Citotoxicidad mediada por células I

Hasta ahora, a lo largo del curso de inmunología hemos visto lo que sería la activación del linfocito T, para el desarrollo

de una respuesta inmune adaptativa que ayudaría a los linfocitos B a producir anticuerpos, habría una producción de

citoquinas que estimularían a células granulocíticas a producir una serie de factores que también estarían mediando la

inflamación. Vimos también como los linfocitos T al ser activados, se proliferan y diferencian a células efectoras del tipo

Th, las cuales podían ser Th1 o Th2, y hasta ahora, lo que habíamos hecho énfasis era en los efectos de las células Th2,

en la colaboración de los linfocitos B para que estos se diferenciaran en células plasmáticas productoras de

anticuerpos. En esta clase y la siguiente vamos a enfocarnos en la inmunidad del tipo celular mediada de alguna

manera por Th1 pero de una forma indirecta, es decir, ellas son actores secundarios.

Las Th1 van a reconocer complejos y péptidos antigénicos asociados a moléculas MHC II y de esta manera ella podía,

al ser activada, reproducir factores solubles que actuaban sobre macrófagos que estaban infectados, y así ellas

exhibieran los patógenos intracelulares. Th2 también habíamos visto que va a reconocer complejos péptido

antigénicos con moléculas MHC II, pero en este caso, al ella activarse, a su vez va a producir una citoquina que va a

activar al linfocito B. Hoy les voy a hablar de las células T citotóxicas (entre otras) que van a reconocer complejos

péptido antigénicos unidos a moléculas MHC I, y de esta manera al activarse y diferenciarse va a matar la célula que

expresa dicha molécula con el péptido unido.

Cuáles son los efectores de la inmunidad celular?? Células T CD4 tipo Th1, células TCD8, células NK, células NKT y

macrófagos activados por las células T (el cual será el tema de la clase que viene). Ya sabemos que la inmunidad celular

es una clase de inmunidad adquirida, donde no participan anticuerpos y tienen un papel muy importante en el

rechazo de transplantes, en detección y destrucción de células cancerígenas, y detección del microorganismo que vive

intracelular; en otras palabras, detección y destrucción de células propias que están modif icadas, bien sea porque han

sido infectadas por organismos de vida intracelular, o bien sea por una transformación abrupta.

Qué sería la citotoxicidad celular?? Mecanismo efector esencial en la respuesta inmune, donde los leucocitos van a

reconocer, va a contribuir en la defensa de la anatomía micro celular contra células tumorales, y ésta citotoxicidad es

muy importante en el rechazo de tejidos alogénicos (guárdenlo en un “rinconcito de su conocimiento”).

Entonces hoy principalmente hablaremos de los linfocitos T CD8, las

células NK y superf icialmente de las NKT. De ellas, unas

constitutivamente tienen la capacidad de ser citotóxicas: las NK, ellas

no necesitan ningún tipo de activación previa para ellas sembrar

toda la maquinaria metabólica y todos sus componentes necesarios

para, en cuanto ellas vean una célula blanco, la destruyan. Otras,

como los linf TCD8, tienen la potencialidad de ser citotóxicas, sin

embargo en su fase “naive” son incapaces de tener mecanismos

citotóxicos porque no tienen la maquinaria metabólica adecuada,

entonces ellas para poder ser citotóxicas tienen que adquirir esas

propiedades. Y también pueden haber células con actividad

citotóxica mediada por un porcentaje mínimo de células CD4 que

pueden tener también efectos citotóxicos, bien sea mediados por citoquinas como el TNF, o por otros mecanismos

que veremos más adelante.

Nuevamente, hoy hablaremos de: el linfocito T CD8, T CD4, la célula NK, una modif icación de NK que son las células K,

que no son más que NK que han sido activadas por citoquinas, y ellas han complicado su comportamiento y son más

efectivas en la eliminación de células tumorales, y por último las NKT.

Qué es lo primero que necesita un linfocito T CD8 para poderse activar?? Reconocimiento del antígeno. Existen

diferencias vastas entre lo que sería el reconocimiento del antígeno por células CD8 y NK . Ustedes recuerdan que una

de las características de la inmunidad innata es que no es específ ica, y que las células NK son componentes de ésta,

por ende son células que no tienen especif icidad por el antígeno, sin embargo, ellas tienen una serie de requisitos para

activarse, donde de por medio, hay un reconocimiento, pero tengan en cuenta que no es específ ico. Entonces, los CD8

sí son específ icos por el antígeno, y tiene restricción por las moléculas de MHC; qué ocurre con el NK? Reacciona

contra células que no expresan MHC y esto es lo que determina que éstas células puedan atacar, ellas tienen unos

receptores que NO son para antígeno, sino que cualquier célula que ellos ven que tiene distribuida la concentración

de MHC I, o la tiene alterada o disminuida, entonces ellos van a tener la señal suficiente para empezar con sus

mecanismos citotóxicos y matar a ésta célula blanco.

Repito: el hecho de que ellos (células NK) puedan percibir y que esto desencadene una respuesta en él en forma de

“matar” es que tiene un tipo de receptores que va a poder percibir que la célula blanco no tiene los niveles adecuados

de MHC I, lo cual implica un receptor que luego veremos pero NO ES TCR, no es un receptor para antígeno.

Células T Citotóxicas (CTL)

Estos son generalidades que ya conocen sobre las células T CD8: citotóxicas mediante el reconocimiento específ ico del

antígeno, y en muchos casos requieren de citoquinas que van a ser producidas por un linfocito T CD4 Th1 (los cuales

van a colaborar, no solo con macrófagos activándolos para destruir los patógenos que nos han infectado, sino también

cooperan con los linfocitos T CD8). Tienen restricción por MHC I. Los Th1 también van a activar células NK a través de

las citoquinas, entre ellas la más importante en este caso es el INF.

No solo es importante la inmunidad antiviral, sino también la antitumoral. Ustedes saben que todas las células

nucleadas, bajo condiciones normales, van a expresar moléculas de MHC I, y aquellas infectadas expresan péptidos

virales unidas al complejo, los cuales serán reconocidos por las células T CD8 y esto va a conducir a una actividad

efectora que va a llevar luego a la muerte de la célula infectada. En el caso de las células tumorales ya no son

proteínas virales obviamente, a menos que sea un tumor inducido por virus, sino que son proteínas modif icadas que

son las que determinan que la célula se transforme.

Qué se necesita para éste reconocimiento y futura activación del linfocito

T CD8?? Ó del linfocito T CD8 y su reconocimiento de la célula “diana”??

algún tipo de sinapsis inmunológica como sería la interacción del TCR

péptido-molécula MHC I, pero son muy importantes las moléculas de

adhesión tipo LFA-1 y también CD2 LFA-3.. Para la estimulación de la

célula obviamente se requieren los co estimuladores, que aquí no están

representados. Cómo sería la interacción inicial? En su función de

vigilancia inmunológica él va circulando, hasta que se consigue con una

célula infectada, la cual va a presentar péptidos unidos a MHC I, y a

través del LFA1 de ella que se une al I-CAM de la célula infectada, si no

hay una interacción antígeno específ ica sigue circulando y se va

tranquilamente en circulación.. Si hay un reconocimiento del

péptido unido al MHC, éstas uniones de las moléculas de

adhesión se hacen más fuertes y entonces ésta célula T

citotóxica va a enviar sus señales de muerte (luego veremos

cuáles son) y después de satisfacer toda su maquinaria se

separa..

Qué ocurre? Fíjense que hay dos condiciones diferentes:

1. Cuando un linfocito T CD8 “naive” necesita transformarse en

CTL.. Entonces el linfocito T CD8 virgen debe activarse,

proliferar, diferenciarse a células citotóxicas efectoras.

2. Cuando ya tenemos éste CTL y va a actuar con una célula

diana

AHORA.. Haré énfasis en la primera condición..

Aquí tienen un linfocito T CD4 que está produciendo

anticuerpos.. Uno debería esperar que, al igual que pasa esto

con el linfocito T CD4 (sea Th1 o Th2), el linfocito T CD8 al

reconocer una molécula MHC I que tiene el péptido unido, a

través de señales co estimuladoras y de interacciones de las

moléculas de adhesión, este CD8 T citotóxico debería activarse, proliferar y diferenciarse a una CTL, PERO NO SIEMPRE

ES ASI! Él en muchos casos necesita de la cooperación de un linfocito Th1, para que éste le provea de la IL-2, que

aunque él puede producir, no son cantidades suficientes.

Representado en éste cuadrito: aquí tienen los diferentes estadios de este linfocito T CD8 a medida que se va

activando, resulta que su etapa precursora él no expresa receptor de IL-2 como debería de esperarse, no va a producir

IL-2, por lo tanto no prolifera. Una vez que él es activado, empieza a expresar receptores para la IL-2; y si recuerdan

hay un evento simultáneo que se empieza a derreprimir el gen que codif ica para el receptor de IL-2 y al mismo tiempo

se activa el gen que produce la IL-2, entonces al mismo tiempo que se expresa el receptor comienza a producirse la IL-

2, pero esta no es en cantidad suficiente como para que éstos linfocitos proliferen y se diferencien. Entonces aquí

necesito, por la IL-2 que va a producir la Th1, para que adquiera la maquinaria necesaria para su efecto, que son unos

gránulos citotóxicos, lo que le permite a ella matar. Se requieren aprox 5 días para que pase éste linfocito virgen a su

forma efectora.

P qué tiene más importancia: el INF ó la IL-2? En éste caso la IL-2, porque ella es el factor de diferenciación de los

linfocitos T, y el interferón tiene otras funciones.

P en este caso podríamos hablar de la bimodalidad de la célula dendrítica para también activar al citotóxico al expresar

MHC I?? pudiera ser.. Qué hace a la célula dendrítica excelente célula presentadora? Que ella expresa co estimuladores

en una concentración bastante alta.

FORMAS DE ACTIVACIÓN DE TCD8

1. Aquí tienen una célula presentadora de antígeno, que normalmente sería

un macrófago.. Ella va a estimular al linfocito TCD4, ella se va a activar y va

a determinar que a través de sus citoquinas aumente la exposición de B7,

en este caso.. Y éste determina que por co estimulación el mismo linfocito

TCD8 produzca IL-2.

2. Otra posibilidad es: la célula

presentadora de antígeno activa la CD4

que producirá IL-2 y ésta aumenta los

niveles de los receptores para ella en

CD8, generando efectos sobre éste

linfocito TCD8.

3. Otro ejemplo es que la célula

dendrítica (que expresa altos niveles de

B7) activa directamente a las células

TCD8 vírgenes. Entonces aquí tienen una

célula dendrítica infectada por virus.. La

célula TCD8 activada va a producir IL-2.

Qué ocurre en el caso de proliferación

de las CTL memoria?? Recuerden que ya

las memoria son células que han visto al

antígeno por primera vez, que ellas se indujeron.. Se originan de una diferenciación

de unas células vírgenes y están esperando encontrarse al antígeno por segunda

vez y tiene unas características diferentes a las vírgenes. Si esto ocurre, en el caso

de la CTL memoria, ellas ya tienen una maquinaria adecuada de manera que al

encontrarse con una célula infectada por virus ella puede activarse y empezar a

producir su propia IL-2 necesaria para tener su efecto citotóxico, y no requiere de Th.

Continuamos con la segunda parte de la historia.. Aquí tenemos un linfocito Tc que ya tiene la maquinaria y disposición

para matar, pero volvemos a lo mismo, este tipo de células no pueden ir matando alegremente por ahí, necesitan una

serie de condiciones que determinan que no pueda matar a todo el mundo.. Esta CTL requiere estrictamente que le

sea presentado (otra vez) el mismo antígeno y en el mismo MHC I que determinó que este linfocito se activara cuando

él era virgen. Cuando se dan estas condiciones, para esto necesitamos de moléculas de adhesión I-CAM y LFA1, de

manera que se forme un conjugado del linfocito Tc efector con la célula blanco.. Esto va a enviar señales al citoplasma

de las células y va a haber un cambio en el citoesqueleto de esta célula, donde habrá activación por rearreglo de

microtúbulos y microfilamentos, y esto va a determinar que los gránulos TODOS se polaricen hacia la zona de contacto

con la célula blanco. Estos gránulos van a ser liberados a la zona de contacto por la célula Tc, para después dejar

moribunda a la célula diana y tranquilamente disociarse y matar a otras células que tengan las mismas condiciones. La

célula moribunda muere por apoptosis.

P qué determina que el CTL no salga lesionado en la sinapsis citotóxica?? Hay dos razones: unos autores dicen que

existe un gradiente en las sustancias de los gránulos que van hacia la célula diana y al citotóxico no le pasa nada.. la

contrapartida de esto es que dicen que hay unas enzimas catepsinas que van a estar en la zona de contacto y

protegen al linfocito Tc para que no se afecte.

Estos serían microfotografías de lo que está ocurriendo: una célula blanco y esto la CTL, y bueno aquí está en dibujito

caricatura.. Donde lo más importante es que te van mostrando como va variando la positividad de los gránulos, cómo

ellos se van moviendo por el citoplasma hacia diferentes regiones, y como quedan en la etapa f inal. Esta interacción

entre la célula citotóxica y la célula blanco es lo que se conoce como “el beso de la muerte”, y está representado aquí

de alguna manera donde en teoría esto representa la interacción del TCR con el MHC I, eso es lo que determina luego

que halla la liberación de los gránulos que van a inducir la muerte de la célula infectada. Las sustancias en los gránulos

van a abrir un poro en la célula, produciendo su muerte por un “choque” que no es verdadero.. Las células NO

NECESARIAMENTE mueren por choque osmótico..

Éstos gránulos son ricos en ciertas enzimas.. El gránulo una

vez que llega es dirigido hacia la membrana del linfocito Tc

que luego va a ser excitado y los monómeros de perforina

van a atacar (se van a unir) a la membrana de la célula

blanco y requiere la presencia de calcio para ella

polimerizarse, y eso no les recuerda al C9 del

complemento?? Ella actúa de una manera parecida! Si sólo

actúa perforina, cosa que NO ES ASÍ a menos que halla una

mutación o sea un modelo experimental manipulado

genéticamente, esta célula morirá por un choque osmótico

porque estos poros producen un desbalance y la célula

revienta. Aquí les traigo un dibujito de la perforina, no

deben saber mucho de ella pero me pareció que era bien

interesante xq desde hace muchos años se ha hablado de

ella pero en noviembre del 2010 es que se caracteriza la

molécula como tal completamente.. Y fue publicado en la revista “nature”. Y aquí tienen representado como sería el

ensamble de la perforina al abrir el poro…

Los gránulos no contienen sólo perforina, también tienen granzima y granulisina. La perforina actúa en el paso del

contenido de los gránulos al citoplasma de la célula blanco, ella es una proteína de 67kD (en el kuby dice 65, es lo

mismo) pero me parece importante que sepan que es una molécula pequeña, tiene multidominios.. Oligomeriza o

polimeriza en presencia de calcio y abre poros en la membrana. Normalmente, una vez que ella actúa y abre el poro,

facilita la entrada de las granzimas.

Las granzimas son serínproteasas que van a activar la apoptosis, una vez que ellas entran al citoplasma de la célula

diana. Se han descrito en humanos 5 granzimas diferentes, pero las más estudiadas son la A, B y C. Por otro lado está

la granulisina, que tiene acciones antimicrobianas que pueden inducir apoptosis; ella actúa por despolarización de la

membrana mitocondrial.

Existen diferentes formas como puede ser mediada la citotoxicidad: una es la que acabo de hablarles que es a través

de perforinas o por gránulos.. Otra es por liberación de enzimas.. Otra es por citoquinas (TNF).. Y a demás “nuestro

amigo” FAS, muy importante, a través del cual las células citotóxicas (bien sea CTL o NK) van a matar.. Qué ocurre?

Tenemos un linfocito T que expresará FASligando que puede tener una forma soluble y al unirse con su FAS

correspondiente determina la muerte de la célula que lo expresa. Cómo el FASL (ligando) es soluble? Hay unas métalo

proteinazas sobre la superf icie extracelular que

participan en el clivaje del FASL de manera que quede

soluble. Ya habíamos hablado de por qué la célula que

expresa el FAS es la que muere (en regulación).. A

demás hay otra muerte inducida por receptores que

sería el receptor para el TNF; estos dos tipos de

receptores inducen muerte en las células que las

expresan, ya que ellos pertenecen a la misma familia

(moléculas de la familia de receptores de TNF), tienen

un dominio de muerte que van a estar involucrados en

la activación de caspasas que determinan que las

células NO MUERAN por choque osmótico (necrosis),

sino por una muerte celular programada o apoptosis.

Si FAS une a su ligando o TNF se une a su receptor, se

determinará una activación de este dominio de muerte

y va a ensamblar a estas moléculas FADD (en caso de

FAS) o TRADD (en caso de TNF), y esto activa unas

caspasas (en este caso 8 y 10) que en algún punto

divergen o se asemejan, están intracelulares bajo una

forma inactiva de procaspasa, entonces en la activación

de FADD las procaspasas se activan a a caspasa y son

proteasas que actúan a cadenas inf initas de

interacciones hasta que se puedan activar también

nucleasas que inducen la fragmentación del ADN. Eso es apoptosis.

Entonces de algún modo ocurren los 2 mecanismos que son diferentes pero que en algún punto divergen en una vía

común; el CTL puede matar a través de la liberación de gránulos con perforinas y granzimas, donde la perforina abre

el poro, la granzima penetra y activa caspasas y esto conduce a apoptosis; otra vía, el FASL del CTL va a unirse al

receptor FAS en la célula diana va a activar caspasas que causarán la muerte por apoptosis.

Existen dos tipos de muerte celular (que ya deberían conocer):

- La necrosis: se pierde organización celular y conduce a la inflamación del tejido intersticial

- En la apoptosis: hay una formación de cuerpos apoptóticos, encogimiento celular, degradación de cromatina.. Los

eventos son ordenados y sus cuerpos apoptóticos son engullidos por células fagocíticas y no hay inflamación.

Hay métodos químicos para poderlo determinar.

Esto que vemos aquí son células que recibieron el “golpe letal” (efecto de la TCD8 sobre la célula diana) y observamos

los cuerpos apoptóticos.

Esto no es para que se lo aprendan, es simplemente por lo gráfica que es: fíjense la membrana, el citoplasma, el ADN

que se va a fragmentar por las nucleasas.. Aquí tienen FASL, TNF con su receptor.. Y fíjense la cantidad de casapasas

que se van activando por el camino hasta llevar a la activación de nucleasas que fragmentan el ADN… “cascada de

caspasas”.

Células NK

Ustedes ya saben cuales son sus características: son linfocitos, no tienen TCR, no expresan Igs en membrana (por lo

tanto no tienen marcadores ni de T ni de B), se activan por INF, IL-2 e IL-15, su mecanismo de destrucción no es

específ ico, pero ya dijimos que sí hay requisitos que evitan que ellas vayan matando alegremente; no tienen restricción

por MHC tipo I pero sí lo reconocen; aquí ven los marcadores de superf icie de las células NK..

Todos saben que las células NK son componentes tempranos en la

respuesta del hospedador. Entonces esto está muy bien representado

aquí: se producen

los interferones y

posterior a esto

hay activación de

NK y muchos días

después es que la

CTL se pone en

marcha.. Y este gráf ico es una repetición de lo mismo, de lo que les

acabo de decir, pero fíjense que aquí hay componentes adicionales:

los interferones primordiales serían y , por qué no el ? xq él

necesita que se desarrolle primero la inmunidad adaptativa para

producirse; fíjense lo que ocurre en relación al título de carga viral..

Cuando NK se activa hay un pico de carga viral, que sólo va a

disminuir cuando los CTL actúen.. O sea, NK es buena pero no tan

ef iciente como la activación de linfocitos Tc.

Actividad citotóxica de las células NK

Cómo mata la NK? Requiere de un cierto reconocimiento para discriminar a quién tiene que matar y a quién no. Esta

actividad citotóxica va a depender de un balance entre señales activadoras e inhibidoras de los receptores de células.

Hasta ahora, siempre se les ha dicho que llega un antígeno, se une a un receptor, esto va a dar una señal activadora y

la célula tiene su efecto; aquí en las células NK lo más importante

son las señales inhibidoras. Yo puedo tener una señal activadora,

pero si tengo un receptor inhibidor unido a su ligando, el que

predomina es el efecto de éste último.

Entonces, observen lo que ocurre en una célula normal: uno

debería esperar tener niveles adecuados de MHC I, nosotros en

la célula NK vamos a tener unos receptores activadores y unos

inhibidores, el receptor inhibidor se va a unir a la MHC I y por lo

tanto cuando hay niveles normales de éste el receptor inhibidor

se une y envía señales inhibitorias. De manera que aunque yo

haya unido el receptor activador, la señal es negativa y el NK no

mata.

Qué ocurre cuando la célula tiene una expresión anormal del

MHC I? no se da la señal inhibidora y el NK inicia la

degranulación para matar a la célula.

Si tienes inhibidor y activador no mata

Si no tienes inhibidor pero sí activador mata

Si no tienes inhibidor ni activador no mata

----------en el Abbas están muy bien explicados los receptores inhibidores y activadores.. Guíense por ahí-------------

Yo sólo les voy a presentar los mas importantes, que serían el CD19, y los KIR, fíjense que ellos son inhibidores porque

tienen una cola intracitoplasmática que está unida a unas secuencias que son conocidas como ITIM.. Y el TIM de aquí

lo que quiere decir es “inhibidor”.. cuando se une al receptor las señales que se envían son negativas.

Por otro lado están unos receptores activadores: CD16 (que recuerdan es el receptor para el Fc de la IgG, estúdienlo,

recuérdenlo), y Nkp30, Nkp44 y NKp46 también.

Los motivos o secuencias intracitoplasmáticas son I-CAMs. Cuando el receptor une su ligando debe haber una

transducción, cómo? Cuando se une un receptor activador que tiene I-CAM intracelulares, va a haber activación de

tyrosíncinasas y va a haber una fosforilación. Qué pasa con los inhibidores? Sus colas intracitoplasmáticas de xxxx van

a activar fosfatasas y ellas van a actuar sobre los motivos intracelulares inhibiendo su fosforilación.

Cómo se sabe que hay alteración del MHC?? En las células infectadas por virus hay una variación en la presentación de

MHC. Las células modif icadas pueden presentar bajos niveles. Los virus pueden inhibir la síntesis de proteínas, entre

ellas, la producción de MHC inducidos por interferones. Igualmente, las proteínas virales pueden bloquear el

ensamblaje. Los virus pueden alterar la glicosilación de proteínas

celulares del hospedador. Y por último, la unión de Receptores

activadores (como NKR-P1) junto con una baja expresión o unión a

Receptores KIR activa a las células NK para que maten a las células

diana por apoptosis.

Cómo mata la célula NK? Por interacción FAS-FASL, por liberación de

gránulos perforina y granzima, y por otros mecanismos que sólo

ellas (con respecto a CD8) tienen que es “ADCC” ó “citotoxicidad

celular dependiente de anticuerpos”. Las células NK, a través de su

receptor CD16 se va a unir a una IgG y va a enviar señales de

activación a la célula NK que va a generar sus gránulos y destruirá a

la célula infectada. Hay otras células que pueden matar por ADCC,

que son aquellas que tengan receptores para el Fc de las Igs, entre

ellas: macrófagos, neutrófilos, eosinóf ilos…

NKT

Son linfocitos que no pertenecen ni a los linfocitos T ni a los NK,

pero expresan TCR (no convencional). Si recuerdan, una de las

características de los TCR de los linfocitos es su gran variabilidad,

pero en el caso de las NKT su TCR es invariante!, tiene una cadena

invariante donde la gran mayoría de las NKT tienen una región

variable y una secuencia J, y una cadena seminvariante donde la

región V es 11. Resulta que éstas células con sus receptores lo que

reconocen son glicolípidos. Elemento de restricción? Molécula CD1d (del tipo de moléculas de MHC I no clásicas).

TAREA!!!!!

Estudiar a profundidad las células NKT

Estudiar valoración experimental de la citotoxicidad mediada por células (Kuby pag 366-368)

Fin! :) Vero M

22-02-11