Chromatographie

Physikalisch-chemische Trennmethoden, bei denen die Stofftrennung auf einer unterschied-lichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruhen.

Was ist Chromatographie?

Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen

• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert.

• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.

• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.

Mechanismen der Trennung

1. Adsorptionsgleichgewicht (feste stationäre Phase, flüßige mobile Phase): z.B. HIC, Adsorptionschromatographie.

2. Verteilungsgleichgewicht (flüßige stationäre Phase, flüßigeoder gasförmige mobile Phase): z.B. Verteilungschrom., RP, GLC

3. Ionenaustauschgleichgewicht (Ionentauscher als stationäre Phase, Elektrolyt als mobile Phase): z.B. Ionentauschchrom.

4. Gleichgewicht zwischen einer mobilen und einer stag-nierenden flüßigen Phase : z.B. Gelpermeation, SEC

5. Gleichgewicht zwischen einem immobilisierten Liganden und einer flüßigen mobilen Phase: z.B. Affinitätschromatog.

Verteilungskoeffizient

Der Verteilungskoeffizient Kd beschreibt wie sich eine Substanz zwischen zwei (nicht mischbaren) Phasen verteilt.

Kd = Konzentration in Phase AKonzentration in Phase B

Kapazitätsfaktor

Der Kapazitätsfaktor beschreibt die effektive Verteilung.Er besagt welche Menge an Substanz sich in einer Phase befindet.

Kx =

Damit ist der Kapazitätsfaktor von der Menge der Phasen abhängig.z.B.: Kd=1 und stat. Phase : mob. Phase = 10 : 1

10 x mehr in A als in B

Anzahl Mol in stationärer Phase Anzahl Mol in mobiler Phase

Die Trennung

I

S

D

C

Das Chromatogramm

Programmstart

Basislinie

Detektor-Signal

Lösungsmittel-Peak

Zeit

Der Peak

tR ... Retentionszeit t‘R ... Netto-Retentionszeit tM ... Totzeit w ... Basisbreite

Kapazitätsfaktor

k‘ = =tR - tM

tM

t‘RtM

Det

ekto

rsig

nal

tM tR1 tR2 Zeit

tM

tR1

tR2

h

w

wh

Relative Retention (Trennfaktor)

k‘ ist von der Säulenlänge und von der Geschwindig-keit der mobilen Phase unabhängig!

Peaks werden nur getrennt wenn k1‘ und k2‘ unterschiedlich sind.

Trennfaktor ist ein Maß für die Selektivität des Systems

wird durch die Eigenschaften der mobilen und stationären Phase bestimmt.

k2‘

k1‘

Die Auflösung

Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks A + B ist definiert als:

2 (tRB - tRA)

wA + wB

R =

R = 1.5

R = 0.5

R = 0.8

Trennstufenmodell

N = 16 . ( )2 Trennstufen (theoretische Böden)

H = Höhenequivalent eines theor. Bodens (HETP)

Zahl der theoretischen Trennstufen N gibt an, wie oft eine Gleichgewichtsein-stellung entlang der Säule erfolgen kann. Das Höhenequivalent gibt an, auf welcher Strecke (Länge) sich das Gleichgewicht einmal einstellen kann.

tR

wLN

Beinflussung der Auflösung

R = 0.25 . ( - 1) . N . ( ) 1 + k‘k‘

Selektivität des Systems„Wechselwirkungen“

Leistungsfähigkeitder Trennsäule

Stärke desElutionsmittel

Verbesserung der Auflösung

1. Relative Retention ()Änderung der station. PhaseWechselwirkungen der mob.

2. Trennstufenzahl (N)bessere oder längere Säule (2L1.4R); v von mobil. Phase

3. Kapazitätsfaktor (k‘)Stärke der mobilen Phaseändern

N

k'

N und k' bleiben gleich

und k' bleiben gleich

N und bleiben gleich

Quantifizierung

Etablierung der Basislinie

Messung der Peak-Flächen oder -Höhen

Einfache Kalibration

Gebrauch von Internen Standards

Die Basislinie

Die Basislinie ist nicht (immer) eben!

„Drift“ der Basislinie

„Tailing“ oder „Fronting“

spät eluierende Peaks

schlecht getrennte Peaks

Säulenbluten

Peak-Fläche und Peak-Höhe

Abschätzung der Peak-Fläche A über die Breite auf halber Höhe (wh = b0.5)

A = wh . h

Mit Integratoren oder Computerprogrammen errechenbar. Erkennung des Peak-Anfangs und -Endes wichtig.

Einfache Kalibration

Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!

Kalibration mit internem Standard

Flächen-Quotient

FQ1 = = = 1.05

FQ2 = = = 1.91

FQ3 = = = 2.81

PQ1 = = = 1,61

entspricht 1.64 Konz

Fläche Std 1 1,05Fläche IStd1 1,00

Fläche Std 1 1,62Fläche IStd2 0,85

Fläche Std 1 2,98Fläche IStd3 1,03

Fläche Probe 1,35Fläche Istd P 0,84

Konzentration

0 1 2 3 4

Fläc

henq

uotie

nt

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

x = 1.136 y - 0.18

Fläc

he

Klassifikation der Chromatographie

Planare Chromatographie:DünnschichtchromatographiePapierchromatographie

Säulenchromatogrphie:Flüssigchromatographie (LC, HPLC, IEC, GPC)Gaschromatographie (GLC, GSC)

HPLC & GCMethode Stationäre Phase Prinzip

(A) HPLCLLC flüssig, adsorb. Feststoff VerteilungLSC Feststoff (z.B. Silikagel) AdsorptionIEC Ionentauscher IonenaustauschSEC Polymer mit Poren Molekülgröße

(B) GCGLC flüssig, adsorb. Feststoff VerteilungGSC (a) Feststoff Adsorption

(b) Molekularsieb Molekülgröße