Reacción en cadena de la polimerasa1 INTRODUCCIÓN

Reacción en cadena de la polimerasa (RCP), técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La RCP puede utilizarse para identificar individuos a partir de cantidades mínimas de tejidos o sangre, para diagnosticar enfermedades genéticas y para investigar la evolución.

La RCP fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo.

La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios muy variados, desde la investigación forense hasta el diagnóstico clínico.

2 FUNCIONAMIENTO DE LA RCP

La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales (véase Genética).

La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llama cebador oligonucleotídico; está formado por varios nucleótidos que inician la replicación. La RCP utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla.

La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada templado, la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55 ºC durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerización, la

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temperatura de la mezcla se eleva hasta 75 °C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN.

Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de RCP, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de RCP se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN.

La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de RCP resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzima en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la RCP se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq. Inicialmente se extraía de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en los manantiales de agua caliente del Parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos). Como la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la RCP, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genéticamente.

El uso de la RCP exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación.

3 APLICACIONES

Como bastan pequeñas cantidades de muestras de ADN relativamente poco refinadas, la RCP se ha convertido en un valioso instrumento de investigación en biología y medicina clínica y forense (aplicación del conocimiento científico al trabajo de investigación policial).

En la investigación biológica la RCP ha acelerado el estudio de la función de los genes, la cartografía genética y la evolución. En la investigación de la función de los genes se utiliza la RCP para obtener copias de genes individuales, cuyas actividades pueden estudiarse y definirse con mayor precisión. La cartografía genética (véase Proyecto Genoma Humano) recurre a la RCP para obtener copias múltiples de regiones determinadas del ADN humano. Estas regiones pueden examinarse a continuación para comprobar si están vinculadas con enfermedades genéticas, como la fibrosis quística.

También se ha beneficiado de la RCP el estudio de la evolución. Los científicos la han utilizado para estudiar el ADN de insectos atrapados hace miles de años en gotas de ámbar. Aun cuando gran parte de ese ADN ha perdido su estructura, se conserva todavía intacta una cantidad suficiente para ser multiplicada mediante la RCP para comparar el resultado con el observado en insectos actuales.

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En medicina, la RCP resulta particularmente útil en el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas. Las muestras de ADN obtenidas del feto mediante amniocentesis (extracción de una pequeña cantidad de líquido del útero materno) se analizan ahora en sólo unas horas. Antes era necesario cultivar células fetales en un medio nutritivo especial durante varias semanas para poder realizar análisis bioquímicos. La RCP también se ha utilizado en células tomadas de embriones de sólo unas horas de edad fertilizados in vitro (en un tubo de ensayo) para determinar si están exentos de enfermedades. A continuación, el embrión se implanta en el útero materno para iniciar un embarazo normal.

Otras aplicaciones médicas de la RCP son la identificación de virus, bacterias y células cancerosas en tejidos humanos. Puede utilizarse incluso con células individuales aplicando una variante llamada RCP in situ para identificar tipos celulares específicos.

En medicina forense la RCP ha revolucionado la identificación de delincuentes. Las pruebas de tipificación de ADN basadas en RCP pueden crear ‘huellas dactilares’ (véase Pruebas de ADN) que identifican sin ambigüedad a cualquier persona. Estas pruebas permiten también excluir o implicar a sospechosos basándose en pequeñas cantidades de sangre, piel, pelo o semen recogidas en el escenario del delito.

La RCP se ha utilizado para seguir la pista a residuos industriales y otros productos. Se añaden en origen pequeñas cantidades de ADN de un tipo conocido a lotes de explosivos, derivados del petróleo, venenos, y otros residuos, que quedan así definitivamente etiquetados. Estas etiquetas de ADN pueden recuperarse a partir de fangos u otros contaminantes recogidos en vías de agua públicas (véase Contaminación del agua), por ejemplo, y multiplicarse mediante RCP para comparar el resultado con las listas que mantienen los fabricantes de las etiquetas. Una coincidencia es una prueba con mucho peso que puede inculpar al responsable de la contaminación.

1. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADNLa Hemogenética Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner describe el sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicos de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos.

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Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructura y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudia básicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinado número de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos). Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su aplicación en la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Genética de la Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalística fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica). Jeffreys descubrió la existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos de longitud variable. Estudios posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones consistían en un determinado número de repeticiones en tándem de una secuencia central, el cual variaba de unos individuos a otros.  El primer locus de ADN polimórfico fué descubierto por Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de más de 15 longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos. Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependían del número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number of Tandem Repeat”).Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.

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En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la técnica llamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta básicamente de las siguientes etapas:

1. Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un ADN de alta molecularidad.

2. Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.

3. Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados. 4. Transferencia de las cadenas simples a una membrana de

nitrocelulosa o nylon y fijación de las mismas por medio de calor (80ºC).

5. Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares de unión inespecíficos que pudiera haber en la membrana.

6. Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).

7. Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.

8. Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para una región de un determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucleótidos y presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como

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resultado se observan una o dos bandas por individuo, según sea homocigoto o heterocigoto. El patrón de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o “DNA profiling”Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatélites presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucleótidos que se repiten múltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por persona. Este patrón de múltiples bandas se conoce como huella genética multilocus o “DNA fingerprint”.  

Sondas multilocus Sondas unilocus

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de parámetros como son:

Información aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad discriminativa al aparecer múltiples bandas. No obstante, las mono-locus son más específicas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor tamaño.Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario a la sonda esté intacto. Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las mono-locus son exclusivas de ADN humano.

A pesar de que el análisis SLP ha sido y es bastante útil en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicación

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a la Criminalística ya que presenta una serie de inconvenientes como son:

La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y 100 ng, cantidad difícil de conseguir en casos de criminalística en los que los indicios biológicos encontrados son mínimos. En cuanto a la calidad del ADN, en la práctica forense es muy difícil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un análisis con sondas mono-locus.El tiempo requerido para este tipo de análisis es de dos o tres días.El hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que normalmente, con el primer análisis se consume la totalidad de la muestra, con lo que se dificultan contrapericias y una posterior revisión del caso.

Todas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicación en Genética Forense de una técnica, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (“PCR”), que supuso una revolución en muchos campos de la Biología y de la Medicina.El estudio de indicios biológicos por PCR ha permitido la resolución de un gran número de casos en Criminalística que hasta entonces eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su análisis por RFLP. Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. 

2.  Análisis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)2.1 GeneralLa reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la

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región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.

2. HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente: 

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T). No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará

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de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.

3. EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.

Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

2.2  Componentes de la PCR2.2.1  BUFFER DE AMPLIFICACIÓN Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El MgCl2 es el componente que más influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la polimerasa. La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.2.2.2  PRIMERS A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:

La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad. Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de 5ºC). La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%).

La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-

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2 bases púricas.Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.

Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero.

2.2.3  DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para cada uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una concentración de 1.5 mM.

2.2.4  TAQ-POLIMERASA Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de

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urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de etanol.  2.2.5  ADN MOLDE O “TEMPLATE" Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores: Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado está en torno a los 5 ng.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificación.

ADYUVANTES DE LA PCR Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque algunos autores han recomendado el uso del DMSO y del glicerol, el adyuvante más extendido y utilizado es

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el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa.La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las técnicas de análisis genético utilizadas con anterioridad, como son:

Su capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de ADN es mínima o en casos en los que el ADN esté parcialmente degradado.Genera en un espacio corto de tiempo un elevado número de copias de la secuencia de ADN que es objeto de estudio, lo cual permite utilizar técnicas de visualización más sencillas y rápidas que el uso de sondas marcadas radioactivamente.Permite la determinación y agrupación alélica en clases discretas, lo que facilita la elaboración de bases de datos al ser la estandarización inmediata y posibilitar la aplicación de métodos bioestadísticos y programas elaborados.

El uso de marcadores microsatélites de pequeño peso molecular aumenta las probabilidades de obtener resultados positivos de amplificación cuando el ADN se encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido digeridos. Esta ventaja es de gran importancia en Criminalística ya que normalmente los indicios biológicos encontrados han estado sometidos a diversos factores (calor y humedad) que favorecen el crecimiento bacteriano.Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR que es su elevada sensibilidad puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se podría coamplificar un ADN extraño o ajeno al que nos interesa. No obstante, en los laboratorios de Genética Forense las medidas de precaución que se toman para evitar problemas de contaminación por manipulación son extremas.Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en función de su tamaño por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Genética Forense:

Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida Electroforesis capilar

La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de la Genética Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical. En este caso el proceso electroforético es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50 mm

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de diámetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por láser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados. La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de electroforesis vertical como son:

Rapidez: ya que permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos posean alelos con tamaños solapantes.Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN amplificado.Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas de interpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través de programas informáticos.

Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

 

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Caso de estudio biológico de la paternidad realizado con electroforesis capilar. Cada pico corresponde a un alelo, el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro del padre (P) para que la paternidad sea compatible

HIBRIDACIÓN DEL DNA

Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de moléculas de DNA de distinto origen la renaturalización se conoce como hibridación. Una característica importante de la hibridación es que no sólo se puede producir entre dos DNA distintos, sino también entre DNA y RNA, siempre que sus secuencias de nucleótido sean complementarias.

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La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.

las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre,entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento,interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten

manipular el genoma de un ser vivo.

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales,

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bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:

o Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.

o Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

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En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque

sea de una especie diferente.

2. En la siguiente animación puede verse "en vivo" la actuación de las enzimas de restricción.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

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TECNOLOGÍAS GENÉTICAS

Los científicos han desarrollado una serie de técnicas bioquímicas y genéticas mediante las cuales el ADN puede ser separado y transferido de una célula a otra. Algunos de esos métodos de laboratorio ayudan a los investigadores a estudiar las propiedades de los genes en la naturaleza (permiten, por ejemplo, comparar los ADN de diferentes animales para establecer distancias evolutivas). Otras técnicas de ADN constituyen herramientas básicas en el campo de la ingeniería genética (alteración de genes de un organismo). Esas herramientas son utilizadas en la industria para desarrollar productos comerciales tales como cosechas más resistentes a la desecación o a las plagas, microorganismos capaces de descomponer compuestos contaminantes como hidrocarburos o petróleo, o capaces de producir determinados compuestos útiles en medicina en grandes cantidades como la insulina, el interferón o determinadas vacunas.

ADN recombinante

Las moléculas de ADN de cualquier forma de vida tienen la misma estructura y están constituidas por las mismas cuatro bases nitrogenadas, por lo que los científicos han utilizado esas similitudes para introducir uno o más genes de un organismo en otro diferente. Estos nuevos genes llegan a ser funcionales en el organismo receptor y a producir la proteína deseada. Esta tecnología del ADN recombinante es la que se ha utilizado para obtener grandes cantidades de determinadas proteínas como la insulina, necesaria para los enfermos diabéticos. Inicialmente la insulina se obtenía del ganado vacuno, pero era un

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proceso demasiado largo y costoso. El primer paso para obtener insulina utilizando la tecnología del ADN recombinante fue conocer la secuencia de nucleótidos del gen en la célula humana y emplear enzimas de restricción (proteínas especializadas que actúan como tijeras moleculares) para cortar la doble hélice de ADN y obtener el gen completo que codifica dicha proteína. Posteriormente, este fragmento de ADN es ligado a un vector, es decir, a otra molécula de ADN que permite transportar los genes de un organismo a otro. El vector que contiene el gen de insulina es introducido en una bacteria, como por ejemplo Escherichia coli, que producirá en unas pocas horas millones de células que contienen copias exactas del gen productor de insulina insertado por los científicos. El proceso de fabricar muchas células con ADN idéntico se conoce como clonación.

Genotecas o librerías de ADN

Una librería de ADN es un almacén de información genética que se mantiene en una bacteria como los libros en una biblioteca. Esas bacterias son clones creados con la tecnología del ADN recombinante y suponen una fuente constante de fragmentos de ADN necesarios para multitud de investigaciones. Una genoteca puede contener el genoma completo de un organismo troceado en pequeños fragmentos. Por ejemplo, para crear una librería del genoma humano todos sus cromosomas deben cortarse en pequeñas piezas que serán unidas al azar en vectores (por ejemplo plásmidos o bacteriófagos) e introducidos en una población de bacterias.

Electroforesis

Esta técnica permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño al aplicar una corriente eléctrica a un gel en el interior del cual se ha introducido una mezcla de fragmentos. Éstos comienzan a moverse desde el polo negativo al polo positivo de tal modo que los fragmentos más pequeños se mueven más rápido que los más grandes. Cuando la corriente cesa, los fragmentos de ADN se han distribuido a lo largo del gel, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado. Adicionalmente puede utilizarse una secuencia complementaria de un ADN como sonda para buscar un fragmento específico en el patrón de bandas. Por ejemplo, los científicos pueden usar el ADN encontrado en la sangre presente en la escena de un crimen como sonda para buscar fragmentos complementarios en electroforesis conteniendo ADN obtenido de diversas personas sospechosas.

Secuenciación de ADN

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Una vez que un fragmento interesante de ADN se ha aislado o identificado, los científicos necesitan determinar si la secuencia de nucleótidos de dicho fragmento es un gen conocido o qué clase de proteína puede estar produciendo. Esta técnica permite determinar la secuencia específica (el orden preciso de bases nucleótidas) de un fragmento de ADN. La mayoría de los tipos de secuenciación utilizan la técnica de extensión de oligonucleótido ideada por el británico Frederick Sanger. Esta técnica se puede utilizar por ejemplo para detectar mutaciones relacionadas con enfermedades tales como la fibrosis quística, o bien para alterar la secuencia de un gen y estudiar la función de la proteína resultante.

La tecnología denominada huella de ADN (DNA fingerprinting) permite comparar muestras de ADN de diversos orígenes, de manera análoga a la comparación de huellas dactilares. En esta técnica los investigadores utilizan también las enzimas de restricción para romper una molécula de ADN en pequeños fragmentos que separan en un gel al que someten a una corriente eléctrica (electroforesis); de esta manera, los fragmentos se ordenan en función de su tamaño, ya que los más pequeños migran más rápidamente que los de mayor tamaño. Se puede obtener así un patrón de bandas o huella característica de cada organismo. Se utiliza una sonda (fragmento de ADN marcado) que hibride (se una específicamente) con algunos de los fragmentos obtenidos y, tras una exposición a una película de rayos X, se obtiene una huella de ADN, es decir, un patrón de bandas negras característico para cada tipo de ADN.

Un procedimiento denominado secuenciación de ADN permite determinar el orden preciso de bases nucleótidas (secuencia) de un fragmento de ADN. La mayoría de los tipos de secuenciación de ADN se basan en una técnica denominada extensión de oligonucleótido (primer extension) desarrollada por el biólogo molecular británico Frederick Sanger. En esta técnica se lleva a cabo una replicación de fragmentos específicos de ADN, de tal modo que el extremo del fragmento presenta una forma fluorescente de una de las cuatro bases nucleótidas. Los modernos secuenciadores de ADN parten de la idea del biólogo molecular estadounidense Leroy Hood, incorporando ordenadores y láser en el proceso.

Gilbert no pensaba en un principio descubrir un método de secuenciación (determinación de la secuencia de bases de un ácido nucleico). La idea surgió mientras realizaba experimentos para romper las cadenas de ADN en puntos concretos. Una cadena de ADN está compuesta por unidades estructurales denominadas nucleótidos. Cada nucleótido contiene una de las cuatro bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). La citosina sólo se puede unir con la guanina, y la adenina sólo con la timina. Gilbert sabía que el

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sulfato de dimetilo, un veneno industrial, rompe las cadenas de ADN en los lugares donde existen las bases A o G, y que la hidracina, un compuesto gaseoso, debilita los lugares de las bases C y T. Tras realizar experimentos con diferentes combinaciones, desarrolló cuatro compuestos químicos que rompían el ADN sistemáticamente en los lugares de las cuatro bases. Separando los fragmentos de ADN en función de su longitud a través de un gel fino, fue capaz de capturar sus imágenes en papel fotográfico. Así se consiguió un mapa completo del orden de las bases de la cadena original de ADN. Al mismo tiempo que Gilbert perfeccionaba su método, el bioquímico británico Frederick Sanger desarrolló una técnica diferente para determinar la secuencia. Ambas técnicas se han utilizado ampliamente.

Los científicos ya han completado la secuenciación del material genético de varios microorganismos incluyendo la bacteria Escherichia coli. En 1998 se llevó a cabo el reto de la secuenciación del genoma de un organismo pluricelular, un gusano nematodo conocido como Caenorhabditis elegans. En el año 2000 se descifró el material genético de la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) y de la planta Arabidopsis thaliana, entre otros organismos. Pero el acontecimiento más importante, dentro de este grupo de investigaciones, fue el desciframiento del genoma humano llevado a cabo en febrero de 2001, de manera independiente, por el consorcio público internacional Proyecto Genoma Humano y la empresa privada Celera Genomics.

Manipulación de ácidos nucleicos

Tanto el ADN como el ARN pueden ser aislados desde tejidos o células de humanos o de animales de experimentación empleando técnicas bioquímicas estándar. Posteriormente, dichos ácidos nucleicos pueden ser manipulados de diversas formas y con diversos propósitos los que incluyen desde protocolos experimentales a exámenes de laboratorio de diagnóstico genético.

Corte del ADN mediante enzimas de restricción:Las enzimas de restricción (ERs) se usan como tijeras moleculares para cortar el ADN en sitios específicos. Estas endonucleasas reconocen una secuencia específica del ADN y lo cortan cerca o dentro del sitio de reconocimiento. Las ERs de uso más frecuente en el laboratorio reconocen secuencias de 4 a 6 pares de bases. Para un ADN en particular una ER producirá un número determinado de fragmentos dependiendo del número y de la localización de sus sitios de reconocimiento. Por esta razón las ERs constituyen una herramienta muy valiosa para caracterizar secuencias génicas. El análisis del patrón de digestión de determinados genes es una herramienta útil en el

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estudio de mutaciones ya que al modificarse la secuencia de un gen los sitios de corte resultan modificados. Actualmente el diagnóstico de algunas enfermedades genéticas como la hemocromatosis se efectúa analizando el patrón de digestión de un trozo de ADN específico. Las ERs son también de gran utilidad para "clonar" fragmentos de ADN, tal como se describe más adelante.

Separación de fragmentos de ADN por tamaño:Es posible separar una mezcla de moléculas de ADN mediante electroforesis en un gel de agarosa. Para ello se someten las moléculas de ADN que están inmersas en el gel a la fuerza de un campo eléctrico: como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el ánodo, migrando más rápidamente los fragmentos más pequeños.Las moléculas de ADN separadas se pueden visualizar mediante su tinción con bromuro de etidio, un colorante que se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta.Para determinar el tamaño del fragmento de ADN de interés se carga en el mismo gel una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar), los cuales sirven como referencia de peso molecular (Figura 3).

Este método se utiliza normalmente para separar fragmentos de ADN producidos por cortes con ERs y permite determinar el tamaño de los fragmentos generados. Si se analiza el mismo ADN con otras ERs se puede generar el llamado "mapa de restricción" de un gen con la localización de los sitios de reconocimiento de varias enzimas. Este mapa se puede comparar con el mapa de restricción de otras muestras de ADN, permitiendo, por ejemplo, la detección de deleciones u otros reordenamientos de un gen.

"Clonamiento" del ADN: ¿Que significa "clonar" un fragmento de ADN?

Es la manipulación genética que permite copiar ADN in vivo produciendo numerosas moléculas idénticas o "clones" del mismo. Con las técnicas de biología molecular actuales es posible aislar un ADN con la secuencia de interés y propagarlo en un organismo adecuado. Esto permite obtener cantidades ilimitadas del gen de interés, lo que facilita enormemente su estudio.La metodología general para clonar ADN se ilustra en la figura 5.

Un fragmento de ADN, obtenido generalmente por corte del ADN con ERs, se une covalentemente por medio de la enzima ADN ligasa a un vector o plásmido, que ha sido digerido con la misma enzima de restricción utilizada para preparar el ADN de interés. De esta manera se genera una molécula nueva y única denominada recombinante. El vector utilizado contiene por un lado, secuencias que le permiten replicarse (origen de replicación) y por otro lado, secuencias para su posterior selección (por ejemplo genes que confieren resistencia a antibióticos específicos).

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El paso siguiente consiste en introducir la molécula de ADN recombinante a un microorganismo adecuado. Para ello se usa generalmente una cepa de laboratorio de la bacteria Escherichia coli. Las bacterias que llevan el ADN recombinante son seleccionadas por su resistencia al antibiótico codificado por el plásmido. Las bacterias que incorporan el vector lo replican, por lo que contienen varias copias del mismo plásmido recombinante. Como es posible cultivar cantidades casi ilimitadas de estas bacterias se puede amplificar la molécula recombinante, y por lo tanto purificar grandes cantidades del plásmido.Con la misma metodología es posible obtener plásmidos recombinantes que permitan expresar en gran cantidad una proteína de interés. En este caso se requiere que el vector contenga secuencias que dirijan en forma eficiente la transcripción y traducción del gen en bacterias. De esta manera se puede producir grandes cantidades de proteínas recombinantes, incluso a nivel industrial. Ejemplo de ello es la producción entre otros de insulina y factor de crecimiento recombinante los cuales ya están disponibles para uso clínico.

Transferencia e hibridación de ácidos nucleicos: Southern y Northern:La técnica de hibridación Southern se utiliza comúnmente para identificar genes en el genoma humano. El ADN digerido con una ER, y separado por electroforesis es desnaturado por tratamiento con álcali y luego transferido a una membrana o soporte (Figura 6).

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Figura 6. Transferencia e Hibridación Southern. En este ejemplo el ADN A corresponde al ADN genómico de un individuo normal, y el ADN B corresponde al ADN genómico de un individuo con una enfermedad genética. La sonda utilizada para detectar al gen X hibrida con un fragmento de mayor tamaño en el ADN B debido a que como consecuencia de un reordenamiento del ADN en la región del gen X ha cambiado la localización de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción utilizada en la digestión del ADN.

Luego se incuba la membrana con una "sonda" marcada radioactivamente que es complementaria al fragmento de ADN que se quiere detectar. Como sonda se puede utilizar ARN purificado, ADN obtenido por clonamiento, o un oligonucleótido sintético. Como el ADN de la membrana se encuentra desnaturado (se han separado las dos hebras del ADN) es capaz de aparearse con el fragmento de ADN complementario, proceso que se denomina hibridación.Posteriormente, se lava el exceso de sonda no hibridada y es posible detectar el fragmento que contiene la secuencia deseada exponiendo la membrana a una película radiográfica. Esta técnica se denomina transferencia e

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hibridación Southern en honor a su descubridor. Esta técnica ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, en particular para detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes, como por ejemplo en la enfermedad coreica de Huntington y en la fibrosis quística.La variante del método aplicada al análisis de ARN se denomina "Northern". En ella se utilizan sondas de ADN que hibridan con secuencias de ARN complementarias. Esta es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARN mensajero) y de su regulación ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies de ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas.

Secuenciación del ADN:El método más utilizado para secuenciar ADN es el de los didesoxinucleótidos desarrollado por Sanger y cols. en 1977. Este consiste en sintetizar ADN in vitro en presencia de nucleótidos artificiales (didesoxinucleotidos), que impiden la extensión de la cadena de ADN cuando se incorporan a la hebra en crecimiento. La reacción se realiza simultáneamente en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene una mezcla de nucleótidos y un didesoxinucleotido (ddA, ddG, ddC ó ddT). De esta manera se obtiene en cada tubo una población de moléculas de ADN de distintos tamaños que pueden ser analizados mediante electroforesis en gel (Figura 7). Para detectar el ADN se utilizan nucleótidos marcados o fluorescentes. Para visualizar el ADN los geles se exponen a un film de rayos X o se procesan en instrumentos capaces de medir fluorescencia. La secuencia es "leída" siguiendo los fragmentos de menor a mayor tamaño (Fig. 7).

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Figura 7. El método de los didesoxinucleótidos para la secuenciación del ADN. Con este método se obtiene una población de fragmentos de ADN de distinto largo, cada uno de los cuales contiene en su extremo 3' un tipo particular de didesoxinucleótido (ddG, ddA, ddT óddC). Los productos se separan por electroforesis en gel. La secuencia del ADN es leída desde los fragmentos más pequeños a los más grandes. En este ejemplo se muestra las autorradiografías de geles de secuencia de una región codificante del gen supresor de tumor p53 en dos muestras de ADN: a) muestra de ADN de un individuo normal; b) muestra de ADN de un individuo con un tumor vesicular. Las secuencias obtenidas difieren en un nucleótido, el que se indica con una punta de flecha, lo que genera un cambio de codón en la secuencia de ADN del individuo con cáncer: en lugar de un codón TCC (Ser) en la posición 241 la secuencia leída es TTC (Phe).

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LA HUELLA GENETICA.

Los recientes avances en Biología, especialmente en el conocimiento de la estructura y funciones del ADN han producido una verdadera revolución en las técnicas de identificación individual por lo que la Medicina Legal y la Antropología Forense pueden hoy disponer de unas poderosas herramientas de trabajo que permiten resolver con mucha seguridad algunos de los complicados problemas que se nos plantean. La propiedad del polimorfismo del ADN ha permitido además, su aplicación en muchos campos de la investigación científica que vamos a revisar brevemente.

Cada célula de nuestro organismo posee 46 cromosomas (23 pares) formados por ADN (ácido desoxirribonucleico) que contienen en sus complejas estructuras el Código genético. Este ADN está formado por nucleótidos dispuestos en una doble cadena helicoidal y compuestos a su vez por un azúcar, pentosa (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Estos azúcares y fosfatos son iguales, mientras que las bases son diferentes, lo que permite distinguir cuatro tipos de nucleótidos cuyas bases les dan nombre: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Las bases se unen unas con otras de una manera especial, las A con las T, y las G con las C (A-T, G-C) por medio de puentes de Hidrógeno, dos y tres respectivamente. La mitad del ADN del genoma humano es no codificante y de éste, la mitad es repetitivo (aprox. un 25 % del ADN total). A su vez, la mitad de éste, lo forman secuencias repetidas de dos clases: SINES o elementos dispersos cortos de 500 bp y LINES o elementos dispersos largos, de más de 500 bp.

La otra mitad es el ADN repetido en tandem, parte del cual son los llamados satélites (I, II, III y IV) y los minisatélites, formados por escasos bp, que son los que tienen más capacidad individualizadora. Las unidades en tandem son de 15 a 20 bases que se pueden repetir de 200 a 1.400 veces.

Jeffreys y col. (Nature, 314, 1985) señalan que el genoma humano contiene muchas regiones minisatélites dispersas en tandem, muy polimórficas debido a la variación alélica que se produce al repetirse. Precisamente éste es el motivo de que las pruebas basadas en la repetición de los tandem de una secuencia permitan detectar muchos loci muy variables simultáneamente lo que proporciona así una huella genética específicamente individual muy útil en el análisis de materiales diversos.

Las moléculas de ADN que constituyen los cromosomas son de gran longitud midiéndose en Kilobases (Kb). Cada Kb equivale a 1.000 pares de bases (bp). Para darnos idea de esta longitud señalaremos que el cromosoma X mide 150.000 Kb y el Código genético una longitud de 3.000 millones de bases.

Los análisis de ADN se basan en la propiedad que tienen sus cadenas de ser rotas por métodos físicos o químicos a nivel de las uniones de Hidrógeno, obteniéndose así segmentos de ADN de cadena simple con capacidad para ser duplicados formándose ADN de doble cadena. Para analizar el polimorfismo del ADN usamos las llamadas sondas o segmentos de ADN marcados con

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algún elemento radiactivo (P32), enzimas u otros, consiguiendo que se unan éstos con el ADN complementario (hibridación).

Al cortar el ADN por los lugares adecuados, podemos detectar diferencias en la longitud de los fragmentos (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) y polimorfismos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats).

Las sondas utilizadas pueden ser multilocus con las que se consigue el llamado "DNA fingerprint" al unirse la sonda a muchos loci. Y pueden ser monolocus o unilocus que detectan loci VNTR individuales muy polimorfos.

 APLICACIONES      Los exámenes tradicionales de manchas de sangre en los Laboratorios de Medicina Legal, o los de manchas de semen, raíces de pelos o cabellos, tratan de determinar el sistema ABO, Hemoglobina (Hb), Peptidasa, Fosfoglucomutasa, Rh, Anhidrasa carbónica, ADA, AK, Fosfatasa ácida eritrocítica y otros más. Pero tienen la limitación de que los materiales analizados han de ser recientes. Al mes, estos productos han sufrido una a veces insalvable degradación. Otras muestras como las de semen que contienen enzimas proteolíticas, o bien debido a la actividad bacteriana, pueden producir múltiples errores.

En cambio el ADN puede servir como huella genética y ser analizado en muestras de gran antigüedad como veremos más adelante. De manchas de sangre y semen de 3 a 5 años de antigüedad es perfectamente posible obtener ADN suficiente para aislar huellas genéticas capaces de determinar la identificación individual.

La violación ha sido uno de los delitos más frecuentes en todos los tiempos, una forma de agresión sexual en la guerra y en la paz. Castigada por los Códigos penales antiguos y modernos, ha planteado con frecuencia tremendas dudas a la Justicia sobre el hecho de si hubo o no hubo consentimiento por parte de la víctima, además de averiguar quién fué realmente el agresor. Los exámenes externos permitieron casi siempre comprobar la existencia de rotura del himen en las vírgenes, el estado de las carúnculas mirtiformes, con la excepción de los llamados "hímenes complacientes" cuya notable elasticidad permite la "inmisio penis" sin producir lesión visible. La presencia de semen en la cavidad vaginal, las lesiones del cuerpo de la víctima y el caso extremo pero no infrecuente de la muerte violenta de ésta tras la violación o precediendo a ésta, complicaron más las situaciones.

Hasta hace pocos años se determinaba el HLA, antígeno que está presente en todas las células del organismo y que constituye una huella notable, con la probabilidad de 1/40.000 de que dos personas no emparentadas presenten el mismo resultado. Pero el HLA tiene el inconveniente de ser sumamente frágil, pudiendo destruirse en cuestión de horas, lo que a menudo sucede en los casos de violación hasta que la víctima es examinada.

El estudio del ADN por medio de "sondas", permite interrogar al Código genético de las secreciones del delincuente y recibir una respuesta muy precisa. JEFFREYS, GILL y WERRETT (Nature, 316, 1985) realizando

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investigaciones detalladas en el Home Office Forensic Service, llegaron a este descubrimiento. En el semen del violador como en el de toda célula de cualquier persona, está contenida su huella genética, una huella tan precisa o más que la huella dactilar tradicional que permite llegar a la identificación individual con gran exactitud y precisión.

La probabilidad de que haya dos huellas iguales es de 1/6.300.000.000. Por eso se dice con razón huella genética como se dice huella dactilar a los dibujos de las yemas de los dedos que también son específicas de cada persona.

Hay otras huellas específicas en el organismo humano que permiten al Antropólogo Forense llegar a la identificación del cuerpo o fragmentos de él, por ejemplo, los senos frontales (su forma, tamaño y disposición), las Líneas de Harris o líneas de detención del crecimiento de los huesos largos, en especial de las tibias; la estructura, forma, tamaño, número y disposición de los dientes, la fórmula dentaria (la cavidad bucal ha sido llamada por eso la "caja negra" de nuestro cuerpo comparándola a la que llevan los aviones y que permite averiguar la causa de los desastres aéreos), el HLA, el grupo sanguíneo, etc.

Pero la huella genética procedente del alfabeto genético permite estudiar desde este punto de vista tejidos orgánicos como la raíz de los pelos, los leucocitos de la sangre, los espermatozoides, la piel, el líquido amniótico o cualquier célula humana y encontrar en el núcleo de la misma el patrón genético que caracteriza a cada individuo.

El investigador estudia la muestra tomada de la vagina de la mujer violada y el semen del sospechoso, los compara y dictamina si se trata de la misma persona, realizando para ello la hibridación del material sospechoso y del testigo, marcando la localización de los minisatélites y viendo si se corresponden unos con otros.

Cinco mm3 de sangre o semen bastan para identificar a un culpable. El examen de Laboratorio permitirá ver en el ADN extraído varias decenas de bandas parecidas a los códigos de barras utilizados en los productos comerciales, de diverso espesor y longitud nunca iguales en dos personas, que proceden a partes iguales del padre y de la madre del sujeto analizado.

La investigación de la paternidad después de violación o incesto puede ser establecida por la determinación de grupos eritrocíticos, grupos HLA y enzimas eritrocíticos, efectuados en células de líquido amniótico o de vellosidades coriales. MANGIN y col. (J.Med.Leg.Droit Médicale, 34, 1991) estudiaron 10 casos de aborto consecutivo a agresión sexual (violación e incesto). En todos los casos pudieron determinar la huella genética del feto y comparando con la huella genética de la madre, se pudo determinar el alelo transmitido por el padre al feto. Posteriormente se practicó la búsqueda de este alelo en el material genético del sospechoso. Esto fué posible en 8 de los 10 casos. En un caso el sospechoso fué descartado. En el décimo caso no se pudo hacer la comparación por no hallarse al agresor.

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Hay dificultades en los casos de los fetos macerados. Es fácil en los casos de preñez reciente cuando se puede disponer de tejidos trofoblásticos. La degradación del ADN fetal en fetos macerados ha hecho a veces imposible el análisis. Sin embargo en algunos casos aún es posible obtener buen material para el análisis, del vértice del pulmón y del encéfalo por ser zonas más protegidas por las estructuras óseas.

El ADN es muy útil para la determinación de la paternidad. Sabiendo que en cualquier persona la mitad del genoma procede del padre y la otra mitad de la madre, en el supuesto de que haya dos individuos sospechosos de ser el padre de una criatura, bastará comparar las bandas halladas en las huellas genéticas del hijo, de la madre y de los sospechosos. Las bandas correspondientes a la madre se eliminan y quedan las del verdadero padre. Se comparan éstas con las del sospechoso o sospechosos y aparecerá con claridad si es alguno de ellos por la coincidencia visible que se produce en el espesor y situación de estas bandas. La probabilidad de error será de una entre un millón en los exámenes con sonda multilocus y si se hace con sonda monolocus repitiendo dos o tres veces se alcanza la misma probabilidad.

Debido a que en ocasiones la muestra que hay que analizar viene alterada o es escasa, el método de sondas RFLP no basta para llegar a resultados valorables. KARY MULLIS ideó otra técnica llamada PCR o Reacción en cadena de la polimerasa, por medio de la cual, con muy escasa cantidad de ADN se logran excelentes resultados. Consiste en amplificar segmentos de ADN por síntesis enzimática de secuencias específicas de ADN, utilizando el fragmento Klenow de la ADN-polimerasa. Se perfecciona posteriormente el método utilizando la Taq-polimerasa obtenida a partir de una bacteria termófila.

El PCR es tan sumamente sensible que permite analizar incluso muestras degradadas. Esta técnica presenta muchas posibilidades en Criminalística y Ciencias antropológicas en general.

VERBOVAYA e IVANOV (1991) aislaron ADN de manchas frescas de sangre, sometiéndolo a examen rutinario: digestión con endonucleasas de restricción particulares, fraccionándolo luego por agarosa-gel-electroforesis. Visualizaron con rayos ultravioleta tiñendo con Bromuro de etidio (EtBr) el gel. Así aparece un patrón de banda específico para el sexo, que depende sólo de la enzima de restricción utilizada. La técnica es excelente para la determinación del sexo en el ADN en casos criminales. También se puede realizar la determinación del sexo utilizando la reacción PCR.

EL ADN Y LA HUELLA GENETICA EN OTRO TEJIDOS             

En los estudios del ADN en diferentes tejidos se ha podido observar que el procedente del músculo cardiaco, bazo y hueso es el menos degradado, mientras que el que procede el hígado es el que más fácilmente se degrada.

No existe una correlación estricta entre el estado de degradación del ADN y la data de la muerte. Se ha encontrado ADN de elevado peso molecular en la

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pulpa dentaria en casos en los cuales las condiciones en que quedó el cadáver fueron muy adversas.

S. PÄÄBO (Nature, 314, 1985) estudió 23 momias egipcias obteniendo de ellas ADN. En uno de los casos se trataba de un niño en el que el ADN pudo ser clonizado molecularmente en un vector plásmido. En este clonus encontró dos elementos de la familia Alu de la secuencia humana repetitiva de ADN. Este análisis demostró que muestras de ADN de momias (3,4 Kb) pueden ser clonizadas y que los fragmentos de ADN parece que contienen muy pocas o ningunas modificaciones postmortem.

Las muestras estudiadas variaron desde las procedentes de la VI Dinastía (-2370 -2160 a.C.) hasta las de los tiempos romanos tardíos. Previamente rehidrataba las muestras de tejido momificado (revitalización) y hacía cortes microscópicos tiñéndolos con los métodos clásicos y con Bromuro de etidio que permite detectar pequeñas cantidades de ADN.

Halló núcleos en células de cartílagos de la oreja (en una cabeza de mujer del Museo egipcio de Berlín) y de epidermis y tejido subcutáneo de la cabeza de un hombre del Museo Viktoria de Uppsala. Si bien existían pirimidinas modificadas en el segundo caso, lo que hacía imposible su clonización, en cambio en un niño de un año momificado, procedente del Museo egipcio de Berlín, estaban excelentemente conservados los núcleos. La prueba del C14 en este caso dió una antigüedad de 2430+120.

La conservación histológica de los tejidos momificados fué mucho mejor en los tejidos superficiales y partes periféricas del cuerpo que en las más profundas, observación que también hicieron DANSELS y col. (1970) y CRADEL y col. (1981), debido probablemente a la imbibición con natrón y la consiguiente deshidratación.

Los trabajos de todos estos autores han demostrado que el ADN puede ser estable durante largos periodos de tiempo (miles de años) al menos en ciertos restos humanos y en condiciones especiales de momificación.

De gran valor antropológico es el estudio del ADN en huesos y dientes antiguos. Las enormes posibilidades que brinda para la investigación de estos restos son evidentes.

Así HAGELBERG y col. estudiando huesos muy antiguos de 300 a 5.000 años encontraron aún ADN estable en ellos (Ancient bone DNA amplified, Nature 342, 1989).

LEE y col. (Genetic markers in human bone, J.For.Sc.36, 1991) aislaron ADN de muestras de tejido óseo humano esponjoso y compacto. Fueron utilizadas para visualizarlo, técnicas como la espectrofotofluorometría y las tinciones con Bromuro de etidio en minigeles, así como para estimar la cantidad y el grado de degradación del ADN. El extenso polimorfismo detectado por este tipo de análisis de ADN está en relación con el número variable de tandems de

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repetición (VNTR) dentro de las secuencias de ADN repetitivo en el genoma humano (HUANG y col. Advances in Forensic Sc. 3 vol. Chicago 1990).

LEE y col. (J.For.Sc.36:320, 1991) para obtener ADN de huesos toman muestras de 10 a 20 mg de hueso esponjoso y 75 a 100 mg de hueso compacto. Las diversas etapas de tratamiento de estos materiales pueden resumirse así:

1. Inmersión y agitación en agua destilada fría (15 min).

2. Pase por etanol (15 min).

3. Pase por éter etílico (15 min).

4. Secado de la muestra.

5. Inmersión en N líquido por 15-30 segundos para congelarla.

6. Reducción a fino polvo.

7. Extracción del ADN de este polvillo utilizando el método que se emplea para las manchas de sangre que es el siguiente:

8. Incubación durante una noche a 37ºC con 400 L Extraction Buffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA) y 100 mM (ClNa) pH 8, conteniendo 2% SDS (Sodium dodecyl sulfato) y 4.1 sigma unidades de Proteinasa K seguido por lo menos de dos extracciones con ClH (pH 8), fenol y formol equilibrados conteniendo alcohol isoamílico (24:1 v/v).

9. El ADN se precipita con etanol 100 %, se lava con etanol 70 % y se redisuelve en TE (10 mM Tris y 1 mM Na2 EDTA, pH 7.8) buffer.

El ADN fué obtenido de 10 a 20 veces en mayor cantidad en tejido esponjoso que en compacto. Por lo menos se necesitan 50 mg o más de hueso compacto para obtener ADN. Con menos no se consiguieron resultados.

La aplicación de esta técnica al estudio del diente ha dado excelentes resultados debido a la sorprendente estabilidad del ADN contenido en la cavidad pulpar. La razón es que en ella el ADN está protegido, de manera que la contaminación y la acción bacteriana son mínimas o nulas.

SCHWARZ (1991) sometió a dientes extraídos a diversas condiciones ambientales: varios pH (3, 7, 10), temperaturas diversas (4ºC, 25ºC, 37ºC, incineración), humedad (20%, 66%, 98%), varios tipos de suelos (arena, piso del jardín y otros), agua de mar, dientes enterrados y tiempo diverso (una semana a seis meses). Además examinó dientes extraídos hacía 16 a 19 años conservados a la temperatura de la habitación.

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Aisló el ADN de las muestras en gel con objeto de determinar la concentración e integridad del ADN. Observó que la pulpa dentaria es un material muy rico en ADN. Realizó el tipo de análisis de ADN que hemos llamado RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). La incineración produjo la completa pérdida de HMW y un ADN de bajo peso molecular. Pero en la mayoría de los casos obtuvo suficiente ADN para hacer un análisis de RFLP, obteniendo de 15 a 20 microgramos de HMWDNA de la pulpa dentaria.

OTRAS APLICACIONES             

Además de las propias de la Criminalística que hemos ido citando como es el examen de indicios hallados en el lugar del crimen (semen, manchas de sangre, cabellos en la mano de la víctima, fragmentos de la piel del agresor bajo las uñas por arañazos de defensa de la víctima, etc.), en los que la huella genética puede conducir a la identificación del agresor o bien a descartar a un acusado inocente, el estudio del ADN es muy útil en Arqueología y Paleopatología. Materiales humanos antiguos han demostrado su valor diagnóstico para estudios diacrónicos en genes polimorfos de poblaciones neolíticas y paleolíticas, así como el del estudio del ADN contenido en virus de aquellos tiempos.

Se ha empleado para determinar la procedencia y descendencia de los antiguos pobladores del Valle del Nilo, así como las relaciones entre las familias faraónicas y las diversas dinastías.

El polimorfismo del ADN ha revolucionado el análisis genético humano, no sólo en el campo del diagnóstico de la identidad individual sino en el origen de las enfermedades del pasado y la evolución de las mismas a través del tiempo.

En Antropología está permitiendo estudiar el pedigree de determinados grupos de población, así como distinguir las uniones entre consanguíneos, la endogamia, etc.

En el campo de la Evolución de las especies tiene un enorme interés y a medida que se avance en su conocimiento, la huella genética nos permitirá llegar a saber quiénes fueron los antepasados directos o indirectos de una especie dada, así como la relación entre las diversas especies y su posición filogenética.

El quagga es un miembro ya extinguido de la familia del caballo. HOGUCHI y col. (Nature, 312, 1984) examinaron músculos desecados de una pieza de Museo perteneciente a un quagga, especie de cebra (Equus quagga) extinguido en 1883. De estos músculos obtuvieron ADN de bajo peso molecular. La muestra correspondía a un ejemplar muerto hacía 140 años que se encontraba conservado en el Museo de Historia Natural de Mainz (Alemania). En la comparación con el ADN obtenido de una cebra actual (Equus zebra) se obtuvo la misma señal de hibridación.

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En Antropología Forense es un método prometedor si funciona sobre todo el tipo de análisis PCR sobre ADN obtenido en huesos. Un caso frecuente que se presenta es el de determinar si un fragmento de hueso o un hueso (supuesta reliquia de un santo por ejemplo) pertenece realmente a ese santo cuyos restos en su mayor parte se encuentran bien identificados y documentados en un sarcófago de un monasterio. La comparación del ADN en ambos restos puede confirmar o por el contrario descartar que se trate de la misma persona.

De la misma forma se pueden estudiar restos dispersos de cadáveres en una gran catástrofe y saber si pertenecen a la misma persona o a personas distintas.

PORVENIR DE LA HUELLA GENETICA             

Se ha dicho que la huella genética puede llegar a substituir a la huella dactilar. Esta idea es errónea. Cada una tiene sus aplicaciones específicas. Y si bien el estudio de la huella genética ha sido un avance revolucionario en determinados casos como es el estudio del semen o la sangre para identificar a la persona a quien pertenece, no tiene nada que ver con el hallazgo de huellas dactilares sobre la superficie de un arma u otro objeto donde el criminal haya puesto sus manos.

Es como si quisiéramos comparar un plato con un paraguas. Se trata de dos métodos diferentes, complementarios en muchos casos para la investigación forense.

WERRETT menciona el caso de dos mujeres violadas y asesinadas en una población. Un joven fué acusado de ser el culpable de ambas violaciones. Se comparó su huella genética con el ADN del semen hallado en el cuerpo de ambas mujeres que era de una misma persona. Resultó que el joven tenía una huella genética diferente a la del semen del culpable y fué exculpado, al menos de las violaciones. Se propuso entonces el estudio de la huella genética de todos los hombres de la región, en total 3.300. Dice WERRRETT que aún están realizando estos análisis cada uno de los cuales dura por lo menos dos semanas.

Aquí se plantea el problema de la voluntariedad como ocurre con la prueba de la alcoholemia. La ley no puede obligar a nadie a dejarse practicar esta prueba. El hecho de negarse sin embargo, puede hacer sospechoso a un individuo. Si el violador está entre los 3.300 varones examinados, será perfectamente detectado por medio del estudio de la huella genética sin duda alguna.

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