental
Británica, Sudáfrica, Ceilán, India, Islas Canarias, Archipiélago Malayo y Australia
(Infoagro 2002).
28
Figura No. 2
Fotografías de la planta de papaya (Carica papaya)
Laboratorio de Protección Vegetal, Universidad del Valle de Guatemala, 2008.
La humedad y el calor son las condiciones esenciales para el buen desarrollo del
papayo. Requiere zonas de una pluviometría media de 1800 mm anuales y una
temperatura media anual de 20-22 ºC; aunque puede resistir fríos ligeros, si no tiene la
cantidad suficiente de calor, se desarrolla mal y los frutos no llegan a madurar. Posee
alta tolerancia al viento (Infojardín 2006).
II.1.2 Importancia Económica de la papaya
Importancia económica de la papaya en Guatemala
Algunos de los datos que describen la relevancia económica del cultivo de
papaya en Guatemala, se muestran en los cuadros 24 y 25.
Cuadro No. 24
Detalle de las importaciones y exportaciones de papaya realizadas por Guatemala,
según año y país, expresadas en US$ y kilogramos (período 2000 – 20005)
AÑO PAIS IMPORTACIONES
MONTO
PESO
(Kg)
EXPORTACIONES
MONTO
PESO
(Kg)
2,000
USA 0 0 16,238 18,656
MÉXICO 3,850 21,250 10 45
EL
SALVADOR
0 0 547,231 3,130,995
HONDURAS 41,006 115,921 26,609 225,989
CANADÁ 0 0 168 395
BÉLGICA 0 0 52,264 60,897
PAÍSES
BAJOS
0 0 10,441 13,392
NICARAGUA 0 0 4,620 11,308
29
AÑO PAIS IMPORTACIONES
MONTO
PESO
(Kg)
EXPORTACIONES
MONTO
PESO
(Kg) TOTAL 44,856 137,171 657,581 3,461,677
2,001
USA 0 0 29,312 49,095
MÉXICO 843 4,989 0 0
EL
SALVADOR
0 0 667,081 2,854,539
HONDURAS 35,811 92,280 26,862 103,312
NICARAGUA 0 0 2,214 5,238
PANAMÁ 0 0 588 2,065
TOTAL 36,654 97,269 726,057 3,014,249
2,002
ALEMANIA 0 0 14,070 12,065
EL
SALVADOR
0 0 490,128 2,159,237
HONDURAS 33,031 110,400 10,199 27,333
BÉLGICA 0 0 24,460 20,646
ESPAÑA 0 0 22,752 22,785
0 0 181,866 27,129
TOTAL 33,031 110,400 743,475 2,269,195
2,003
COSTA RICA 0 0 1,650 2,272
CANADÁ 0 0 66 10
EL
SALVADOR
0 0 329,121 1,397,571
HONDURAS 4,736 52,440 210 10,400
USA 7,267 11,975 145,500 337,941
NICARAGUA 0 0 495 1,360
TOTAL 12,003 64,415 477,042 1,749,554
2,004
USA 6,663 8,290 90,821 119,806
MÉXICO 11,555 77,100 0 0
ALEMANIA 0 0 10 78
EL
SALVADOR
0 0 268,232 904,127
HONDURAS 0 0 10,491 41,236
TOTAL 18,218 85,390 369,554 1,065,247
2,005
EL
SALVADOR
0 0 594,164 2,820,029
HONDURAS 0 0 48,402 97,700
NICARAGUA 0 0 782 895
USA 0 0 96,012 174,799
TOTAL 0 0 739,360 3,093,423
FUENTE: BANCO DE GUATEMALA Y CALCULOS PROFRUTA, AÑO 2006
(Monterroso 2007)
30
Cuadro No. 25
Detalle de las plantaciones de papaya establecidas y la generación de jornales para
el año 2006 según los datos del Ministerio de Agricultura, Ganadería y
Alimentación (MAGA) y el proyecto de desarrollo de la fruticultura y agroindustria
(PROFRUTA) de Guatemala, así como las predicciones para el año 2007.
Departamento Variedad Hectáreas
establecidas
Cantidad
de plantas
otorgadas
Monto
asignado
GENERACIÓN
DE JORNALES
ANUALES
2006 2007
Escuintla Criolla 60.530 131,148.00 491,805.00 31,983 34,172
Maradol 3.100 11,366.00 24,777.88 1,638 1,750
Subtotal 63.630 142,514 516,582.88 33,621 35,922
Quetzaltenango Criollas 21.903 50,157 188,088.75 11,573 12,365
Subtotal 21.903 50,157 188,088.75 11,573 12,365
Retalhuleu Criolla 46.955 106,350 398,812.50 24,810 26,508
Maradol 17.730 82,004 178,768.72 9,368 10,009
Tainung 11.200 44,800 97,664.00 5,918 6,323
Subtotal 75.885 233,154 675,245.22 40,096 42,840
San Marcos Criolla 9.830 23,338 87,517.50 5,194 5,549
Maradol 1.441 10,569 23,040.42 762 814
Subtotal 11.271 33,907 110,557.92 5,956 6,363
Santa Rosa Criolla 10.800 23,400 87,750.00 5,707 6,097
Subtotal 10.800 23,400 87,750.00 5,707 6,097
Suchitepequez Criolla 21.510 46,605 174,768.75 11,366 12,143
Subtotal 21.510 46,605 174,768.75 11,366 12,143
TOTALES 204.999 529,737 1,752,993.52 108,318 115,731
(Mencos 2007)
II.1.3 Comercialización y oportunidades
La papaya es una fruta tropical que se consume por su pulpa principalmente, que
suele ser de color anaranjado y de sabor dulce y jugoso, y sus propiedades digestivas. Es
un fruto bajo en calorías, rico en vitaminas A,C (Infojardín 2006), B, tiamina,
riboflavina, niacina, calcio, hierro, fósforo, potasio y fibra dietética; se cree que protege
al cuerpo de oxidación (previene el cáncer); regula niveles de colesterol, fomenta la
absorción de hierro, favorece la síntesis de colágeno, útil para tratar desórdenes
gástricos (activa jugos pancreáticos, antidiarreico y antihelmíntico (Ascaris), papaína es
digestiva); antimicrobial, amebicida, bactericida, aunque se han realizado pocos estudios
al respecto (Martínez 2006).
Existen diferentes variedades o cultivares de uso comercial. Entre las mejores
figuran la variedad cubana conocida como Maradol. Otra de las variedades era la
llamada criolla, que se sembraba en la región oriental de Cuba, con rendimientos sobre
las 40 toneladas por hectárea y sin mayores problemas fitosanitarios. En Centro y
31
Suramérica, se conocían las variedades Maradol o mamey, también conocida como la
Cubana, la Criolla y la tipo Cartagena y la tipo Paraguanera. Existe una gran cultura en
el desarrollo de frutos pequeños o mini frutos de diferentes tipos, provenientes de la
variedad Solo (Pestano 2001).
El comercio interno y de exportación a nivel mundial, excede los 3 millones de
toneladas de esta fruta, y que es habitual en Europa estar consumiendo papaya de Sur
Africa, así como de México o de Brasil. Los 10 países que encabezan la lista de
exportadores en el mundo son: Brasil, México, Indonesia, India, Zaire, Las Filipinas,
China, Perú, Colombia y Mozambique. Además tenemos a Hawai que forma parte del
territorio americano, que es un enorme productor y suple en parte la demanda de este
país (Pestano 2001).
El fruto de la papaya, tiene diferentes usos, tanto como fruta fresca, en jugos, en
batidos, en helados, como parte de las ensaladas, dulces diversos de elaboración casera o
envasados por la industria, tanto semi verdes como maduros (Pestano 2001). También se
elaboran diversos productos como confituras y jaleas (Infojardín 2006).
Algunos países de Asia, Africa y Oceanía los destinan a la obtensión de látex. De
este líquido lechoso que es abundante en los frutos verdes, se extrae la papaína (Pestano
2001), una enzima proteolítica (Infojardín 2006), ampliamente usada como ablandador
de carnes y también en la clarificación de cervezas y otras bebidas; es de utilidad para
suavizar las lanas, así como en el curtido de las pieles. Tiene gran aplicación en la
fabricación de caucho y además en la preparación de productos medicinales y de
remedios caseros, etc. (Pestano 2001). Las semillas tienen un sabor picante. Los tallos y
las hojas contienen pequeñas cantidades de carpaína, un alcaloide estimulante del ritmo
cardíaco (Infoagro 2002).
II.1.4 Enfermedades de la Papaya
El cultivo de la papaya se encuentra afectado por una serie de agentes patógenos
de los cuales se hacen conocidos las plagas, parásitos, nemátodos y otros insectos tales
como moscas. Además de éstos, es con frecuencia atacada por hongos, virus, viroides,
bacterias y fitoplasmas (ver Anexo A).
Las infestaciones por la mosca de la papaya, Toxotrypana curoicauda
Gerstaecker, y la presencia de los virus en las infecciones de la planta son dos de los
problemas fitosanitarios más importantes que enfrentan los productores de papaya en el
sur de Florida (USA), México y algunos de los países de Centroamérica (Aluja et al.
1997).
La mosca de la papaya es un insecto con varias generaciones por año, nativo de
América tropical. Típicamente la hembra introduce el ovopositor a través de la pulpa
inmadura y deposita 10 o más huevos entre las semillas de la cavidad central de la
papaya. Las larvas se alimentan de las semillas y el revestimiento de la cavidad y antes
32
de completar su desarrollo salen de la fruta y caen al suelo, para convertirse en pupa ahí
(Aluja et al. 1997).
II.2.1 Los Fitoplasmas
Los fitoplasmas se han asociado con enfermedades de más 300 especies de
plantas, en años recientes las enfermedades por fitoplasmas se han reportado en varios
vegetales y plantas ornamentales en Canadá. Sin embargo muchas de estas
enfermedades no se han identificado y sus relaciones genéticas con otros fitoplasmas que
afectan plantas herbáceas ornamentales, vegetales y en cultivos de forrajes no se ha
establecido (Wang 2001).
Los fitoplasmas son organismos procariotas. Anteriormente se conocían como
organismos parecidos a micoplasmas (MLO’s), actualmente se nombran como
fitoplasmas y espiroplasmas (Mitchell 2004). Son bacterias únicas debido a que pueden
invadir de forma efectiva las células de insectos y plantas, organismos de dos reinos
distintos. Son miembros de la clase Mollicutes (mollis, suave; cutis, piel) debido a la
ausencia de pared celular (Bai et al. 2006). Usualmente poseen genomas pequeños (Bai
et al. 2006) entre 600–1150 kb, no helical (a excepción de espiroloplasmas) y con un
contenido de G+C entre 23.0–26.2 mol % (Seemüler et al. 1998), poseen pocos operones
de rARN, pocos genes de tARN y actividades metabólicas limitadas (Bai et al. 2006).
Están asociados con enfermedades en cientos de plantas (Seemüler et al. 1998), cuyos
síntomas varían según el agente causal y el estado de infección. Algunas de las
características de la infección por fitoplasma incuyen virescencia (flores verdes), filodía
(desarrollo de partes florales en estructuras de hoja), esterilidad de las flores,
proliferación de retoños axilares, elongación anormal de los internudos (retoños
delgados), malformaciones generalizadas, decolarión de hojas y retoños, enrollamiento
de hojas, apariencia abultada al final del tallo, necrosis y declinación generalizada del
desarrollo (Lee 1999).
Los fitoplasmas que infectan las plantas se encuentran principalmente confinados
en los elementos de tamizaje de los tejidos del floema (Lee 1999). La transmisión de
estos patógenos es persistente y propagativa, los vectores son infectivos durante toda su
vida y el patógeno se mueve fuera la garganta para multiplicarse en la cavidad corporal y
en las glándulas salivares antes de ser transmitido a un nuevo hospedero al momento de
la alimentación (Mitchell 2004). Usualmente estos insectos suelen tratarse de
homópteros, los cuales se alimentan de los fluídos del floema (Guthrie 1998).
El metabolismo de la planta es evidentemente alterado en las partes cercanas a
donde se alojan los fitoplasmas. Se ha encontrado que la concentración de algunos
fitoplasmas es muy baja dentro de los tejidos que presentan síntomas externos. La
observación del daño celular en las localidades distantes al sitio en que se encuentra el
fitoplasma indica la implicación de la producción de toxinas inducidas por el patógeno
(Siddique 1998).
33
Los reportes del período de incubación, primera detección del fitoplasma dentro
de la planta y el comienzo de síntomas visibles varían de acuerdo a la planta, el
fitoplasma y la severidad de los síntomas. El período de incubación se ha atribuido a una
etapa de traslocación y multiplicación del fitoplasma dentro de la planta (Guthrie 1998).
El manejo de estos patógenos se limita a la poda, tan rápido como se observan
los signos externos, dejando la planta con 0.75m de alto; ésta estrategia asume que los
fitoplasmas se localizan en las partes superiores de los retoños (Guthrie 1998).
Clasificación
El fracaso en desarrollar técnicas que permitan obtener cultivos de fitoplasmas
bajo condiciones estériles, ha dificultado la caracterización e impide que exista una
clasificación definitiva. Por un largo período se diferenciaron los fitoplasmas en base a
los síntomas inducidos, la planta hospedera afectada, el área geográfica en que ocurrían y
la especificidad por los vectores, sin embargo en muchos casos se agrupaban organismos
genéticamente muy distintos (Seemüler et al. 1998). El desarrollo de antisuero
policlonal y luego monoclonal, permitió iniciar la diferenciación de los fitoplasmas
(Bertaccini 1999). Una nueva era para la investigación de los fitoplasmas se ha iniciado
con la introducción de los métodos basados en ADN. La filogenia de los fitoplasmas
puede obtenerse usando análisis de secuencias comparativas del gen 16S del ARN
ribosomal (Seemüler et al. 1998).
En 1996, la organización internacional para la micoplasmología adoptó una
nueva clasificación basada en el gen 16S del rARN y describió cada subclado (grupo
mayor) definida a nivel tentativo de especies como Candidatus de las especies de
fitoplasma. En una muestra de 246 fitoplasmas analizados, los fitoplasmas se agruparon
en base al esquema propuesto por Lee et al. 1999 y Gundersen et al. 1998, se obtuvieron
103 fitoplasmas correspondientes al subclade AY, dentro del cual se formaron 8
subgrupos (I-A al I-I), dentro de los cuales los fitoplasmas se consideraron muy similares
o idénticos. Los 143 fitoplasmas no AY, se clasificaron de forma similar formándose en
este caso 19 grupos. El concepto de la clasificación para los fitoplasmas debe
expandarse y adaptarse a la diversidad existente, sin embargo debe tomarse en cuenta
que en muchos casos, el uso de un solo marcador puede no ser suficiente para definir la
taxonomía (Seemüler et al. 1998).
Los fitoplasmas representan una rama del árbol filogenético de las eubacterias
gram positivas como Bacillus, Clostridium, and Streptococcus spp.. Su árbol
filogenético está compuesto de dos grandes clados que divergen de forma temprana en la
evolución. Un clado contiene los órdenes Acholeplasmatales y Anaeroplasmatales
(AAA clade mollicutes), y el otro clado contiene los órdenes Mycoplasmatales y
Entomoplasmatales (SEM clade mollicutes) (Bai 2006).
Métodos de detección
Actualmente, técnicas serológicas y moleculares han proporcionado herramientas
para la detección de fitoplasmas, aún en bajas concentraciones, mejorando la seguridad
34
en el diagnóstico. El desarrollo de técnicas tales como la prueba de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), usando iniciadores universales que se aparean en
sectores conservados de la región del 16S rADN de los procariotas, ha permitido la
detección de diferentes fitoplasmas, aún en tejidos donde su concentración es baja
(Herrera et al. 2003). El uso del operón de genes de proteínas ribosomales y secuencias
cromosomales clonadas tiene como resultado un nivel más fino de diferenciación,
mostrando un mayor grado de diversidad entre las cepas (Bertaccini 1999). De esta
forma se desarrollaron procedimientos para extraer y aumentar el ADN fitoplasmático,
para luego clonarlo y secuenciarlo, a fin de generar datos moleculares de la diversidad de
los fitoplasmas (Seemüler et al. 1998).
II.2.1 Técnicas de detección e identificación de fitoplasmas
Hibridización Dot blot
La hibridización o renaturalización de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un
proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con
secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma
la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas
bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se
trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases
nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestas a la fuente
emisora de energía (Wikipedia 2009 a).
Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales:
A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A. Así, dos cadenas perfectamente complementarias
se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes
geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a
inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión (Wikipedia 2009 a).
El proceso de hibridización se puede revertir simplemente calentando la solución
que contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la
temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres
puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto,
y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha
energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las
especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN
mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN,
según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen
enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial. En biología
molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridización: Tipo
Southern, para uniones ADN-ADN y tipo northern, para uniones ADN-ARN (Wikipedia
2009 a).
35
La hibridización del ADN es el proceso más común para detectar un gen
particular o un segmento de un ácido nucleico. Existen muchas variaciones del método
básico, el que más se utiliza es el uso de fragmentos de ADN o ARN marcados
radioactivamente conocidos como sondas. De hecho esta metodología es la base de la
amplificación controlada de ADN conocida como PCR por sus siglas en inglés
Polimerase Chain Reaction o reacción en cadena de la polimerasa que se utiliza para la
clonación y secuenciación de ADN (Vásquez 2003).
Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan
frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. Ambos
métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico,
bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia
de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o
ADN de cadena sencilla de secuencia parecida (Wikipedia 2009a).
Se han utilizado extensamente fragmentos del ADN cromosomal fitoplásmico,
clonados al azar, en ensayos de hibridazación Dot Blot (Seemüler et al. 1998). Además
del ADN del fitoplasma pueden utilizarse sondas del ARN complementario (Lee 1999).
Usualmente presentan un rango de detección mayor que el de los anticuerpos. Su
especificidad varía dependiendo de la secuencia seleccionada y conlleva a la definición
de relaciones, más o menos, estrechas. La mayor desventaja de este método es la
sensibilidad insuficiente de las sondas en trabajos comparativos en los que los títulos del
fitoplasma en el hospedero son bajos. En algunas cepas la diferenciación no puede
realizarse con el método de hibridización, pero es posible realizarlo usando análisis de
RFLP (Seemüler et al. 1998).
Southern Blot
Tanto la hibridización por southern blot como el análisis de los patrones de
RFLP proveen más información de la relaciones genéticas que los ensayos con dot blot
(Seemüler et al. 1998). El análisis por RFLP de parte o la totalidad del ADN genómico,
mediante la hibridización con southern blot, usando sondas clonadas de ADN
seleccionado, resulta útil para la diferenciación de cepas estrechamente relacionadas
dentro de un grupo o subgrupo dado de fitoplasmas (ej. los subgrupos 16SrARN),
logrando una diferenciación hasta nivel de cepas. Este tipo de hibridización se ha
utilizado para la diferenciación de los miembros correspondientes al aster yellows,
enfermedad X, proliferación en manzana y otros grupos de fitoplasmas (Lee 1999).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (o PCR, sigla de Polymerase Chain
Reaction) es una técnica ideada por Kary Mullis en 1986. Se utiliza para sintetizar in
vitro secuencias específicas de ADN. Las polimerasas son enzimas que sintetizan a los
ácidos nucleicos, (tanto ADN como ARN). El método imita el proceso natural de
replicación del ADN en las células, llevado a cabo por polimerasas de ADN. El mayor
mérito de la PCR es que, a partir de un pequeño número de moléculas, permite obtener
gran número de copias de un fragmento de ADN, lo que resulta de enorme utilidad en
36
gran parte de los estudios de biología molecular. El tamaño del fragmento replicado
puede variar entre unos 100 y unos pocos miles de pares de bases (Posik et al. 2007).
Para realizar la multiplicación de un
fragmento determinado de ADN se debe
contar con una cadena que funcione como
molde a amplificar y con un par de cebadores
o primers. Los últimos son oligonucleótidos
(cortos tramos de ADN de cadena simple,
compuestos por aproximadamente unas 20
bases) de secuencia conocida que se unen a
los extremos del fragmento a amplificar. Si
bien es necesario conocer la secuencia de
bases de los cebadores, no es preciso conocer
la del interior del segmento a amplificar
(Posik et al. 2007).
La utilidad tras la amplificación, reside
en que resulta mucho más fácil identificar con
una muy alta probabilidad virus o bacterias
causantes de una enfermedad, identificar
personas (cadáveres) o hacer investigación
científica sobre el ADN amplificado. Estos
usos derivados de la amplificación han hecho
que se convierta en una técnica muy
extendida, con el consiguiente abaratamiento
del equipo necesario para llevarla a cabo
(Wikipedia 2009b).
Tanto los bajos títulos como la
irregularidad en la distribución de los
fitoplasmas en las plantas han sido un
obstáculo para el diagnóstico de las
enfermedades causada por fitoplasmas (Lee
1999). El PCR con cebadores de secuencias
de ADN de fitoplasma clonado al azar, de 16S
rADN, genes de proteínas ribosomales y otros fragmentos hace posible la “nueva era” de
la fitoplasmología, mostrando la diversidad y las relaciones filogéneticas entre sí y con
respecto a otros procariotas, siendo las enfermedades de amarillamiento las que han
recibido mayor atención (Bertaccini 1999).
Los ensayos de PCR han proporcionado una forma de detección más sensitiva y
sensible, basándose en el uso de cebadores “universales” como método preliminar en el
diagnóstico (Lee 1999). Estudios realizados con fitoplasmas permitieron la
determinación de cebadores específicos para cepas de fitoplasmas, generados a partir de
secuencias de las regiones intergénicas 16S-23S del ARN ribosomal (Smart 1996).
Figura No. 3
Proceso de amplificación de ADN por
PCR
37
El PCR anidado se ha utilizado para aumentar la sensibilidad y especificidad en
los casos en que las muestras de fitoplasmas presentan bajos títulos dentro del
hospedero, o existe un grado sustancial de inhibidores que pueden interferir con la
eficiencia del PCR. Este método permite la detección de dos o varios fitoplasmas
presentes en los tejidos infectados. El PCR de inmunocaptura puede ser un método de
detección alternativo para aumentar la detección y sensibilidad, basándose en el uso de
anticuerpos para la extracción del ADN, facilitando así este proceso, y realizando
posteriormente la amplificación (Lee 1999). El PCR comparativo también ha sido
empleado para aumentar la sensibilidad de detección en aquellos casos en que la
concentración del fitoplasma es baja en el hospedero, en este caso el ADN blanco es
coamplificado con un estándar interno de ADN (IS), que compite por los cebadores, la
cuantificación se logra por la comparación del rendimiento relativo de los productos de
PCR amplificados tanto por el IS, como por el ADN de interés (Berges et al. 2000).
Polimorfismo de longitud de fragmentos restringidos (RFLP’s)
En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos
de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere
a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por
las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían
entre individuos (Wikipedia 2009c).
Figura No. 4
Digestión con enzimas de restricción y separación de moléculas por electroforesis
38
Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia,
longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población,
por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción
(Wikipedia 2009c).
En varios grupos sometidos a estudios filogenéticos se ha hecho uso tanto de la
secuenciación como de los análisis por RFLP del ADN ribosomal. El gen 16S rARN
posee tanto un región variable, como una conservada, que lo hace útil para estudios
genómicos. El acceso al gen por medio de su amplificación por PCR, permitió su
posterior análisis mediante RFLP, siendo en la actualidad el método de elección para la
diferenciación de rutina y la clasificación de fitoplasmas. Los RFLP’s también se han
utilizado para el análisis de fragmentos de ADN cromosómico clonado al azar, para
diferenciar fitoplasmas estrechamente relacionados (Seemüler et al. 1998), gracias al uso
de endonucleasas. Recientemente se ha construido un esquema para la clasificación de
fitoplasmas que incluye 14 grupos y 41 subgrupos basándose en esta técnica, debido a
que los patrones de RFLP característicos de cada fitoplasma son reproducibles, haciendo
posible la identificación de fitoplasmas desconocidos (Lee 1999).
II.2.3 Enfermedades causadas por fitoplasmas en papaya
En Australia se han reportado tres fitoplasmas que causan enfermedades en
papaya, yellow crinkle (YC), mosaic (M) y dieback (Siddique 1998). El dieback se
encuentra dentro del subclado xii (el subgrupo stolbur correspondiente al grupo de la
cepa aster yellow), mientras que los fitoplasmas asociados con el YC y el mosaico se
encuentran dentro del subclado iii (Guthrie 1998).
Se ha sugerido que tanto el YC como el mosaico resultan de un complejo de la
enfermedad que involucra a la misma cepa del fitoplasma, diferenciándose por otros
factores tales como otros agentes microbiológicos, edad de la planta hospedera o nivel
del inóculo al momento de la infección (Guthrie 1998). Sin embargo, los estudios de
RFLP’s realizados a partir de la amplificación por PCR no han permitido distinguir entre
los fitoplasmas asociados con las enfermedades de YC y mosaico, en tejidos afectados
(Siddique 1998).
En Australia, el dieback causa del 10 al 100% de la pérdida de las plantaciones en
cualquier estación, mientras YC y el mosaico son enfermedades menos severas. Se ha
observado que dieback presenta una mayor distribución de acuerdo a las estaciones, en
términos de la expresión de síntomas, en dos períodos del año: octubre a noviembre y
marzo a abril. Las epidemias periódicas de YC, usualmente ocurren después del calor,
climas húmedos que favorecen la alimentación y movimiento de los homópteros.
(Guthrie 1998).
Los reportes del período de incubación, primera detección del fitoplasma dentro
de la planta y el comienzo de síntomas visibles varía de acuerdo a la planta, el fitoplasma
y la severidad de los síntomas. El período de incubación se ha atribuido a una etapa de
traslocación y multiplicación del fitoplasma dentro de la planta. La expresión de
39
síntomas en papayas afectadas por YC se da entre 9 y 13 semanas, luego de infección,
en dieback se presenta a las 5 semanas (Guthrie 1998).
Los síntomas típicos de dieback incluyen ramificación en las hojas de los
extremos, enrollamiento en los tejidos apicales y clorosis de las hojas, seguido por la
necrosis basípeta de las hojas jóvenes y de los tejidos del tallo. Las plantas con síntomas
externos visibles también pueden presentar una decoloración café de los tejidos
vasculares, así como la presencia de células de floema necróticas en los tejidos afectados
(Siddique 1998).
II.3.1 Pruebas estadísticas para la validación de técnicas de diagnóstico
Es evidente que una buena prueba diagnóstica es la que ofrece resultados positivos
en individuos enfermos y negativos en sanos (en este caso en específico plantas de
papaya) (Pita S. y Pértigas S. 2003).
Por lo tanto, las condiciones que deben ser exigidas a un test son (Pita S. y Pértigas
S. 2003):
Validez: Es el grado en que un test mide lo que se supone que debe medir. ¿Con qué
frecuencia el resultado del test es confirmado por procedimientos diagnósticos más
complejos y rigurosos? La sensibilidad y la especificidad de un test son medidas de su
validez.
Reproductividad: es la capacidad del test para ofrecer los mismos resultados cuando se
repite su aplicación en circunstancias similares. La variabilidad biológica del hecho
observado, la introducida por el propio observador y la derivada del propio test,
determinan su reproductividad.
Seguridad: La seguridad viene determinada por el valor predictivo de un resultado
positivo o negativo. ¿Con qué seguridad un test predecirá la presencia o ausencia de
enfermedad? Ante un resultado positivo de un test ¿qué probabilidad existe de que este
resultado indique presencia de la enfermedad? Estando esta probabilidad muy
influenciada por la prevalencia de la patología.
II.3.1.1 La validez de una prueba diagnóstica: Sensibilidad y especificidad
El caso más sencillo que se puede plantear es el de una prueba dicotómica, que
clasifica a cada individuo como sano o enfermo en función de que el resultado de la
prueba sea positivo o negativo. En casos como éste, generalmente un resultado positivo
se asocia con la presencia de enfermedad y un resultado negativo con la ausencia de la
misma. Cuando se estudia una muestra de individuos, los datos obtenidos permiten
clasificar a los sujetos en cuatro grupos según una tabla 2x2 como la que se muestra en el
cuadro a continuación (Pita S. y Pértigas S. 2003).
40
Cuadro No. 26
Relación entre el resultado de una prueba diagnóstica y la presencia o ausencia de
una enfermedad.
Resultado de la prueba Verdadero diagnóstico
Enfermo Sano
Positivo Verdaderos Positivos
(VP)
Falsos Positivos
(FP)
Negativo Falsos Negativos
(FN)
Verdaderos Negativos
(VN)
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
En ésta, se enfrenta el resultado de la prueba diagnóstica (en filas) con el estado
real de los individuos (en columnas) o, en su defecto, el resultado de la prueba de
referencia o “gold standard” que vayamos a utilizar. El resultado de la prueba puede ser
correcto (verdadero positivo y verdadero negativo) o incorrecto (falso positivo y falso
negativo). El análisis de su validez puede obtenerse calculando los valores de
sensibilidad y especificidad (Pita S. y Pértigas S. 2003).
Sensibilidad
Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la
probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado
positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la
enfermedad (Pita S. y Pértigas S. 2003).
Cuando los datos obtenidos a partir de una muestra de individuos se clasifican en
una matriz como la mostrada con anterioridad, es fácil estimar a partir de ella la
sensibilidad como la proporción de individuos enfermos que obtuvieron un resultado
positivo en la prueba diagnóstica. Es decir:
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
De ahí que también la sensibilidad se conozca como “fracción de verdaderos positivos
(FVP)” (Pita S. y Pértigas S. 2003).
Especificidad
Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la
probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. En otras
palabras, se puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a los sanos. A
partir de la matriz de resultados de la prueba diagnóstica, la especificidad se estimaría
como:
De ahí que también sea denominada “fracción de verdaderos negativos (FVN)” (Pita S. y
Pértigas S. 2003).
41
II.3.1.2 La seguridad de una prueba diagnóstica: Valores predictivos
Los conceptos de sensibilidad y especificidad permiten, por lo tanto, valorar la
validez de una prueba diagnóstica. Sin embargo, carecen de utilidad en la práctica. Tanto
la sensibilidad como la especificidad proporcionan información acerca de la probabilidad
de obtener un resultado concreto (positivo o negativo) en función de la verdadera
condición del hospedero con respecto a la enfermedad. Así, por ejemplo, cuando a una
persona se le realiza alguna prueba, el médico carece de información a priori acerca de
su verdadero diagnóstico, y más bien la pregunta se plantea en sentido contrario: ante un
resultado positivo (negativo) en la prueba, ¿cuál es la probabilidad de que el individuo
esté realmente enfermo (sano)?. De esta forma los valores predictivos juegan un papel
importante para la interpretación de la sensibilidad y especificidad de las pruebas, siendo
un complemento importante de las mismas (Pita S. y Pértigas S. 2003).
Valor predictivo positivo
Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en
el test. El valor predictivo positivo puede estimarse, por tanto, a partir de la proporción
de individuos con un resultado positivo en la prueba que finalmente resultaron estar
enfermos:
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
Valor predictivo negativo
Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté
realmente sano. Se estima dividiendo el número de verdaderos negativos entre el total de
individuos con un resultado negativo en la prueba:
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
II.3.1.3 La influencia de la prevalencia
Aún cuando los valores de sensibilidad y especificidad definen completamente la
validez de la prueba diagnóstica, presentan la desventaja de que no proporcionan
información relevante a la hora de tomar una decisión ante un determinado resultado de
la prueba. Sin embargo, tienen la ventaja adicional de que son propiedades intrínsecas a
la prueba diagnóstica, y definen su validez independientemente de cuál sea la
prevalencia de la enfermedad en la población a la cual se aplica (Pita S. y Pértigas S.
2003).
Por el contrario, el concepto de valores predictivos, a pesar de ser de enorme
utilidad a la hora de tomar decisiones y transmitir a los productores información sobre
sus diagnósticos, presenta la limitación de que dependen en gran medida de lo frecuente
que sea la enfermedad a diagnosticar en la población objeto de estudio. Cuando la
prevalencia de la enfermedad es baja, un resultado negativo permitirá descartar la
42
enfermedad con mayor seguridad, siendo así el valor predictivo negativo mayor. Por el
contrario, un resultado positivo no permitirá confirmar el diagnóstico, resultando en un
bajo valor predictivo positivo (Pita S. y Pértigas S. 2003).
II.3.1.4 Razones de probabilidad
Debido a que la prevalencia es un factor determinante en los valores predictivos de
un test, éstos no pueden ser utilizados como índices a la hora de comparar dos métodos
diagnósticos diferentes, ni tampoco a la hora de extrapolar los resultados de otros
estudios a datos propios. Por ello, resulta necesario determinar otros índices de
valoración que sean a la vez clínicamente útiles y no dependan de la prevalencia de la
enfermedad en la población a estudiar. Así, además de los conceptos de sensibilidad,
especificidad y valores predicitivos, se suele hablar del concepto de razón de
verosimilitudes, razón de probabilidad, o cociente de probabilidades. Estos miden
cuánto más probable es un resultado concreto (positivo o negativo) según la presencia o
ausencia de enfermedad (Pita S. y Pértigas S. 2003):
Razón de verosimilitudes positiva o cociente de probabilidades positivo: se
calcula dividiendo la probabilidad de un resultado positivo en los individuos enfermos
entre la probabilidad de un resultado positivo entre los sanos. Es, en definitiva, el
cociente entre la fracción de verdaderos positivos (sensibilidad) y la fracción de falsos
positivos (1-especificidad):
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
Razón de verosimilitudes negativa o cociente de probabilidades negativo: se
calcula dividiendo la probabilidad de un resultado negativo en presencia de enfermedad
entre la probabilidad de un resultado negativo en ausencia de la misma. Se calcula por lo
tanto, como el cociente entre la fracción de falsos negativos (1-sensibilidad) y la fracción
de verdaderos negativos (especificidad):
(Pita S. y Pértigas S. 2003)
La razón de probabilidades ofrece la ventaja de que relaciona la sensibilidad y la
especificidad de una prueba en un solo índice. Además, pueden obtenerse razones de
probabilidad según varios niveles de una nueva medida y no es necesario expresar la
información de forma dicotómica, como resultado de normal o anormal o bien positivo y
negativo. Por último, al igual que sucede con la sensibilidad y la especificidad, no varía
con la prevalencia. Esto permite utilizarlo como índice de comparación entre diferentes
pruebas para un mismo diagnóstico (Pita S. y Pértigas S. 2003).
En definitiva, es sumamente importante el saber valorar la validez y seguridad de
las diferentes pruebas diagnósticas con el fin de seleccionar la más adecuada en cada
momento. La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos son los criterios
tradicionalmente utilizados para valorar la capacidad predictiva de un test. Los estudios
43
de evaluación de tests diagnósticos son el instrumento adecuado para obtener esta
información. No obstante, no debemos olvidar que existen determinados aspectos en el
diseño de este tipo de investigaciones que pueden afectar a la precisión y a la validez de
las estimaciones realizadas. Una vez más, el cálculo de intervalos de confianza puede
ayudarnos a conocer la precisión de los índices calculados. La población de estudio, la
estrategia de muestreo, la selección del criterio de referencia y la forma de aplicación de
las pruebas diagnósticas serán algunos de los elementos a cuidar para evitar la presencia
de sesgos (Pita S. y Pértigas S. 2003).
44
PARTE III
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El fitoplasma es uno de los patógeno más difíciles de estudiar a nivel de cultivos, ya
que debido a su naturaleza (bacteria sin pared celular), tanto su aislamiento como cultivo
o reproducción in vitro no son posibles con métodos tradicionales. El ADN de estas
bacterias fastidiosas es sumamente lábil. Uno de los objetivos más ambiciosos del
estudio buscaba la estandarización de un método de laboratorio en el que se evitará la
extracción del ADN del parásito, empleando de forma directa el tejido infectado de la
planta fijada a una membrana de nylon cargada positivamente. Sin embargo, no se
obtuvieron resultados satisfactorios debido a la fatla de sensibilidad y especificadad del
método. En las secciones a continuación se expone el trabajo realizado a lo largo del
proyecto, los resultados obtenidos y las posibles sugerencias para mejorar el estudio.
III. 1 RESULTADOS
III.1.1 Extracción y cuantificación de ADN
En el cuadro 27 se muestran los valores de absorbancia obtenidos luego de
extraer el ADN de las muestras trabajadas, así como los valores de pureza y
concentración obtenidos a partir de estas absorbancias.
Cuadro No. 27
Valores de Absorbancia obtenidos para las muestras trabajadas mediante
Espectrofotometría UV, así como el respectivo cálculo de pureza y concentración
Muestra Absorbancias Pureza
Concentración
[ng/ul] No. Código A260 A280 A320
1 1 0.269 0.17 0.077 2.1 960.0
2 2 0.313 0.195 0.088 2.1 1125.0
3 3 0.194 0.141 0.083 1.9 555.0
4 4 0.21 0.133 0.063 2.1 735.0
5 5 0.337 0.205 0.082 2.1 1275.0
6 6 0.181 0.107 0.042 2.1 695.0
7 7 0.333 0.205 0.091 2.1 1210.0
8 8 0.143 0.089 0.04 2.1 515.0
9 9 0.185 0.113 0.053 2.2 660.0
45
Muestra Absorbancias Pureza
Concentración
[ng/ul] No. Código A260 A280 A320
10 10 0.234 0.141 0.047 2.0 935.0
11 11 0.232 0.127 0.04 2.2 960.0
12 12 0.284 0.167 0.057 2.1 1135.0
13 13 0.28 0.167 0.07 2.2 1050.0
14 14 0.234 0.147 0.063 2.0 855.0
15 15 0.207 0.128 0.058 2.1 745.0
16 16 0.244 0.138 0.047 2.2 985.0
17 17 0.222 0.14 0.061 2.0 805.0
18 18 0.192 0.111 0.041 2.2 755.0
19 19 0.281 0.156 0.05 2.2 1155.0
20 20 0.232 0.119 0.03 2.3 1010.0
21 21 0.128 0.076 0.029 2.1 495.0
22 22 0.329 0.196 0.079 2.1 1250.0
23 23 0.259 0.159 0.073 2.2 930.0
24 24 0.256 0.153 0.061 2.1 975.0
25 25 0.294 0.174 0.079 2.3 1075.0
26 26 0.141 0.08 0.027 2.2 570.0
27 27 0.376 0.243 0.116 2.0 1300.0
28 28 0.324 0.201 0.091 2.1 1165.0
29 29 0.296 0.205 0.117 2.0 895.0
30 30 0.157 0.096 0.039 2.1 590.0
31 31 0.308 0.183 0.072 2.1 1180.0
32 32 0.347 0.218 0.093 2.0 1270.0
33 33 0.297 0.181 0.077 2.1 1100.0
34 34 0.264 0.187 0.104 1.9 800.0
35 35 0.287 0.171 0.069 2.1 1090.0
36 36 0.112 0.085 0.051 1.8 305.0
37 37 0.245 0.165 0.085 2.0 800.0
38 38 0.293 0.179 0.074 2.1 1095.0
39 39 0.262 0.164 0.073 2.1 945.0
40 40 0.302 0.202 0.105 2.0 985.0
41 41 0.131 0.092 0.049 1.9 410.0
42 42 0.17 0.119 0.063 1.9 535.0
43 43 0.18 0.122 0.057 1.9 615.0
44 44 0.184 0.119 0.056 2.0 640.0
45 45 0.354 0.26 0.151 1.9 1015.0
46 46 0.174 0.116 0.058 2.0 580.0
47 47 0.317 0.214 0.112 2.0 1025.0
48 48 0.417 0.274 0.132 2.0 1425.0
49 49 0.322 0.212 0.096 1.9 1130.0
50 50 0.259 0.189 0.112 1.9 735.0
46
Muestra Absorbancias Pureza
Concentración
[ng/ul] No. Código A260 A280 A320
10 10 0.234 0.141 0.047 2.0 935.0
11 11 0.232 0.127 0.04 2.2 960.0
12 12 0.284 0.167 0.057 2.1 1135.0
51 51 0.166 0.114 0.059 1.9 535.0
52 52 0.392 0.225 0.082 2.2 1550.0
53 53 0.2 0.127 0.054 2.0 730.0
54 54 0.225 0.133 0.052 2.1 865.0
55 55 0.265 0.157 0.057 2.1 1040.0
56 56 0.294 0.189 0.079 2.0 1075.0
57 57 0.347 0.196 0.067 2.2 1400.0
58 58 0.284 0.164 0.054 2.1 1150.0
59 59 0.154 0.095 0.041 2.1 565.0
60 60 0.159 0.108 0.055 2.0 520.0
61 C+3 0.007 0.004 0.001 2.0 30.0
62 C+4 0.005 0.004 0.002 1.5 15.0
63 C+5 0.011 0.006 0.001 2.0 50.0
64 C+6 0.01 0.005 0.001 2.3 45.0
65 H1 0.202 0.187 0.137 1.3 325.0
66 H2 0.025 0.018 0.001 1.4 120.0
67 H3 0.244 0.233 0.167 1.2 385.0
68 M1 0.053 0.047 0.031 1.4 110.0
69 M2 0.047 0.039 0.032 2.1 75.0
70 M3 0.041 0.038 0.034 1.8 35.0
71 C1 0.007 0.005 0.003 2.0 20.0
72 C2 0.002 0.001 0 2.0 10.0
73 C3 0.005 0.004 0.002 1.5 15.0
74 C4 0.004 0.003 0.001 1.5 15.0
75 C5 0.003 0.002 0 1.5 15.0
III.1.2 Detección de fitoplasmas mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y la reacción en cadena de la polimerasa anidada (nPCR)
La detección inicial de fitoplasma en las muestras se hizo mediante PCR
convencional y nPCR, a fin de comparar los resultados obtenidos con esta técnica con
los obtenidos empleando el método de hibridización de ácidos nucleicos con sondas no
radiactivas. Las figuras 5 y 6 ejemplifican la identificación de productos amplificados
con PCR y nPCR respectivamente. En el cuadro 28 se resumen los resultados obtenidos
al emplear nPCR para la detección de fitoplasma en las muestras colectadas. A partir de
los resultados obtenidos con la amplificación de fitoplasma con nPCR fue posible
calcular la prevalencia de éste patógeno en la finca A, este valor se muestra en el cuadro
29.
47
Figura No. 5
Productos de la amplificación de fitoplasmas para muestras de papaya mediante PCR
utilizando la combinación de iniciadores universales P1/P7
Gel de agarosa al 1.6%, teñido con bromuro de etidio. Cada pozo fue cargado con 8ul de muestra de la
siguiente forma: Marcador molecular, PCR Markers de 50 lanes marca Novagen (pozo 13 fila 1 y pozo 2 en fila
2), vacíos (pozos 14 al 16 de la fila 1, pozos 8 al 16 de la fila 2), muestras amplificadas por PCR de ~1500 bp
(pozos 1 al 12 de la fila 1 y 3 al 7 de la fila 2).
Figura No. 6
Productos de la amplificación de fitoplasmas para muestras de papaya mediante nPCR
utilizando la combinación de iniciadores R16F2n/R2 para la región exterior y fU5/rU3
para la sección interna.
Gel de agarosa al 1.6%, teñido con bromuro de etidio. Cada pozo fue cargado con 8ul de muestra de la
siguiente forma tanto en la fila 1 como en la 2: Marcador molecular, PCR Markers de 50 lanes marca Novagen
(pozo 1), vacíos (pozos 2,5,8,11 y 14), muestras amplificadas por nPCR de ~780 bp (pozos 3,4,6,7,9,10,12,13,15
y 16).
48
Cuadro No. 28
Determinación de presencia de fitoplasma en las muestras de papaya colectadas y
los controles positivos, mediante nPCR
Muestra Diagnóstico Muestra Diagnóstico Muestra Diagnóstico
1 + 26 - 51 -
2 + 27 - 52 -
3 + 28 - 53 -
4 + 29 - 54 -
5 + 30 - 55 +
6 + 31 - 56 -
7 + 32 - 57 -
8 - 33 + 58 -
9 - 34 + 59 -
10 + 35 + 60 -
11 - 36 - C+3 +
12 + 37 - C+4 +
13 - 38 - C+5 +
14 - 39 - C+6 +
15 + 40 - H1 -
16 + 41 - H2 -
17 - 42 - H3 -
18 - 43 - M1 -
19 + 44 - M2 -
20 - 45 - M3 -
21 - 46 - C1 -
22 + 47 - C2 -
23 - 48 - C3 -
24 - 49 - C4 -
25 - 50 - C5 - ***La nomenclatura de las muestras utilizadas se encuentra descrita en la sección de anexos
Cuadro No. 29
Valor de prevalencia de fitoplasma para muestras colectadas en Retalhuleu, en la
finca A
Prevalencia 0.283 Porcentaje de prevalencia 28.3% ***Para que la población de estudio fuera válida, es necesario que los miembros empleados para el
análisis estadístico posean las mismas condicones físicas y químicas en el cultivo a estudio así como
ser un número representativo. En base a esto, se tomó solamente la finca A para obtener este
valor, ya que la mayor parte de las muestras colectadas pertenecían a este lugar.
49
III.1.3 Estandarización y validación del método de hibridización con sondas no
radioactivas para la detección de fitoplasmas en papaya
En las secciones a continuación se describen los resultados obtenidos en el
proceso de laboratorio durante la estandarización del método de hibridización con
sondas no radioactivas para la detección de fitoplasmas. Así mismo, se muestran los
resultados obtenidos del análisis estadístico empleado con las muestras de papaya
analizadas, para la validación del método. La discusión de cada uno de estos aspectos
se muestra en la sección III.2. La metodología final empleada no se detalla en los
resultados, ya que los protocolos utilizados se han descrito en detalle en la sección de
metodología.
III.1.3.1 Marcado de sondas
Las sondas empleadas durante el procedimiento fueron obtenidas del marcaje
(ver metodología) de los productos de PCR y nPCR para fitoplasma. La medición de
eficiencia del marcaje (figura 7) permite conocer si la sonda puede o no emplearse para
el proceso de hibridización.
Figura No. 7
Membranas empleadas para la medición de la eficiencia del marcaje en la sondas
III.1.3.2 Temperatura de hibridización
En la figura 8 y 9 se muestran las pruebas realizadas para el método de
hibridización, en las que la temperatura es el factor en estudio. La figura 8 muestra los
resultados obtenidos luego de emplear el método de hibridización a diferentes
temperaturas, a fin de conocer la temperatura más adecuada. Así, la temperatura de
46 ºC fue el que presentó los mejores resultados. Por otra lado, la figura 9 muestra los
dos tipos de sondas probadas (ver figura 7), a la temperatura de hibridización final, con
la finalidad de observar diferencias y similitudes.
50
Figura No. 8
Membranas utilizadas para la estandarización de la temperatura de hibridización.
En las membranas anteriores el C+2 corresponde a un control positivo para fitoplasma, y el C- a
ADN de papaya libre del patógeno, C+ de ADN corresponde a ADN de geminivirus, Buf al buffer
empleado para la extracción del material genético y el Bla a agua destilada. En el caso de las
membranas que no presentan circunferencias para indicar la positividad, los signos (+) lo
simbolizan.
Figura No. 9
Comparación de las dos sondas utilizadas para la detección de fitoplasma en
muestras de papaya un Tm de 46 ºC
***El procedimiento se llevó a cabo en duplicado empleando ADN de mosca con presencia de (C+
ADN) y ausencia de geminivirus (C- ADN), a fin de evaluar las posibles reacciones cruzadas. El
Control positivo correspondía a una muestra de papaya que era positiva para la presencia de
fitoplasma con PCR y nPCR (C+).
III.1.3.3 Límite de detección
La figura 10 muestra los resultados obtenidos al realizar el proceso de
hibridización con 3 muestras positivas con diferentes diluciones, y llevando a cabo el
proceso en triplicadol. La elaboración de diluciones permitió evaluar el límite de
detección de la prueba de hibridización con sondas no radioactivas para la detección de
fitoplasmas.
51
Figura No. 10
Diluciones en agua de ADN extraído para diversas muestras positivas y reveladas
con las sonda del producto de PCR
Las membranas anteriores corresponden a diluciones de las muestras 4, 16 y 22
respectivamente (trabajadas en triplicado), siendo t1 la primera dilución y t14 la última, con las
siguientes concentraciones en orden descendente: 15ng/ul, 5ng/ul, 1ng/ul, 0.1ng/ul, 0.01ng/ul,
5pg/ul, 3pg/ul, 1pg/ul, 0.5pg/ul, 0.3pg/ul, 0.1pg/ul, 0.05pg/ul, 0.03pg/ul, y 0.01pg/ul. Siendo el
límite de detección en esta caso de 5ng/ul.
Las membranas anteriores corresponden a diluciones de las muestras 29, 34 y 35
respectivamente (trabajadas en triplicado), siendo t1 la primera dilución y t14 la última, con las
siguientes concentraciones en orden descendente: 100ng/ul, 50ng/ul, 25ng/ul, 15ng/ul, 5ng/ul,
1ng/ul, 0.1ng/ul, 0.01ng/ul, 5pg/ul, 3pg/ul, 1pg/ul, 0.5pg/ul, 0.3pg/ul y 0.1pg/ul. Siendo el límite
de detección en esta caso de 5ng/ul.
III.1.3.4 Corrida de muestras en membrana de nitrocelulosa y de papel
En este apartado se muestran los resultados de laboratorio obtenidos al analizar
las muestras de papaya con la técnicaz de hibridización con sondas no radioactivas. La
figura 11 muestra los resultados obtenidos al comparar el método de hibridización con
sondas no radioactivas empleando membranas de nitrocelulosa y de papel. Por otro lado
los resultados finales obtenidos para todas las muestras recolectadas se pueden ver en la
figura 12.
52
Figura No. 11
Resultados obtenidos para la presencia de fitoplasma en papayas de variedad hawaiana,
criolla y maradol empleando membranas de nitrocelulosa y papel, mediante hibridización
de sondas no radioactivas
*** Los resultados obtenidos se basan en el empleo tanto de la sonda del producto de PCR como de nPCR. Las
membranas de nitrocelulosa se trabajaron en triplicado, mientras que las de papel en duplicado, siendo el
mapa mostrado en la parte superior el orden en que las muestras fueron colocadas.
Figura No. 12
Resultados obtenidos para la presencia de fitoplasma en la población de cultivo de papaya
criolla muestreada, mediante hibridización de sondas no radioactivas
*** La sonda utilizada corresponde al producto de PCR, el proceso se hizo en duplicado.
53
III.1.3.5 Pruebas estadísticas
En base a los resultados obtenidos para la detección de fitoplasmas tanto por nPCR como
por hibridización, se realizaron los análisis estadísticos pertinentes a la validación de un método.
Las pruebas estadísticas empleadas (ver metodología) se muestran en los cuadros 30 al 32. La
información en estos cuadros sugiere que existe poca especificidad hacia la detección de
fitoplasmas, con la sonda elaborada a partir del producto de amplificación con los iniciadores
universales P1/P7, por lo que no es posible validar este método de diagnóstico de fitoplasmas.
Cuadro No. 30
Resultados del diagnóstico de fitoplasmas mediante hibridización con sondas no
radioactivas tomando como prueba de referencia, el diagnóstico de fitoplasmas mediante
nPCR
Resultado de la prueba Criterios de Verdad Total
Enfermos No enfermos
Positivos 20 38 58
Negativos 1 16 17
Total 21 54 75 ***Las sonda utilizada en este caso es el producto de PCR amplificado con los iniciadores universales P1/P7 y
marcada con dioxigenina.
Cuadro No. 31
Valores de las pruebas estadísticas realizadas para la validación de la técnica de
hibridización con sondas no radioactivas pre – prueba (sin relacionar la prevalencia del
patógeno a los parámetros estadísticos), tomando como prueba de referencia, el
diagnóstico de fitoplasma mediante nPCR
Prueba
estadísticas
Valor
estimado
Porcentaje
estimado
Intervalo de confianza del 95%
Sensibilidad 0.95 95% 0.86 – 1.04
Especificidad 0.30 30% 0.17 – 0.42
VPP 0.34 34% 0.22 – 0.47
VPN 0.94 94% 0.83 – 1.05
RV+ 1.35 ---- 1.11 – 1.65
RV- 0.16 ---- 0.02 – 1.14 ***Las sonda utilizada en este caso es el producto de PCR amplificado con los iniciadores universales P1/P7 y
marcada con dioxigenina
Cuadro No. 32
Valores de las pruebas estadísticas realizadas para la validación de la técnica de
hibridización con sondas no radioactivas post – prueba (relacionando la prevalencia del
patógeno a los parámetros estadísticos), tomando como prueba de referencia, el
diagnóstico de fitoplasma mediante nPCR
Prueba estadística Valor estimado Porcentaje estimado
Probabilidad de resultados positivo VPP 0.35 35%
Probabilidad de resultado negativoVPN 0.06 6%
RV+ 1.36
RV- 0.17 ***Las sonda utilizada fue el producto de PCR amplificado con los iniciadores universales P1/P7 y marcado
con dioxigenina.
***Para que la población sea estadísticamente representativa de una población en estudio, debe presentares
individuos con condiciones físicas y químicas iguales o similares, por lo que solamente se tomó en cuenta al fina
A para el cálculo de este valor.
54
III.1.4 Caracterización de fitoplasmas encontrados en las muestras mediantes
RFLP’s
Con el fin de caracterizar los fitoplasmas detectados mediante nPCR, se efectuó la una
digestión enzimática de los productos de amplificación para luego visualizarlos mediante
electroforesis. Los resultados obtenidos se muestran las figuras 13 a la 16 y en el cuadro 33.
Figura No. 13
Migración del ADN de las muestras positivas para fitoplasma en gel de agarosa
Gel de agarosa al 1.6%, teñido con bromuro de etidio. Cada pozo fue cargado con 8ul de muestra de la
siguiente forma: Marcador molecular, PCR Markers de 50 lanes marca Novagen (pozo 1 de la fila 1 y 2),
vacíos (pozos 5 al 7 y 12 al 16 de la fila 2), ADN de muestras extraídas (pozos 2 al 16 de la fila 1 y 2,3,4,8,9,10 y
11 de la fila 2).
Figura No. 14
Gel de agarosa empleado para visualizar RFLP’s de los fitoplasmas amplificados
mediante nPCR
Geles de agarosa al 3%, teñido con bromuro de etidio. Las bandas típicas del marcador molecular de 50 bp se
encuentran señalados con flechas, cada pozo fue cargado con 22ul de muestra de la siguiente forma: Marcador
molecular, 50 bp de Promega (pozo 1 y 16 del gel mostrado a la derecha, mientras en el de la izquierda se
encuentran en los pozos 1 y 12), vacíos (pozos 13 al 16 del gel de la derecha), muestras de papaya digeridas con
enizmas de restricción; Taq I (pozos 2 al 15 del gel de la izquierda y del 2 al 11 en el de la derecha).
55
Figura No. 15
Gel de poliacrilamida al 6% empleado para visualizar RFLP’s de los fitoplasmas
amplificados por nPCR con las enzimas de restricción Tru9 I y Alu I
Gel de poliacrilamida al 6% (19:1 acrilamida:bis-acrilamida), teñido con plata, las bandas típicas del marcador
molecular de 50 bp se encuentran señalados con flechas verticales, mientras las bandas obtenidas están con
flechas horizontales. Cada pozo fue cargado con 6ul de la siguiente forma: Marcador molecular (pozo 1 y 29),
vacío (pozos 2, 6, 7, 28, 30, 43, 44 y 49), muestras de papaya digeridas con enzimas de restricción; Tru9I (pozos
3, 4, 5, del 8 al 27), Alu I (pozoas 31 al 42, y 45 al 48).
Cuadro No. 33
Tamaño aproximado ( bp) de las bandas obtenidas en las muestras de papaya luego
de 3.5 horas de digestión con enzima Tru9I. Ver regresión lineal usada en Anexo D.
Pozo de las muestras
4 5 27
Distancia de
migración y masas
moleculares de las
bandas
(cm) (bp) (cm) (bp) (cm) (bp)
8 863 8 863 6.2 947
8.2 854 8.2 854 6.4 937
12.8 642 13 632 7.3 896
7.7 877
7.9 868
8 863 ***Los pozos descritos corresponden a las siguientes muestras: 4 (MM 50 bp digerido con Tru9I), 5
y 27 (muestras 1 y C+6E respecstivamente, diregidas con Tru9I).
56
Figura No. 16
Gel de poliacrilamida al 6% empleado para visualizar RFLP’s d los fitoplasmas
amplificados por nPCR con las enzimas de restrición Tru9 I, Rsa I y Alu I
Gel de poliacrilamida al 6% (19:1 acrilamida:bis-acrilamida), teñido con plata, las bandas típicas del marcador
molecular de 50 bp se encuentran señalados con flechas. Cada pozo fue cargado con 6ul de la siguiente forma:
Marcador molecular (pozo 1, 13 y 41), vacío (pozos 2, 12, 14, 38, 39, 40 y 42), muestras de papaya digeridas con
enzimas de restricción; Alu I (pozos del 3 al 11), Rsa I (pozos del 15 al 37), Tru9 I (pozos del 43 al 49).
III.1.5 Análisis de costos de la prueba de hibridización con sondas no radioactivas
El cuadro 34 muestra el valor obtenido, en quetzales, para el cálculo comprativo
de costos entre la hibridización con sondas no radiactivas y el PCR.
Cuadro No. 34
Comparación de costos entre el método evaluado (hibridización) y el método de diagnóstico
empleado como referencia (PCR)
Método Precio por muestra
Hibridización de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas Q. 3.38
Reacción en cadena de la polimerasa Q. 3.86
NOTA: El ánalisis de costos realizado en la tabla anterior no incluyen los gastos concernientes a la
depreciación de equipo, ni los relacionados con los gastos de servicios (agua, luz, mobiliario, etc.) o utilización
de las instalaciones físicas.
57
III. 2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.2.1 Extracción y cuantificación de ADN
El proceso de extracción de ADN permitió obtener tanto una alta concentración
de ADN como de pureza en la mayoría de las muestras trabajadas, tal como se muestra
en el cuadro No. 27. Es importante recordar que la estanarización de un método de
biología molecular depende en mucho de la calidad del ADN a trabajar. Una de las
dificultades del estudio residió en la labilidad del ADN del patógeno, ya que varios
momentos en los que se había progresado, exigió la repetición de los procedimientos.
El ADN de fitoplasma posee una corta vida útil aún bajo rigurosas condiciones
de almacenamiento, a diferencia de otros materiales genéticos como el de planta. Los
valores mostrados en el cuadro No. 27 permiten observar la efectividad del método
empleado para obtener una calidad de ADN adecuada para el trabajo en laboratorio.
Debe recordarse que estos valores no corresponden en su totalidad al ADN de
fitoplasma, ya que el método espectrofotométrico usado sólo mide la absorbancia de
ADN sin hacer distinción de su origen, por lo que parte de éste es resultado del material
genético contenido en el tejido vegetal del que el fitoplasma fue extraído.
III.2.2 Detección de fitoplasma mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) la reacción en cadena de la polimerasa anidada (nPCR)
Al momento de plantear la implementación de un nuevo método de detección de
fitoplasma en cultivos de papaya, se estableció como “gold estándar” la técnica que hasta
el momento se había empleado en el laboratorio para la detección del mismo. En las
figuras No. 5 y 6 se muestran las bandas características de fitoplasma, luego de la
amplificación con cada uno de los métodos y el empleo de electroforesis horizontal para
su visualización.
Tal como puede apreciarse en las figuras antes mencionadas, las bandas
obtenidas muestran una diferencia significativa con las bandas teóricamente obtenidas en
la amplificación de estos iniciadores. Es decir, en el caso del PCR las bandas deberían
corresponder a un producto de aproximadamente 1.80Kb mientras que el producto
obtenido es de aproximadamente 1.5Kb, de igual forma el producto esperado para el
nPCR es de aproximadamente 850 bp y se obtuvo un producto de aproximadamente 100
bp menos. Debido a que tanto la diferencia de bases era menor como a que las bandas
obtenidas eran más definidas y con menor cantidad de productos secundarios se eligió el
uso del nPCR como guía para la determinación de muestras positivas, pero de igual
forma se le corrió un PCR general (inciadores P1/P7) a todas las muestras trabajadas.
58
Los cuadros No. 28 y 29 muestran los resultados obtenidos para la presencia de
fitoplasma en las muestras trabajadas, así como los resultados de los controles positivos
y negativos empleados para el dot blot.
En este último cuadro (No. 29) se resume el porcentaje de muestras positivas
encontradas para la población de muestras del cultivo de papaya muestreada. Si se
multiplica el valor de prevalencia obtenido por 100%, se puede observar que el 28% de
las muestras recolectadas en la finca A (60 muestras), presentaban presencia de
fitoplasma aún cuando ninguna de la plantas presentaban síntomas característicos de la
presencia del patógeno, sino más bien de virus tales como PRSV. Este dato sugiere que
existe una infección del cultivo de papaya en Guatemala, y que por tanto la realización
de estudios posteriores es de gran relevancia para el país.
Debido a que los fitoplasmas pueden ser devastadores en un cultivo porque hasta
la fecha el único tratamiento empleado es la poda, la continuación del estudio de este
patógeno es de vital relevancia para conocer el impacto del patógeno, así como
información relacionada con su transmisión (posibles vectores) y la relación con sus
hospederos. Por otro lado, este estudio arroja datos preliminares sobre la presencia de
esta bacteria fastidiosa en poblaciones de papaya en la costa sur de Guatemala, publicado
y de acceso abierto para toda la población mediante CONCYT. Así, estos resultados
representan el primer paso en pro de la investigación sobre patógenos poco mencionados
en papaya, con cuál podrá dársele mayor relevancia al tema permitiendo a largo plazo
beneficiar a los productores de la región. Por otro lado, el dato de prevalencia será de
gran ayuda al momento de estudios posteriores o implementación de nuevos métodos de
estudio y detección, ya que será la base para la aplicación de pruebas estadísticas.
Es importante destacar, que los resultados obtenidos sugieren la presencia de
fitoplasma en una plantación sin sintomatología aparente, por lo que sería interesante
conocer si existe algún tipo de resistencia de la papaya criolla en la región de la costa sur
a dicho procariota. En este estudio también se recomienda mandar a secuenciar los
productos de PCR obtenidos a fin de confirmar totalmente la presencia de fitoplasma de
forma más certera, ya que los tamaños de los productos amplificados con los iniciadores
utilizados poseen valores diferentes a los reportados en la literatura.
Cabe mencionar, que la(s) especie(s) de fitoplasma presentes en el país, podrían
ser no conocidas o variantes, por lo que podría incidir de forma directa sobre el tamaño
de los productos amplificados por PCR y nPCR, lo que nuevamente podría corroborarse
con la secuenciación, ya que la caracterización de éstos no fue posible mediante los
RFLP’s realizados a partir de los productos del nPCR.
Por útlimo, los iniciadores empleados en la segunda reacción del nPCR
(fU5/rU3), han sido útiles para detectar un amplio rango de fitoplasmas (Lorenz K. et al.
1995), pero aún así siguen siendo selectivos para un rango, por lo que es probable que la
prevalencia pueda ser aún más alta, debiendo buscarse otro tipo de primers que puedan
brindar ese tipo de información, tales como los reportados por Smart D. et al. en el año
1996.
59
III.2.3 Estandarización y Validación del método de Hibridización con sondas no
radioactivas para la detección de fitoplasma en papaya
Las figuras y cuadros representativos de esta sección presentan los resultados
obtenidos para el proceso de estandarización y validación del método de hibridización
(dot blot), debido a que las figuras fueron escaneadas a partir del cuaderno de trabajo de
laboratorio, la visualización de las muestras positivas resulta difícil en algunos casos
pero se indica en la mayoría de ellos por la presencia de un signo más (+) o negativo (-)
sino hubo reacción alguna.
III.2.3.1 Marcado de sondas
En la figura No. 7 puede observarse una serie de diluciones realizadas con las
sondas marcadas a partir de muestras positivas para PCR y de bandas únicas, cuyos
productos fueron purificados para su posterior marcaje. En este caso sólo se probó
estandarizar el procedimiento con las muestras presentadas en las dos filas inferiores de
la membrana de la izquierda y la sonda colocada en la membrana de la derecha. La
razón por la cuál se tomó dicha decisión, se debe a que solo éstas presentaban un nivel
de detección de 0.1pg/ul, lo que es un indicativo de un marcaje eficiente.
Debe notarse, que junto a las sondas fijadas en las membranas se colocó un
control positivo de marcaje que posee el kit y que como puede verse en la membrana de
la derecha, presentó el mismo nivel de positividad que las sondas a probar. De igual
forma, se colocó un control positivo que poseía ADN de papaya pero no tuvo
amplificación para fitoplasma, y tal como se observa (ver membrana de la derecha), no
presentó marcaje alguno puesto que se esperaba que al purificarse la resuspensión
quedará libre de ADN.
Tal como se discute más adelante, es necesaria la estandarización de la
temperatura de hibridización para llevar a cabo la estandarización del método, este
procedimiento se llevó a cabo con la sonda realizada a partir del producto de PCR, luego
de lo cuál se probaron las otras sondas a la misma temperatura para ver su funcionalidad.
III.2.3.2 Temperatura de hibridización
Para llevar a cabo la estandarización de este paso se calculó una temperatura de
hbiridización teórica, basándose en las sencuencias del fitoplasma encontradas en el
GeneBank del NCBI, para la región 16S ribosomal (ver anexo C). Esta temperatura
correpondió a un valor de 46 ºC, a partir de la cuál se eligieron valores más bajos y más
altos a los que se probó la efectividad y sensibilidad del marcarje, tal como se muestra en
la figura No. 8.
60
Tal como puede apreciarse en la figura No. 8, la membrana que posee los
mejores resultados es la de temperatura de 46 ºC, ya que los otros poseen positividad ya
sea con el buffer o con control positivo de ADN, el cuál corresponde a begomovirus por
lo que implica una reacción cruzada con el mismo. Así, se eligió la temperatura de
46 ºC como la idónea para llevar a cabo el proceso de hibridización. Posteriormente se
realizaron pruebas con las diferentes sondas a esta temperatura. La sonda marcada a
partir del producto de PCR presentó una mejor resolución al momento de las pruebas, ya
que permitía hacer más visibles las muestras positivas aún cuando los resultados fueron
los mismos comparados con la sonda obtenida a partir del producto de nPCR, tal como
se muestra en la figura No. 9.
III.2.3.3 Límite de detección
El limite de detección de la prueba se puede calcular mediante una prueba
cualitativa, en la cual se realizan una serie de diluciones de diferente concentración del
extracto que contiene ADN del fitoplasma, a fin de conocer un rango en el cuál la prueba
ya no puede aplicarse puesto que se vuelve poco sensible a dicha concentración del
patógeno. En la figura No. 10 pueden observarse los resultados obtenidos para la serie
de diluciones realizadas con 6 muestras diferentes.
A partir de las membranas presentadas en la figura antes mencionada (ver Figura
No. 10) puede observarse que el límite de detección de la prueba es de aproximadamente
5ng/ul, lo que lo convierte en una técnica relativamente más sensible que el PCR en lo
que respecta a la concentración de patógeno capaz de detectar. Por otro lado, cada una
de las muestras fue trabajada en triplicado a fin de establecer la posible variación de los
resultados, y es visible que se obtuvieron los mismos resultados para cada muestra por
individual lo que muestra la repetibilidad de la sonda empleada.
III.2.3.4 Corrida de muestras en membranas de nitrocelulosa y de papel
Uno de los objetivos del proyecto era establecer si era posible el uso de
membranas de papel bond en lugar de nitrocelulosa para el proceso de hibridización.
Para ello si fijaron muestras tanto en membranas de nitrocelulosa como de papel bajo las
mismas condiciones (empleando luz UV por media hora), el proceso de hibridización
con la sonda y su revelado también ser realizaron de igual forma (ver figura No. 11).
En la parte superior de la figura 11 se puede apreciar un mapa de cómo se
colocaron las muestras en la membrana. Debajo de este equema, se muestran las
membranas de nitrocelulosa empleadas y en la parte inferior las membranas de papel.
Las membranas de nitrocelulosa se trabajaron en triplicado y las de papel en duplicado.
Así, puede verse que la sonda fabricada a partir de los productos de nPCR no sirvió para
la detección de los controles positivos (muestras No. 4 y 34) mientras que la sonda
realizada a partir del producto de PCR sí fue efectiva para la detección de estos
controles. Es importante observar que existía reproducibilidad de los resultados, ya que
61
tanto las membranas en las que utilizó la sonda del pronto de nPCR como las sondas del
producto de PCR para la metodología, presentaron los mismos resultados. Luego de
llevar a cabo este proceso de evaluación de las sondas marcadas, se decidió trabajar con
la sonda obtenida a partir del producto de PCR para el proceso de detección de
fitoplasmas en el resto de muestras colectadas, ya que detecto de forma adecuada los
controles positivos.
Por otro lado, es importante ver que al igual que las membranas de nitrocelulosa
trabajadas con la sonda del nPCR, en las membranas de papel tampoco fue posible la
detección de los controles positivos. A diferencia de la nitrocelulosa el papel bond posee
dos características importantes; es sumamente poroso y no está cargado. Las
características antes definidas tienen dos desventajas enormes. En este caso, la
porosidad del papel hace que éste sea capaz de absorber una gran cantidad de agua y la
humedad lo hace menos resitente, por lo que a lo largo del proceso se obervó la
degradación gradual de la membrana e incluso la ruptura. Tal como se mira en la figura
No. 11, los bordes de las membranas de papel se encuentran desgastados, principalmente
en el papel bond de 120 g. Aunque el papel de 75 g fue más resistente al prcedimiento,
de igual forma presentaba daños en su superficie, así como en los bordes.
Otra desventaja del papel es que absorbió el color de la solución de revelado, por
lo que las membranas presentaban una coloración morada al final de esta etapa. La
coloración representa problemas para la correcta visualización de muestras positivas
debido al fondo, por lo que no se recomienda su uso. Además, se cree que tampoco se
logró la fijación del ADN. En el caso de las membranas de nitrocelulosa, la unión de las
moléculas de ADN (carga negativa) se lleva a cabo por la carga positiva de la
membrana, permitiéndo así la unión. Para las membranas de papel la ausencia de cargas
en la membrana dificulta la fijación del ADN, por lo que se recomienda probar otros
métodos diferentes al UV para dicho paso, tal como la fijación por calor empleando un
horno, o tratando de friccionar el papel contra una superficie con carga electrostática
para generar cierta carga en él, etc.
Para realizar el proceso de validación del método propuesto, fue necesario correr
todas las muestras bajo las condiciones establecidas durante el proceso de
estandarización, para lo cuál se fijaron las muestras pendientes de análisis a una
membrana de nitrocelulosa y luego se trabajaron de acuerdo a los protocolos presentados
con antelación. Las muestras se trabajaron en duplicado, y en esta ocasión hubo
repetibilidad en la mayoría de las muestras, pero no para todas. Debido a que el proceso
de validación implicaba la comparación de los resultdos de diagnóstico de fitoplasmas
obtenidos por el método de hibridización contra el de nPCR, fue necesario establecer un
criterio de negatividad. En este caso se tomaron como negativas, muestras que no
presentaban señales de hibridización en ninguna de las dos membranas reveladas. La
figura 12 esquemtatiza los resultados obtenidos en la población de papayas criollas.
Los resultados mostrados en la figura No. 12, son la repetición de una prueba
previa realizada en triplicado, en la que se encontraron resultados similares, pero con la
diferencia de que no exitía reacción cruzada con el ADN de geminivirus. Se creyó en un
principio, que los resultados obtenidos eran erróneos, ya que la cantidad de muestras
62
obtenidas diagnósticas por hibridización era notablemente mayor que las detectadas por
PCR (58/75 contra 21/75 respectivamente). Sin embargo al repetirse el experimento,
los resultados variaron ligeramente.
Una de las razones por las cuales podrían estar variando los resultados puede
deberse a que tal como se describió en las secciones anteriores, el límite de detección es
mayor para este método que para el de PCR o nPCR, tomados como prueba de
referencia para llevar a cabo la detección. Por otro lado, la sonda empleada realmente
podría se poco específica al momento de procesar grandes cantidades muestras. Una de
las razones por las cuales la inespecificidad no fue notoria con antelación, se debe a que
el proceso de estadarización se hizo con poca cantidad de muestras, en las que todos los
resultados eran coherentes con las pruebas de nPCR hasta ese momento.
Las tablas mencionadas en las sección a continuación, son el resultados de una
serie de pruebas estadisticas. Estas pruebas fueron empleadas para asegurar que el
método de diagnóstico que se deseaba implementar (hibridización), fuera válido para su
aplicación. Los resultados obtenidos evidencian que no es posible validarlo debido a su
baja especificidad principalmente.
III.2.3.5 Pruebas estadísticas
En en cuadro No. 30 se resumen los resultados obtenidos para todas las muestras
de papaya procesadas. Así, puede observarse que aunque el número de falsos negativos
es de solamente 1, el número de falsos positivos asciende a 38, lo que corrobora
nuevamente la poca especificidad de las sondas para aplicar esta prueba como
diagnóstico de fitoplasmas. Los cuadros No. 31 y 32, proporcionan un análisis
estadístico sumamente interesante que refuerza las deducciones hechas hasta ahora, a
cerca de la especificidad y sensibilidad de la prueba estandarizada. En este caso puede o
no tomarse en cuenta la prevalencia del fitoplasma en el cultivo de papaya para hacer los
cálculos. Si se comparan los valores obtenidos en ambos cuadros, los valores son
similares.
Lo anterior refleja que los resultados mostrados en la tabla No. 32, no se ven
significativamente afectados, al excluir del análisis estadístico las muestras que no
pertenecían a la finca A, ya que el cultivo de papaya conformaba la mayor parte de las
muestras del estudio. Es importate notar, que no puede inferirse lo mismo del proceso
inverso (muestras que no pertenecen a la finca A), en el que el número de muestras
empleadas podría incluso no llegar a ser significativo.
Al analizar los resultados obtenidos en los cuadros No. 31 y 32 puede verse que
el porcentaje de sensibilidad obtenido para la prueba es alto para un nivel de confianza
del 95%. En este caso dicho valor indica que la prueba es capaz de detectar a plantas
enfermas, no obstante, el resultado también refleja que con 95% de seguridad, el
paciente tiene el 34% de probaliblidad de padecer la enfermedad (VPP), si se obtiene un
resultado positivo, lo que hace ver que la prueba no es muy fiable bajo estas
circunstacias.
63
De forma opuesta puede verse que la especificidad obtenida es tan solo del 30%,
lo que indica que la prueba con un 95% de confianza, solamente es capaz de identificar
el 30% de no enfermos entre los no enfermos (lo que se refleja en la matriz de 2x2 como
el alto nivel de falsos positivos). Sin embargo, dado que los negativos obtenidos por
PCR y por membrana son los mismos (no es sinónimo de que los totales sean los
mismos), la probabilidad de que al darse un resultado negativo realmente sea negativo
es del 94% (VPN). Veáse que este valor sí es notablemente diferente en ambas tablas
(ver cuadros No. 31 y 32), por lo cuál puede entenderse cómo afecta la prevalencia de
fitoplasmas en los resultados. Esto implica que poblaciones cómo la de papaya criolla
muestreada con 60 individuos, posee solamente un 6% de probabilidad de que no sea un
falso positivo.
De nuevo los valores de RV son parecidos al comparar las tablas. En este caso,
según Yerushalmy 1947, el índice de proporción correcta de aciertos o desaciertos
permite concer qué porcentaje de la población evaluada está correctamente clasificado
como positivo o negativo. Así, un buen método de validación debería tener un RV-
cercano a 0 y un RV+ entre más alto mejor25
, aunque en la litetura consultada no
específica que tanto.
Debido a que el RV- refleja la probabilidad de que el método evaluado muestre
más resultados negativos en los enfermos que en los no enfermos, es decir es un índice
de que refleja número de falsos negativos. Al observar los resultados puede verse el
RV- obtenido es cercano a 0. Esto puede corroborarse en base a los resultados obtenidos
en la matriz (ver cuadro No. 31), en el que es notorio que este porcentaje fue bajo (1 de
cada 17).
De forma opuesta, en buen test el RV+ debe ser alto25
, aunque la literatura
consultada no específica que tanto. Esta prueba estadística refleja la probabilidad de
que el método evaluado muestre resultados positivos en los enfermos con relación a los
no enfermos (ver cuadro No. 30), es decir la medición de los verdaderos positivos. El
RV+ corresponde a 1.35 veces más probable que una muestra con resultado positivo
tenga fitoplasma, un probabilidad baja, y que por tanto sugiere una deficiencia del
método empleado para el diagnóstico.
Así, puede verse que no fue posible validar la técnica de hibridización con el
empleo de estas sondas, ya que tal como lo reflejan las pruebas estadísticas realizadas, la
sensibilida y especificidad no son adecuadas, dando lugar a una gran cantidad de falsos
positivos en base a la prueba de referencia (nPCR). Sin embargo debe recordarse que
aunque los iniciadores empleados para la prueba detectan un amplio rango de
fitoplasmas, no incluyen a todos, por lo que podría ser posible que algunas otras
muestras negativas con nPCR sí sean positivas.
También se hace enfásis nuevamente en que el límite de detección para
hibridización es mayor por lo que esto podría provocar una mayor cantidad de supuestos
falsos positivos, que en realidad sean verdaderos positivos. De esta forma se recomienda
realizar un nuevo estudio que incluya el proceso de secuenciación como un paso inicial
64
para conocer si existe o no presencia del patógeno en las muestras, así como una nueva
generación de sondas en base a las secuencias de fitoplasmas propios del país.
III.2.4 Caracterización de fitoplasmas encontrados en las muestras mediante
RFLP’s
El proceso de caracterización requiere de un ADN extraído que tenga una buena
pureza y concentración adecuadas, pero además de ello cuya integridad sea buena, para
cerciorarse que la naturaleza del ADN extraído no interfiera con los resultados. En la
figura No. 13 se muestra la integridad del ADN de las muestras positivas, puede verse
que al final, los controles estaban ya bastante degradados mientras el resto de muestras
tenían un buen nivel de integridad.
Tal como se indicó en la sección de resultados, las muestras positivas fueron
amplificadas mediante nPCR, y sus productos fueron sometidos a digestión con enzimas
de restricción para caracterizar a los fitoplasmas encontrados. Según el protocolo la
separación de los fragmentos generados podría visualizarse con un gel de agarosa al 3%
(ver figura No. 14), sin embargo no fue posible, por lo que se recurrió a una matriz más
fina que permitiera una mejor separación, razón por la cuál se emplearon geles de
acrilamida/bisacrilamida.
En las figuras No. 15 y 16, se observan los geles realizados para la separación de
los productos de digestión. Sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados ya
que no hubo bandas capaces de brindar una diferenciación entre las muestras a patir del
uso de las enzimas Taq I, Tru9I, RsaI y AluI.
Puede verse la presencia de bandas en 3 muestras digeridas con la enzima Tru9I
(ver figura 15 y cuadro 33), pero no se produjeron patrones de bandas para todas las
muestras positivas para fitoplasmas y digeridas con el enzima Tru9I. Así, los resultados
obtenidos sirven como control de que se la reacción con el enzima de digestión si se dio,
pero no pueden emplarse para establecer algún tipo de relación filogenética entre las
muestras positivas para fitoplasma.
Por otro lado, algunos de los estudios de fitoplasmas reportados en la literatura,
comprenden una caracterización con RFLPs realizada a partir del prodcuto amplificado
por PCR, en lugar de la digestión de los productos de nPCR como se hizo en este
proyecto (Lee et al. 1996 y Lorenz K. et al. 1995). Lo anterior, pudo ser la razón por la
que no se lograron obtener patrones de bandas a partir de la digestión. Se recomienda
probar realizar la caracterización a partir del material clonado y de ser posible,
secuenciar dichas muestras, para caracterizar los fitoplasmas detectados por PCR y
nPCR.
Debe mencionarse que por un error en el laboratorio, la enzima Tru9I se trabajó
en un buffer Multicore en lugar de Buffer F, en el cuál no es 100% activa sino de 25 –
50%. Dado que con cada una de las enzimas usadas se colocó un marcador molecular
(MM) de 50 bp para emplearlo como control de digestión, y no se observó digestión de
65
ninguna muestra o marcador molecular, los resultados sugieren que la reacción
enzimática se inhibió (por posibles contaminantes de nPCR), o que el período de
digestión fue muy extenso (a pesar de que el protocolo está estandarizado para hasta 4
horas y el tiempo siempre fue menor).
Este último aspecto explicaría por qué solamente se encontró amplificación en
una mezcla de reacción dónde la actividad de la enzima era menor, y por tanto no todos
los productos de PCR fueron totalmente digeridos, como en los otros casos (e.i. con las
otras enzimas). No se llevaron a cabo otras pruebas debido a que el reactivo se agotó y
no se contaban con más fondos disponibles, pero siendo éste un estudio preliminar de la
presencia de fitoplasmas en cultivos de papaya, se recomienda que en futuros estudios,
se contemplen fondos para enviar a secuenciar los bancos de germoplasma creados a
partir del proceso de clonación, a fin de caracterizar de esta forma los fitoplasmas
almacenados.
III.2.5 Análisis de costos de la prueba de hibridización con sondas no radioactivas
El análisis de costos realizado para este estudio, se presenta de forma resumida
en el cuadro 34 de la sección de resultados. La lista detallada de los items utilizados
para cada metodología empleada (hibridización con sondas no radioactivas y reacción en
cadena de la polimerasa), así como su costo real, se describe en los cuadros 37 y 38 del
apéndice E.
Tal como puede observarse en el apéndice E, el costo final no incluye gastos tales
como la depreciación de equipo, uso de intalaciones y servicios, etc. Este análisis
comprende un gasto aproximado que permite hacer comparaciones del costo que
representaría el procesamiento de una muestra con cada tipo de metodología. De forma
similar, tampoco se incluyen los gastos de extracción de ADN, ya que se trabajó con el
mismo protocolo para ambas metodologías. Así, para fines compartivos de costos no
resulta útil agregarlo a la lista, ya que aumentaría en igual magnitud el costo final para
ambos métodos.
Tanto en el cuadro 34, como en el 37 y 38, puede apreciarse que el costo para
procesar una muestra mediante la hibridización de ácidos nucleicos con sondas no
radioactivas (Q. 3.38), es menor que para procesar una muestra mediante la reacción en
cadena de polimerasa (Q. 3.86). Los costos presentados en este informe fueron
calculados en base a los precios de los reactivos adquiridos durante el proyecto, o con
los valores que estos tuvieron en el mercado durante el tiempo en que se realizó el
mismo.
Sin embargo, ya que las sondas utillizadas durante este estudio no fueron útiles
para la detección de fitoplasma mediante hibridización, sería relevante generar más
estudios que permitan experimentar con nuevas sondas. La estandarización de ésta
metodología con sondas que posean tanto la especificidad como la sensibilidad idóneas,
permitirían reducir los costos del diagnóstico de fitoplasmas.
66
De igual forma, al encontrar sondas adecuadas para la implementación de esta
metodología, podrían llevarse a cabo estudios que busquen una detección directa sobre la
membrana de nitrocelusoa sin proceso de extracción de ADN (squash blot). Lo anterior
representaría una alta reducción de costos, así como la implementación de un método
con menor riesgo de contaminación, degradación de la muestra y menor dificultad en el
procesamiento de la misma.
Por otro lado, es importante tomar en cuenta que varios buffers detallados en la
lista de costos de hibridización son reusables, y que el volumen empleado en una
bandeja de reacción puede emplearse para más de una membrana a la vez, lo que
representaría también una disminución significativa del costo.
Por último, los resultados obtenidos en cuanto al costo sugieren probar nuevas
sondas en futuros proyectos, ya que la información presentada en esta sección indica que
la técnica de hibridización de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas es más
rentable. De igual forma, se recomienda llevar a cabo estudios adicionales que busquen
la implementación de este método para el diagnóstico de otro tipo de patógenos en
plantas, ya que mateniéndose los valores de sensibilidad y especificidad adecuados, los
costos podrìan ser menores.
67
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES
1. Se lograron detectar 21 muestras positivas para fitoplasma de 75 muestras trabajadas,
mediante las técnicas de PCR y nPCR.
2. El porcentaje de prevalencia de fitoplasma para una población del cultivo de papaya
criolla de 60 individuos fue de 28.3%.
3. Se creó un pequeño banco de controles positivos de fitoplasmas a partir de la
clonación de las muestras positivas, identificadas por nPCR.
4. La estandarización de la técnica de RFLP’s se llevó a cabo con muestras de papaya
positivas para fitoplasmas, ya que no se contaba con controles positivos específicos
para las variedades de papaya trabajadas.
5. Aún cuando se contaba con una integridad y concentración de ADN adecuada en las
muestras, no fue posible caracterizar mediante el uso de RFLP’s las muestras que
poseían resultados positivos a partir del producto de nPCR, y por tanto no fue posible
generar árboles filogénticos. Las posibles razones de este resultado se atribuyen a
contaminantes que inhibieron las enzimas de restricción, un alto tiempo de digestión,
o un producto de PCR inadecuado para la caracterización.
6. Los valores obtenidos para las pruebas estadísticas bajo condiciones pre-prueba (sin
relacionar la prevalencia del patógeno a los parámetros estadísticos) y con un límite
de confianza del 95%, fueron de 95% se sensibilidad, 30% de especificidad, 34% de
VPP, 94% de VPN, RV de 1.35 y RV- de 0.16.
7. Los valores obtenidos para las pruebas estadísticas bajo condiciones post-prueba
(relacionando la prevalencia del patógeno a los parámetros estadísticos), fueron un
VPP del 35%, un VPN del 6%, un RV+ de 1.36 y un RV- de 0.17.
8. Los valores estadísticos obtenidos sugieren que la prueba posee una alta sensibilidad
(95%) ante el fitoplasma, pero solamente el 34% de los resultados obtenidos como
positivos son verdaderos positivos, por lo que no es fiable bajo estas condiciones.
Por otra parte posee baja especificad dando lugar a falsos positivos. En el caso de las
muestras negativas es 94% probable que realmente lo sean. El RV- cercano a 0 (0.16
y 0.17) indica que la prueba da lugar a pocos falsos negativos, mientras que el RV+
(1.35 y 1.36) representa el número más probable de que una muestra con resultado
positivo tenga fitoplasma, una probabilidad más baja en este caso.
68
9. El proceso de validación del método, demostró que no es posible emplearlo como un
método para detección de fitoplasmas en cultivos de papaya con las sondas
empleadas; siendo las principales razones la diferencia del límite de detección entre
el método de referencia y el evaluado (hibridización), o la falta de repetibilidad en
una mayor cantidad de muestras.
10. No fue posible utilizar membranas de papel para fijar el ADN, ya que presentan las
desventajas de ser más porosas y no poseer carga positiva que facilita la adherencia
del material genético. Estas dos características las hicieron poco recomendables para
el método ya que se desintegran gradualmente y muy probablemente no se logró fijar
el ADN.
11. Los resultados obtenidos mediante la amplificación mediante por PCR y nPCR
sugieren que existe una infección del cultivo de papaya por fitoplasmas en
Guatemala (específicamente en la región Costa Sur), aún cuando no se observaron
síntomas característicos en las muestras colectadas.
12. La estandarización del proceso de hibridización consistió en la realización de sondas,
marcaje eficiente, temperatura de hibridización y especificidad de las sondas. La
sonda empleada fue obtenida a partir del producto de PCR purificado y marcado a
una concentración de sonda de 6.48 ng/ml de DIG Easy Hyb, las condiciones de
hibridización fueron de 46 ºC, toda la noche. La especificidad de la sonda mostraba
ser buena para detectar muestras positivas, negativas, no hibridizaba contra blancos
ni poseía en apariencia reacciones cruzadas.
13. El límite de detección para el proceso de hibridización de ácidos nuleicos con sondas
no radioactivas fue de 5 ng/ul, mientras que en PCR es de aproximadamente 25
ng/ul, lo que sugiere que puede ser un poco más sensible a la detección del patógeno
a una menor concentración que la prueba de referencia, mostrando además
repetibilidad de los resultados.
14. El costo para procesar una muestra mediante la hibridización de ácidos nucleicos con
sondas no radioactivas (Q. 3.38), es menor que para procesar una muestra mediante
la reacción en cadena de polimerasa (Q. 3.86).
69
IV.2 RECOMENDACIONES
Debido a la naturaleza del proyecto (estudio preliminar), no existen datos previos en
el país con que pueda compararse la prevalencia de fitoplasmas en Guatemala. Se
recomienda realizar otros proyectos con la idea de conocer más a fondo las especies
existentes en el país, su agresividad, su hospederos predilectos, los hospederos
alternos, posible resistencia de la planta al patógeno, cepas menos violetas con las
plantaciones, etc.
Se recomienda enviar a secuenciar los productos de PCR correspondientes a las
muestras clonadas, a fin de confirmar que la identidad del ADN amplificado
corresponde a fitoplasma. De ser posible, se recomienda caracterizar la especie(s)
obtenida(s) a partir de las secuencias obtenidas, mediante la comparación de
porcentajes de similitud genética con las secuencias conocidas de los bancos
genéticos actuales, tales como GeneBank del NCBI.
Se recomienda contar con controles positivos de procedencia extranjera o comercial,
ya que de esta forma la estandarización de los métodos es más sencilla, y pueden
darse resultados más fehacientes conociendo el comportamiento del ADN del
patógeno, con lo que puede conocerse además el grado de labilidad del mismo.
Se recomienda realizar de nuevo la caracterización de fitoplasmas empleando el
producto de PCR (iniciadores P1/P7) en lugar del de nPCR, como uno de los
primeros pasos para el estudio de estos patógenos en los cultivos del país, pudiendo
usarse el banco de controles positivos creado mediante el proceso de clonación.
Se recomienda diseñar nuevas sondas para el proceso de hibridización a partir de los
productos enviados a secuenciar, cuya unión sea más específica y sensible contra
la(s) especie(s) de fitoplasma(s) presentes en los cultivos de papaya del país.
Los valores estadísticos obtenidos fueron basados en la muestra poblacional aleatoria
de 60 individuos de papaya criolla, por lo que los individuos de las otras variedades
que conformaban una menor proporción (no corresponden a poblaciones
estadísticamente mínimas (30 plantas)), se veían afectados por este sesgo. Se
recomiendan estudios posteriores que comparen la prevalencia a nivel de diversas
variedades de papaya, y de esta forma tener un mejor estándar de comparación contra
la prueba de hibridización que permita evaluar nuevamente la validación de la misma
bajo parámetros más amplios.
Se recomienda mandar secuenciar los productos de PCR obtenidos a fin de confirmar
totalmente la presencia de fitoplasma de forma más certera, ya que los tamaños de
los productos amplificados con los iniciadores utilizados poseen valores diferentes a
los reportados en la literatura, y debe cerciorarse que correspondan a fitoplasma.
70
Se recomienda llevar a cabo el proceso de hibridación con membranas de papel de
75g, probando inducir una carga electrostática en ellas para facilitar la fijación del
ADN de mejor forma antes de la exposición a luz UV, o probar fijarlo mediante
calor.
Los iniciadores empleados en la segunda reacción del nPCR (fU5/rU3), han sido
útiles para detectar un amplio rango de fitoplasmas (Lorenz K. et al. 1995), pero aún
así siguen siendo selectivos para un grupo amplio de fitoplasmas, por lo que es
probable que la prevalencia pueda ser aún mayor, debiendo buscar otro tipo de
inciadores que puedan brindar ese tipo de información, tales como los reportados por
Smart D. et al. en el año 1996.
El análisis comparativo de costos realizado en este proyecto sugiere evaluar nuevas
sondas en futuros proyectos, que resulten eficaces para la detección de fitoplasma.
La información obtenida indica que la técnica de hibridización de ácidos nucleicos
con sondas no radioactivas es más rentable.
Se recomienda llevar a cabo estudios adicionales que busquen la implementación de
este método para el diagnóstico de otro tipo de patógenos en plantas, ya que
mateniéndose los valores de sensibilidad y especificidad adecuados, los costos
podrìan ser menores.
71
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Aluja, M., Jiménez, A., Camino, M., Aldana, L., Castrejón, V. y Aldes, M.E..
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a/417/IMG/abcl4.jpg&imgrefurl=http://www.faba.org.ar/fabainforma/417/A
BCL.htm&usg=__sFMOtw88ryjtf8s4C76IKG9tzR0=&h=486&w=438&sz=
51&hl=en&start=8&um=1&tbnid=WmmuWdFlK8kPnM:&tbnh=129&tbnw
=116&prev=/images%3Fq%3Denzimas%2Bde%2Brestricci%25C3%25B3n
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for extracting nucleic acids from woody plants infected with various
phytopathogens for PCR assay. Journal of Virological Methods 71 (1998)
45–50.
IV.4 ANEXOS
74
ANEXO A
Cuadro No. 35
Descripción de los patógenos causantes de enfermedad en papaya según la
American Phytophathological Society (Nishijima, W., 1999)
Enfermedad Agente causal
Bacterias
Bacterial canker Erwinia sp.
Bacterial leaf spot Pseudomonas carica-papayae Robbs.
Bacterial wilt Pseudomonas solanacearum E. F. Smith
Black rot Erwinia cypripedii (Hori) Bergey et al (=Pectobacterium
cypripedii (Hori) Brenner et al.)
Bunchy top Unknown bacterium
Erwinia decline Erwinia sp.
Erwinia mushy canker Erwinia sp.
Internal yellowing Enterobacter cloacae (Jordan) Hormaeche & Edwards
Purple stain Erwinia herbicola Löehnis Dye
Hongos
Alternaria fruit spot Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl.
Angular leaf spot Leveillula taurica (Lév.) G. Arnaud
Anthracnose Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
Black spot
Asperisporium caricae (Speg.) Maubl.
Cercospora papayae Hansf.
Phomopsis caricae-papayae Petr. & Cif.
Blossom spot Choanephora cucurbitarum (Berk. & Ravenel) Thaxt.
Brown spot Corynespora cassicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei
(=Cercospora melonis Cooke; = C. vignicola E. Kawamura;
=Helminthosporium cassiicola Berk. & M. A. Curtis; =H. vignae
Olive in Olive, Bain, & Lefebvre); = H. vignicola (E.
Kawamura) Olive
Chocolate spot Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
Collar rot Cylindrocladium crotalariae (C. A. Loos) D. K. Bell & Sobers
(teleomorph: Calonectria crotalariae (C. A. Loos) D. K. Bell &
Sobers)
Damping off Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler
Phytophthora nicotianae Breda de Haan var. Parasitica (Dastur)
G. M. Waterhouse (=Phytopthora parasitica Dastur)
Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.
Pythium debaryanum Auct. non R. Hesse
Pythium ultimum Trow
Pythium sp.
Rhizoctonia solani Kühn (teleomorph: Thanatephorus
cucumeris (A. B. Frank)
Dry rot Phoma caricae-papayae (Tarr) Punithalingam (=Ascochyta
carica Pat. and A. caricae-papayae Tarr) (teleomorph:
Mycosphaerella caricae Syd. & P. Syd.)
Foot rot Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.
Pythium ultimum Trow
Fruit rot Monilia sp.
Fruit spot Cercospora mamaonis Viégas & Chupp
Fusarium fruit rot Fusarium solani (Mart.) Sacc.
Fusarium spp.
Guignardia spot Guignardia sp.
Greasy spot Corynespora cassiicola. (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei
(=Cercospora melonis Cooke; = C. vignicola E. Kawamura;
=Helminthosporium cassiicola Berk. & M. A. Curtis; =H. vignae
75
Enfermedad Agente causal
Olive in Olive, Bain, & Lefebvre); = H. vignicola (E.
Kawamura) Olive
Internal blight Cladosporium sp.
Fusarium sp.
Penicillium sp.
Lasiodiplodia fruit rot
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl.
(=Botryodiplodia theobromae Pat.; =B. gossypii Ellis. & Barth.;
=Diplodia theobromae (Pat.) W. Nowell; =D. gossypina Cooke;
=D. natalensis Pole-Evans; =Lasiodiplodia triflorae Higgins)
Leaf spot
Alternaria sp.
Asperisporium caricae (Speg.) Maubl.
Cercospora mamaonis Viégas & Chupp
Cercospora papayae Hansf.
Choanephora cucurbitarum (Berk. & Ravenel) Thaxt.
Curvularia carica-papayae Srivastava and Bilgrami
Gloeosporium sp.
Phoma caricae-papayae (Tarr) Punithalingam (teleomorph:
Mycosphaerella caricae Syd. & P. Syd.)
Phyllosticta sp.
Petiole spot Didymella sp.
Phytophthora blight
Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler
Phytophthora nicotianae Breda de Haan var. Parasitica (Dastur)
G. M. Waterhouse (=Phytopthora parasitica Dastur)
Powdery mildew
Erysiphe cichoracearum De Candolle
Erysiphe sp.
Oidium caricae F. Noack
O. indica Kamat
Ovulariopsis papayae van der Bilz
Sphaerotheca fuliginea (Schlecht.) Poll.
S. humuli (D.C.) Burr.
Phytophthora fruit rot
Phytophthora capsici Leonian
Phytophthora nicotianae Breda de Haan var. Parasitica (Dastur)
G. M. Waterhouse (=Phytopthora parasitica Dastur)
Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler
Rhizopus soft rot Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. (=R. nigricans Ehrenb.)
Root rot
Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler
Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.
Pythium ultimum Trow
Pythium spp.
Rhizoctonia solani Kühn (teleomorph: Thanatephorus cucumeris
(A. B. Frank)
Sclerotium blight Sclerotium rolfsii Sacc. teleomorph: Athelia rolfsii (Curzi) Tu &
Kimbrough)
Seedling blight Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
Stem-end rot
Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl.
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
Fusarium sp.
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl.
(=Botryodiplodia theobromae Pat. =B. gossypii Ellis. & Barth.;
=Diplodia theobromae (Pat.)W. Nowell; =D. gossypina Cooke;
=D. natalensis Pole-Evans;
=Lasiodiplodia triflorae Higgins)
Phoma caricae-papayae (Tarr) Punithalingam (=Ascochyta
carica Pat. and A. caricae-papayae Tarr) (teleomorph:
Mycosphaerella caricae Syd. & P. Syd.)
Phomopsis sp.
76
Enfermedad Agente causal
Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. (=R. nigricans
Ehrenb.)
Stemphylium fruit spot Stemphylium lycopersici (Enjoji) W. Yamamoto (=Thyrospora
lycopersici Enjoji; =S. floridanum Hannon & G. F. Weber)
Stem rot
Fusarium solani (Mart.) Sacc.
(teleomorph: Nectria haematococca Berk. & Broome)
Fusarium sp.
Phytophthora palmivora (E. J. Butler) E. J. Butler
Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.
Pythium ultimum Trow
Target spot Phyllosticta caricae-papayae Allesch.
Verticillium wilt Verticillium dahliae Kleb.
Wet fruit rot Phomopsis sp.
Parásitos,
Nemátodos
Reniform nematode Rotylenchulus reniformis Linford and Oliveira
R. parvus (Williams) Sher
Root-knot nematode
Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood
M. javanica (Treub) Chitwood
M. arenaria (Neal) Chitwood
M. hapla Chitwood
Virus y
Viroides
Apical necrosis Papaya apical necrosis rhabdovirus
Droopy necrosis Papaya droopy necrosis rhabdovirus
Feather leaf Unknown virus
Leaf curl Virus suspected
Mosaic Papaya mosaic potexvirus
Papaya ringspot Papaya ringspot potyvirus
Spotted wilt Tomato spotted wilt tospovirus
Terminal necrosis and
wilt
Tobacco ringspot nepovirus
Fitoplasmas Dieback Phytoplasma
Yellow crinkle Phytoplasma
Otros
Algal leaf spot Cephaleuros virescens Kunze
Bumpy fruit Boron deficiency
Freckles Physiological
Nivum Haamir dieback Unknown cause
77
ANEXO B.
Cuadro No. 36
Información sobre las muestras trabajadas
No. Código
asignado
Finca Departamento Variedad de
papaya
Observaciones
1 1 A Retalhuleu Criollla
Plantaciones sin
sintomatología propia de
fitoplasmas, pero en algunas
plantas se observó presencia
de virus
2 2 A Retalhuleu Criollla
3 3 A Retalhuleu Criollla
4 4 A Retalhuleu Criollla
5 5 A Retalhuleu Criollla
6 6 A Retalhuleu Criollla
7 7 A Retalhuleu Criollla
8 8 A Retalhuleu Criollla
9 9 A Retalhuleu Criollla
10 10 A Retalhuleu Criollla
11 11 A Retalhuleu Criollla
12 12 A Retalhuleu Criollla
13 13 A Retalhuleu Criollla
14 14 A Retalhuleu Criollla
15 15 A Retalhuleu Criollla
16 16 A Retalhuleu Criollla
17 17 A Retalhuleu Criollla
18 18 A Retalhuleu Criollla
19 19 A Retalhuleu Criollla
20 20 A Retalhuleu Criollla
21 21 A Retalhuleu Criollla
22 22 A Retalhuleu Criollla
23 23 A Retalhuleu Criollla
24 24 A Retalhuleu Criollla
25 25 A Retalhuleu Criollla
26 26 A Retalhuleu Criollla
27 27 A Retalhuleu Criollla
28 28 A Retalhuleu Criollla
29 29 A Retalhuleu Criollla
30 30 A Retalhuleu Criollla
31 31 A Retalhuleu Criollla
32 32 A Retalhuleu Criollla
33 33 A Retalhuleu Criollla
34 34 A Retalhuleu Criollla
35 35 A Retalhuleu Criollla
36 36 A Retalhuleu Criollla
37 37 A Retalhuleu Criollla
38 38 A Retalhuleu Criollla
39 39 A Retalhuleu Criollla
40 40 A Retalhuleu Criollla
78
41 41 A Retalhuleu Criollla
42 42 A Retalhuleu Criollla
43 43 A Retalhuleu Criollla
44 44 A Retalhuleu Criollla
45 45 A Retalhuleu Criollla
46 46 A Retalhuleu Criollla
47 47 A Retalhuleu Criollla
48 48 A Retalhuleu Criollla
49 49 A Retalhuleu Criollla
50 50 A Retalhuleu Criollla
51 51 A Retalhuleu Criollla
52 52 A Retalhuleu Criollla
53 53 A Retalhuleu Criollla
54 54 A Retalhuleu Criollla
55 55 A Retalhuleu Criollla
56 56 A Retalhuleu Criollla
57 57 A Retalhuleu Criollla
58 58 A Retalhuleu Criollla
59 59 A Retalhuleu Criollla
60 60 A Retalhuleu Criollla
61 C+3 Indefinida Petén Indefinida Controles positivos
almacenados en el
laboratorio
62 C+4 Indefinida Petén Indefinida
63 C+5 Indefinida Petén Indefinida
64 C+6 Indefinida Petén Indefinida
65 H1
B
Retalhuleu Hawaina Red
Venus
Plantaciones sanas
66 H2
B
Retalhuleu Hawaina
Golden
67 H3
B
Retalhuleu Hawaina
Golden
68 M1 C Escuintla Maradol
69 M2 C Escuintla Maradol
70 M3 C Escuintla Maradol
71 C1 D Escuintla Criollla Plantaciones sin
sintomatología propia de
fitoplasmas, pero en algunas
plantas se observó presencia
de virus
72 C2 D Escuintla Criollla
73 C3 E Escuintla Criollla
74 C4 F Escuintla Criollla
75 C5 E Escuintla Criollla
79
ANEXO C
Secuencias de fitoplasmas empleadas para el cálculo de Tm óptimo en el proceso de
hibridización
Primera secuencia
LOCUS AY971669 1247 bp DNA linear BCT 16-APR-2005
DEFINITION Carnation yellow phytoplasma 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence.
ACCESSION AY971669
VERSION AY971669.1 GI:62461705
KEYWORDS .
SOURCE Carnation yellow phytoplasma
ORGANISM Carnation yellow phytoplasma
Bacteria; Tenericutes; Mollicutes; Acholeplasmatales;
Acholeplasmataceae; Candidatus Phytoplasma; Candidatus Phytoplasma
asteris.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1247)
AUTHORS Cai,H., Zhang,H.M. and Chen,H.R.
TITLE Sequences analysis of 16S ribosomal DNA of phytoplasm associated
with carnation yellow
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 1247)
AUTHORS Cai,H., Zhang,H.M. and Chen,H.R.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (22-MAR-2005) Plant Pathology, Key Laboratory for Plant
Pathology of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University,
Kunming, Yunnan 650201, China
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1247
/organism="Carnation yellow phytoplasma"
/mol_type="genomic DNA"
/host="carnation"
/db_xref="taxon:322140"
rRNA <1..>1247
/product="16S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 tacgactgct gctaagactg gataggagac aagaaggcat cttcttgttt ttaaaagacc
61 tagcaatagg tatgcttagg gaggagcttg cgtcacatta gttagttggt ggggtaaagg
121 cctaccaaga ctatgatgtg tagccgggct gagaggttga acggccacat tgggactgag
181 acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatt ttcggcaacg gaggaaactc
241 tgaccgagca acgccgcgtg aacgatgaag tatttcggta cgtaaagttc ttttattagg
301 gaagaataaa tgatggaaaa atcattctga cggtacctaa tgaataagcc ccggctaact
361 atgtgccagc agccgcggta atacataggg ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta
421 aagggtgcgt aggcggttaa ataagtttat ggtctaagtg caatgctcaa cattgtgatg
481 ctataaaaac tgtttagcta gagtaagata gaggcaagtg gaattccatg tgtagtggta
80
541 aaatgcgtaa ataaatggag gaacaccagt agcgaaggcg gcttgctggg tctttactga
601 cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt
661 aaacgatgag tactaaacgt tggttaaaac cagtgttgaa gttaacacat taagtgctcc
721 gcctgagtag tacgtacgca agtatgaaac ttaaaggaat tgacgggact ccgcacaagc
781 ggtggatcat gttgtttaat tcgaaggtac ccgaaaaacc tcaccaggtc ttgacatgct
841 tctgcaaagc tgtagaaaca cagtggaggt tatcagttgc acaggtggtg catggttgtc
901 gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattgtta
961 gttaccagca cgtaatggtg gggactttag caagactgcc agtgataaat tggaggaagg
1021 tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacaaacgt gatacaatgg
1081 ctgttacaaa gggtagctga agcgcaagtt tttggcgaat ctcaaaaaac agtctcagtt
1141 cggattgaag tctgcaactc gacttcatga agttggaatc gctagtaatc gcgaatcagc
1201 atgtcgcggt gaatacgttc tcggggtttg tacacaccgc ccgtcaa
//
Segunda secuencia
LOCUS AY737647 1298 bp DNA linear BCT 15-NOV-2004
DEFINITION Cassava frogskin disease phytoplasma strain FSDY29 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence.
ACCESSION AY737647
VERSION AY737647.1 GI:52631909
KEYWORDS .
SOURCE Cassava frogskin disease phytoplasma
ORGANISM Cassava frogskin disease phytoplasma
Bacteria; Tenericutes; Mollicutes; Acholeplasmatales;
Acholeplasmataceae; Candidatus Phytoplasma; 16SrIII (X-disease
group).
REFERENCE 1 (bases 1 to 1298)
AUTHORS Alvarez,E., Mejia,J.F., Loke,J.B., Hernandez,L. and Llano,G.A.
TITLE Detecting the phytoplasm-frogskin disease association in cassava
(Manihot esculenta Crantz) in Colombia
JOURNAL (in) PHYTOPATHOLOGY 93:S4. PUBLICATION NO. P-2003-0021-
AMA;
(2003)
REFERENCE 2 (bases 1 to 1298)
AUTHORS Mejia,J.F., Llano,G.A., Alvarez,E. and Loke,J.B.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (30-AUG-2004) Cassava Phythopathology Program,
International Center for Tropical Agriculture, Km 17 recta Cali -
Palmira, Palmira, Valle del Cauca, Colombia
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1298
/organism="Cassava frogskin disease phytoplasma"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="FSDY29"
/isolation_source="roots"
81
/host="Manihot esculenta Crantz var. SM 1219-9"
/db_xref="taxon:293993"
rRNA <1..>1298
/product="16S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 cccttaagac gaggataacg attggaaaca gttgctaaga ctggatagga aaagtaaagg
61 catctttact tttttaaaag accttttttg aaggtatgct taaggagggg cttgcgacac
121 attagttagt tggcagggta aaggcctacc aagactatga tgtgtagctg gactgagagg
181 ttgaacagcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg
241 aattttcggc aatggaggaa actctgaccg agcaacgccg cgtgaacgat gaagtacctc
301 ggtatgtaaa gttcttttat taaggaagaa aaaagagtgg aaaaactccc ttgacggtac
361 ttaatgaata agccccggct aattatgtgc cagcagccgc ggtaatacat aaggggcgag
421 cgttatccgg aattattggg cgtaaagggt gcgtaggcgg tttaataagt ctatagttta
481 atttcagtgc ttaacgctgt tgtgctatag aaactgtttt actagagtga gttagaggca
541 agcggaattc catgtgtagc ggtaaaatgc gtaaatatat ggaggaacac cagaggcgta
601 ggcggcttgc tgggacttta ctgacgctga ggcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt
661 agataccctg gtagtccaca ccgtaaacga tgagtactaa gtgtcgggta aaaccggtac
721 tgaagttaac acattaagta ctccgcctga gtagtacgta cgcaagtatg aaacttaaag
781 gaattgacgg gactccgcac aagcggtgga tcatgttgtt taattcgaag atacacgaaa
841 aaccttacca ggtcttgaca ttttcttgcg aagttataga aatataatgg aggttatcag
901 gaaaacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttagg ttaagtccta
961 aaacgagcgc aacccttgtc gttaattgcc agcatgtaat gatggggact ttaacgagac
1021 tgccaatgaa aaattggagg aaggtgggga ttacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgatc
1081 tgggctacaa acgtgataca atggttgata caaagagtag ctgaaacgcg agttcttagc
1141 caatctcaca aaatcaatct cagttcggat tgaagtctgc aactcgactt catgaagttg
1201 gaatcgctag taatcgcgaa tcagcatgtc gcggtgaata cgttctcggg gtttgtacac
1261 accgcccgtc aaaccacgaa agttggcaat accccaaa
//
Tercera secuencia
LOCUS AY737646 1260 bp DNA linear BCT 15-NOV-2004
DEFINITION Cassava frogskin disease phytoplasma strain FSDY17 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence.
ACCESSION AY737646
VERSION AY737646.1 GI:52631908
KEYWORDS .
SOURCE Cassava frogskin disease phytoplasma
ORGANISM Cassava frogskin disease phytoplasma
Bacteria; Tenericutes; Mollicutes; Acholeplasmatales;
Acholeplasmataceae; Candidatus Phytoplasma; 16SrIII (X-disease
group).
REFERENCE 1 (bases 1 to 1260)
AUTHORS Alvarez,E., Mejia,J.F., Loke,J.B., Hernandez,L. and Llano,G.A.
TITLE Detecting the phytoplasm-frogskin disease association in cassava
(Manihot esculenta Crantz) in Colombia
82
JOURNAL (in) PHYTOPATHOLOGY 93:S4. PUBLICATION NO. P-2003-0021-
AMA;
(2003)
REFERENCE 2 (bases 1 to 1260)
AUTHORS Mejia,J.F., Llano,G.A., Alvarez,E. and Loke,J.B.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (30-AUG-2004) Cassava Phythopathology Program,
International Center for Tropical Agriculture, Km 17 recta Cali -
Palmira, Palmira, Valle del Cauca, Colombia
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1260
/organism="Cassava frogskin disease phytoplasma"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="FSDY17"
/isolation_source="petioles; leaf midribs"
/host="Manihot esculenta Crantz"
/db_xref="taxon:293993"
rRNA <1..>1260
/product="16S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 aggataacga ttggaaacag ttgctaagac tggataggaa aagtaaaggc atctttactt
61 ttttaaaaga ccttttttga aggtatgctt aaggaggggc ttgcgacaca ttagttagtt
121 ggcagggtaa aggcctacca agactatgat gtgtagctgg actgagaggt tgaacagcca
181 cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga attttcggca
241 atggaggaaa ctctgaccga gcaacgccgc gtgaacgatg aagtacctcg gtatgtaaag
301 ttcttttatt aaggaagaaa aaagagtgga aaaactccct tgacggtact taatgaataa
361 gccccggcta attatgtgcc agcagccgcg gtaatacata aggggcgagc gttatccgga
421 attattgggc gtaaagggtg cgtaggcggt ttaataagtc tatagtttaa tttcagtgct
481 taacgctgtt gtgctataga aactgtttta ctagagtgag ttagaggcaa gcggaattcc
541 atgtgtagcg gtaaaatgcg taaatatatg gaggaacacc agaggcgtag gcggcttgct
601 gggactttac tgacgctgag gcacgaaagc gtgggagcaa acaggattag ataccctggt
661 agtccacacc gtaaacgatg agtactaagt gtcgggtaaa accggtactg aagttaacac
721 attaagtact ccgcctgagt agtacgtacg caagtatgaa acttaaagga attgacggga
781 ctccgcacaa gcggtggatc atgttgttta attcgaagat acacgaaaaa ccttaccagg
841 tcttgacatt ttcttgcgaa gttatagaaa tataatggag gttatcagga aaacaggtgg
901 tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttaggtt aagtcctaaa acgagcgcaa
961 cccttgtcgt taattgccag catgtaatga tggggacttt aacgagactg ccaatgaaaa
1021 attggaggaa ggtggggatt acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatctg ggctacaaac
1081 gtgatacaat ggttgataca aagagtagct gaaacgcgag ttcttagcca atctcacaaa
1141 atcaatctca gttcggattg aagtctgcaa ctcgacttca tgaagttgga atcgctagta
1201 atcgcgaatc agcatgtcgc ggtgaatacg ttctcggggt ttgtacacac cgcccgtcaa
//
83
ANEXO D.
Gráfica que muestra la regresión lineal y su respectiva ecuación, utilizada para el cálculo
de las masas moleculares de las bandas obtenidas mediante RFLP’s con la enzima de
restricción Tru9 I (Mse I) y visualizada en geles de poliacrilamida teñidos con plata.
Figura No. 17
Distancia de migración del ADN en función de
la masa molecular para el marcador molecular
de 50bp (Promega)
y = -46.217x + 1233.2
R2 = 0.8989
-200
0
200
400
600
800
1000
0 5 10 15 20 25 30
Distancia recorrida (cm)
Masa m
ole
cu
lar
(bp
)
84
ANEXO E. Listados de los itmes incluidos en el análisis comparativo de costos.
Cuadro No. 37
Detalle de los costos totales para el procesamiento de una muestra, mediante el
método de hibridización de ácidos nucleicos con sondas no radioactivas
Reactivos o material Cantidad
No. de muestras
que se pueden
procesar
Precio
por kit
Precio
por
muestra
Kit para purificacion de ADN 1 2400 Q288.18 Q0.12
PCR para obtención del producto
para marcar 1 2400 Q19.31 Q0.01
DIG High Prime DNA labeling
and detection starter kit I 1 2400 Q3,960.72 Q1.65
DIG wash and block buffer set 1 3000 Q2,713.00 Q0.90
Buffer 2X SSC, 0.1% SDS, 1 l 1 l 3333 Q76.00 Q0.02
Buffer 0.5X SSC, 0.1% SDS , 1 l 1 l 3333 Q25.00 Q0.01
Buffer TE, 1 l 1 l 3333 Q900.00 Q0.27
Nylon membranes, positively
charged, 10x15 cm, (20 piezas /
caja) 20 6000 Q2,402.40 Q0.40
Costo total por muestra Q3.38
Cuadro No. 38
Detalle de los costos totales para el procesamiento de una muestra, mediante el
método de reacción en cadena de la polimerasa
Reactivos o material Cantidad
No. de muestras
que se pueden
procesar Precio
Precio
por
muestra
Go taq Flexi DNA polymerase
(500U) 500 µl 2000 Q1,160.25 Q0.58
1Kb ladder promega, 300 µl 1950 Q951.90 Q0.49
dNTPs mix 10mM c/u, 2.5 mM c/u 1000 µl 400 Q436.50 Q1.09
primer 1 100 nmol 480 Q289.25 Q0.60
primer 2 100 nmol 480 Q289.25 Q0.60
agarosa 500 g 10833 Q3,845.25 Q0.35
Ethidium bromide Molecular
grade, Promega, 10 mg/ml 10 ml 52000 Q520.88 Q0.01
Loading buffer, marca Invitrogen 3 ml 4500 Q496.00 Q0.11
buffer TAE 1 l 233 Q5.27 Q0.02
Costo total por muestra Q3.86
NOTA: El ánalisis de costos realizado en las tablas de este apéndice no incluyen los
gastos concernientes a la depresiación de equipo, así como tampoco los relacionados los
gastos de servicios (agua, luz, mobiliario, etc.) o utilización de las instalaciones físicas.
Tampoco se incluyen los gastos de extracción de ADN, ya que es el mismo
procedimiento realizado en ambos métodos, por lo que no resulta útil para fines
comaparativos de costos.
AD-R-0013
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 023-2007 1a.
Investigador Principal: MÉLANY DÁMARIS VELÁSQUEZ GÓMEZ 2a. PRÓRROGA AL 31/11/2008
Monto Autorizado: Q75,000.00 3a. PRÓRROGA AL 28/02/2009
Fecha de Inicio y Finalización: 01/08/2007 AL 31/05/2008 10 MESES
Menos (-) Mas (+)
1 Servicios No Personales
122 Impresión, encuadernación y reproducción 1,500.00Q 690.00Q 810.00Q -Q
133 Viáticos en el interior 1,440.00Q 240.00Q 1,680.00Q -Q
181 Estudios,investigacionesy proyectos de factibilidad 28,000.00Q 20,000.00Q 8,000.00Q
185 Servicios de capacitación 7,600.00Q 7,600.00Q -Q
189 Otros estudios y/o servicios 3,000.00Q 3,000.00Q -Q
2 Materiales y Suministros
241 Papel de escritorio 350.00Q 280.62Q 69.38Q
243 Productos de papel o cartón 449.26Q 1,880.00Q 2,327.68Q 1.58Q
244 Productos de artes gráficas 54.90Q 54.90Q -Q
262 Combustibles y Lubricantes 900.00Q 200.00Q 100.00Q 789.38Q 10.62Q
261 Elementos y compuestos químicos 3,916.00Q 3,916.00Q -Q
267 Tintes, pinturas y colorantes 600.00Q 477.00Q 123.00Q
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 1,200.00Q 2,916.01Q 3,002.00Q 1,236.96Q 49.03Q
269 Otros productos químicos y conexos 26,142.56Q 6,759.99Q 363.10Q 19,745.67Q -Q
291 Útiles de oficina 300.00Q 520.00Q 814.90Q 5.10Q
295 Útiles menores, médico-quirúrgicos y de laboratorio 570.00Q 7,808.20Q 7,238.20Q -Q
299 Otros materiales y suministros 650.00Q 98.20Q 370.19Q 181.61Q
3 Propiedad, planta y equipo
9 Asignaciones Globales
(-) Gastos Administrativos (10%) 6,818.18Q 6,818.18Q -Q
TOTAL Q75,000.00 Q21,834.20 Q21,834.20 Q66,559.68 Q8,440.32
Monto Autorizado 75,000.00Q Disponibilidad: 8,440.32Q
( -) Ejecutado 66,559.68Q
Sub-total 8,440.32Q
( -) Apertura de Caja Chica
Total por Ejecutar 8,440.32Q
CATORCEAVA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
En Ejecuciòn
Detección de fitoplasmas en papatya por medio de hibridización de ácidos nucleicos con sondas no
radioactivas y su caracterización mediante RPLP´S
Ejecutado Renglon Pendiente de
Ejecutar
PRÓRROGA AL31/10/2008
Grupo
TRANSFERENCIA
Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria
PA
RT
E V
V.1
IN
FO
RM
E F
INA
NC
IER
O
85