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ANALYTISCHE CHEMIE I
Trennmethoden
2. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
WS 2007/2008
Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Konstanz
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HPLC
• HPLC = hochauflösende Flüssigkeitschromatographie
= high performance liquid chromatography
• Die HPLC ist eine flüssigchromatographische Methode zur Analyse löslicher fester und flüssiger Substanzgemische.
• Mit ihrer Hilfe können u.a. komplexe Probengemische in ihre einzelnenKomponenten aufgetrennt, identifiziert (Retentionszeit) und auchquantifiziert (Detektor/Standards) werden.
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Haupteinsatzgebiet der HPLC ist die Untersuchung von:
• Substanzen die schwerflüchtig oder nicht flüchtig sind (beiflüchtigen Substanzen GC)
• Stark polare oder ionische Substanzen
• Substanzen mit hohem Molekulargewicht MW>500
• Thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen
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Klassische SC und HPLC
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Trennleistung einer HPLC
Korngröße der stationären Phase in der Säule
Trennleistung: Je kleiner die Korngröße, desto höher die Trennleistung. Problem: Kleine Korngrößen führen zu hohen Packungsdichten, die Schwerkraft reicht zum Transport der mobilen Phase nicht mehr aus; daher Einsatz von HPLC-Pumpen
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HPLC-Komponenten
• Vorratsgefäß (mobile Phase)• HPLC Pumpe(n)• Mischkammer• Proben-Injector (manual oder automatisch)• Säule• Detektor• (Fraktionssammler)• Abfallgefäß (mobile Phase)
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HPLC-System (1)
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HPLC-System (2)
LösemittelLösemittel
PumpePumpe
InjectorInjector
SäuleSäule
DetectorDetector
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HPLC-Pumpen
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Die HPLC - Pumpe hat die Aufgabe, die mobile Phase durch die Trennsäule zu fördern. Folgende Forderungen werden an eine derartigePumpe gestellt:
• Ausreichende Förderleistung
• Geringe Pulsation, um eine stabile Detektion zu erreichen.
• Konstante Förderleistung, um die Trennungen reproduzierbar zumachen
• Geringes Innenvolumen, um schnelle Gradientenbildung zuermöglichen
• Druckstabilität, da je nach Säulenfüllung hohe Drücke bis 400bar auftreten können.
Da die Pumpen hohen Belastungen ausgesetzt sind, unterliegen siestarkem Verschleiß.
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HPLC-Pumpen
Pneumatische Pumpe
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HPLC-Pumpen
Kolbenpumpe
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HPLC-Pumpen
Reziproke Pumpe
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Proben-Injektion in der HPLC
Funktion eines Sechswege-Ventils mit Dosierschleife
“load” “inject”
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HPLC-Säulen (1)
Analytische Säulen (unten):
2 - 8 mm ID
Präparative Säulen (rechts):
8 - 50 mm ID
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HPLC-Säulen (2)
• Analytisch: ng down to fg• Semi-prep: mg to ug• Preparativ: g• Industrie: kg
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Entgasung einer HPLC-Anlage
Die flüssige mobile Phase muss für die HPLC ausreichend frei von gelösten Gasen sein. Gasblasen stören den gleichmäßigen Fluss des Eluenten und verstärken das Rauschen im Detektor oder erzeugen sogenannte Geisterpeaks.
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Einflußgrößen
Säulenparameter
• Säulenmaterial
• Stationäre Phase
• Deaktivierung
• Coating Material
Instrumentenparameter
• Temperatur
• Flußrate
• Signal
• Proben-Sensitivität
• Detektor
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Säulen-Effizienz
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Arten von Flüssigchromatographie
• Verteilung (flüssig-flüssig)– Umkehr-Phasen
• unpolare stationäre Phase– Normal-Phasen
• polare stationäre Phase• Adsorption (flüssig-fest)
– zur Trennung relativ unpolarer Moleküle mit MW < 5000 – eine spezielle Stärke dieser Methode ist die Trennung
isomerer Mischungen wie meta- und para-Benzol-Derivate• Ionenaustausch• Gelpermeation
– Packung ist hydrophob - Trennung unpolarer Moleküle• Gelfiltration
– Packung ist hydrophil - Trennung polarer Moleküle
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Trennprinzipien (1)
102
103
104
105
106
MWAdsorption Verteilung Ionenaus-
tausch
RP NP
Ausschluß
Permeation Gelfiltration
Wasserunlöslich(unpolar)
Wasserlöslich(polar, ionisch)
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Trennprinzipien (2)
Beispiel: Peptide werden durch RP Verteilungschromatographie getrennt
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Anforderungen an die Stationäre Phase
• kleine poröse Partikel mit definierten Poren (Partikeldurch-messer 3 - l0 µm) und einer
• spezifischen Oberfläche zwischen 20 und 1000 m2/g
• enge Korngrößenverteilung (Durchmesserverhältnis des kleinsten zum größten Korn 1 zu 1,5 bis 2)
• chemische Veränderbarkeit der Partikel, um Art und Stärke derWechselwirkungen (Selektivität der Phase) zu beeinflussen
• reproduzierbare Herstellung
• mechanische Stabilität
• chemische Inertheit gegenüber Eluenten und Probe
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Stationäre Phasen –Zusammensetzung und Struktur
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Eluent / Lösungsmittel (mobile Phase)
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Das Lösungsmittel bzw. der Eluent muß in der HPLC mehrere Bedingungenerfüllen:
• Die Probe muß im Eluent löslich sein und darf keine chemischen Reaktionen mitdem Eluent eingehen
• Die stationäre Phase muß vom Eluent benetzt werden
• Das Eluens sollte in Wechselwirkung mit der geeigneten stationären Phase, dasGemisch möglichst schnell trennen.
• Es sollte sich ein Verteilungsgleichgewicht der gelösten Proben zwischen den beiden Phasen einstellen
• Das Eluens sollte mit der Detektorfunktion verträglich sein.
• Für den UV-Detektor darf es bei der Meßwellenlänge keine nennenswerteEigenabsorption besitzen.
• Das Eluens muß völlig frei von Schwebstoffen (Verstopfung von Fritten und unregelmäßiger Fluß) und Gasblasen sein (Bläschenbildungen! Störungen imDetektor; Entgasen !)
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Eluotrope Reihe
Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft E0
(≙ Polarität) bezogen auf NP-Phase (empirisch bestimmt)
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Adsorptionschromatographie
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• Die Adsorptionschromatographie (Flüssigkeits-Festkörper-Chromatographie) gehört zu den ältesten chromatographischen Methoden (Tswett, 1906).
• Die Retention wird bei der Adsorptionschromatographie durch die Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und den aktiven Stellen einer festen stationären Phase (Adsorbens) verursacht. Das Adsorbens ist ein poröser Festkörper mit grosser Oberfläche (50 - 1000 m2/g) wie z. B. Silicagel und Aluminiumoxid.
• Die Trennung der Probenmoleküle an polaren Adsorbentien wie Silicagel oder Aluminiumoxid (Normalphasen) erfolgt durch Polaritätsunterschiede, wobei polare Probenmoleküle stärker adsorbiert werden als apolare.
• Für die Abhängigkeit der Elution von der Art der funktionellen Gruppen der Probenmoleküle lässt sich deshalb eine empirische Reihenfolge aufstellen: gesättigte Kohlenwasserstoffe < Ester < primäre Amine < Carbonsäuren.
• Die Adsorptionschromatographie erzielt oft gute Trennungen von Isomeren-gemischen, wird aber im Allgemeinen nicht sehr häufig angewandt.
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Verteilungschromatographie
Man unterscheidet zwei Formen der Verteilungschromatographie:
• Die „Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie“, bei der flüssigestationäre Phasen verwendet werden
Nichtmischbarkeit von mobiler und stationärer Phase führt oft zu praktischen Schwierigkeiten (Sättigungsprobleme, mangelnde Stabilität, etc.)
Der ständige Verlust der stationären Phase (die nur durch physikalische Adsorption an den Teilchen des Packungsmaterials zurückgehalten wird) bedingt eine periodische Erneuerung/Wiederauftragen der stationären Phase.
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Verteilungschromatographie
• Die „Chromatographie an gebundenen Phasen“, bei der die organischestationäre Phase an einer Oberfläche immobilisiert wird
Dies erhöht die Stabilität gegenüber auswaschen durch die mobile Phase
Die organische stationäre Phase wird meist an Kieselgel-Partikel gebunden, die Durchmesser von 3-10µm haben. Kieselgel hat den Vorteil, dass es mechanisch stabil ist (was bei den hohen Drücken der HPLC nötig ist) und dass organische Verbindungen relativ einfach und vor allem in dichter Packung daran gebunden werden können
Kieselgel
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Gebundene, stationäre Phasen
“Umkehrphasen”Reversed Phase
“Normalphasen”
Nicht umgesetzte OH-Gruppen müssen durch kleine Chlorakylsilane deaktiviertwerden, was als Endcapping bezeichnet wird.
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RP-HPLC
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Lösemitteloptimierung – Mobile Phase
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HPLC Elutionssysteme
In der Regel werden Eluiermittelgemische verwendet. Man bezeichnet diese alsbinär (aus zwei Eluiermitteln bestehend), tertiär (drei Eluiermittel) oderquartemär (vier Eluiermittel).
Als isokratisch bezeichnet man Eluiermittelgemische, deren Zusammensetzungwährend der chromatographischen Trennung gleich bleibt.
Als Gradient bezeichnet man Eluiermittelgemische, deren Zusammensetzungwährend der chromatographischen Trennung geändert wird; dabei ändert sich die Eluier-Eigenschaft und der Druck.
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Gradientenprofil
Gradientenelution
Isokratische ElutionZeit
100% B
100% A
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HPLC Gradientensystem
Niederdruckgradient:
• Der Gradient wird vor der Pumpe erzeugt.• Verschiedenen Lösungsmittel werden durch
ein System von Schaltventilen in eineMischkammer gefördert.
• Nachteil: Es können Luftblasen in derMischkammer entstehen.
Hochdruckgradient:
• Aufwendiger, da für jede Komponente eineeigene, teure HPLC Pumpe benötigt wird.
• Durch das Mischen der Eluiermittel unterhohem Druck entstehen praktisch keineLuftblasen.
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Gradienten-Einfluß (1)
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Gradienten-Einfluß (2)
k* (retention)a* (selectivity)N (column conditions)
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Gradienten-Einfluß (3)
Der Gradient ermöglicht die Trennung aller acht Substanzen in etwaeinem Drittel der Zeit!
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HPLC : Derivate von 30 Aminosäuren(Orthophtalaldehyde, C18 RP column)
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Detektoren für HPLC
Detektoren am Ende der Säule der HPLC-Anlage wandeln stets eine physikalische Information in elektrische Signale (Analogsignale) um. Anforderungen an einen HPLC-Detektor sind:
• hohe Empfindlichkeit, um kleinste Mengen nachzuweisen • kurze Ansprechzeit (20ms bis 10ms) für steile Peakflanken• hohe Stabilität (Basisliniendrift, Langzeit- und Kurzzeitschwankungen) • kleines Küvetten-/Messzellenvolumen für geringe Rückvermischung • möglichst großer linearer Bereich
In Abhängigkeit von den aufzutrennenden Mischungskomponenten, der vorliegenden Konzentration, eventueller Matrixeffekte und der "Weiter-verwendung" (z. B. Bestimmung mit einem weiteren Detektor) ist für die HPLC eine ganze Reihe von Detektoren gebräuchlich, wobei das vomDetektor erzeugte elektrische Signal einerseits von der Konzentration des Analyten im Eluentenstrom abhängen kann oder vom Massenstrom des Analyten.
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Detektoren für HPLC
• Absorption (UV mitFilter, UV mitMonochromatoren)
• IR Absorption
• Fluoreszenz
• Brechungs-Index
• Verdampfung-Lichtstreuung(ELSD)
• Electrochemisch
• Massen-spektrometrisch
• Photo-Dioden Array
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Detektoren in der Flüssigkeitschromatographie
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HPLC Detektoren UV/Vis-Detektor
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HPLC Detektoren Diodenarray-Detektor (DAD)
• polychromatisches Licht (Deuterium- oder Wolfram-Lampe) wird auf die Probe eingestrahlt (wellenlängenselektive Absorption durch die Bestandteile der Probe)
• nach Durchstrahlung der Probe wird der polychromatische Lichtstrahl auf ein Gitter gelenkt, das ihn in seine Teilstrahlen zerlegt
• Anzahl der Teilstrahlen entspricht der Anzahl der Photodioden auf dem Array • Ergebnis: 3-dimensionale Abhängigkeit von Zeit, Absorption und Wellenlänge
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HPLC Detektoren Diodenarray-Detektor (DAD)
Die Software zu Diodenarray-Detektoren ist in der Lage, ein Chromatogramm im 3-dimensionalen Raum darzustellen. Beispiel: 3D-Ansicht eines Chromatogrammsvon polycyclischen Kohlenwasserstoffen (PAK)
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Anwendung HPLC Edman-Sequenzierung (1)
1. Kopplung: In diesem ersten Schritt wird an die freie N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das „EDMAN-Reagens“ Phenyl-isothiocyanat (PITC) gekoppelt. Dabei entsteht in annäherndquantitativer Ausbeute ein Phenylthiocarbamylpeptid (PTC-Peptid)
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Anwendung HPLC Edman-Sequenzierung (2)
2. Spaltung: Durch den säurekatalysierten nucleophilen Angriff des Schwefels an der ersten Peptidbindung kommt es zur Abspaltungder N-terminalen Aminosäure als Anilinthiazolinon-Aminosäure(ATZ-Aminosäure).
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Anwendung HPLC Edman-Sequenzierung (3)
3. Konvertierung: Die instabile ATZ-Aminosäure wird mit wäßrigerSäure linearisiert und bei erhöhter Temperatur zur relativ stabilenPhenylthiohydantoin-Aminosäure (PTH Aminosäure) umgelagert. Die PTH-Aminosäuren werden chromatographisch (HPLC) anhand derRetentionszeiten eines Referenzlaufes identifiziert.
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Anwendung HPLC Edman-Sequenzierung (4)
Durch Vergleich der Retentionszeiten jeder abgespaltenen Aminosäuremit denen von Standardaminosären kann die jeweilige Aminosäureidentifiziert werden
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Kenngrößen eines Chromatogramms
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Chromatogramme
Chromatographische Läufe sind nie 100% identisch, denn eskann zu „ganz normalen“ Schwankungen zwischen den Läufenkommen, wie:
• Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen (Luftblasen, manuelle Injektion).
• Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes.
• Veränderungen der Umgebungstemperatur etc.
Durch Zugabe eines internen Standards können diese Faktorenkorrigiert werden!
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Interne Standards
Interne Standards (engl. tracer) dienen sowohl der Überprüfung derchromatographischen Leistung einer HPLC-Anlage, sowie der Quanti-fizierung von Substanzen.
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