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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES PRODUCIDOS POR EL
PINABETE ABIES GUATEMALENSIS Y CUANTIFICACIÓN DE LOS
COMPONENTES MAYORITARIOS
PROYECTO FODECYT No. 87-2006
MSc. LUCÍA NITSCH VELÁSQUEZ
Investigador Principal
GUATEMALA, DICIEMBRE 2010.
i
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-, Universidad del Valle de Guatemala. Los análisis GC-MS
fueron realizados en la Universidad Mariano Gálvez.
i
RESUMEN
El pinabete (Abies guatemalensis) se encuentra en peligro de extinción porque el aroma
de sus ramas son símbolo del tiempo de Navidad en la región de Guatemala; éstas son
cortadas en diciembre, durante el tiempo de generación de la semilla dentro del ciclo
fenológico de este tipo de abeto. Buscando contribuir a las estrategias de conservación
de esta especie endémica, y como parte de un primer paso para diseñar un producto
comercializable que en un futuro pueda generar fuentes de trabajo, en este estudio
fueron identificados y cuantificados los compuestos químicos considerados como
componentes mayoritarios en el aroma del pinabete. Las muestras de tres diferentes
lugares (Panquix, Tejutla y San José Pinula) fueron analizados y comparados. Las
emanaciones fueron extraídas con la técnica de microextracción en fase sólida (SPME
por sus siglas en inglés); la identificación fue por cromatografía de gases (GC) acoplada
a espectrometría de masas (MS); la cuantificación de 3 comoponentes fue con GC
acoplado al detector de ionización en llma. La presencia de alfa-pineno, beta-pineno,
limoneno, y cariofileno fueron confirmadas; al mismo tiempo el tricicleno –previamente
detectado en el aceite esencial- no fue detectado. La composición de las emanaciones
de la muestra de Panquix fue: alfa-pineno (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pineno
4.18E-04 mol/g*cm3 ± 3%, (±)-limoneno 4.89E-04 mol/g*cm
3 ± 5%). Las
composiciones de las muestras provenientes de diferente lugar de origin fueron
differentes, a pesar del hecho que todas ellas eran de la misma especie y eran vendidas
por el mismo olor característico. Sin embargo, los 4 componentes fueron detectados
consistentemente en el aroma de estas ramas de pinabete, y por lo tanto es
recomendable que se les incluya en el diseño del producto. Algunos de los compuestos
detectados y que serán objeto de futuros estudios son: mirceno, eugenol,
sesquiterpenoides, cetonas, ésteres de ácidos grasos, y fenilpropanoides (como
benzaldehído, ácido benzóico, y otros). Entre las técnicas y condiciones, recomendadas
para futuras investigaciones del aroma de pinabete, se encuentran: SPME en el bosque,
GC-MS utilizando el “espacio de cabeza” (headspace), todas ellas aplicadas durante el
tiempo de Navidad. Otras recomendacions son estudiar el perfil cromatográfico como
función del lugar de origen para encontrar los compuestos que son comunes en estos
pinabetes. Esto ayudará a definir cuáles son los compuestos que son los que dan el
tradicional aroma a pinabete. Estos datos pueden servir también para un análisis
quimiotaxonómico.
Palabras clave: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, microextraccion de fase sólida,
terpenoides.
ii
SUMMARY
Pinabete (Abies guatemalensis) is in danger to dissapear because its branchs aroma are
symbol of Christmas time in the Guatemalan region; those are cut in December during
the seeding time on the phenology of this fir tree. In order to contribute to conserve this
endemic specie, and as part of a first step to design a commercial product that will lead
to generate job sources in the future, in this study were identified and cuantified the
chemical compounds considered as major components in pinabete’s aroma. Samples
from 3 different places (Panquix, Tejutla and San José Pinula) were analyzed and
compared. Emanations were extracted with the solid phase microextraction technique
(SPME), identification were made by gas chromatography (GC) coupled to mass
spectrometry (MS), cuantification of 4 componentes was by GC coupled to flame
ionization detector. The presence of alpha-pinene, beta-pinene, limonene, and
cariophyllene were confirmed; at the same time tricyclene -previously founded in the
essential oil- was non-detected. The composition of Panquix sample emanations was:
alpha-pinene (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pinene 4.18E’04 mol/g*cm
3 ± 3%, (±)-
limonene 4.89E04 mol/g*cm3 ± 5%). The compositions of samples from different
origin were different, despite the fact that all of them are the same specie and are
offered for the same smell. Nevertheless, those 3 components are consistently present in
the pinabete’s aroma, and it is recommended to be included in the product design.
However, since them are common to other tree firs there are still other components to
identify and quantify to get the particular pinabete’s aroma composition. Some of the
compounds detected and that will be in the follow up of this research are: myrcene,
eugenol, sesquiterpenoids, ketones, fatty acid esters, and phenylpropanoids (such as
benzaldehyde, benzoic acid and others). Between the techniques recommended for
future research on pinabete’s aroma are SPME in the forest, headspace GC-MS, all of
them applied during Christmas time. Other recommendations are to study the
chromatographic profile as function of geographical origin to find the common
compounds that will help to define what are compounds that give the traditional
pinabete’s aroma. This data can be used for a chemotaxonomy analysis as well.
Keywords: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, solid phase microextraction,
terpenoids.
iii
CONTENIDO
Página
RESUMEN i
LISTA DE CUADROS iii
LISTA DE FIGURAS iv
LISTA DE ABREVIATURAS v
PARTE I 1
1.1 INTRODUCCIÓN 1
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
1.2.1 Antecedentes en Guatemala 3
1.2.2 Justificación 4
1.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 6
1.3.1 Objetivos 6
1.3.1.1 Generales 6
1.3.1.2 Específicos 6
1.3.1.3 Hipótesis 6
1.4 METODOLOGÍA 7
1.4.1 Las Variables 7
1.4.2 Indicadores 8
1.4.3 Estrategia Metodológica 8
1.4.3.1 Población y Muestra 8
1.4.4 El Método 8
1.4.5 Técnica Estadística 10
1.4.6 Instrumentos Utilizados 10
PARTE II 11
2 MARCO TEÓRICO 11
PARTE III 26
3 RESULTADOS 26
3.1 Discusión de Resultados 33
PARTE IV 35
4.1 CONCLUSIONES 35
4.2 RECOMENDACIONES 36
4.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 37
4.4 ANEXOS 42
4.4.1 Descripción Botánica del Pinabete 43
4.4.2 Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de
Masas (Panquix) 44
4.4.3. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de
Masas (San José Pinula) 46
4.4.4. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Detector de
Ionización de Llama 50
4.4.5. Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 51
4.4.6. Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 53
4.4.7. Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 54
PARTE V 67
5.1 INFORME FINANCIERO 67
iv
LISTA DE CUADROS Página
Cuadro No. 1, Reactivos utilizados durante el estudio. .......................................................................................... 9
Cuadro No. 2, Especies asociadas a Abies guatemalensis en diversos bosques naturales de Guatemala
.............................................................................................................................................................................. 17
Cuadro No.3, Breve historia del pinabete en Guatemala.
.............................................................................................................................................................................. 19
Cuadro No. 4, Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica.
.............................................................................................................................................................................. 21
Cuadro No. 5, Resumen de los resultados de las investigaciones fitoquímicas sobre el pinabete.
.............................................................................................................................................................................. 22
Cuadro No. 6, Resultados del tamizaje fitoquímico por reacciones químicas de extractos de diferentes
polaridades de la ramilla del pinabete.
.............................................................................................................................................................................. 26
Cuadro No. 7, Componentes de las emanaciones de pinabete analizados por GC-MS ........................................ 26
Cuadro No. 8, Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas ......................... 27
Cuadro No. 9, Tabulación de resultados de la GC-FID de las emanaciones de pinabete a 21 C .......................... 29
Cuadro No. 10, Composición de las emanaciones de pinabete de diferentes lugares de origen, a 21
C ........................................................................................................................................................................... 31
Cuadro No. 11, Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete
proveniente de Panquix. ....................................................................................................................................... 44
Cuadro No. 12, Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete
proveniente de San José Pinula, análisis realizado en época post-navideña ......................................................... 46
Cuadro No. 13, Análisis estadístico de los tiempos de retención de los aceites esenciales comunes
en coníferas. ......................................................................................................................................................... 50
Cuadro No. 14, Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a
21 C. ..................................................................................................................................................................... 51
Cuadro No. 15, Curva de calibración para la cuantíficacion de alfa-pineno. ....................................................... 51
Cuadro No. 16, Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a
21 C. ..................................................................................................................................................................... 53
Cuadro No. 17, Curva de calibración para la cuantificación de b-pineno ........................................................... 53
Cuadro No. 18, Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21
C ........................................................................................................................................................................... 53
Cuadro No. 19, Curva de calibración +/- limoneno 99% Merck en diclorometano ............................................ 54
v
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1, Diagrama de flujo del proceso para el diseño de un producto comercioal con aroma a
pinabete .................................................................................................................................................................. 7
Figura 3, Ilustración de Abies guatemalensis (Macvean, 2003).. ......................................................................... 17
Mapa, Distribución del género (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999). ................................... 20
Figura 5, Perfil cromatográfico de las emanaciones de pinabete a 21 C. ............................................................... 4
1
Figura 6, Superposición de cromatogramas de las emanaciones de muestras de pinabete
provenientes de diferentes lugares de origen: Panquix, Totonicapán y Tejutla.. .................................................. 44
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
CG Cromatografía de gases
GC-FID Gas Chromatography with Flame Ionization Detector
GC-MS Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry
GC Gas Chromatography
SPME Solid Phase Micro-Extraction
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
El pinabete (Abies guatemalensis R.) pertenece a la tradición navideña
guatemalteca, por lo que generar información sobre esta especie representa un tipo de
homenaje a la cultura chapina. Es más, el pinabete es una especie endémica de
Guatemala y de acuerdo a la distribución de Abies, es la especie más austral de este
género. Es decir, que otras especies relacionadas habitan en climas más fríos; lo cual
implica que el pinabete es una especie que se ha adaptado a un clima más templado y
por lo tanto pueden esperarse propiedades peculiares de esta especie. Por ejemplo, el
efecto de un clima más cálido probablemente indujo en el pinabete el desarrollo de
mecanismos para resistir infecciones a diversidad de hongos e insectos. Otro ejemplo
sería la comunicación interespecifica, el particular y apreciado aroma podría ser una
consecuencia de evolución adaptativa al clima.
Actualmente, el pinabete se encuentra en peligro de extinción, en 1979 ingresó
al listado de CITES como especie protegida. Las causas puede dividirse en dos grupos:
el primero corresponde a fenómenos que afectan a la biodiversidad guatemalteca en
general; mientras que el segundo esta relacionado con características particulares de la
especie. La desaparición de su hábitat natural debido al pastoreo en el sotobosque, el
cambio del uso de suelo y extracción de madera tanto de pinabete como de pino
blanco, ha causado una significativa reducción en las poblaciones de árboles de pinabete
adultos silvestres. Un factor que cabe mencionar, pero que aun no se ha estudiado, es el
calentamiento global y consecuente cambio en los ecosistemas. En el caso del pinabete,
hay más factores que reducen la posibilidad de regeneración de sus bosques, por
ejemplo, el bajo porcentaje de germinación de la semilla, así como las dificultades para
lograr transplantes del vivero al bosque. Sin embargo, el factor con mayor impacto
es el uso de la ramilla de pinabete durante la época navideña. En Guatemala el olor a
pinabete es un ícono de la Navidad, las ramillas son vendidas en los mercados locales
únicamente durante dicha temporada, siendo su principal atractivo el característico olor.
El impacto de esta tradición se origina en el ciclo fonológico del árbol, en diciembre los
pinabebetes está en el proceso de generación de semillas. De esta manera, el
desramado tiene un doble efecto en la regeneración de poblaciones de pinabete:
primero, los árboles silvestres adultos son dañados al punto que algunas veces mueren;
segundo, se reduce la producción de semilla.
El Instituto Nacional de Bosques (INAB) ha apoyado estrategias que mitiguen
el desaparecimiento del pinabete. El desarrollo de bosques cultivados de pinabete a
través de incentivos forestales, ha permitido el mercadeo de ramillas y árboles de
pinabete de bosques cultivados, que ha resultado una exitosa alternativa. Sin embargo,
un pinabete está listo para el mercado después de ocho años, lo cual representa un lento
crecimiento que al mismo tiempo es afectado por la vulnerabilidad de la especie,
implicando altos costos y baja producción. Aunado a esto y a pesar de los controles en
el desramillado de pinabete de rodales puros, el desramillado de pinabete es todavía un
hecho. Representando una desventaja para el comercio de pinabetes cultivados. Otra
opción, que INAB ha desarrollado, es la introducción en el mercado navideño de otras
especies del género Abies, sin embargo aunque cuentan con apariencia del Abies
guatemalensis, no tienen el olor característico a pinabete. Entre otros esfuerzos para
proteger la especie se encuentran diversos proyectos de investigación que buscan
mejorar la propagación del árbol, ya sea por cultivo de meristemos o por diversos
2
tratamientos a la semilla que mejoren el porcentaje de germinación, así como estudios
preliminares sobre el aroma de pinabete.
El pinabete es un ícono de la Navidad chapina por su apariencia y olor
característico. Dado que el factor apariencia esta siendo resuelto con la introducción de
otras especies, el olor a pinabete es un área que debe ser explorada a mayor
profundidad. Es más, una posible estrategia de protección al pinabete sería la
comercialización de un producto que tenga dicho olor característico. Esto contribuiría a
reducir el uso de las ramas de pinabete durante la época navideña. Además, se podría
combinar con otros abetos en el mercado cuya apariencia es similar al pinabete,
compensando el olor con un producto sintético. Idealmente, dicho producto estaría
desarrollando la generación de una industria alrededor del aroma del pinabete. Por
ejemplo, el cultivo de plantas aromáticas a usarse como materia prima, ofrecería una
opción más a las comunidades rurales agrícolas. El procesamiento y producción del
aroma a pinabete generaría puestos de trabajo en la industria; mientras que la
comercialización beneficiaría a pequeños empresarios interesados en vender dicho
producto. Por lo tanto, el aroma a pinabete representa no solo enriquecimiento en el
conocimiento de la biodiversidad guatemalteca que por si mismo es un objetivo
importante. Sino que además, representa una potencial oportunidad para mejora de la
economía nacional.
El primer paso producir aroma de pinabete sintético, es conocer la composición
del aroma de pinabete. Este puede ser pensado de dos formas, la primera como una
solución que lentamente se va evaporando. La segunda, como una composición gaseosa
que es detectada por los receptores del olor en la nariz. Tomando la primera idea como
base, se inició el proyecto de análisis del aceite esencial de pinabete en el 2003. Según
estos resultados y de proyectos subsiguientes se detectaron alfa-pineno, beta-pineno y
limoneno. Sin embargo, el aceite esencial extraído no contenía el mismo olor
característico. Así pues, se optó por el segundo punto de vista y se determinó que era
necesario analizar las emanaciones del pinabete in vivo. En proyectos posteriores se
probaron diversas técnicas de aireación, detectando dichos componentes como
mayoritarios, sin embargo no se llegó a la cuantificación de éstos.
En este proyecto se analizaron las emanaciones de la planta in vivo y se
cuantificaron los compuestos antes mencionados, así también se encontraron nuevos
componentes en el aroma como ésteres de ácidos grasos y cetonas. Entre las
perspectivas del proyecto queda al análisis del aroma durante la época de producción de
semilla, así como pruebas preliminares de mezclas de los monoterpenoides
cuantificados.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1. Antecedentes en Guatemala
Desde mediados del siglo XX hasta la actualidad, se ha dado una disminución
continua de los bosques de Abies guatemalensis Rheder, llevando a la desaparición de
los ecosistemas asociados en algunas regiones de Guatemala. Entre los factores que
influyen en la desaparición o disminución de los ecosistemas con pinabete, figuran:
pastoreo en el sotobosque, desramado, cambio de uso del suelo, extracción de madera, e
incendios, principalmente (CONAP-INAB-USAID, 1999). Así pues, dado que el A.
guatemalensis es una especie endémica de Guatemala (Steinle, 2001) y por las
amenazas anteriormente expuestas, el CITES lo agregó a su lista de especies
amenazadas en peligro de extinción en 1979 (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).
El corte de ramas para árboles de Navidad figura como la segunda amenaza para
los bosques de pinabete y supone un doble problema para el árbol en sí. En primer
lugar, el árbol desramado se debilita y en ocasiones termina muriendo. Por otro lado,
debido a que la actividad se realiza en la época en la que los árboles están produciendo
semillas, se reduce la capacidad de regeneración natural de la especie (CONAP-INAB-
USAID, 1999). El uso principal de las ramas es ornamental, especialmente para la
decoración en iglesias y de gran demanda en época navideña (Asociación Becaria
Guatemalteca, 1991).
La ramilla es valorada tanto por su apariencia como por su aroma. Dado que
existen árboles de apariencia similar (por ejemplo A. alba, que es utilizado como árbol
de navidad en Europa), el principal problema es que estos árboles no liberan el mismo
aroma que A. guatemalensis. Por ello, si saliera al comercio un producto con las
mismas propiedades organolépticas que el aroma del pinabete, se estaría dando una
alternativa al consumidor para obtener dicho aroma sin que él tuviera que obtener la
ramilla de pinabete. Lo cual, implicaría una disminución en el interés comercial de la
ramilla de pinabete, que al mismo tiempo forzaría al vendedor a desramar menos
árboles. De esta forma se estaría protegiendo a dicho árbol del desramado (que como ya
se mencionó, figura como la segunda causa de desaparición de los bosques de
pinabete). Además de proteger al pinabete de la deforestación, se estarían generando
fuentes de empleo para la producción a nivel industrial del aroma.
Dado el potencial aprovechamiento del aroma sintético a A. guatemalensis (no
extraído del árbol) y la necesidad de proteger al pinabete por estar en peligro de
extinción, el diseño de un producto con este aroma característico contribuiría tanto a la
generación de fuentes de trabajo como a la protección del mismo. Como primera parte
de este proceso, es necesario conocer la composición cualitativa y cuantitativa del
aroma de pinabete (Ver fig. No. 1: Proceso para el diseño de un producto
comercializable con aroma a pinabete).
4
I.2.2. Justificación del trabajo de investigación
En la fase anterior a esta propuesta, (Análisis del aceite esencial de Abies
guatemalensis: Identificación y cuantificación de los componentes químicos de su
aroma, Nitsch, 2002), se determinó la presencia de alfa pineno, beta pineno, limoneno y
cariofileno. Se especuló sobre la presencia de felandreno. También, se halló que el
aroma del aceite esencial, obtenido por destilación con arrastre de vapor, era diferente al
del árbol in vivo. Por ello, se hace necesario determinar los compuestos de una forma
tal que no se degraden en el proceso de extracción. Por eso en esta investigación se
trabajó con el aroma obtenida in vivo, utilizando la técnica de extracción en fase sólida
(SPME por sus siglas en inglés).
El proyecto global, lograr la industria del aroma del pinabete, llegaría a durar
alrededor de 10 años. El proceso requiere de profesionales de diversas áreas como:
química, ingeniería química, ingeniería forestal, agricultores, mercadeo, técnicos para la
planta industrial. Además, la inversión requeriría de diversas asociaciones a empresas
para lograr la cantidad de fondos requerida (en especial, para el establecimiento de la
planta industrial tanto a pequeña como a gran escala). También, se ha de considerar el
elaborar mezclas con éstos, para determinar la composición real que dará el aroma a
pinabete. En esta fase, se inician estas pruebas, aunque no se completan y será
necesario validar las concentraciones utilizadas en una fase posterior.
En esta investigación, se analizaron las emanaciones de la planta obtenidas de la
ramilla sin aplicación de calor y se cuantificaron los compuestos químicos ya
identificados en la fase anterior. Con lo cual se definen fases posteriores para llegar a
la fabricación de un producto comercializable con aroma a A. guatemalensis pero que
su materia prima provenga de otras especies.
5
Fig. No. 1.
Diagrama de flujo del proceso para el diseño de un producto comercial con aroma a
pinabete.
SI
SI
NO
El aroma del pinabete tiene
potencial comercial.
Análisis químico del aceite esencial de pinabete
Verificación de las concentraciones
encontradas previamente
Adquisición de los compuestos
Determinar la composición de las emanaciones de la planta
Pruebas de mezclas para obtener la
composición exacta del producto a
comercializar
Diseño del producto comercializable
Fabricación a pequeña escala.
Diseño y elaboración de planta piloto.
Se conoce la identidad y concentración de
todos los compuestos
Se conoce la composición
del aroma.
Investigar plantas idóneas
para materia prima del
aceite esencial, tal que: Contengan los compuestos de
interés;
sean de fácil siembra y cosecha;
endémicas de Guatemala.
Estudios de mercado
Industria del aroma del pinabete
Pruebas en
el mercado.
Pruebas en
el mercado.
Planta de
extracción,
Siembra de
plantas que
servirán de
materia prima
NO
6
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Identificar y cuantificar los componentes del aroma de pinabete A. guatemalensis.
I.3.1.2 Específicos
1. Extraer el aroma de pinabete de ramillas de árboles cultivados.
2. Determinar la cantidad de componentes presentes en el aroma de pinabete.
3. Identificar y cuantificar los componentes mayoritarios del aroma de pinabete.
4. Determinar si los compuestos: alfa-pineno, beta-pineno, limoneno, cariofileno y
felandreno están presentes en el aroma.
5. Generar información acerca de la composición del aroma de dicha especie para
investigaciones relacionadas con cultivo de meristemos a través de la
divulgación de los resultados en publicaciones periódicas.
I.3.1.3 Hipótesis
Las emanaciones de pinabete in vivo contienen otros compuestos volátiles
además de los compuestos mayoritarios: alfa-pineno, beta-pineno y limoneno.
7
I.4 METODOLOGIA
I.4.1. Localización
Lugar de colecta: Compra Mercado Navideño al Sr. Dimas López. Calzada Roosevelt.
Las muestras procedían de bosques de pinabete cultivados en Panquix, Tejutla y San
José Pinula.
Las áreas de Panquix (Totonicapán) y Tejutla (San Marcos) corresponden al bosque
muy húmedo montano subtropical. Se estima que la precipitación total anual puede ser
de 2,500 mm con una biotemperatura de 11ºC. (De la Cruz).
Lugar de origen de la muestra: Bosque cultivado en la comunidad de Panquix
Coordenadas geográficas: Localización de Panquix: altura: 2930 mts SNM, lat.
14º52’56”, long 91º19’48” (Diccionario Geográfico de Guatemala)
Altura: 2,400 a 3,300 msn
Temperatura mínima: -7ºC en las partes más altas
Temperatura promedio: 9ºC
Precipitación anual: 1,000 a 1,500 mm.
Humedad relativa: hasta el 80%
Localización de Tejutla: lat. 15º07’21”, long. 91º48’19”.
(Diccionario Geográfico de Guatemala)
Lugar de colecta: Mercado Navideño. Calzada Roosevelt.
Lugar de origen de la muestra: Tejutla
Altura: a más de 3,300 msnm
En San José Pinula (Guatemala), la región asociada a bosques de pinabete corresponde
con la del bosque húmedo montano bajo subtropical. Se estima que la precipitación
anual va de 2,065 a 3,900 mm, con un promedio de 2,730 mm. Biotemperaturas de 12.5
a 18.6ºC (De la Cruz).
Localización de San José Pinula: 1,752 mts SNM, lat. 14º32’44”, long. 90º24’46”
(Diccionario Geográfico de Guatemala).
I.4.2 Las Variables
1.4.2.1. Variables dependientes
Composición de las emanaciones de pinabete adsorbidas a una fibra específica.
1.4.2.2. Variables Independientes
En esta investigación se consideraron las siguientes variables como estudio
preliminar para determinar en un futuro la composición real del aroma del pinabete:
Temperatura: se analizaron las emanaciones a 6ºC, 21ºC y 23ºC (temperatura
ambiente).
Intervalo de tiempo de emanación, el cual se dejó constante a 24 horas
aproximadamente.
8
Duración del muestreo por SPME, que está asociado al tiempo requerido para
llegar al equilibrio entre la fase gaseosa y la fase líquida. Sin embargo, por la
naturaleza de la muestra, este equilibrio no se da de manera idéntica a una
muestra no viva, porque el proceso de emanación está regulado
fisiológicamente, y no regida únicamente por factores abióticos.
Lugar de origen del material vegetal utilizado: Panquix, Tejutla, Totonicapán.
I.4.3 Indicadores
Perfiles cromatográficos de las emanaciones de pinabete.
Espectros de masas de los compuestos mayoritarios.
I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.4.1 Población y Muestra
La población de árboles de pinabete silvestre, las muestras fueron tomadas de
ramilla de pinabete comercializada en el mercado navideño.
I.4.5. El Método
Materiales
Material Vegetal: Se colectó el material vegetal el 9/12/2007 en el “Mercado
Navideño de los Campos del Roosevelt”, en la venta del Sr. Dimas propietario
de bosques de pinabete en Panquix, Huehuetenango, Totonicapán, Totonicapán
y Tejutla, San Marcos. Se almacenó a temperatura ambiente hasta el día del
análisis.
Terpenoides para curva de calibración
a-pineno: () -a-pineno, Aldrich (99%)
b-pineno: ()-b-pineno, Aldrich (99%)
limoneno: (+/-)- limoneno, Merck (98%)
Diclorometano, Merck, 99%, grado HPLC.
Viales ámbar para HPLC (2 mL +/- 0.05 mL)
Pinzas para sellar y abrir viales
Micropipetas de 100 microL y 1000 microL
Cristalería volumétrica y diversos matraces.
Balanza analítica (+/- 0.000001g)
9
Cuadro No.1
Reactivos utilizados durante el estudio.
No. Nombre Marca Pureza Masa molar punto de ebullición
(ºC)
índice de refracción
(nD20)
densidad (g/mL)
1 (±)--pinene Aldrich 98% 136,24 155-156 1,465 0,858
2 (1S)-(-)-b-pinene Aldrich 99% 136,24 165-167 1,4782 0,859
3 ®-(+)-limonene Merck >97% 136,24 xxx 0,84
4 diclorometano Merck xxx
Métodos:
Preparación de la muestra:
Se cortaron pedazos de ramilla. Se pesaron. Se anotó si eran solamente hojas
o bien, hojas y tronco. El material vegetal fue cortado con tijeras de acero inoxidable en
regiones que representaban crecimiento de años previos y no de crecimiento reciente. Se
pesó la muestra. Se colocó en viales ámbar (HPLC vials, Hewlett Packard) de 2 mL,
sellados herméticamente. Se colocaron en un sitio donde recibieran luz natural, en un
espacio a temperatura controlada, dejándoles emanar por 24 horas, permitiendo las
sustancias volátiles (desde monoterpenos como el pineno hasta sesquiterpenos como el
cariofileno) equilibrarse en el espacio superior del vial (o “headspace”). .
Microextracción en fase sólida (SPME)
Se utilizó una fibra de 100 m PDMS (Supelco) sin sistema de sostén para todos
los muestreos por SPME. Se expuso la fibra de SPME al espacio superior del vial por
30 minutos bajo condiciones estáticas, a 4º y 21ºC. Para la determinación de estas
condiciones, se tomaron como referencia los estudios de Lagalante y Montgomery
(2003) y Steffen & Pawliszyn, (1996).
GC-MS
Se utilizó un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas
Hewlett Packard modelo, en colaboración con el Instituto de Investigaciones Químicas,
Biológicas y Biomédicas de la Universidad Mariano Gálvez.
Se analizaron adsorbidas a la fibra de SPME, con desorción por 5 min.
Se analizaron muestras de pinabete por Headspace, sin embargo se deberá optimizar el
método para obtener resultados adecuados.
GC-FID: Perfil cromatográfico de las emanaciones de pinabete
Las muestras fueron analizadas en un Cromatógrafo de gases acoplado al
detector de ionización en llama. El programa utilizado fue el diseñado por el Programa
de Análisis Químico, de la Universidad del Valle de Guatemala para el análisis de
aceites esenciales o fragancias, con modificación en la inyección de muestra. Después
de adsorbidos los volátiles en la fibra, se colocó ésta por 5 min en el puerto de inyección
A para resorberlos a 250ºC en el inyector. Las condiciones del método son: Nitrógeno a
(40ps), columna SPB-5 30m*0.53mm diámetro, 0.5 micrómetros de film, nitrógeno
splitless, acarreador inicial en la columna: 2psi, inyector 250ºC, Detector FID 300ºC,
Horno a 70ºC por 3 min, 10ºC/min hasta 255ºC por 5 min.
10
Comparación de tiempos de retención de estándares vs la muestra
Se colocaron 5 mL de estándar en el mismo tipo de vial usado para SPME. Se
dejaron vaporizar a 21ºC durante 24 hrs. Se procedió al muestreo por SPME y se
inyectó al GC/FID según procedimientos indicados previamente. Se obtuvieron los
tiempos de retención de los estándares y se compararon con las muestras.
Curva de calibración
Se prepararon soluciones de de al menos cinco diferentes concentraciones,
usando diclorometano como solvente según David et al (1995). Se inyectaron alrededor
de 0.5 L y se determinó el área correspondiente en cuentas*s. Los estándares utilizados
fueron los terpenoides: -pineno, -pineno, D-limoneno. Se graficó el área de pico en
cuentas*s en función de la cantidad de analito (L) inyectado. Se consideró un rango
lineal aquél cuyo coeficiente de correlación múltiple fuera de 0.99. Se obtuvieron las
ecuaciones de cada uno, utilizando la fórmula con intercepto (y=mx+b, donde y= área
(cuentas*s), y x = L de terpenoide.
Procesamiento de resultados
Se interpolaron las cantidades de -pineno, -pineno, D-limoneno. Se obtuvo la
cantidad de moles y la fracción molar de cada uno en la fase gaseosa. Aplicando la ley
de se calculó la fracción molar en la fase líquida en el equilibrio.
I.4.6. Técnica Estadística
Para el análisis de estadística descriptiva y regresión lineal se utilizó el análisis toolpack
de Excell 2004.
I.4.7. Instrumentos utilizados
Cromatógrafo de gases con detector de ionización en llama
Cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas
Jeringa para la microextracción en fase sólida
Balanza analítica
11
PARTE II
MARCO TEÓRICO
Información de la planta
Nombre científico
Abies guatemalensis Rehder
Sinónimos
Según Farjon (1998), son:
Abies tacanensis Lundell 1940
Abies guatemalensis Rehder var. tacanensis (Lundell) Martínez 1963.
Abies guatemalensis Rehder var. longibracteata Debreczy et Rácz 1995.
Abies guatemalensis Rehder var. tamaulipensis Silba 1997.
Nombres comunes
Pinabete
Pashaque (Standley y Steyermark, 1958)
Abeto
Guatemalan fir
Guayami
Hallarin
Plumajatzinç
Plumajillo de montaña,
Oyamel (Vales et al, 2000)
Romerillo (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999),
Guayamé.
Clasificación según Wiersema (2004):
Reino: Plantae
Subreino: Plantas vasculares
División: Gimnosperma
Clase: Pinópsida
Orden: Pinales
Familia: Pinaceae
Subfamilia: Abietoideae
Género: Abies
Especie: Abies guatemalensis
En la Fig. No. 1, se presenta una ilustración de las ramas, conos y semilla de la especie.
12
Fig. No. 1
Ilustración de Abies guatemalensis (Macvean, 2003). Se observa la ramilla, la
disposición de hojas, semillas y yemas en ésta. Además el cono y la semilla alada.
También la plántula que se forma durante el proceso de germinación.
13
Descripción de la especie:
El pinabete es un árbol siempre verde, llega a medir hasta 25 m de alto, con el
tronco hasta 1 m de diámetro, con crecimiento simétrico (Asociación Becaria
Guatemalteca, 1991). Llega a su madurez entre los 30 y 40 años de edad (MAGA-
ICTA-UNEPROCH, 2000). La copa tiene forma piramidal o cónico-oblonga
(Asociación Becaria Guatemalteca, 1991). Cabe mencionar que usualmente la ramilla
es obtenida en rodales puros, y particularmente proviene de árboles maduros. Muchas
veces los árboles son desramillados al punto que mueren, por lo que la regeneración de
dichos especímenes requeriría 30 a 40 años.
Las hojas son lineares, en la parte superior son verde oscuro brillante; en la
parte inferior, plateadas. Las hojas poseen canales resiníferos (Asociación Becaria
Guatemalteca, 1991), presentando dos canales resiníferos subepidérmicos (Ponciano et
al, 1988).
Los conos cilíndricos subsésiles, de 8.5 a 11.5 cm de largo, anchamente
truncados en forma cilíndrica, con un diámetro que fluctúa entre 4.5 y 5 cm (López,
1997). Son resinosos, de color café claro y con escamas planas transversales. Las
semillas aladas son de color café pálido y tienen forma de cuñas ovoidales (Asociación
Becaria Guatemalteca, 1991).
La madera es de hilo recto, fácil de hendir, flexible, medianamente dura, fuerte,
de limitada resistencia a la intemperie (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991), no es
resinosa, ni presenta olor. Tiene la zona la zona de la albura blanca; la medular, color
rojizo y con olor fuerte (López, 1997). Los anillos de crecimiento son poco
diferenciados a simple vista, con anchura bastante heterogénea. La madera de primavera
es más ancha que la de verano. Su peso específico es de 0,35 g/cm3, por lo que puede
decirse que es muy ligera (Vales et al, 2000) Su madera es utilizada por sus cualidades
para la industria del papel (Ponciano et al, 1988).
La corteza varía en color y textura según la edad del árbol. En los jóvenes es
gris blanquecina y lisa; en los adultos, moreno grisácea, surcada y partida en placas no
muy profundas (López, 1997)). Las especies del género Abies, producen óleoresina por
incisión, la cual se usa por sus propiedades balsámicas (Ponciano et al, 1988).
Las semillas son cuneabovadas de 8 a 10mm de largo, color castaño claro y
alas ovaladas que llegan a alcanzar 15 mm de diámetro (López, 1997). La época de
colecta de las semillas es de enero a diciembre (MAGA-ICTA-UNEPROCH, 2000). En
diversos estudios realizados sobre las características fisiológicas y anatómico-
morfológicas de la semilla del pinabete se ha encontrado que:
La viabilidad es de 2% en el campo y 10% en el vivero (sin aplicar
tratamiento alguno a la semilla) (Macz et al, 2000a).
No todas las semillas de pinabete contienen un embrión viable. Pero,
entre las que sí lo contienen, no presentan embriones deformes o carentes de
cotiledones (Macz et al, 2000a).
Las semillas presentan cinco sacos resiníferos, que están turgentes y
llenos de resina bajo condiciones normales. Durante el proceso de germinación, los
14
sacos pierden turgencia y disminuyen en tamaño y volumen. Sin embargo, no se
observó que tuvieran algún efecto sobre la germinación (Macz et al, 2000a).
La cubierta seminal tiene alta cantidad de compuestos fenólicos
(determinados por la actividad catecol oxidasa) (Valdéz, 1999).
Distribución y Hábitat
El género cuenta con unas 39 especies –también se reportan 55 especies en
Ponciano et al (1988)- de zonas templadas del hemisferio Norte, en América del Norte,
Central y Europa, ver figura 2 (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999).
La localización de los dos biomas de coníferas diferentes en América, los cuales están
separados por alrededor de 20° latitudinales (Earle ed., 2004). El bioma más
ecuatorial se extiende del sur de México (Estado de Chiapas), al norte de Nicaragua. En
dicha región, el género tiene un número máximo de especies entre la zona de
Guatemala (altiplano occidental) y México, y se reduce hacia el sur en Honduras
(Ponciano et al, 1988). Se ha reportado que Abies religiosa corresponde al lado norte
de México; mientras que Abies guatemalensis se encuentra en el sur de México,
Guatemala y algunos bosques aislados en Honduras (Ponciano et al, 1988).
Mapa No. 1
A) Distribución del género (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999).
Puede observarse que crece en la parte Norte del globo terrestre. A excepción de
México y América Central (Sur de México, Guatemala y Norte de Honduras y el
Salvador) y otras regiones de Asia.
Fuente: Nitsch (2005)
15
b) Distribución de Abies guatemalensis (Vales et al, 2000). De esta especie se
encuentran bosques naturales en el Sur de México, Guatemala y el Norte de Honduras y
El Salvador.
Fuente: Nitsch (2005)
El A. guatemalensis se encuentra desde el Sur de México hasta Honduras y El
Salvador. En Guatemala, se le encuentra en los bosques del altiplano occidental, en la
siguiente distribución:
Las partes altas de Totonicapán: Rancho de Teja, Pachoc, Volcán
Zunil (Ponciano et al, 1988), San Francisco El Alto, Santa maría Chiquimula, Santa
Lucía la Reforma, Chinente (Macz et al, 2000a);
Huehuetenango: Todos Santos Cuchumatán, Chiantla, San Mateo
Ixtatán (López, 1997), Puerta del Cielo, Cumbres del Aire, camino a San Juan Ixcoy,
Chex, Certix, Las Majadas, Cerro Canana, Chee, Tuculta, Tzuján, Anlaj, partes altas
cerca de San Juan Atitán, Cerro Grande y arriba de 2,500 msnm (Ponciano et al, 1988),
Santa Cruz Barillas, San Rafael Petzal, San Pedro Soloma, Santa Eulalia, Aguacatán
(Macz et al, 2000a);
El Quiché: Sierra de los Cuchumatanes, Nebaj, Xesibanchitz,
Asichimansana, Calauté, Macalajau Zunil (Ponciano et al, 1988);
Quetzaltenango: San Francisco la Unión, San Carlos Sija, San Andrés
Xecul, San Miguel Siguilá, San Martín Sacatepéquez (Ponciano et al, 1988), Palestina
delos Altos, San Juan Ostuncalco, Sibilia, Cabricán, Cantel (Macz et al, 2000a);
San Marcos: Tejutla (López, 1997), Ixchigüán, San Andrés, Volcán
Tajumulco, San Sebastián, San Lorenzo, Sierra Madre (Ponciano et al, 1988),
Comitancillo, Astillero Municipal de San Marcos y de San Pedro Sacatepéquez (Macz
et al, 2000a);
16
Jalapa: Cerro Miramundo, Mataquescuintla (Macz et al, 2000);
Chimaltenango: Del camino viejo de Tecpán a Los Encuentros
(Ponciano et al, 1988);
Chiquimula: Volcán de Ipala (López, 1997);
Zacapa: Sierra de las Minas (López, 1997).
El A. guatemalensis, se caracteriza por su endemismo (INAB, 1997). Ésta es
la especie más austral del género, aunque se encuentran otros géneros de la familia más
al sur; se le halla entre las latitudes 14º y 15º Norte (MAGA-ICTA-UNEPROCH,
2000), y en altitudes que van de los 2700 a 3600 msn (Asociación Becaria
Guatemalteca, 1991). Estas áreas corresponden a las montañas de Guatemala y México,
y las partes altas de Honduras y el Salvador. Por lo que puede decirse que crece en
poblaciones aisladas (MAGA-ICTA-UNEPROCH, 2000).
Condiciones de crecimiento (adaptado de Nitsch (2005)):
o Precipitación pluvial anual: 1500-3000 mm, con época notoria de
lluvia de abril a octubre y el resto del año lluvias aisladas (Asociación Becaria
Guatemalteca, 1991).
o Temperatura media: 9-10°C. aunque puede soportar temperaturas bajo
cero. En algunos casos, se encuentra en áreas donde la temperatura llega hasta los 17ºC
(Mataquescuintla, por ejemplo), pero éstas no son los ecosistemas característicos de la
especie (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).
o Suelo: suelos de altura desarrollados sobre ceniza volcánica, texturas
diversas: franco turboso, franco arcilloso o franco arenoso, con suficiente materia
orgánica (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).
o Zonas biogeográficas: se distribuye en tres de las ocho zonas de vida
donde crecen las coníferas en Guatemala, las cuales según INAB (1997) son:
o Bosque muy húmedo montano subtropical
o Bosque muy húmedo bajo subtropical
o Bosque montano bajo subtropical.
Se ha encontrado que, generalmente, su dirección de exposición foliar es hacia
el noroeste, raramente se observa otra exposición. Lo que podría indicar que es una
especie con bajos requerimientos de horas luz (López, 1997).
Asociaciones en el bosque:
En general se halla asociado con Pinus ayacahuite (pino blanco), Pinus rudis
y Cupresus sp o ciprés. En el cuadro No.1, se presentan otras especies agrupadas
según la localización de bosques de pinabete (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).
17
Cuadro No. 2
Especies asociadas a Abies guatemalensis en diversos bosques naturales de Guatemala.
No.
Localización
del bosque de
pinabete
Especies asociadas
1 Cuchumatantes Pinus hartweegii Lindl
2
María Tecún;
San Marcos;
Quetzaltenango
Pinus ayacahuite
Eherenberg
3
Áreas tal que las
temperaturas
suben de 12 a
17 °C
Cupressus lusitánica
Miller, Pinus
pseudostrobus Lindl,
Pinus rudis Endl
Fuente: Nitsch (2005)
Propagación
Se reproduce por semilla. La colecta se realiza entre lo meses de octubre a
enero (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991); se ha observado que la producción de
mejor calidad de semillas cada tres años (Macz et al, 2000a). El INAB, como parte de
la estrategia de protección al pinabete, ha financiado diversos proyectos de
caracterización ecológica (González (1979), USAC-DIGI (1998), López (1997)) y
estudios que buscan facilitar la propagación de la especie, como el cultivo de
meristemos (Saquimux et al, 1998 y Macz et al, 2000), tratamientos pre-germinativos
con ácido giberélico y diversas temperaturas (García (1989), Valdéz (1999)), y, en
general, el crecimiento de Abies (Guzmán, (1986) y Peñalonzo y Zanotti (1989).
Plantación
Actualmente el INAB, a través del programa de Incentivos Forestales, está
apoyando a las plantaciones de pinabete con fines comerciales. Las principales son:
Palestina de los Altos, Quetzaltenango; Tecpán, Chimaltenango.
Según estadísticas (Vales et al, 2000) hay datos de exportación de semillas
desde Guatemala a EE.UU.
Respecto al manejo de los bosques y ecosistemas cabe decir que la tasa
promedio de crecimiento varia entre 0.36 y 0.46m/año y viven entre 49 y 71 años. El
incremento anual en diámetro varía entre 0.59 y 0.69cm (crecimiento lento) (UNEP-
World Conservation Monitoring Centre, 1999).
Producción
El pinabete plantado puede venderse para navidad a los 7 u 8 años de sembrado
(Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).
18
Plagas y enfermedades
Los hongos que atacan al pinabete, causando la muerte cuando éste es joven:
Fusarioum sp, Verticillium sp, Rhizoctonia sp (Saquimux et al, 1999).
También, se ha encontrado que insectos de la familia Torymidae atacan la
semilla del pinabete (Macz et al, 2000).
Usos principales
La Asociación Becaria Guatemalteca indica los siguientes usos:
Fabricación de telares
Forros interiores
Techos para construcciones rurales
Leña
Carbón
La pulpa es apreciada por la industria papelera
Las ramas, para tapeexcos (refugios temporales)
Etnobotánico: oleorresina, obtenida por incisión, con propiedades balsámicas,
se usa para:
Fabricación de medicinas
Pinturas.
Ornamental:
decoración en iglesias
arbolito de navidad
Causas del peligro en extinción
Actualmente, el A. guatemalensis es una especie considerada en peligro de
extinción, figura en el listado del CITES desde 1979 (ver cuadro No. 2), debido a la
reducción de los rodales de pinabete (INAB, 1997). En Honduras fue común hasta
1940 y es probable que aún existan poblaciones aisladas. En México es difícil de
definir su estado, debido a una confusión con otras especies del mismo género, muchas
de las cuales son morfológicamente muy similares y presentan distribuciones muy
restringidas (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999).
Se han realizado estudios donde se determinó que la mayoría de áreas donde
crece A. guatemalensis, son zonas que presentan alteración ecológica – en algunas, el
pinabete está siendo desplazado por otras especies forestales o arbustivas (López, 1997).
Entre las causas de este deterioro que se Nitsch (2005) incluye como de mayor impacto
se encuentran:
Incendios forestales, que causan la muerte en pie de los árboles, y son
frecuentes en la zona.
Fuertes vientos, que provocan quebraduras de ramas y fustes.
Pastoreo a gran escala de ganado bovino que impide la regeneración
natural de la especie.
Dificultad para reproducción por medio de la semilla (bajo porcentaje
de germinación entre otros) (INAB, 1997).
19
Deforestación y avance de la frontera agrícola.
Sobrepastoreo.
Plagas y enfermedades (López, 1997)
Aprovechamiento de la especie a una tasa superior a la de su
regeneración natural (Saquimux et al, 1999).
Tala de árboles para consumo local (leña) y comercial (madera de
aserrío y arbolitos de navidad).
Corte de ramilla en época navideña, las ramillas y los árboles son
utilizados para comercializarse en centros urbanos, principalmente en la
ciudad capital en la época navideña. En esta temporada es cuando aun
se están produciendo los conos (Macz et al, 2000) y se inicia la
liberación de semillas. Por lo cual, las posibilidades de regeneración
natural son casi nulas (López, 1997), y las de almacenamiento y
establecimiento de nuevas plantaciones se ven reducidas (Macz et al,
2000). Actualmente, este corte y comercialización es considerado
ilegal. Sin embargo, éstas se deben a razones culturales y
socioeconómicas: su demanda se incrementa como árbol ornamental
por sus características morfológicas y de aroma (Saquimux et al,
1999).
Cuadro No. 3
Breve historia del pinabete en Guatemala.
Ubicación temporal Estado de los bosques del pinabete
Época Maya Deforestación parcial por el cultivo
migratorio de los Mayas.
Colonia Aumenta la deforestación, por la necesidad de
madera para construcción.
XIX Aún hay abundancia en los altiplanos del
occidente de Guatemala.
1941 El pinabete entra al listado de especies
arbóreas en protección.
1950 Fuerte explotación de los rodales.
1979 El CITES lo agregó a su lista internacional de
especies amenazadas en peligro de extinción
Fuente: Nitsch (2005)
20
Investigación fitoquímica del género y la especie
Actualmente, se están investigando varias especies del género Abies (ver
Anexo 8). Se han encontrado diversos principios activos además de los aceites
esenciales (que en algunos casos es comercializado como el del Abies alba). Además,
los taninos y triterpenos son compuestos comunes del género.
En el estudio realizado por Nitsch (2005), se identificaron a las familias de
metabolitos secundarios estaban presentes en los extractos hexánico, etérico, etanólico y
acuoso de cinco partes del árbol (semilla, ramilla, corteza, madera y raíz); además de
determinar si éstos eran bioactivos. Para lo cual se hicieron baterías de pruebas
químicas según el extracto y luego se analizaron por cromatografía de capa fina (CCF).
Se encontró que la composición general es predominantemente de terpenoides
y esteroles; también contiene flavonoides, carotenoides, y glicósidos de los tres;
saponinas, taninos catéquicos, osas y/o poliosas. Se observó que los extractos de raíz y
corteza presentan patrones de CCF. En el extracto etérico se detectó un terpenoide
mayoritario. Se cree que la madera puede contener alta concentración de saponinas.
Los extractos etanólicos presentan una parte apolar (terpenoides y esteroles) y una
polar según el análisis por CCF y cromatografía en columna. Se determinó lo mismo
para los acuosos, por CCF. Se encontró que la bioactividad de todos los extractos está
en el intervalo de 400 ppm a menos de 100 ppm (Nitsch, 2005).
Los resultados obtenidos indicaron que la especie tiene interés para fines de la
humanidad (uso terapéutico, insecticida, etc) y que debe continuarse con la
investigación de los metabolitos secundarios encontrados. Los patrones de CCF de los
extractos hexánicos o etéricos que presenta el árbol pueden ser utilizados en
quimiotaxonomía del árbol (en especial para las diferentes regiones de Guatemala en las
que crece esta especie) (Nitsch, 2005).
Las investigaciones sobre A. guatemalensis, en su mayoría, analizan procesos
que mejoren el porcentaje de germinación, ecología y genética de poblaciones. Las que
se refieren a su fitoquímica que hayan sido realizadas en Guatemala, son:
Análisis del aceite esencial de semilla y ramilla de pinabete (Nitsch,
2002).
Extracción del aceite esencial de pinabete (Abies guatemalensis
Rheder) por medio de arrastre de vapor, para la extracción y caracterización del aceite
esencial a nivel de planta piloto y su escalonamiento a nivel industrial, para la
elaboración de un producto de limpieza y su esencia (Castañeda, 2005).
Análisis fitoquímico de los extractos de pinabete (Nitsch, 2005). Ver
cuadros Nos. 3, 4 y 5 donde se resumen propiedades del genero Abies. Se ha
encontrado que la ramilla de pinabete es rica en diversas familias de productos naturales
y tiene una alta bioactividad (ver cuadro 5).
21
Cuadro No. 4.
Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica.
No. Especie Información fitoquímica
sobre la especie
1 Abies alba Miller
Triterpenoide con
capacidad de gelificarse
(desmetilabietoespirano) de la
corteza (O’neill et al, 2005).
2 Abies cilicia Ant y
Kotschy Carr.
El extracto etanólico de
resinas de las raíces y madera tiene
una alta actividad antimicrobiana
(Kizil , 2002).
3 Abies coreana
Un triterpenoide tipo
lanostano, de la corteza de la raíz,
presenta actividad antitumoral (Kim
et al, 2004).
4 Abies
nephrolenpsis
Las hojas contienen fenoles
derivados de la catequina,
incluyendo el
epigalocatequingalato, los cuales
presentan un potencial efecto
quimioprotectivo contra la
carcinogénesis (Lee et al, 2004).
5
Abies pindrow
Planta utilizada en el
Ayurveda. Los extractos de
diferente polaridad mostraron
actividades: antiinflamatoria,
analgésica, potenciación de la
hipnosis por barbitúricos y
antiulcerogénica. Contiene
glicósidos, esteroides, terpenoides y
flavonoides. No tienen efecto
antibacteriano (Singh et al, 1998).
6 Abies sibirica
El extracto acuoso de
semillas es coadyuvante del efecto
radioprotectivo del quitosano (en
Radiats Biol Radioecol, 2004).
7 Abies webbiana
Lindl
Usado en medicina
tradicional hindú. Se ha encontrado
que el extracto metanólico de las
hojas tiene: actividad antitusiva
contra el reflejo de tos inducida por
dióxido de azufre en ratones, por
dosis oral. Efecto sedativo, además,
presenta sinergia en el tiempo de
sueño provocado por sedantes
patrón (Nayak et al, 2004).
Fuente: Nitsch (2005)
22
Continuación Cuadro No. 4.
Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica.
No. Especie Información fitoquímica
sobre la especie
8
Conos de la familia
Pinaceae (Abies, Picea,
Pinus, Pseudotsuga, Tsuga)
Se determinó que
contienen cuatro antocianidinas: 3-
glucósido cianidina, 3-glucósido
delfinidina, 3-glucósido peonidina,
3-glucósido petunidina (Griesbach y
Santamour, 2003).
9 Picea abies
La semilla contiene taninos
condensados (Behrens et al, 2003).
El duramen contiene al lignano
hidroximatairesinol, el cual tiene
efectos quimiopreventivos de
carcinogenesis en ratas (Katsuda et
al, 2004).
Fuente: Nitsch (2005)
Cuadro No. 5
Resumen de los resultados de las investigaciones fitoquímicas sobre el pinabete. Se
presenta la composición del aceite esencial de ramilla y semilla obtenida por destilación
por arrastre con vapor. Según Castañeda (2005) el aceite esencial de ramilla tiene una
densidad de 0.768 g/mL y nD=1.38.
Parte del árbol
analizada
Ramilla1 Ramilla
2 Semilla
2
Componente % (v/v) % (v/v) % (v/v)
Alfa-pineno 5
3.65
3
9.38
7
1
Beta-pinento -
-
1
.34
8
.5
Limoneno 2
8.86
3
4.42
1
6
Mirceno 5
.10
-
-
-
-
Canfeno 1
.07
5
.67
0
.46
Tricicleno -
-
0
.60
0
.21
No identificado 1
1.32
-
-
Rendimiento
0.8 %
(v/p)
0.6 %
(v/p)
6 %
(v/p)
1: Según Castañeda (2005). La destilación fue a nivel industrial por 1 hr 30
min.
23
2: Según Nitsch (2002). La destilación fue a nivel de laboratorio por 3 hrs.
Entre las observaciones de este experimento figuraba que hubo un compuesto que era
muy volátil y se perdió durante el proceso.
Cuadro No. 6.
Resultados del tamizaje fitoquímico por reacciones químicas de extractos de diferentes
polaridades de la ramilla del pinabete.
Categoría Solvente de extracción
Hexano Éter Etanol Agua
Apariencia Betún verde oscuro.
Bioactividad
inmediata
Betún verde oscuro.
Bioactividad
inmediata Líquido café
Sólido café,
esponjoso
Concentración final (g/mL +/- ) 0.02468 0.014 0.01775 0.01
Bioactividad (DE50 para Artemia salina, ppm) <100 <100 <1000 <1000
Tratamiento Metabolito secundario
detectado
Solvente de extracción
Hexano Éter Etanol Agua
Extracto
apolar no
hidrolizado
Alcaloides - -
Agliconas de flavonoides +1 +1
Emodoles - -
Cumarinas - -
Esteroles y triterpenos +, terpenoides +, esteroles y terpenoides
+
Carotenoides ++
Extracto
apolar
hidrolizado
apariencia
sln verde. Se formó gota grasosa,
naranha. Se filtro.
CCF (Cuadro No.)
sln verde
Esteroles y triterpenos + +++,
terpenos
Carotenoides +++ +
Ácidos grasos + +, color
verde
Extracto
polar
hidrolizado
Glucósidos de antraceno - -
Cumarinas - -
Glicósidos
esteroidales/terpenoides
+, terpenoides el
menos abundante +, terpenoides
Glicósidos de flavonoides +, flavonas +, flavonoides
Glicósidos de antocianidinas. -5
+, cambios de color
de rojo a verde 4.
Extracto
polar no
hidrolizado
Poliurònidos ?
Compuestos reductores + +
Osas y poliosas
Saponinas +, triterpénicas probablemente
Taninos +, catéquicos +, catéquicos
Glicósidos cardiotónicos -
Alcaloides - -
Fuente: Nitsch (2005)
24
Extracción en fase sólida (SPME)
El método de Microextracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés) usa
una fina barra de sílica cubierta con una fina capa de un sólido o líquido para extraer
compuestos orgánicos directamente de muestras acuosas para análisis instrumental por
GC o GC/MS (Zhang & Pawliszyn, 1993).
El tiempo de eficiencia, portabilidad, precisión, y límite de detección así como el
bajo costo de la técnica SPME ha sido mejorara significativamente en comparación a la
extracción en fase sólida tradicional (Zhang & Pawliszyn, 1993).
Si bien el muestreo por SPME puede hacerse en matrices líquidas, también
puede hacerse del espacio libre arriba de la muestra. Este muestreo reduce el tiempo de
obtención de analito porque la difusión de los analitos en la fase gaseosa es De cuatro
órdenes de magnitud mayor que en la fase acuosa. Se puede alcanzar el equilibrio
rápidamente entre las fases acuosas y de vapor a través de la agitación constate de la
muestra gaseosa para generar una superficie “fresca” continuamente. Al muestrear de
esta manera, la técnica de SPME puede ser extendida a muestras más complejas que
contengan sólidos o materiales de alta masa molecular como tierra y lodos (Zhang &
Pawliszyn, 1993).
Esta técnica, acoplada con GC, ha sido usada para analizar compuestos
orgánicos volátiles en áreas como alimentos, bebidas, bioquímica clínica, biología
vegetal y monitoreos ambientales. Entre las ventajas que presenta la SPME se
encentran la reducción de los tiempos de muestreo, reducción de costos en equipo,
presenta selectividad para los compuestos presentes en la fase gaseosa. Además, puede
extenderse a compuestos menos volátiles por el efecto de concentración en el
recubrimiento de la fibra (Zhang & Pawliszyn, 1993).
El principio de la SPME es el proceso de equilibrio de partición del analito entre
el recubrimiento de la fibra y la solución acuosa. Para un recubrimiento líquido, la
cantidad absorbida por éste puede ser calculada a partir de la ecuación
n = CoV1V2K/(KV1+V2)
(Ecuación No.1)
Donde:
n = masa absorbida por el recubrimiento
V1 = Volumen del recubrimiento
V2 = Volumen de la solución acuosa
K = es el coeficiente de partición del analito entre el recubrimiento y el agua
Co = es la concentración inicial del analito en la solución acuosa.
(Zhang & Pawliszyn, 1993)
Según Zhang & Pawliszyn (1993), el sistema SPME puede considerarse como
un sistema de tres fases: el recubrimiento polimérico de la fibra, el espacio libre y la
solución acuosa involucrada. La cantidad de analitos absorbidos por el recubrimiento
polimérico está relacionado con el equilibrio total de los analitos en las tres fases del
sistema. La técnica de SPME del espacio libre sobre la solución está basada en el
equilibrio de los analitos entre las fases involucradas. La ecuación No. 1, da la masa de
25
los analitos absorbidos por el recubrimiento polimérico cuando se ha llegado al
equilibrio.
La cinética del transporte de masas, en el cual los analitos se mueven de la fase
acuosa hacia el espacio libre sobre la muestra y, finalmente, hacia el recubrimiento,
debe ser tomada en cuenta. Porque, precisamente, es este proceso el que determina el
tiempo de muestreo en la técnica de SPME del espacio libre sobre la solución (Zhang &
Pawliszyn, 1993). Si la muestra fuera un ser no vivo, entonces se podría aplicar el
análisis fisicoquímico sugerido por dichos autores. Sin embargo, la muestra y los
resultados esperados tenían las siguientes características:
Se buscaba analizar las emanaciones de la planta, pues son éstas las que
percibe el órgano del olfato.
El origen de las emanaciones es un material vivo, estando reguladas por
condiciones ecofisiológicas particulares. Por lo cual se debe considerar
la posibilidad de daño celular por calor y agitación de la muestra, con la
consecuente alteración del ritmo metabólico de la planta y sus
emanaciones.
Aparentemente existen compuestos termolábiles.
Por lo cual, no se consideró necesario aplicar dicho análisis, pues en este estudio
no se buscaba la concentración de los analitos en el pinabete sino en los compuestos
volatilizados. Las concentraciones determinadas por GC/FID, con la curva de
calibración respectiva, fueron tomadas como las concentraciones de los analitos en la
fase gaseosa. Esto, suponiendo que los terpenoides cuantificados tenían un igual
coeficiente de absorción al recubrimiento.
Presión de vapor
Un líquido colocado en contenedor cerrado que tiene un volumen mayor que el
ocupado por el líquido, llenará el espacio libre con su vapor, y eventualmente el líquido
llega al equilibrio con su vapor. Esto no implica que la transferencia de moléculas a
partir de la superficie líquida del espacio del vapor haya cesado, pero la concentración
molecular en el vapor se vuelve lo suficientemente grande para que la velocidad de
condensación de las moléculas de vapor es igual a la velocidad de volatilización de las
moléculas líquidas. Se dice que la presión de vapor en el equilibrio es una función de la
sustancia líquida y de su temperatura y es llamada presión de vapor del líquido (Brey,
1978).
Suponiendo que la concentración de los analitos en el recubrimiento de la fibra
es igual a su concentración en la fase gaseosa, y que los analitos se comportan
idealmente, puede predecirse la concentración de estos tres componentes en la fase
líquida en el equilibrio.
Debe hacerse notar que el análisis GC-MS reveló la presencia de otros
terpenoides, diferentes ésteres de ácidos grasos, aldehídos y algunos fenilpropanoides,
que deberán ser cuantificados para incluirlos en el cálculo de la mezcla para la
elaboración de aroma a pinabete.
26
PARTE III
III. RESULTADOS
Los resultados obtenidos consisten en el análisis de las emanaciones de
pinabete en GC-MS, los tiempos de retención de aceites esenciales en GC-FID, y la
cuantificación de los -pineno, -pineno y limoneno en emanaciones de pinabete de tres
lugares de origen. Los datos originales, así como las curvas de calibración se
encuentran en la sección de Anexos.
Cuadro No. 7.
Componentes de las emanaciones de pinabete analizados por GC-MS. Se presentan los
compuestos con >90% de coincidencia con los de patrones de la librería NIST. Para ver
resultados de varias corridas, consultar Anexo 8.
tR Compuesto CAS
5,13 Tolueno 108-88-3
11,59 alpha-pinene 7785-70-8 ó
7785-26-4
15,39 3-carene 13466-78-9
15,95 Limoneno 5989-27-5
16,14 1-metil-3-(1-metiletil)-benceno 535-77-3
16,6 alcohol bencílico 100-51-6
19,65 1-metil-4-(1-metiletenil)-benceno 1195-32-0
20 Undecano 1120-21-4
20,21 Nonanal 124-19-6
20,6 Alcohol feniletílico 60-12-8
23,42 ácido benzóico 65-85-0
25,19 Decanal 112-31-2
28,93 acetato de bornilo 76-49-3
31,76 (+)-4-careno 29050-33-7
32,1 Eugenol 97-53-0
32,94 alpha-cubebene 17699-14-8
34,84 Caryophyllene 87-44-5
36,24 alpha-caryophyllene 67653-98-6
37,74 Ciclodecano 294-62-2
39,67 alpha-calacorene 1000293-02-3
42,69 heptadecil éster del ácido 3-cloropropiónico 1000283-05-1
42,78 1,6-dimetil-4-(1metiletil)-naftaleno 483-78-3
27
43,1 Eicosano 112-95-8
44,08 ácido tetradecanoico 544-63-8
45,45 ácido pentadecanoico 1002-84-9
Obsérvese en el cuadro 2 la presencia de diversos fenilpropanoides presentes
en las emanaciones de pinabete, por ejemplo el alcohol bencílico, metilbencenos y ácido
benzoico; los cuales no habían sido detectados en estudios preliminares. Así también se
encuentran diversos aldehídos, como el nonanal y el decanal, y ésteres de ácidos grasos.
Se hace resaltar la presencia del careno, eugenol, calacoreno y cubebeno cuya
naturaleza es terpenoidal. Es recomendable que en estudios posteriores se cuantifique la
presencia de éstos. En especial, la del careno quien es común en los aceites esenciales
de coníferas por lo que sería de esperar su presencia en las emanaciones de pinabete.
Respecto a los dos últimos, son sesquiterpenoides que podrían estar asociados al aroma
remanente en los pinabetes cortados y almacenados hasta después de la época navideña.
Análisis de estándares de aceites esenciales
Las muestras analizadas fueron aceites esenciales comunes en coníferas con los
que contaba internamente la Universidad del Valle par determinar tiempos de retención
para comparar más adelante con las muestras de pinabete. Se analizaron 5 microlitros
de cada aceite utilizando las condiciones antes mencionadas. En el cuadro No. 3. se
presenta la tabulación de estos resultados.
Cuadro No. 8
Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas. Ver
análisis estadístico en Anexos.
No.
Aceite esencial
(Nombre común y
UIPAC)
Estructura
Tiempo
de
retención
(min.)
Datos del
reactivo
1
alfa pineno
(Bicyclo[3.1.1]hept-2-
ene, 2,6,6-trimethyl-)
13.577
Aldrich,
98%, grado
técnico.
CAS: 80-
56-8
2
®-+-limoneno
(1-methyl-4-(1-
methylethenyl)-)
17.844
Merck,
97%, CAS:
5989-27-5
Fuente: FODECYT 87-2006.
28
3
beta pineno
(Bicyclo[3.1.1]heptane,
6,6-dimethyl-2-
methylene-)
16.305
Aldrich,
99%, grado
técnico,
CAS: 127-
91-3
4
+/- linalool
(1,6-Octadien-3-ol,
3,7-dimethyl-)
19.560
Aldrich,
CAS: 78-
70-6
Continuación Cuadro No. 8
Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas. Ver
análisis estadístico en Anexos.
No.
Aceite esencial
(Nombre común y
UIPAC)
Estructura
Tiempo
de
retención
(min.)
Datos del
reactivo
5
Mirceno
(1,6-Octadiene, 7-
methyl-3-methylene-)
16.144
Aldrich,
CAS: 123-
35-3
6
[(1S)-endo]-(-)-borneol
(Bicyclo[2.2.1]heptan-
2-ol, 1,7,7-trimethyl-)
20.525
Aldrich,
CAS: 507-
70-0
7 Canfeno
15.583
Aldrich,
CAS:
8
alfa terpineol
(2-(4-Methyl-3-
cyclohexen-1-yl)-2-
propanol)
26.837
Aldrich,
CAS: 10482-56-1
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
29
Estos datos se compararon con los cromatogramas GC-FID de las emanaciones de
pinabete.
El 2/12/2007 se colectó ramilla de pinabete del mercado local (Mercado
Navideño de la Calzada Roosevelt, zona 12). Se obtuvieron muestras de Panquix,
Huehuetenango y de Tejutla, San Marcos, del bosque cultivado del Sr. Dimas Pérez.
También se colectó pinabete de San José Pinula.
Se obtuvieron las emanaciones de pinabete de 10 hojas de pinabete de cada una de las
muestras, según el método desarrollado previamente. Se analizaron por GC/FID (Fig.
No. 1), observando que hay diferencias en el perfil cromatográfico de las emanaciones
según el lugar de origen de la muestra.
El análisis por GC/masas confirma la presencia de alfa-pineno, limoneno y cariofileno
(Ver cuadro No. 2). Estos componentes también habían sido detectados previamente en
el aceite esencial de pinabete, difiriendo en la presencia de beta-pineno y canfeno,
aunque se recomienda realizar estudios utilizando la técnica de headspace-GC/MS
Además de haberse detectado otros componentes como aldehídos y ésteres de ácidos
grasos, los cuales debieran ser estudiados en futuras investigaciones.
Con estos resultados y los de estudios anteriores, se asignaron identidades a los picos
mayoritarios (ver cuadro No. 3).
Entre las dificultades que se presentaron durante este periodo, cabe mencionar
la disponibilidad del equipo durante las fechas navideñas. Por lo que se realizaron
análisis en fechas próximas a antes y después de la Navidad. Sin embargo, puede
esperarse diferencias del aroma entre unas fechas y otras debido a la fenología de la
planta.
Cuadro No. 9.
Tabulación de resultados de la GC- FID de las emanaciones de pinabete a 21ºC.
Compuesto Origen Código
No.
Cromatograma
(SIG00)
Tiempo
de
retención
(min.)
Área
(counts*s)
alfa-pineno
Tejutla Ag6A 6 13,640 2,00E+07
Tejutla Ag6B 7 13,327 9,66E+06
Panquix Ag5J 5 13,419 7,03E+06
San José
Pinula Ag19A 17 13,567 5,18E+05
beta pineno
Tejutla Ag6A 6 16,757 1,41E+07
Tejutla Ag6B 7 16,746 2,12E+07
Panquix Ag5J 5 16,905 2,57E+07
San José
Pinula Ag19A 17 16,496 2,38E+05
Limoneno
Tejutla Ag6A 6 18,372 3,41E+06
Tejutla Ag6B 7 18,248 1,77E+06
Panquix Ag5J 5 18,294 1,74E+06
San José
Pinula Ag19A 17 18,155 6,51E+04
30
Cariofileno
Tejutla Ag6A 6 25,281 9,70E+00
Tejutla Ag6B 7 25,263 9,74E+05
Panquix Ag5J 5 25,418 1,11E+06
San José
Pinula Ag19A 17 25,427 3,94E+05
Fuente: FODECYT 87-2006.
31
Cuadro No. 10
Composición de las emanaciones de pinabete de diferentes lugares de origen, a
21ºC.
Fig
ura
No. 2
Per
fil
crom
ato
grá
fico
de
las
eman
acio
nes
de
pin
abet
e a
21ºC
. O
bsé
rven
se l
as d
ifer
enci
as.
Fuen
te:
FO
DE
CY
T
87
-2006.
seg
ún e
l lu
gar
de
ori
gen
.
Fuente: FODECYT 87-2006.
32
Origen Código
No.
Cromatograma
(SIG00)
a-pineno
(moles
mL*g)
b-pineno
(moles
mL*g)
(+/-)-
limoneno
(moles
mL*g)
Tejutla Ag6A 6 1,41E-03 1,24E-03 5,13E+05
Tejutla Ag6B 7 6,43E-05 1,74E-04 2,50E+04
Panquix Ag5J 5 9,33E-05 4,18E-04 4,89E+04
San José Pinula Ag19A 17 4,26E-05 1,21E-06 5,69E+02
Fuente: FODECYT 87-2006.
33
Fig No. 3
Superposición de cromatogramas de las emanaciones de muestras de pinabete provenientes de diferentes lugares de origen: Panquix, Totonicapán y Tejutla. Los tiempos de
retención fueron normalizados utilizando el programa de ChemStation. A) compuestos cuantificados. B) Posibles compuestos detectados.
Felandreno
Mirceno Región de los
sesquiterpenoides
Fuente: FODECYT 87-2006.
III.1 Discusión de Resultados
Si bien, los tiempos de retención son reproducibles (ver cuadro No. Anexos), lo
cual implica que la desorción y el método cromatográfico son reproducibles no puede
decirse lo mismo de las concentraciones de los diversos analitos, pues varían
significativamente de una muestra a otra, indicando falta de reproducibilidad (Ver
Figura No. 2 ). Esto se puede atribuir, según Lagalante y Montgomery (2003), a que la
concentración de alfa pineno sea diferente entre muestra y muestra. También se ha de
considerar el proceso de partición de los terpenoides entre la matriz vegetal y el espacio
libre durante el muestreo, el cual puede ser reducir la reproducibilidad por depender de
la fisiología de la planta. Se recomienda trabajar con mayor cantidad de muestras
provenientes de la misma región geográfica y en lo posible de la misma región de la
ramilla; siempre se deberá incluir una prueba de olor de cada muestra para poder
correlacionar los perfiles cromatográficos y el aroma. Esto permite utilizar la
información obtenida, aún si no hay reproducibilidad en la emanación de aceites
esenciales por la planta.
Respecto a la metodología SPME utilizada cabe decir que aunque Beaulieu & Lea
(2006) sugieren calentamiento a 40ºC y agitación durante la exposición a la fibra, el
experimento se realizó a 21ºC y sin movimiento por la naturaleza de la muestra.
Respecto a la agitación, porque se buscaba analizar la emanación de la planta viva
cuando no está movimiento (pues es la forma en que se comercializa). Y, el
calentamiento, afectaría de los resultados de dos formas principales:
a) El calor, mataría a sus células perdiendo la regulación fisiológica y liberando
más sustancias volátiles que las que normalmente emanaría la planta. Por lo
cual se corría el riesgo de extraer más tipos y mayor concentración de los
metabolitos de los necesarios para el aroma a pinabete. Pues en estudios
anteriores (Nitsch, ), se ha determinado que el aroma del aceite esencial obtenido
por destilación por arrastre con vapor de agua es diferente al del aroma a
pinabete
b) Posiblemente existen compuestos termolábiles.
Sin embargo, podrían considerarse modificaciones metodológicas de la incubación
como utilizar una temperatura aún menor, similar a la del bosque nuboso; además de
considerar la cantidad y tipo de luz que recibe la planta durante la SPME.
En esta investigación se realizaron pruebas preliminares para las siguientes variables
con el fin de tener parámetros para la siguiente fase del estudio:
Temperatura: se analizaron las emanaciones a 6ºC, 21ºC y 23ºC (temperatura
ambiente). Encontrando diferencias en los perfiles cromatográficos, por lo cual
se recomienda analizar las emanaciones de la planta a diferentes temperaturas
que estén dentro del intervalo de las condiciones climáticas de la época navideña
(de 19 a 24 ºC).
Intervalo de tiempo de emanación, el cual se dejó constante a 24 horas
aproximadamente. Sin embargo se pueden explorar intervalos menores.
Duración del muestreo por SPME, que está asociado al tiempo requerido para
llegar al equilibrio entre la fase gaseosa y la fase líquida. Sin embargo, por la
35
naturaleza de la muestra, este equilibrio no se da porque la planta está en un
proceso de emanación regulada fisiológicamente, y no regida únicamente por
factores no biológicos como en el caso de muestras inertes.
Material vegetal utilizado
Según los resultados obtenidos es recomendable considerar las siguientes variables
en futuros estudios:
Hora en que se hace el muestreo. Dado que se está trabajando con material
vegetal vivo, debe considerarse la fenología de la planta pues puede presentar
patrones de emanación diferentes según la cantidad de luz, calor , humedad, etc.
Es recomendable hacer un estudio de correlación entre las propiedades
organolépticas del aroma y la composición de las emanaciones de la planta
durante el período de producción de semilla del pinabete (que va de octubre a
enero).
Humedad presente en la muestra y el medio ambiente. Además de la producida
por la planta durante el tiempo de extracción.
Presión atmosférica.
Época del año
El agua y el dióxido de carbono detectada por GC/MS se atribuyen a productos del
metabolismo de la planta, pues el vial estaba guardado en un lugar seco y el porcentaje
de humedad del GC/MS reportaba menos del 8% (ver anexo).
Aunque la cantidad de repeticiones no es óptima, puede decirse que hay compuestos
que aparecen en los perfiles cromatográficos de ejemplares de pinabete provenientes de
diferentes lugares (Fig. No.3). Estos compuestos son: alfa-pineno, beta-pineno,
limoneno y cariofileno. Los primeros tres fueron cuantificados en este proyecto (ver
cuadro No. 5). Estos compuestos podrían ser esenciales para obtener un aroma
característico a pinabete, puesto que los tres ejemplares fueron recolectados por su
aroma en bosques cultivados por personas que venden pinabete durante las épocas
navideñas. Sin embargo, aun quedan compuestos por identificar y cuantificar (Fig No.
3). Por ejemplo, los compuestos que representan los picos alrededor de 15.3 min, 20.2
y la región de los sesquiterpenoides. Al cruzar esta información con la obtenida por
GC-MS (Anexos ) y la composición de plantas de la familia pinaceae (Nitsch, 2005 ),
puede asignarse al canfeno, mirceno, en los tiempos de retención mencionados. Y se
puede esperar la presencia de alfa-copaeno y cubebeno en la región de los
sesquiterpenoides.
Entre otros compuestos detectados en las emanaciones del pinabete, cabe resaltar los
fenilpropanoides (Anexos) tales como el benzaldehído, salicilato de metilo, alcohol
bencílico y ácido benzoico. Aunque éstos se encuentran a bajas concentraciones,
Dada la alta concentración de beta-pineno, el cálculo de fracción molar en la fase
gaseosa se ve afectado, pues se obtiene un valor de 0.999, reduciendo los valores de los
otros compuestos a una cantidad de 0.001 o menos. Aunque podría predecirse una
mezcla basada en esta información (Anexos), es recomendable determinar la
composición de las emanaciones de pinabete bajo diferentes condiciones (Fig No.3 )
para observar si hay variaciones de liberación de aroma durante el transcurso del día que
puedan orientar de mejor manera el diseño de la composición de la mezcla de aceites
esenciales para obtener el aroma a pinabete.
36
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES
1. Se identificaron y cuantificaron los componentes mayoritarios del aroma del
pinabete.
2. Se extrajeron las emanaciones/aroma de ramilla de pinabete cultivados
provenientes de tres diferentes lugares: Panquix, Tejutla y San José Pinula,
utilizando la técnica de microextracción en fase sólida.
3. Se determino que existen 7 compuestos en común en las emanaciones de
ramilla de pinabete cultivado de tres diferentes lugares de origen. Además se
detectaron alrededor de 80 compuestos presentes en las emanaciones de
pinabete, los cuales pertenecen a diferentes familias de compuestos: terpenoides,
fenilpropanoides, aldehídos y ésteres de ácidos grasos.
4. Se identificaron alfa-pineno, beta-pineno, (±)-limoneno como componentes
mayoritarios en el aroma de ramilla de pinabete cultivado, de acuerdo a previos
estudios sobre su aceite esencial. En las emanaciones de ramilla de pinabete
cultivado proveniente de Panquix, se cuantificaron: -pineno (9,33E-05
moles/g*cm3
± 2%), -pineno (4,18E-04 moles/g*cm3
± 3%), (±)-limoneno
(4,89E+04 moles/g*cm3
± 5%).
5. Se confirmo la presencia de -pineno, -pineno, (±)-limoneno.
6. La fibra utilizada en SPME presentó un comportamiento lineal en la adsorción
de los compuestos cuantificados, ver cuadros 10, 12 Y 14.
7. Se detectaron nuevos componentes de las emanaciones de pinabete: terpenoides
(D-3-careno, cubebeno, eugenol), aldehídos (decanal), y fenilpropanoides
(benzaldehído, ácido benzóico).
8. Se cuantificaron los componentes mayoritarios alfa-pineno, beta-pineno y
limoneno en las emanaciones de pinabete utilizando la microextracción en fase
sólida encontrando variaciones en las emanaciones según temperatura y otros
factores que no eran parte de este estudio.
9. Al comparar la composición de emanaciones de ramilla de pinabete cultivado de
tres diferentes lugares de origen, se detectaron diferentes perfiles
cromatográficos (ver figuras 2 y 3). Sin embargo, todas las ramillas eran Abies
guatemalensis y en el mercado se ofrecían por su característico olor. Por lo
tanto puede decirse que estas muestras contenían los compuestos necesarios para
el aroma de pinabete, además de otros compuestos.
10. Se generó información acerca de la composición del aroma de pinabete.
11. Se acepta la hipótesis planteada
37
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Ya que se determinaron los compuestos mayoritarios del aroma de pinabete, el
siguiente paso sería determinar los componentes necesarios para el aroma de pinabete.
Esto se recomienda debido a que se detectaron diferencias de composición en ramillas
de pinabete de diferente lugar de origen, pero que todas fueron adquiridas por su aroma
característico. Para ello se deberán estudiar más muestras de al menos los lugares de
origen incluidos en esta investigación.
Al mismo tiempo se sugiere hacer una revisión bibliográfica de plantas que sean
potenciales fuentes de limoneno, y los pinenos, compuestos detectados como parte del
aroma de pinabete.
2. Respecto al proceso de extracción:
Explorar el potencial uso de técnicas de espacio de cabeza (headspace) para el
análisis de las emanaciones de la planta, pues representa una medición directa de
la fase gaseosa sin la fibra intermediaria como en SPME.
Utilizar una ramilla de pinabete completa, lo cual implica utilizar una cámara
cerrada más grande. Esto debido a que el pinabete se comercializa por ramilla,
la cual lleva tanto hojas como tronco del árbol, y los resultados de este estudio
sugieren que puede existir diferencias entre analizar solamente hojas y ramilla.
Utilizar mayor cantidad de material vegetal en un contenedor hermético. El
volumen de este contenedor debe ser tal que el volumen del material vegetal sea
insignificante.
3. Respecto a la detección y cuantificación de los componentes del aroma de pinabete:
Optimizar un método de detección y cuantificación de volátiles utilizando GC-
MS.
Determinar la isomería de los compuestos detectados, para lo cual se deberá
considerar una columna cromatográfica quiral.
Cuantificar al cariofileno, careno, eugenol, aldehídos y fenilpropanoides
detectados.
Se puede considerar el uso de agentes secantes para reducir la cantidad de agua,
que es producida por la planta inyectada al cromatógrafo y podría alterar los
resultados obtenidos.
4. Entre otras recomendaciones se encuentran:
Al estudiar la composición de las emanaciones de pinabete en función de
diferentes lugares de origen, los datos generados pueden servir para el estudio
quimiotaxonómico. Un modelo de estudios en quimotaxonomía de coníferas
utilizando SPME puede hallarse en Lagalante & Montgomery (2003).
Monitoreo de las variaciones en la composición de las emanaciones del pinabete
según la época del año, para determinar otros componentes importantes para el
aroma característicos.
38
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aguilar, J. 1961. Pinos de Guatemala. Ministerio de Agricultura. Guatemala. 32pp.
Allingen, N., et al. 1971. Organic Chemistry. Worth Publishers. New York. 1007 pp.
Asociación Becaria Guatemalteca. Guauhitemala: lugar de bosques. 1991.
Asociación Becaria Guatemalteca. Ed. Piedra Santa. Guatemala. vol 1. 65pp.
Bagci, E. & M. Digrak. 1996. Antimicrobial Activity Of Essential Oils Of Some Abies
Species From Turkey. J. Flavour. Fragr. (11) 251-256
Bauer, J. Ed. 1982. Especies con potencial para la reforestación en Honduras.
Corporación Hondureña de desarrollo forestal. CATIE. Honduras.
Beaulieu, J. & J. M. Lea. Characterization and semiquantitative analysis of volatiles
in seedless watermelon varieties using solid-phase microextraction.
JAgricFoodChem (54): 7789-7793. 2006.
Beneítez Flores, Rocío. Terpenos, esteroles y aceites esenciales. Química de
productos vegetales. Universidad del Valle de Guatemala. 1999.
Bennaton, E. 2001. Estrategia Nacional para la protección y conservación del pinabete.
Revista Guatemala Forestal. INAB. Número 9, Año IV. Pagina 2. Guatemala
Brey. W. Physical Chemistry And Its Biological Applications. Academic Press. New
York. 1978. 589pp.
Castañeda, Juan Carlos. 2005. Extracción del aceite esencial de pinabete (Abies
guatemalensis Rheder) por medio de arrastre de vapor, para la extracción y
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43
IV.4. ANEXOS
44
IV.4.1. ANEXO 1
IV.4.1.A. Descripción botánica del Pinabete Descripción del árbol: el pinabete es una conífera proveniente del hemisferio norte,
con tronco alto y fuerte, hojas aciculares perennes color verde, la copa con forma
piramidal, sus conos son dehiscentes de forma ovalada. El olor de su resina en el tronco
y ramas es muy agradable. Sus semillas son de forma ovalada que presentan datos de
germinación muy bajos (7-15%).
Distribución: el pinabete crece en regiones con una altitud mínima aprox. de 2400
msnm hasta los 3500, con precipitaciones mínimas de 1000mm anuales, con exposición
solar de norte y noroeste. Estos datos corresponden según Holdrige a las zonas de vida
Bosque húmedo y muy húmedo montano. En Guatemala, se encuentra principalmente
en las zonas montañosas como el altiplano y Sierra de las Minas. Los bosques más
representativos de pinabete se encuentran en los departamentos de Totonicapán,
Quetzaltenango y Huehuetenango.
Ecología: los bosques de pinabete suelen estar asociados con diferentes especies de
coníferas y latifoliadas. Los principales rodales se encuentran asociados con las
coníferas Pinus ayacahuite y Cupressus lusitanica, y en menor proporción con
latifoliadas como Quercus spp. Ocupa un “grado avanzado” en la sucesión ecológica
de los lugares en donde habita, ya que para su buen desarrollo, necesita de sombra que
es proporcionada por grandes árboles de especies descritas anteriormente y micorrizas
características de estos bosques.
Las semillas y el aceite esencial:
Las semillas tienen localizadas glándulas de almacenamiento de las oleorresinas donde
se encuentra el aceite esencial.
El aroma en del género Abies es una mezcla de varios compuestos (terpenos, a-b
pineno, a-b- felandreno, limoneno, mentona, entre otros comunes del género Abies del
Este de Rusia). Las propiedades de estos compuestos son utilizadas como defensa
natural de las plantas contra depredadores. Estas mezclas complejas pueden ser
determinadas en su mayoría por el método que implica la separación de estos
componentes por sus interacciones químicas (polares y apolares) y la determinación de
la fórmula molecular de éstos: espectrometría de masas/cromatografía de gases.
La determinación de los componentes del aceite esencial servirían de información
importante para investigaciones relacionadas con la especie tales como:
Procesos de germinación
Cultivo de meristemos
Síntesis del aceite esencial
Componentes del aceite esencial que han sido identificados:
Alfa pineno, beta pineno, limoneno, cariofileno. Probablemente, también felandreno.
45
ANEXO 2
Resultados de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas
Cuadro No. 11
Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente
de Panquix. La fibra fue almacenada a 4ºC durante cuatro semanas. Pico
No. tR
Area
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
11 2,46 0,61 2,4-Heptadiene, (E,E)- 86 2818 002384-94-3
2,4-Hexadiene, 2-methyl- 64 2849 028823-41-8
12 6,74 3,76 2-Hexenal 96 3073 000505-57-7
2-Hexenal, (E)- 91 3111 006728-26-3
2-Hexenal, (E)- 91 3113 006728-26-3
13 6,93 4,49 2-Hexenal 96 3073 000505-57-7
2-Hexenal, (E)- 94 3112 006728-26-3
2-Hexenal, (E)- 94 3113 006728-26-3
14 12,27 4,91 Benzaldehyde 96 4942 000100-52-7
Benzaldehyde 96 4944 000100-52-7
Benzaldehyde 96 4941 000100-52-7
15 12,46 0,76 Benzaldehyde 74 4941 000100-52-7
Benzaldehyde 72 4944 000100-52-7
17 15,74 1,33 Benzene, 1-methyl-2-(1-
methylethyl) 97 14404 000527-84-4
Benzene, 1-methyl-2-(1-
methylethyl) 95 14406 000527-84-4
Benzene, 1-methyl-3-(1-
methylethyl) 91 14402 000535-77-3
18 15,95 5,68 D-Limonene 93 15136 005989-27-5
D-Limonene 93 15128 005989-27-5
Limonene 91 15138 000138-86-3
19 16,08 1,16 Cyclohexene, 1-methyl-4-(1-
methylethenyl)-, (S)- 70 15340 005989-54-8
20 17,54 0,64 1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-
(1-methylethyl)- 91 15330 000099-85-4
1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-
(1-methylethyl)- 86 15322 000099-85-4
1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4-
(1-methylethyl)- 78 15328 000099-85-4
21 20,39 1,89 Phenylethyl Alcohol 91 9609 000060-12-8
Phenylethyl Alcohol 91 9608 000060-12-8
Phenylethyl Alcohol 87 9607 000060-12-8
22 24,49 2,06 Methyl Salicylate 91 24654 000119-36-8
Methyl Salicylate 91 24651 000119-36-8
Methyl Salicylate 90 24653 000119-36-8
23 28,87 1,14 Acetic acid, 1,7,7-trimethyl-
bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester 98 53424 092618-89-8
Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol, 1,7,7-
trimethyl-, acetate, (1S-endo)- 96 53444 005655-61-8
Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
46
Acetic acid, 1,7,7-trimethyl-
bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester 89 53426 092618-89-8
24 34,79 14,24 Caryophyllene 99 58633 000087-44-5
Caryophyllene 98 58637 000087-44-5
Bicyclo[5.2.0]nonane, 2-
methylene4,8,8-trimethyl-4-vinyl- 93 58752 242794-76-9
25 36,22 1,99 .alpha.-Caryophyllene 95 58682 006753-98-6
1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9-
tetramethyl-, Z,Z,Z- 94 58735 1000062-61-9
.alpha.-Caryophyllene 93 58681 006753-98-6
26 40,13 0,51 Dodecanoic acid 94 56048 000143-07-7
Dodecanoic acid 93 56046 000143-07-7
Dodecanoic acid 93 56043 000143-07-7
28 42,77 2,94 Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1-
methylethyl)- 98 55045 000483-78-3
Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1-
methylethyl)- 96 55044 000483-78-3
Azulene, 1,4-dimethyl-7-(1-
methylethyl) - 94 55040 000489-84-9
29 44,07 0,96 Tetradecanoic acid 98 75070 000544-63-8
Tetradecanoic acid 96 75069 000544-63-8
Tetradecanoic acid 95 75071 000544-63-8
30 45,64 1,41 1,2-Benzenedicarboxylic acid,
bis(2-methylpropyl) ester 83 105074 000084-69-5
1,2-Benzenedicarboxylic acid,
butyl 8-methylnonyl ester 78 145664 000089-18-9
1,2-Benzenedicarboxylic acid,
butyl octyl ester 74 134724 000084-78-6
31 46,43 0,82 Hexadecenoic acid, Z-11 98 90865 002416-20-8
z-7-Hexadecenoic acid 92 90861 1000130-90-8
Cyclopentadecane 86 63051 000295-48-7
32 46,66 3 n-Hexadecanoic acid 99 92228 000057-10-3
n-Hexadecanoic acid 98 92226 000057-10-3
n-Hexadecanoic acid 96 92227 000057-10-3
33 51,65 4,84 Hexanedioic acid, bis(2-
ethylhexyl) ester 95 148385 000103-23-1
Hexanedioic acid, bis(2-
ethylhexyl) ester 91 148381 000103-23-1
Hexanedioic acid, bis(2-
ethylhexyl) ester 91 148384 000103-23-1
Fuente: FODECYT 87-2006.
47
ANEXO 3
Cuadro No. 12
Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente
de San José Pinula, análisis realizado en época post-navideña. Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
6 5,13 0,15 Toluene 91 2403 000108-88-3
Toluene 87 2400 000108-88-3
Toluene 87 2404 000108-88-3
10 11,59 0,24 1R-.alpha.-Pinene 96 15161 007785-70-8
1S-.alpha.-Pinene 96 15160 007785-26-4
Bicyclo [3.1.1] hept-2-ene, 2,6,6-
trimethyl-, (.+/-.)- 95 15351 002437-95-8
13 12,93 5,47 Benzaldehyde 96 4942 000100-52-7
Benzaldehyde 96 4944 000100-52-7
Benzaldehyde 95 4943 000100-52-7
16 14,52 0,03
Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene, 3,6,6-
trimethyl- 74 15289 004889-83-2
Tricyclo[2.2.1.0(2,6)]heptane,
1,7,7-trimethyl- 72 15325 000508-32-7
Cyclohexane, 1-methylene-4-(1-
methylethenyl)- 72 15307 000499-97-8
17 14,95 0,08 cis-3-Hexenoic acid 64 7000 1000132-06-8
18 15,05 0,15 Cyclotetrasiloxane, octamethyl- 72 115616 000556-67-2
22 15,39 0,44
Bicyclo[4.1.0]hept-3-ene, 3,7,7-
trimethyl-, (1S)- 97 15344 000498-15-7
3-carene 95 15133 013466-78-9
3-carene 94 15130 013466-78-9
24 16,14 0,46
Benzene, 1-methyl-3-(1-
methylethyl)- 97 14402 000535-77-3
Benzene, 1-methyl-2-(1-
methylethyl)- 95 14406 000527-84-4
Benzene, 1-methyl-3-(1-
methylethyl)- 95 14403 000535-77-3
27 16,36 6,18 D-Limonene 94 15138 005989-27-5
Limonene 91 15127 000138-86-3
Limonene 91 15128 000138-86-3
28 16,6 5,12 Benzyl Alcohol 94 5229 000100-51-6
Benzyl Alcohol 94 5228 000100-51-6
Benzyl Alcohol 91 5227 000100-51-6
29 19,46 0,9
Benzene, 1-methyl-4-(1-
methylethenyl)-
96 13628 001195-32-0
o-Isopropenyltoluene 95 13581 007399-49-7
Benzene, (2-methyl-1-propenyl)- 90 13598 000768-49-0
33 20 0,75 Undecane 89 27119 001120-21-4
34 20,21 0,43 Nonanal 90 19126 000124-19-6
Nonanal 64 19124 000124-19-6
35 20,6 3,64 Phenylethyl Alcohol 91 9608 000060-12-8
5229 000100-51-6 94 5228 000100-51-6 94 5227 000100-51-6
91
Fuente: FODECYT 87-2006.
48
Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
Phenylethyl Alcohol 91 9607 000060-12-8
Phenylethyl Alcohol 91 9609 000060-12-8
41 23,42 0,17 Benzoic Acid 72 9574 000065-85-0
42 23,79 3,36 Benzoic Acid 70 9572 000065-85-0
Benzoic Acid 64 9574 000065-85-0
Benzoic Acid 64 9573 000065-85-0
43 24,05 1,3 Benzoic Acid 76 9574 000065-85-0
Benzoic Acid 64 9573 000065-85-0
Cyclobutane-1,1-dicarboxamide,
N,N' -di-benzoyloxy- 64 151867 1000253-25-3
56 25,19 0,11 Decanal 91 26906 000112-31-2
Decanal 86 26907 000112-31-2
57 27,37 0,28 Benzeneacetic acid 90 15708 000103-82-2
Benzeneacetic acid 83 15709 000103-82-2
Benzoic acid, 3-methyl 72 15718 000099-04-7
60 28,93 1,82
Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol, 1,7,7-
trimethyl-, acetate, (1S-endo)- 98 53444 005655-61-8
Acetic acid, 1,7,7-trimethyl-
bicyclo[2.2.1]hept-2-y1 ester 98 53424 092618-89-8
Bornyl acetate 96 53333 000076-49-3
61 31,76 0,09 (+)-4-Carene 93 15144 029050-33-7
Bicyclo[3.1.0]hexane, 6-
isopropylidene-1-methyl- 90 15339 024524-57-0
Bicyclo[2.2.1]heptane, 2,2-
dimethyl-3-methylene-, (1S)- 87 15363 005794-04-7
62 32,1 0,22 Eugenol 97 31517 000097-53-0
Eugenol 96 31519 000097-53-0
Phenol, 2-methoxy-3-(2-
propenyl)- 96 31637 001941-12-4
63 32,94 0,23 .alpha.-Cubebene 95 58657 017699-14-8
Copaene 93 58614 003856-25-5
.alpha.-Cubebene 93 58655 017699-14-8
65 34,3 0,17 Caryophyllene 70 58633 000087-44-5
Naphthalene, 1,2,3,5,6,7,8,8a-
octahydro-1,8a-dimethy1-7-(1-
methyleth enyl)-, [1R-
(1.alpha.,7.beta.,8a.a1pha.)]- 62 58890 004630-07-3
66 34,84 8,57 Caryophyllene 99 58633 000087-44-5
Caryophyllene 95 58637 000087-44-5
Bicyclo[5.2.0]nonane, 2-
methylene-4,8,8-trimethyl-4-
vinyl- 95 58752 242794-76-9
69 36,24 1,24
1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9-
tetramethyl-, Z,Z,Z- 98 58735 1000062-61-9
.alpha.-Caryophyllene 98 58683 006753-98-6
.alpha.-Caryophyllene 97 58682 006753-98-6
Fuente: FODECYT 87-2006.
49
Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
71 37,21 0,08
Spiro[5.5]undec-2-ene, 3,7,7-
trimethyl-11-methylene-, (-)- 86 58754 018431-82-8
Azulene, 1,2,3,4,5,6,7,8-
octahydro-1,4-dimethyl-7-(1-
methylethylidene)-,(1S-cis)- 78 58831 000088-84-6
Thujopsene-13 76 58634 1000162-77-8
72 37,53 0,07
3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl-
1-cyclohexen-l-y1)- 86 50517 014901-07-6
3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl-
1-cyclohexen-l-y1)-, (E)- 62 50539 000079-77-6
3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl-
1-cyclohexen-l-y1)-, (E)- 62 50532 000079-77-6
73 37,74 0,07 Cyclododecane 94 34706 000294-62-2
1-Tetradecanol 91 65757 000112-72-1
1-Tetradecanol 90 65761 000112-72-1
75 38,38 0,07
Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2-
trimethylcyclopentyl) -, (R) - 98 57459 016982-00-6
Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2-
trimethylcyclopentyl) -, (R) - 98 57458 016982-00-6
Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2-
trimethylcyclopentyl) -, (R) - 97 57457 016982-00-6
76 39,02 0,11
Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,
6-dimethyl-4-(1-methylethyl)-,
(1S -cis) - 91 57467 000483-77-2
Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-
1, 1,6-trimethyl- 64 38744 000475-03-6
Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,
5,7-trimethyl- 64 38737 021693-55-0
77 39,67 0,07 .alpha.-Calacorene 90 56313 1000293-02-3
Naphthalene, 1,2-dihydro-3,5,8-
trimethyl- 81 37582 030316-18-8
78 40,14 0,13 Dodecanoic acid 94 56043 000143-07-7
Dodecanoic acid 91 56047 000143-07-7
Dodecanoic acid 83 56046 000143-07-7
81 41,03 0,03 Diethyl Phthalate 80 70484 000084-66-2
Diethyl Phthalate 78 70483 000084-66-2
Diethyl Phthalate 60 70482 000084-66-2
82 41,1 0,15
Propanoic acid, 2-methyl-, 1-(1,1-
dimethylethyl)-2-methyl-1,3-
propanediyl ester 78 109845 074381-40-1
Pentanoic acid, 2,2,4-trimethyl-3-
carboxyisopropyl, isobutyl ester 64 109844 1000140-77-5
86 42,44 0,09
Naphthalene, decahydro-4a-
methyl-1-methylene-7-(1-
methylethylidene)-, (4aR-trans) - 66 58833 000515-17-3
.beta.-Panasinsene 76 58675 1000159-39-0
88 42,69 0,09
3-Chloropropionic acid,
heptadecyl ester 93 139663 1000283-05-1
Fuente: FODECYT 87-2006.
50
Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
Trichloroacetic acid, pentadecyl
ester 82 148859 074339-53-0
89 42,78 0,54
Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1-
methylethyl)- 99 55045 000483-78-3
Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1-
methylethyl)- 96 55044 000483-78-3
6-Isopropyl-1,4-
dimethylnaphthalen 94 55037 000489-77-0
90 42,99 0,08 8-Heptadecene 86 81252 054290-12-9
8-Heptadecene 86 81251 002579-04-5
2-Tetradecene, (E)- 63 53627 035953-53-8
91 43,1 0,08 Eicosane 98 107653 000112-95-8
Hexadecane 95 73963 000544-76-3
Hexadecane 94 73968 000544-76-3
94 44,08 0,35 Tetradecanoic acid 99 75070 000544-63-8
Tetradecanoic acid 99 75072 000544-63-8
Tetradecanoic acid 95 75069 000544-63-8
95 44,83 0,14 2-Ethylhexyl salicylate 87 88400 000118-60-5
97 45,45 0,1 Pentadecanoic acid 99 83686 001002-84-2
Pentadecanoic acid 93 83683 001002-84-2
98 45,64 0,26
1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(
2-methylpropyl) ester 86 105074 000084-69-5
Dibutyl phthalate 78 105065 000084-74-2
Dibutyl phthalate 64 105063 000084-74-2
104 46,27 0,13
Pentadecanoic acid, 14-methyl-,
methyl ester 87 100727 005129-60-2
Pentadecanoic acid, 14-methyl-,
methyl ester 83 100726 005129-60-2
Hexadecanoic acid, methyl ester 83 100708 000112-39-0
105 46,43 0,17 5-Octadecene, (E)- 89 89785 007206-21-5
cis-9-Hexadecenal 89 81204 056219-04-6
Cyclopentadecane 86 63051 000295-48-7
107 46,66 0,7 n-Hexadecanoic acid 98 92228 000057-10-3
Tridecanoic acid 95 65562 000638-53-9
Tridecanoic acid 90 65565 000638-53-9
108 46,76 0,1
1,2-Benzenedicarboxylic acid,
butyl cyclohexyl ester 72 119727 000084-64-0
1,2-Benzenedicarboxylic acid,
butyl 8-methylnonyl ester 72 145664 000089-18-9
Dibutyl phthalate 72 105065 000084-74-2
111 47,58 0,18
Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl-2
-pyridyl)-4-(1H-pyrrol-1-y1)- 64 114656 1000268-74-7
113 47,96 0,17
2-Allylpent-4-enoic acid, methyl
ester 60 26429 054385-33-0
121
51,66 1,41
Hexanedioic acid, bis(2-
ethylhexyl 148385 000103-23-1
95 ) ester 95 148385 000103-23-1
Fuente: FODECYT 87-2006.
51
Pico
No. tR
Área
(%) Nombre
Coincidencia
(%) Ref· CAS No.
Diisooctyl adipate 91 148373 001330-86-5
Hexanedioic acid, bis(2-
ethylhexyl 148385 000103-23-1
95 ) ester 91 148385 000103-23-1
123 51,99 0,26
Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl-2-
pyridyl)-4-(1H-pyrrol-1-y1)- 60 114656 1000268-74-7
ANEXO 4
Resultados de cromatografía de gases acoplado a detector de ionización en llama
Se analizó la repetibilidad de los tiempos de retención de diversos aceites esenciales con
potencial interés para el aroma de pinabete. Se puede observar que existe
reproducibilidad del tiempo de retención, pero al analizar la repetibilidad en la
composición del las muestras (Cuadro No. 8) se encontró que variaron
significativamente.
Las muestras analizadas fueron aceites esenciales comunes en coníferas con los que
contaba internamente la Universidad del Valle par determinar tiempos de retención para
comparar más adelante con las muestras de pinabete. Se analizaron 5 microlitros de
cada aceite utilizando las condiciones antes mencionadas. En el cuadro No. 3. se
presenta la tabulación de estos resultados.
Cuadro No. 13
Análisis estadístico de los tiempos de retención de los aceites esenciales comunes en
coníferas.
Categoría -pineno canfeno pineno limoneno cariofileno
Media 13,48825 15,185 16,726 18,26725 25,34725
Error típico 0,0707264 0,04691837 0,08480468 0,045330959 0,04363938
Mediana 13,493 15,207 16,7515 18,271 25,3495
Moda #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A
Desviación estándar 0,1414529 0,081265 0,16960936 0,090661918 0,08727877
Varianza de la muestra 0,0200089 0,006604 0,02876733 0,008219583 0,00761758
Curtosis -
2,9441668 #¡DIV/0! 1,91125584 0,305093201 -
5,73631122
Coeficiente de asimetría
-0,1276566 -1,1289534
-0,87362114 -0,226312438
-0,02750344
Rango 0,313 0,158 0,409 0,217 0,164
Mínimo 13,327 15,095 16,496 18,155 25,263
Máximo 13,64 15,253 16,905 18,372 25,427
Suma 53,953 45,555 66,904 73,069 101,389
Cuenta 4 3 4 4 4
Nivel de confianza (95,0%) 0,2250833 0,20187359 0,26988659 0,144263478 0,13888013
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
52
En esta sección se presentan los datos de áreas de los picos cromatográficos, datos para
curva de calibración, regresiones lineales respectivas y análisis estadístico de los
tiempos de retención.
ANEXO 5
Cuadro No. 14
Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC.
Origen Código No.
Cromatograma (SIG00)
Tiempo de
retención (min)
Área (counts*s)
Cantidad de
pineno (uL)
g de -pineno
moles de
-pineno
Tejutla Ag6A 6 13,640 2,00E+07 9,57E-03 8,21E-03 6,03E-05
Tejutla Ag6B 7 13,327 9,66E+06 4,65E-03 3,99E-03 2,93E-05
Panquix Ag5J 5 13,419 7,03E+06 3,39E-03 2,91E-03 2,14E-05
San José Pinula Ag19A 17 13,567 5,18E+05 2,89E-04 2,48E-04 1,82E-06
Totonicapán Ag4B 2 12,842 2241401 1,11E-03 9,53E-04 7,00E-06
Cuadro No.15
Curva de calibración para la cuantificación de alfa-pineno.
Dilución Código No.
Cromatograma
Tiempo de retención
(min)
Área (counts*s)
Volumen inyectado
a-pineno (uL/500uL dicloro-metano)
Volumen de dicloro-
metano (uL)
Cantidad de a-pineno inyectada
(uL)
1/10 Ag43A 43 15,488 8,27E+07 0,4 50 500 0,04
1/20 Ag43B 44 15,183 3,56E+07 0,6 25 500 0,03
1/40 Ag43C 45 15,113 2,79E+07 0,5 12,5 500 0,0125
48: 1000000 Ag48A 62 14,918 4,22E+04 0,5 6 125000 0,000024
6:50000 Ag48B 63 14,87 5,22E+04 0,4 6 50000 0,000048
1/1000 Ag48C 64 14,916 6,13E+05 0,6 4,4 5000 0,000528
5/1000 Ag48D 65 14,955 6,06E+06 0,5 5,4 1000 0,0027
"10/1000" Ag48E 66 14,998 1,10E+07 1 5,4 1000 0,0054
"1/80" Ag43D 46 0,5 6 500 0,006
Curva de calibración: Área=2097382082(uL a-pineno)-89098,2825 uL a-pineno= (área+89098,2825)/2097382082
Estadísticas de la regresión de la curva de
calibración para la cuantificación de a-pineno
Coeficiente de correlación múltiple 0,99762233 Coeficiente de determinación R^2 0,99525031
R^2 ajustado 0,99366708
Error típico 388728,753
Observaciones 5
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
53
Cantidad de a-pineno inyectada (uL) Curva de regresión ajustada
y = 2E+09x - 89098
-2,00E+06
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
Cantidad de a-pineno inyectada (uL)
Áre
a (
co
un
ts*s
)
Fuente: FODECYT 87-2006.
54
ANEXO 6
Cuadro No. 16
Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC.
Origen Código No.
Cromatograma
Tiempo de retención
(min)
Área (counts*s)
Cantidad
de -pineno
inyectada (uL)
g de-pineno
moles de -pineno
Tejutla Ag6A 6 16,757 1,41E+07 8,39E-03 7,21E-03 5,29E-05
Tejutla Ag6B 7 16,746 2,12E+07 1,26E-02 1,08E-02 7,94E-05
Panquix Ag5J 5 16,905 2,57E+07 1,52E-02 1,31E-02 9,61E-05
San José Pinula Ag19A 17 16,496 2,38E+05 1,42E-04 1,22E-04 8,92E-07
Cuadro No.17
Curva de calibración para la cuantificación de b-pineno.
(1S)-(-)-beta-pineno 99% Aldrich en diclorometano.
Dilución Código No.
Cromatograma
Tiempo de
retención (min)
Área (counts*s)
Volumen inyectado
-pineno (uL/500uL dicloro-metano)
Cantidad
de -pineno
inyectada (uL)
1/10 Ag41A 38 16,7 1,02E+08 0,6 50 0,06
1/20 Ag41B 39 16,395 3,75E+07 0,5 25 0,025
1/40 Ag41C 40 16,285 2,43E+07 0,5 12,5 0,0125
1/50
regresión lineal: área counts*s = (1685054493,5806)(uL B pineno)
entonces uL B pineno = área counts*s/1685054493,5806
Estadísticas de la regresión para la curva de
calibración para la cuantificación de -pineno
Coeficiente de correlación múltiple 0,99517797 Coeficiente de determinación R^2 0,99037919
R^2 ajustado 0,98075839
Error típico 5795737,9
Observaciones 3
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
55
ANEXO 7
Cuadro No. 18
Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a
21ºC.
Origen Código No.
Cromatograma
Tiempo de
retención (min)
Área (counts*s
)
g de (+/-)- limoneno
moles de (+/-)-limoneno
Tejutla Ag6A 6 18,372 3,41E+06 2,42E-03 1,77E-05
Tejutla Ag6B 7 18,248 1,77E+06 1,23E-03 9,04E-06
Panquix Ag5J 5 18,294 1,74E+06 1,21E-03 8,88E-06
San José Pinula Ag19A 17 18,155 6,51E+04 -6,89E-06 -5,06E-08
Cuadro No. 19
Curva de calibración +/- limoneno 99% Merck en diclorometano.
Dilución Código No.
Cromatograma
Tiempo de
retención (min)
Área (counts*s)
Volumen inyec Tado (uL)
(+/-)-limoneno
(uL)
Diclorometano
(uL)
Cantidad de (+/-)-
limoneno inyectada
(uL)
6/1000 Ag45B 56 17,439 6,06E+06 0,4 6 1000 0,0024
4/1000 Ag45A 55 17,45 3,40E+06 0,5 6 1500 0,002
2/1000 Ag46C 58 17,32 1,65E+06 0,6 6 3000 0,0012
1/1000 Ag46B 59 17,3 9,47E+05 0,5 6 6000 0,0005
6/100000 Ag47A 60 17,313 8,44E+04 0,6 6 100000 0,000036
48/1000000 Ag47B 61 17.304 4,43E+04 0,6 6 125000 0,0000288
y= 1378074731,43168 x + 74555,5034923425 entonces: x= (y-74555,5034923425)/1378074731,43168
Fuente: FODECYT 87-2006.
Estadísticas de la regresión para la
cuantificación de (+/-)-limoneno
Coeficiente de correlación múltiple 0,98716563 Coeficiente de determinación R^2 0,97449598
R^2 ajustado 0,96174398
Error típico 150669,477
Observaciones 4
Fuente: FODECYT 87-2006.
Fuente: FODECYT 87-2006.
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Gráfica de la curva de regresión y datos experimentales para el análisis de limoneno.
Cantidad de limoneno inyectada (uL) Curva de regresión ajustada
y = 1E+09x + 74556
0,00E+00
2,00E+05
4,00E+05
6,00E+05
8,00E+05
1,00E+06
1,20E+06
1,40E+06
1,60E+06
1,80E+06
2,00E+06
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014
Cantidad de limoneno inyectada (uL)
Áre
a (
co
un
ts*s
)
Fuente: FODECYT 87-2006.
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ANEXO 8
Perfiles cromatográficos de las emanaciones de pinabete
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59
ANEXO 9
Espectros de masas de los componentes mayoritarios de las emanaciones de pinabete.
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ANEXO 8
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO