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Centro de Investigación Científica y de Educación
Superior de Ensenada, Baja California
Maestría en Ciencias Ciencias de la Vida
con Orientación en Biomedicina y Bionanotecnología
Desarrollo de un sistema antimicrobiano basado en
nanopartículas tipo virus
Tesis
para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Presenta:
Kendra Ramírez Acosta
Ensenada, Baja California, México
2020
Tesis defendida por
Kendra Ramírez Acosta
Y aprobada por el siguiente comité
_____________________________ Dr. Rubén Darío Cadena Nava
Director de tesis
Miembros del comité
Dra. Carmen Guadalupe Paniagua Chávez
Dra. Rufina Hernández Martínez
__________________________________________ Dra. Patricia Juárez Camacho
Coordinadora del Posgrado en Ciencias de la Vida
__________________________________________ Dra. Rufina Hernández Martínez
Directora del Estudios de Posgrado
Kendra Ramírez Acosta © 2020 Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis
ii
Resumen de la tesis que presenta Kendra Ramírez Acosta como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en biomedicina y bionanotecnología.
Desarrollo de un sistema antimicrobiano basado en nanopartículas tipo virus Resumen aprobado por:
_________________________ Dr. Rubén Darío Cadena Nava
Director de tesis La emergencia acelerada de bacterias resistentes a los antibióticos representa uno de los retos globales más grandes de la actualidad y predice un futuro donde las enfermedades infecciosas podrían nuevamente convertirse en la principal causa de muerte. Así mismo, los problemas de estabilidad en pH fisiológico de los péptidos antimicrobianos y su costo elevado han impedido su comercialización como agentes antimicrobianos de uso común. Es por ello que se desarrolló un sistema antimicrobiano que consiste en partículas tipo virus (VLP) del virus mosaico del bromo (BMV) que encapsidan al péptido antimicrobiano DCD-1L y que son posteriormente funcionalizadas con los antibióticos ampicilina, kanamicina y aztreonam (BMV VLPs). El ensamble de las VLPs fue logrado al optimizar un protocolo de ensamble que permitió disminuir los volúmenes de las soluciones utilizadas, así como el tiempo requerido para la reacción. Las BMV VLPs-(DCD-1L) fueron funcionalizadas con los antibióticos mediante el método de la carbodiimida y se caracterizaron mediante dispersión dinámica de luz, microscopía electrónica de barrido y espectroscopía por ATR-FTIR. Las VLPs presentaron un diámetro promedio de 30 nanómetros que determina una morfología cuasi-esférica T=3, y los espectros de ATR-FTIR mostraron la presencia de picos característicos del antibiótico aztreonam en las VLPs funcionalizadas. Además, las VLPs conservaron una distribución monodispersa de tamaño tras un mes de almacenamiento a 4 °C. Finalmente, los ensayos de actividad antimicrobiana de las VLPs contra las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus mostraron una inhibición en el crecimiento del 23% para E. coli y del 9% para S. aureus, lo cual implica que el efecto bactericida hacia bacterias Gram-negativas es mayor. Palabras clave: BMV, CCMV, VLP, péptido, DCD-1L.
iii
Abstract of the thesis presented by Kendra Ramírez Acosta as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Life Sciences with orientation in biomedicine and bionanotechnology.
Development of an antimicrobial system based on virus-like particles
Abstract approved by:
________________________ Dr. Rubén Darío Cadena Nava
Thesis Director The accelerated emergence of drug-resistant bacteria represents one of the biggest health issues which foretells a future where infectious diseases could once again become a main cause of death. The use of antimicrobial peptides as possible alternative treatments has been hindered by their elevated production costs as well as the stability issues they face at physiological pH. Given this scenario, we developed a virus-like particle, VLP, antimicrobial system where the antimicrobial peptide DCD-1L is encapsidated in Brome Mosaic Virus, BMV, virus-like particles (BMV VLPs) which were further functionalized with the antibiotics ampicillin, kanamycin and aztreonam. This was achieved through an optimization of a VLP assembly protocol to reduce the volume of reagent used as well as assembly times. Additionally, the BMV VLPs-(DCD-1L) were functionalized with antibiotics through the carbodiimide method and were characterized through dynamic light dispersion, transmission electron microscopy and ATR-FTIR spectroscopy. The VLPs presented an average diameter of 30 nanometers that signifies a T=3 quasi-spherical morphology, while the ATR-FTIR spectra showed that the functionalized VLPs presented peaks that are characteristic to aztreonam. Furthermore, the VLPs preserved their structure one month after their storage at 4 °C. Antimicrobial susceptibility tests of the VLPs against Escherichia coli and Staphylococcus aureus showed an inhibition of growth of 23% in E. coli and 9% in S. aureus, signifying an increase in bactericidal activity against Gram-negative bacteria. Keywords: BMV, CCMV, VLP, peptide, DCD-1L.
iv
Dedicatoria
A mi madre, tú que has sido la fuerza que me impulsa a seguir adelante. Este trabajo no podría haberlo
cumplido sin tu apoyo incondicional. Gracias por todo.
v
Agradecimientos
▪ Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca que me fue otorgada durante mi estancia en
el posgrado.
▪ A los proyectos CONACyT: CB 239878 & PN 247474
▪ Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada.
▪ Al Centro de Nanociencias y Nanotecnología de la UNAM.
▪ A la Universidad Nacional Autónoma de México.
▪ Al Departamento de Bionanotecnología por brindarme sus instalaciones y el apoyo de sus
integrantes.
▪ A mi director, Dr. Rubén D. Cadena Nava, por su asesoría en este proyecto.
▪ A mis sinodales, Dra. Rufina Hernández Martínez y Dra. Carmen G. Paniagua Chávez, por todo su
apoyo y disposición.
▪ Al Dr. William Gelbart, por su apoyo en la adquisición del péptido utilizado en este proyecto.
▪ A la Dra. Katrin Quester e Itandehui Betanzo, por su apoyo técnico.
▪ Al M.C. Juan Manuel Martínez Andrade, del LNMA-CICESE UNAM, por su apoyo técnico en el TEM.
▪ Al Dr. Ramesh Kumar Chowdari, por su asistencia técnica en el ATR-FTIR.
▪ A Eduardo Pérez e Iván Rosales, por acompañarme todos estos años.
vi
Tabla de contenido
Página
Resumen en español ..................................................................................................................................... ii
Resumen en inglés ....................................................................................................................................... iii
Dedicatoria ....................................................................................................................................................iv
Agradecimientos ........................................................................................................................................... v
Lista de figuras............................................................................................................................................... ix
Lista de tablas ................................................................................................................................................ xi
Capítulo 1. Introducción .............................................................................................................................. 1
1.1 Antecedentes ..................................................................................................................................... 2
1.1.1 Resistencia a los antibióticos ...................................................................................................... 2
1.1.2 Péptidos antimicrobianos ........................................................................................................... 4
1.1.3 El péptido DCD-1L ....................................................................................................................... 5
1.1.4 Nanovehículos virales ................................................................................................................. 6
1.1.5 Virus del CCMV y BMV ................................................................................................................ 7
1.1.6 Dispersión dinámica de luz (DLS) ................................................................................................ 9
1.1.7 Microscopía electrónica de transmisión……………………………………………………………………………… 11
1.1.8 Espectroscopía por ATR-FTIR .................................................................................................... 12
Capítulo 2. Justificación, Hipótesis y Objetivos ........................................................................................ 14
2.1 Justificación ....................................................................................................................................... 14
2.2 Hipótesis ........................................................................................................................................... 14
2.3 Objetivos ........................................................................................................................................... 14
2.3.1 Objetivo general ........................................................................................................................ 14
2.3.2 Objetivos específicos ................................................................................................................. 15
Capítulo 3. Metodología ............................................................................................................................ 16
3.1 Producción de BMV y CCMV ............................................................................................................. 16
3.1.1 Inoculación de plantas con BMV y CCMV .................................................................................. 16
vii
3.2 Purificación de BMV y CCMV ............................................................................................................ 17
3.2.1 Macerado de hojas .................................................................................................................... 17
3.2.2 Separación de componentes celulares ...................................................................................... 18
3.2.3 Colchón de sacarosa al 10%....................................................................................................... 18
3.2.4 Gradiente de sacarosa ............................................................................................................... 19
3.2.5 Eliminación de sacarosa ............................................................................................................ 19
3.2.6 Precipitación con Polietilenglicol (PEG) 8000 ............................................................................ 20
3.2.7 Colchón de sacarosa al 20%....................................................................................................... 20
3.2.8 Cuantificación ............................................................................................................................ 20
3.3 Síntesis de VLPs-(DCD-1L) ................................................................................................................. 21
3.3.1 Purificación de proteína de cápside .......................................................................................... 21
3.3.2 Encapsidación del péptido DCD-1L ............................................................................................ 22
3.3.2.1 Ensambles de prueba ......................................................................................................... 22
3.3.2.2 Ensamble final .................................................................................................................... 23
3.3.3 Ensayo de cambio en la movilidad electroforética.................................................................... 24
3.3.4 Gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) ................................................................. 24
3.4 Funcionalización de VLPs-(DCD-1L) con antibióticos ........................................................................ 27
3.5 Caracterización.................................................................................................................................. 27
3.5.1 Determinación de tamaño por dispersión dinámica de luz (DLS) ............................................. 27
3.5.2 Microscopía electrónica de transmisión ................................................................................... 27
3.5.3 ATR-FTIR .................................................................................................................................... 28
3.6 Generación de cepas resistentes ...................................................................................................... 29
3.7 Ensayos de susceptibilidad antimicrobiana ...................................................................................... 29
3.7.1 Ensayo en cultivo líquido ........................................................................................................... 30
Capítulo 4. Resultados ............................................................................................................................... 31
4.1 Purificación de las partículas de BMV y CCMV ................................................................................. 31
4.2 Síntesis de VLPs-(DCD-1L) ................................................................................................................. 32
4.2.1 Purificación de proteína de cápside .......................................................................................... 32
4.2.2 Encapsidación del DCD-1L en VLPs de BMV .............................................................................. 32
4.2.2.1 Ensambles de prueba ......................................................................................................... 32
4.2.2.2 Ensamble final .................................................................................................................... 37
4.2.2.3 Estequiometría DCD-1L : Proteína de la cápside del BMV ................................................. 38
viii
4.3 Funcionalización de BMV y CCMV nativo ......................................................................................... 40
4.3.1 Caracterización por microscopía electrónica de transmisión ................................................... 40
4.3.2 Caracterización por dispersión dinámica de luz ........................................................................ 42
4.3.3 SDS-PAGE ................................................................................................................................... 45
4.4 Funcionalización de VLPs con antibióticos........................................................................................ 45
4.4.1 Caracterización por dispersión dinámica de luz ........................................................................ 45
4.4.2 Caracterización por microscopía electrónica de transmisión (TEM) ......................................... 46
4.5 Caracterización por ATR-FTIR............................................................................................................ 49
4.6 Estabilidad de las VLPs ...................................................................................................................... 51
4.6.1 Estabilidad de ensambles de CCMV VLPs .................................................................................. 51
4.7 Selección de mutantes espontáneas resistentes a los antibióticos ampicilina, kanamicina y
aztreonam ............................................................................................................................................... 52
4.8 Ensayo de actividad antimicrobiana ................................................................................................. 53
Capítulo 5. Discusión ................................................................................................................................. 55
5.1 Purificación de BMV y CCMV ............................................................................................................ 55
5.2 Síntesis de VLPs-(DCD-1L) ................................................................................................................. 56
5.3 Funcionalización de virus nativo y VLPs ............................................................................................ 58
5.4 Espectroscopía por ATR-FTIR ............................................................................................................ 59
5.5 Estabilidad de las VLPs ...................................................................................................................... 60
5.6 Ensayo de actividad antimicrobiana ................................................................................................. 61
Capítulo 6. Conclusiones ........................................................................................................................... 62
Literatura citada ......................................................................................................................................... 64
ix
Lista de figuras
Figura 1. Mecanismo de actividad de los péptidos antimicrobianos. ........................................................... 5
Figura 2. Estructura del BMV y CCMV ........................................................................................................... 7
Figura 3. Distribución de cargas electrostáticas en la cápside del BMV. ...................................................... 8
Figura 4. Interferencia de ondas en la dispersión dinámica de luz ............................................................... 9
Figura 5. Análisis de tamaño de VLPs del virus de Hepatitis B .................................................................... 10
Figura 6. Análisis de tamaño de BMV-VLPs................................................................................................. 11
Figura 7. Diagrama del funcionamiento básico de un microscopio electrónico de transmisión. ............... 12
Figura 8. Hojas infectadas con BMV y CCMV. ............................................................................................. 16
Figura 9. Diagrama del protocolo de purificación de virus ......................................................................... 17
Figura 10. Filtrado de hojas molidas. .......................................................................................................... 17
Figura 11. Sobrenadante de extracto de cebada infectado con bmv. ........................................................ 18
Figura 12. Colchón de sacarosa al 10%. ...................................................................................................... 19
Figura 13. Diálisis en solución amortiguadora de desensamble. ................................................................ 22
Figura 14. Proceso de microdiálisis para el ensamble de VLPs. .................................................................. 23
Figura 15. Banda azul de BMV .................................................................................................................... 31
Figura 16. Ensayo de movilidad electroforética en gel de agarosa al 1%. .................................................. 33
Figura 17. Distribución de tamaño por volumen de los ensambles de VLPs-(DCD-1L) .............................. 34
Figura 18. Micrografía electrónica y distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una
relación 1:3. ......................................................................................................................................... 35
Figura 19. Micrografía electrónica y distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una
relación 1:6. ......................................................................................................................................... 35
Figura 20. Micrografía electrónica y distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una
relación 1:9. ......................................................................................................................................... 36
Figura 21. Micrografía electrónica a 80 kev de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:12. ....... 36
Figura 22. Variación de la estructura de las VLPs. ...................................................................................... 37
Figura 23. Ensayo de movilidad electroforética en solución amortiguadora de virus a pH 6 .................... 38
Figura 24. Gel desnaturalizante de poliacrilamida de BMV CP ................................................................... 38
Figura 25. Gel desnaturalizante de poliacrilamida de DCD-1L .................................................................... 39
Figura 26. Relación lineal entre la intensidad de banda en función de la masa de la proteína de cápside del
BMV ...................................................................................................................................................... 39
Figura 27. Relación lineal entre la intensidad de banda en función de la masa del péptido DCD-1L ........ 40
x
Figura 28. Micrografías de la funcionalización de bmv con 100, 500 y 1000 equivalentes de ampicilina por
partícula viral ....................................................................................................................................... 41
Figura 29. Distribución de tamaño por volumen para BMV nativo. ........................................................... 42
Figura 30. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con ampicilina. ..................... 42
Figura 31. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con kanamicina. ................... 43
Figura 32. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con aztreonam. .................... 43
Figura 33. Sds-page de CCMV y BMV nativos y funcionalizados con antibióticos. ..................................... 45
Figura 34. Distribución de tamaño por volumen de VLPs funcionalizadas en distintas soluciones ........... 46
Figura 35. Micrografía de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en PBS con MgCl2 20 mM y funcionalizadas con
kanamicina ........................................................................................................................................... 47
Figura 36. Distribución de tamaño de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en PBS suplementado con MgCl2 20 mM
y funcionalizadas con kanamicina. ....................................................................................................... 47
Figura 37. Micrografía de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en solución amortiguadora de ensamble y
funcionalizadas con kanamicina .......................................................................................................... 48
Figura 38. Micrografía de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en Tris-HCl pH 7.5 20 mM y funcionalizadas con
kanamicina. .......................................................................................................................................... 48
Figura 39. Espectro ATR-FTIR de VLPs nativas y aztreonam a 100 µg/ml. .................................................. 49
Figura 40. Espectro ATR-FTIR de VLPs nativas y VLPs funcionalizadas con aztreonam (VLP-Azt). ............. 50
Figura 41. Espectro ATR-FTIR de aztreonam y VLPs funcionalizadas con aztreonam (VLP-Azt). ................ 50
Figura 42. Distribución de partículas de VLPs-(DCD-1L) recién ensambladas y VLPs-(DCD-1L) un mes
después de su síntesis .......................................................................................................................... 51
Figura 43. Distribución de partículas de CCMV VLPs-(DCD-1L) recién ensambladas y CCMV VLPs-(DCD-1L)
un mes después de su síntesis ............................................................................................................. 52
Figura 44. Cultivos de E. coli en LB agar posterior a los tratamientos con antibióticos. ............................ 52
Figura 45. Cultivos de S. aureus en LB agar posterior a los tratamientos con los antibióticos .................. 53
Figura 46. Viabilidad observada en bajo tratamientos antimicrobianos para E. coli y S. aureus ............... 54
xi
Lista de tablas
Tabla 1. Composición del gel SDS-PAGE ..................................................................................................... 24
Tabla 2. Masa de los reactivos utilizados en los geles desnaturalizantes de poliacrilamida. ..................... 25
Tabla 3. Ensayo de actividad antimicrobiana de VLPs-(DCD-1L) funcionalizadas con aztreonam. ............ 30
Tabla 4. Relaciones para ensamble de VLPs-(DCD-1L). ............................................................................... 32
Tabla 5. Relaciones para ensamble de VLPs-(DCD-1L). ............................................................................... 33
Tabla 6. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado. ................................................. 44
1
Capítulo 1. Introducción
Uno de los más grandes retos para el sector salud a nivel mundial es la resistencia que han generado las
bacterias a los antibióticos. En México, la venta de antibióticos representa un mercado anual de
aproximadamente 960 millones de dólares, donde el 40% de estos productos son consumidos
inadecuadamente (Dreser et al., 2008). Esto compromete su eficacia, cuyo desarrollo ha perdido el ímpetu
que poseía décadas atrás, cumpliéndose ya más de 30 años desde el descubrimiento de una nueva clase
de antibióticos. De no encontrar tratamientos alternativos, las enfermedades infecciosas que actualmente
son tratadas con relativa facilidad podrían presentar complicaciones que podrían conllevar a la muerte de
pacientes infectados.
En años recientes, se ha tomado interés por el estudio de los péptidos antimicrobianos como posibles
agentes para el tratamiento de enfermedades infecciosas provocadas por microorganismos resistentes a
los antibióticos convencionales. Esta clase de péptidos están constituidos por cadenas cortas de
aminoácidos y pueden interaccionar con la membrana celular bacteriana mediante fuerzas electrostáticas,
lo cual permite su ingreso al interior del organismo. A pesar de ello, los péptidos antimicrobianos
presentan costos elevados de producción, por lo que se ha propuesto utilizarlos mediante terapias
combinadas con el fin de disminuir las dosis y el costo del producto.
Sin embargo, uno de los retos para el uso de los péptidos antimicrobianos es la falta de un vehículo que
los mantenga activos y los lleves a donde deben de actuar. En este trabajo se propone el uso de cápsides
virales como nanovehículos de péptidos antimicrobianos. Los virus constituyen naturalmente el vehículo
más eficiente para el envío y entrega de material genético y otras moléculas, por lo cual se han
considerado para la entrega de fármacos. A partir de los virus podemos construir partículas tipo virus,
también llamadas VLPs, que pueden tener características idénticas a los virus nativos del cual provienen,
sin presentar algún riesgo de infección viral.
En el presente trabajo, además de encapsidar un péptido antimicrobiano, se modificará químicamente la
superficie de la cápside del virus mosaico del bromo, (BMV por sus siglas en inglés, Brome Mosaic Virus),
con antibióticos convencionales para ser administrados en conjunto con péptidos antimicrobianos, con la
finalidad de tener un sistema que presente un efecto antimicrobiano potencial, incluso contra
microorganismos resistentes al antibiótico utilizado.
2
1.1 Antecedentes
1.1.1 Resistencia a los antibióticos
La resistencia a los antibióticos es un proceso natural. Durante siglos, los microorganismos han enfrentado
compuestos de los cuales se han derivado los antibióticos que se utilizan actualmente. El conocimiento de
la relación entre enfermedad e infecciones llevó al descubrimiento e implementación de las vacunas, uno
de los hitos de la ciencia cuya utilidad para el ser humano permanece a lo largo del tiempo. Sin embargo,
es claro que el desarrollo de resistencia antimicrobiana representará el fin de la eficacia de los antibióticos.
Desde el descubrimiento de la penicilina, Alexander Fleming advirtió sobre los peligros que el abuso de los
antibióticos originaría. Al poco tiempo se observaron los primeros estafilococos capaces de sintetizar
penicilinasa, una enzima que inactiva la penicilina. A partir de ello, la industria farmacéutica comenzó a
producir paralelamente antibióticos para combatir cepas bacterianas resistentes a la penicilinasa, útiles
para atacar diferentes microorganismos tales como bacterias y hongos. Empero, se inició una carrera
donde la producción de nuevas moléculas antimicrobianas es alcanzada por la diseminación de genes de
resistencia, en un periodo de tiempo cada vez más corto (Ventola, 2015).
El Centro de Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos, CDC por sus siglas en inglés,
define a la resistencia antimicrobiana como “la capacidad que un microorganismo posee para resistir los
efectos de un antibiótico” (Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2010). Así mismo, los
microorganismos resistentes pueden clasificarse en tres categorías de acuerdo con su resistencia:
1. Microorganismos multirresistentes (MDR): Son aquellos resistentes a más de un agente antimicrobiano.
2. Microorganismos extensivamente resistentes (XDR): Las bacterias de esta categoría son resistentes a la
mayoría de los agentes antimicrobianos aprobados para su consumo.
3. Microorganismos pan-resistentes (PDR): Se refiere a aquellos organismos resistentes a todos los
agentes antimicrobianos de uso comercial (Falagas & Karageorgopoulos, 2008).
El esparcimiento de la resistencia es acelerado mediante procesos de selección por antibióticos donde una
población bacteriana es expuesta a un antibiótico, eliminando a aquellos organismos susceptibles. Los
sobrevivientes son capaces de generar progenie, la cual hereda los genes de resistencia. De esta manera,
3
la nueva población está constituida principalmente por organismos resistentes tal que, al exponerla al
mismo antibiótico, el efecto del tratamiento disminuirá considerablemente.
Aunado a lo anterior, la transferencia horizontal es uno de los principales responsables de la diseminación
de genes de resistencia entre poblaciones bacterianas. De acuerdo a Barlow (2009), la transferencia
horizontal de genes ha contribuido a esparcir mecanismos de resistencia contra numerosas clases de
antibióticos como los aminoglucósidos, macrólidos, glicopéptidos, tetraciclinas, β-lactámicos, y
fluoroquinolonas.
Los mecanismos de transferencia horizontal típicamente observados son los siguientes:
• Transformación: La transformación bacteriana se lleva a cabo cuando el DNA desnudo de un
organismo es liberado por eventos de lisis y permite que otro organismo competente sea capaz
de integrar el DNA exógeno. El gen de resistencia puede integrarse en el cromosoma o en el
plásmido de la bacteria receptora.
• Transducción: Este proceso involucra la transferencia de genes de resistencia de una bacteria a
otra mediante bacteriófagos cuyo ciclo de vida lisogénico permite integrar estos genes en el
cromosoma de la bacteria recipiente.
• Conjugación: Ocurre por contacto directo entre dos bacterias tal que los plásmidos forman un
puente de apareamiento que permite el intercambio de DNA, lo cual puede resultar en la
adquisición de genes de resistencia (Furuya & Lowy, 2006).
A pesar de que Staphylococcus aureus es naturalmente susceptible a todos los antibióticos que han sido
desarrollados, este microorganismo es conocido por su habilidad para adquirir resistencia contra los
antibióticos. Las infecciones provocadas por cepas resistentes de S. aureus frecuentemente suceden en
forma de olas epidémicas iniciadas por unas cuantas clonas exitosas. Además, posee la habilidad para
colonizar asintomáticamente personas saludables de tal manera que aproximadamente el 30% de los
humanos son portadores asintomáticos de S. aureus en sus vías nasales, quienes esparcen la infección
mediante contacto directo de la piel con otras personas.
Las infecciones causadas por cepas resistentes de S. aureus han alcanzado proporciones epidémicas a nivel
mundial. La tasa de infección ha incrementado en comunidades y centros de salud, donde las cepas
4
resistentes han mostrado una particular virulencia, incrementando el peligro a la salud humana tras
adquirir una infección (Chambers & Deleo, 2010).
Por otro lado, la emergencia de cepas de Escherichia coli resistentes a los antibióticos son de particular
preocupación debido a que esta bacteria Gram-negativa es el patógeno más común en seres humanos.
Así mismo, las cepas patógenas de E. coli son transmitidas ampliamente mediante vegetales regados por
aguas y fertilizantes contaminados, así como por el consumo de carnes crudas que presentan grandes
cantidades de esta bacteria (Paulo, 2014).
1.1.2 Péptidos antimicrobianos
El estudio de péptidos antimicrobianos ha cobrado interés como alternativa potencial a la administración
de antibióticos convencionales. Los péptidos antimicrobianos son una familia de oligopéptidos con una
longitud usualmente menor a 200 residuos aminoacídicos. En animales, estos péptidos son usualmente
encontrados en tejidos y órganos expuestos a patógenos transmitidos por el aire y se consideran la
primera línea de defensa del sistema inmune innato contra virus, bacterias y hongos (Téllez & Castaño,
2010). La mayoría de los péptidos de esta especie son catiónicos, con una carga entre +2 y +9, con una
proporción usualmente mayor al 30% de residuos hidrofóbicos. Frecuentemente, los péptidos
antimicrobianos interactúan con la membrana plasmática bacteriana (Figura 1). A pesar de que se han
descrito mecanismos de resistencia contra esta clase de péptidos, existe una baja probabilidad de que se
desarrolle resistencia total, debido a la interacción obligada de los péptidos antimicrobianos con la
membrana celular bacteriana, ya que esto implicaría que la bacteria requeriría reconfigurar dicha
membrana (Marr et al. 2006).
En menor frecuencia, existen péptidos antimicrobianos aniónicos cuya carga en pH fisiológico varía entre
-1 y -7 (Harris et al., 2009). En humanos se ha observado su presencia en fluidos corporales con altas
concentraciones de sales utilizando iones metálicos o sales como cofactores que potencian su efecto
antimicrobiano (Paulmann et al., 2012). Un ejemplo de este tipo de péptidos con carga negativa es el DCD-
1L.
5
Figura 1. Los péptidos antimicrobianos se caracterizan por interactuar con la membrana bacteriana, promoviendo la formación de poros que alteran el potencial de membrana y provocan la muerte del microorganismo. Imagen tomada de Galdiero et al. (2013).
1.1.3 El péptido DCD-1L
El péptido DCD-1L es un péptido con actividad antimicrobiana, derivado del péptido dermcidin, de amplio
espectro. Presenta 47 aminoácidos de longitud y, debido a su abundante concentración en el sudor,
constituye la primera línea de defensa contra patógenos en la piel humana (Schittek et al., 2001). A
diferencia de la mayoría de los péptidos antimicrobianos, el DCD-1L posee una carga neta negativa -2 a pH
fisiológico. Es de carácter anfipático y es capaz de insertarse en la membrana bacteriana, formando
canales transmembranales que irrumpen en la homeostasis celular del microorganismo (Paulmann et al.,
2012). El DCD-1L es capaz de mantener su efecto antimicrobiano a lo largo de un rango amplio en el pH,
así como en ambientes de altas concentraciones de sales, los cuales se asemejan a las condiciones
observadas en el sudor (Becucci et al., 2013).
Este péptido es capaz de superar los mecanismos de resistencia bacteriana que dependen de la repulsión
electrostática de los péptidos antimicrobianos, debido a que su unión a la membrana bacteriana no es
mediada por su carga electroestática. En cambio, la secuencia de aminoácidos del DCD-1L permite la
formación de una estructura secundaria, donde los residuos cargados se agrupan en un extremo de una
hélice mientras que los residuos hidrofóbicos se agrupan en el otro extremo. Esto permite que el DCD-1L
forme α-hélices cuyo carácter anfipático determina su potencial de unión a la membrana bacteriana (Hyun
Ho et al., 2010).
6
En un inicio, el DCD-1L carece de una estructura definida. Cuando se encuentra en presencia de una
membrana lipídica bacteriana, el N-terminal del DCD-1L es atraído electrostáticamente y se une a la
superficie de la membrana. Esto provoca la formación de un canal hexamérico conformado por α-hélices
que son estabilizadas por iones divalentes de zinc (Zn2+) a través de los residuos glutamina 5 (Glu5),
asparagina 9 (Asp9), histidina 380 (His380) y asparagina 420 (Asp420) (Loboda et al., 2018).
Subsecuentemente, se promueve la formación de canales iónicos en la membrana bacteriana, lo cual
altera el potencial de membrana y culmina con la muerte del microorganismo (Burian et al, 2015).
1.1.4 Nanovehículos virales
Los virus son por excelencia los nanovehículos más eficientes de la naturaleza. En su forma más simple,
constan de material genético protegido por una capa de proteínas llamada cápside y utilizan la maquinaria
traduccional de la célula que infectan para replicarse. Por lo general, las proteínas que constituyen la
cápside viral son capaces de autoensamblarse en ausencia del material genético, formando
nanoestructuras denominados partículas tipo virus o VLPs. Al carecer de material genético, las VLPs
pierden su carácter infeccioso, por lo que son ideales para atrapar moléculas en su interior o funcionalizar
su superficie interna o externa. Esto las convierte en sistemas potenciales para el transporte de moléculas
de interés.
Previamente, Yoo et al. (2011) demostraron que las partículas tipo virus pueden ser utilizadas como
nanovehículos de transporte para una amplia gama de moléculas, incluyendo fármacos y péptidos. Así
mismo, resaltaron la sencillez con la que las partículas pueden ser obtenidas y la posibilidad de escalar su
producción a nivel industrial.
Para los propósitos de este trabajo, se observa que las VLPs pueden fungir como vehículos capaces de
proteger al péptido DCD-1L y transportarlo hacia su blanco terapéutico. Esto evitaría que el péptido sea
degradado por proteasas o que el ambiente cambie su conformación, con lo cual se asegura que conserve
su actividad antimicrobiana.
7
1.1.5 Virus del CCMV y BMV
El virus mosaico del bromo (Brome Mosaic Virus: BMV) así como el virus mosaico clorótico del frijol
(Cowpea Chlorotic Mottle Virus: CCMV), son virus de planta de ARN positivo pertenecientes a la familia
Bromoviridae (Figura 2). Estos virus poseen un diámetro de 28 nm y tienen un genoma dividido en tres
ARN mensajeros de cadena sencilla: ARN1, ARN2 y ARN3. La cadena de ARN1 codifica la proteína con
funciones tipo helicasa para la replicación de ARN, ARN2 codifica la ARN polimerasa; y ARN3 codifica la
proteína de movimiento y la proteína de cápside, necesarias para la propagación de célula a célula.
Finalmente, la última cadena subgenómica derivada de ARN3, el ARN4, codifica para la proteína de la
cápside (Annamalai & Rao, 2006).
Figura 2. Estructura del BMV y CCMV, tomado de (Waterbeemd et al., 2016)
.
Tanto el virión de BMV como el de CCMV poseen la forma de un icosaedro truncado, compuesto por 180
subunidades idénticas de una proteína de aproximadamente 20 kDa. Cada subunidad cuenta con un brazo
N-terminal largo que posee una alta concentración de residuos básicos y un dominio globular que
permiten su entrecruzamiento con la cola C-terminal del virión. Esta configuración permite la interacción
electrostática entre los polipéptidos cargados positivamente que abundan en el interior de la cápside
(Figura 3) con el ARN de carga negativa necesaria para el ensamble adecuado del virión. También se ha
observado que la presencia del brazo N-terminal es indispensable para su actividad infecciosa (Cuillel et
al., 1981).
8
Figura 3. Distribución de cargas electrostáticas en la cápside del BMV. La coloración azul representa la presencia de cargas positivas mientras que el color rojo representa las cargas negativas. Las cargas positivas se concentran principalmente en el interior de la cápside, lo cual favorece la encapsidación de moléculas aniónicas. Imagen tomada de Lucas et al. (2002).
Entre otros virus, el BMV fue uno de los primeros virus esféricos reensamblados in vitro, donde las
partículas reconstituidas son indistinguibles del virus nativo y mantienen su carácter infeccioso. Esto se
logró al someter al virus a un pH 7.5 o superior, así como a una fuerza iónica mayor a 0.5 M, lo cual provoca
que el virus se disocie en dímeros. Una vez que el pH y la fuerza iónica son disminuidos, los dímeros se
asocian nuevamente y reensamblan la cápside del virus (Lucas et al., 2002). A partir de este método, se
ha logrado observar que las cápsides de BMV disociadas in vitro también son capaces de reensamblarse
alrededor del ARN de otros virus, ARN homopolimérico sintético, y ácidos polianiónicos no nucleicos
(Bancroft & Hiebert, 1967).
Por otro lado, la superficie de cada subunidad que compone al virus expone distintos grupos funcionales
que pueden ser modificados químicamente. Sabori (2017) demostró que es posible utilizar el método de
la carbodiimida, la cual promueve la activación de los grupos carboxilo que se encuentran en la superficie
de la cápside viral del BMV, para modificar químicamente la superficie de la cápside y adherirle antibióticos.
Utilizó un rango de concentraciones de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, N-hidroxisuccinimida
y antibióticos que variaron de 100 a 1000 equivalentes molares. Se observó que para 1000 equivalentes
molares, las cápsides tienden a aglomerarse debido a que la activación de los grupos carboxilo en la
superficie promueve la formación de enlaces covalentes entre cápsides.
Debido a su similitud estructural, las observaciones anteriores realizadas en BMV aplican potencialmente
al CCMV, por lo que ambos virus pueden ser utilizados para el transporte de moléculas terapéuticas.
9
1.1.6 Dispersión dinámica de luz (DLS)
La dispersión dinámica de luz (DLS – dynamic light scattering) es una de las técnicas más populares de
dispersión de luz debido a que permite determinar el tamaño de partículas de fracciones de 1 nanómetro
hasta micrómetros de diámetro. Esta técnica se basa en iluminar la muestra deseada con un láser
infrarrojo y, por medio de un fotodetector, es posible medir las fluctuaciones de la luz dispersada por el
movimiento Browniano de una población de las partículas (LS Instruments, 2000).
Cuando se incide luz sobre una población de partículas, estas emiten un patrón de dispersión de luz que
es medido mediante un detector. Este patrón posee áreas iluminadas y oscuras, generando una especie
de moteado sobre el detector. Las áreas iluminadas corresponden a la luz dispersada que logra llegar al
detector con la misma fase de onda, por lo que interfieren constructivamente entre ellas y generan un
área brillante. Por otro lado, las áreas oscuras son provocadas por la luz dispersada que llega al detector
con fases de ondas distintas que se cancelan mutuamente (Figura 4) (Malvern Instruments, 2004).
Figura 4. A) Patrón moteado debido a la dispersión de luz. Las zonas brillantes y oscuras son consecuencia de la interferencia de ondas dispersadas al incidir sobre el detector. (Malvern Instruments, 2004). B) La interferencia constructiva consiste en la adición de ondas que poseen la misma fase, donde los valles y las crestas crecen proporcionalmente. C) Por otro lado, la interferencia destructiva es dada por la sustracción de ondas con fase distinta por lo que se cancelan mutuamente.
10
En la práctica, las partículas suspendidas en un líquido poseen un movimiento aleatorio, conocido como
movimiento Browniano debido a la energía térmica del sistema. El movimiento Browniano de las partículas
es provocado por su colisión con las moléculas del líquido que las rodean. Para el análisis por DLS, es
importante notar que las partículas pequeñas se mueven con mayor rapidez que las partículas grandes, lo
cual se define a través de la ecuación de Stokes-Einstein descrita en la ecuación 1:
𝐷𝐻 = 𝐾𝐵𝑇
3𝜋𝜂𝐷 (1)
En esta ecuación DH corresponde al diámetro hidrodinámico, KB es la constante de Boltzmann, T es la
temperatura absoluta, η es la viscosidad del solvente, y D corresponde al coeficiente de difusión.
El movimiento de las partículas provoca que la intensidad de cada punto detectado fluctúe en intensidad.
Así, el equipo utiliza un correlacionador digital para medir la tasa de fluctuación en intensidad detectada
y calcula el grado de correlación entre cada medición. El equipo relaciona una tasa alta de fluctuación con
partículas pequeñas, mientras que una tasa baja de fluctuación determina la presencia de partículas
grandes. El programa toma estos datos y, mediante una función de correlación, calcula la distribución de
tamaño de las partículas presentes en una suspensión y la tasa de decaimiento para partículas de distintos
tamaños (Malvern Instruments, 2004).
Esta técnica ha sido utilizada exitosamente para medir el diámetro hidrodinámico de partículas tipo virus
(VLPs) del virus de hepatitis B. Lu & Swartz (2016) realizaron mediciones de DLS utilizando un equipo
Zetasizer Nano ZS de Malvern y obtuvieron un gráfico de distribución de tamaño de las partículas. Los
tamaños obtenidos se compararon con las mediciones de tamaño en microscopía electrónica de
transmisión, observándose gran similitud en los resultados (Figura 5).
Figura 5. Análisis de tamaño de VLPs del virus de hepatitis B. A) Distribución de tamaño de partícula obtenida mediante DLS. B) Micrografía obtenida por microscopía electrónica de transmisión (Lu & Swartz, 2016).
11
De manera similar, Escobedo (2018) mostró resultados de distribución de tamaño de VLPs de BMV (BMV-
VLPs) obtenidos mediante DLS donde se observan poblaciones de VLPs de distintos tamaños. Estas mismas
poblaciones son observadas mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 6). Ambos casos
demuestran que el DLS es una técnica rápida y efectiva para medir el diámetro hidrodinámico de
nanopartículas tipo virus.
Figura 6. Análisis de tamaño de BMV-VLPs. A) Distribución de tamaño de las poblaciones de VLPs obtenidas mediante DLS. B) Micrografía obtenida por microscopía electrónica de transmisión. La micrografía corrobora la presencia de distintas las poblaciones de partículas de BMV-VLPs detectadas mediante DLS (Escobedo, 2018).
1.1.7 Microscopía electrónica de transmisión
La microscopía electrónica de transmisión, TEM por sus siglas en inglés, es una técnica de caracterización
ampliamente utilizada en el análisis de nanopartículas debido a su límite de resolución que es más
pequeño comparado con la microscopía óptica. Este incremento en la resolución es logrado al utilizar un
haz de electrones como fuente de luz ya que este posee una longitud de onda menor a 1 nm, que es
considerablemente menor a la longitud de onda de la luz visible que oscila entre los 400 y 800 nm.
El microscopio electrónico cuenta con un cañón de electrones que permite formar un haz de electrones
en una cámara de vacío e iluminar una muestra de interés. El cañón de electrones posee con un filamento
de tungsteno o hexaboruro de lantano (LaB6) al cual, para calentarlo, se le aplica un campo eléctrico fuerte,
llamado voltaje de aceleración, hasta que este comience a emitir el haz de electrones. El haz es enfocado
a lo largo de la columna del microscopio mediante una serie de lentes electromagnéticos hasta incidir
sobre una muestra de un espesor muy delgado que permita el paso de los electrones. Algunos electrones
12
son dispersados mientras que el resto atraviesan la muestra e inciden sobre una pantalla fluorescente que
se encuentra en el fondo del microscopio, donde se forma una imagen ampliada del espécimen (Figura 7)
(Jeol, 2020).
Figura 7. Diagrama general de las partes básicas de un microscopio electrónico de transmisión. Modificado de Marturi, 2013.
Gracias a la resolución obtenida mediante microscopía electrónica de transmisión, el TEM es una
herramienta ampliamente utilizada en el análisis morfológico de virus y VLPs. Las micrografías electrónicas
resultan útiles para el análisis geométrico estadístico de VLPs, ya que permiten distinguir entre distintas
poblaciones de nanopartículas virales en una muestra de acuerdo a su tamaño.
1.1.8 Espectroscopía por ATR-FTIR
La espectroscopía de infrarrojo, FTIR, es una técnica útil para la identificación de grupos funcionales de un
compuesto. Esta técnica se basa en incidir una muestra con radiación infrarroja, lo cual provoca que la
vibración intramolecular aumente en intensidad y genere señales que corresponden a la vibración de un
enlace en específico.
13
En el caso particular de la espectroscopía de infrarrojo de reflectancia total atenuada, ATR-FTIR, el haz de
radiación infrarroja incide sobre un cristal denso con alto índice de refracción. La reflectancia interna
genera una onda evanescente que se extiende desde la superficie del cristal hacia la muestra que se
encuentra en contacto con el cristal. En las regiones donde el espectro infrarrojo absorbe energía, la onda
evanescente es atenuada y regresa al cristal, donde es dirigida hacia el detector del espectrómetro de
infrarrojo. El detector genera una señal a partir del haz infrarrojo atenuado que puede ser utilizada para
elaborar un espectro de infrarrojo (Thermo Fisher, 2020).
La ventaja del análisis por ATR-FTIR es que la muestra requiere preparación mínima y para muestras
líquidas solo se requiere agregar una gota sobre el cristal, lo cual permite un análisis rápido y eficiente de
compuestos químicos. La espectroscopía por ATR-FTIR es poco común para el análisis de virus y su
potencial requiere una mayor exploración.
En 2017, Strugała y colaboradores utilizaron la espectroscopía por ATR-FTIR en conjunto con la dispersión
dinámica de luz con el objetivo de realizar un análisis biofísico del BMV. Al someter el virus a distintas
condiciones de pH, el análisis por DLS mostró cambios en el diámetro hidrodinámico del virus. La variación
en el tamaño se explicó con la observación en el cambio en la abundancia de ciertas estructuras
secundarias en la cápside del virus gracias a la detección de enlaces particulares mediante ATR-FTIR. A
partir de esto, se considera que dicha técnica posee el potencial para observar la presencia de cambios
estructurales en la superficie de la cápside viral que ha sido modificada químicamente.
14
Capítulo 2. Justificación, Hipótesis y Objetivos
2.1 Justificación
El problema de resistencia a los antibióticos requiere el desarrollo de terapias alternativas capaces de
superar esta barrera. De lo contrario, la Organización Mundial de la Salud estipula que las enfermedades
infecciosas provocadas por bacterias resistentes a los antibióticos se convertirán en la principal causa de
muerte en humanos para el año 2050. A su vez, las instituciones de salud presentan un foco de infección
con bacterias resistentes importante, donde se observa una de las tasas más aceleradas de generación de
cepas resistentes. Es por ello que se propone un sistema de VLPs con actividad antimicrobiana basado en
péptidos antimicrobianos y antibióticos con la finalidad de contar con un posible tratamiento para la tasa
creciente de microorganismos resistentes.
2.2 Hipótesis
La funcionalización de partículas tipo virus derivadas del BMV con los antibióticos, y que contienen como
cargo a péptidos antimicrobianos, presentan propiedades antimicrobianas incluso al administrarse a
bacterias con resistencia a estos antibióticos.
2.3 Objetivos
2.3.1 Objetivo general
Desarrollar un sistema antimicrobiano a base de partículas tipo virus que contengan antibióticos
comerciales y péptidos antimicrobianos.
15
2.3.2 Objetivos específicos
◼ Determinar las condiciones de ensamble de partículas tipo virus (VLPs) a partir de BMV, atrapando
el péptido DCD-1L en el interior de la cápside (VLP-(DCD-1L)).
◼ Modificar el exterior de la cápside del BMV añadiendo los antibióticos ampicilina, kanamicina y
aztreonam.
◼ Evaluar el efecto antimicrobiano del péptido DCD-1L encapsidado en partículas tipo virus
funcionalizadas con antibióticos.
16
Capítulo 3. Metodología
3.1 Producción de BMV y CCMV
3.1.1 Inoculación de plantas con BMV y CCMV
Se amplificaron los viriones a partir de plantas de cebada y frijol caupí, las cuales son los huéspedes
naturales del BMV y CCMV respectivamente. La siembra se realizó en el invernadero del laboratorio del
Departamento de Bionanotecnología del Centro de Nanociencias y Nanotecnología (CNyN), utilizando
tierra enriquecida con fertilizantes. Se sembraron 10 semillas de cebada y 5 semillas de frijol caupí por
maceta, las cuales fueron regadas diariamente.
Una vez que transcurrieron dos semanas de crecimiento, se inoculó cada virus en su huésped. Se provocó
daño mecánico sobre las hojas de la planta mediante raspado con fibra metálica de pelo de ángel para
posteriormente aplicar 10 µl del virus respectivo a una concentración de 0.2 mg/ml, el cual se esparció en
el área de la herida. Dos semanas después de realizar la inoculación, se cosecharon las hojas que
presentaban síntomas de infección (Figura 8), particularmente clorosis, y se almacenaron a
-20 °C.
Figura 8. Holas de cebada infectadas con BMV (izquierda) y de frijol infectadas con CCMV (derecha).
17
3.2 Purificación de BMV y CCMV
La metodología de extracción utilizada consistió en una modificación del protocolo desarrollado por
Cadena-Nava y Comas-García (2009) para la purificación de CCMV. Esta modificación permite recuperar el
virus que permanece en el sobrenadante, después de centrifugar los tubos con colchón de sacarosa al 10%
mediante una precipitación con polietilenglicol (PEG) 8000. En la Figura 9 puede observarse el diagrama
de flujo de este protocolo.
Figura 9. La modificación del protocolo de purificación permite aprovechar tanto el virus presente en el pellet obtenido al ultracentrifugar el colchón de sacarosa al 10% así como en el sobrenadante.
3.2.1 Macerado de hojas
Se utilizaron 50 gramos de hojas de cebada y 100 gramos de hojas de frijol. Las hojas infectadas se
molieron con una licuadora utilizando solución amortiguadora de extracción (acetato de sodio 0.5 M,
acetato de magnesio 0.08 M, pH 4.5), lo cual libera el virus mediante lisis celular. Se obtuvo una pasta que
se colocó en un baño en hielo y se filtró utilizando una gasa fina (Figura 10). El material sólido fue devuelto
a la licuadora para repetir la molienda, maximizando la cantidad de virus recuperado.
Figura 10. Filtrado de hojas molidas en baño de hielo.
18
3.2.2 Separación de componentes celulares
Se realizó una dilución 1:1 del extracto filtrado con cloroformo. La solución fue transferida a tubos de
teflón de 250 ml para centrifugarlos a 8,000 rpm, a 4 °C durante 40 minutos en una centrífuga Avanti JXN-
26. Se recuperó la fase superior del sobrenadante (Figura 11) y se centrifugó de nuevo bajo las mismas
condiciones durante 25 minutos. Posteriormente, se recuperó el sobrenadante y se colocó en un vaso de
precipitado en agitación constante durante un mínimo de 30 minutos a 4 °C para evaporar los restos de
cloroformo.
Figura 11. Tubo de teflón mostrando las fases obtenidas después de centrifugar. La fase superior del sobrenadante (fase color amarillo) es la que contiene virus.
3.2.3 Colchón de sacarosa al 10%
Se vertieron 25 ml de solución de virus en tubos de policarbonato para ultracentrífuga. Posteriormente,
se agregaron cuidadosamente 5 ml de sacarosa al 10% en el fondo del tubo, formando dos fases separadas
por su densidad (Figura 12). Se balancearon los tubos y se centrifugó durante 2 horas a 32,000 rpm a 4 °C
en una ultracentrífuga Beckman modelo Optima XPN-100. Inmediatamente, se recuperó el sobrenadante
en un vaso de precipitado y a cada tubo se le agregaron 500 µl de solución amortiguadora de suspensión
de virus para resuspender el pellet formado.
19
Figura 12. Tubo mostrando la preparación de un colchón de sacarosa al 10%.
3.2.4 Gradiente de sacarosa
La muestra obtenida de los pellets resuspendidos fue centrifugada a 5,000 rpm durante 10 minutos a 4 °C.
Se recuperó el sobrenadante y se repartió en partes iguales en cuatro tubos que contenían un gradiente
continuo de sacarosa del 5% al 40%. Después la muestra fue centrifugada a 30,000 rpm a 4 °C durante 2
horas. Una vez finalizada la centrifugación, se transportaron los tubos a un cuarto oscuro y se colocaron
en un soporte universal, iluminándolos desde la parte inferior con una lámpara. Esto permitió observar la
banda azul característica de los virus y así extraerla con una pipeta Pasteur.
3.2.5 Eliminación de sacarosa
La muestra correspondiente a la banda azul fue diluida 1:4 con solución amortiguadora de suspensión de
virus y fue centrifugada a 32,000 rpm a 4 °C durante 3 horas. Se desechó el sobrenadante inmediatamente
y los pellets fueron resuspendidos con la solución amortiguadora de virus.
20
3.2.6 Precipitación con Polietilenglicol (PEG) 8000
Se agregó 10% w/v de PEG 8000 al sobrenadante recuperado tras centrifugar los colchones de sacarosa y
se mantuvo en agitación constante durante 12 horas. Posteriormente, se centrifugó la solución a 15,000
x g por 10 minutos, recuperando el pellet y disolviéndolo en 20 ml de solución amortiguadora de
suspensión de virus. Se adicionó un 15% w/v de PEG 8000 a la solución y se mantuvo en agitación
constante a 4 °C durante 2 horas. La solución fue centrifugada a 15,000 g durante 10 minutos, recuperando
el sobrenadante.
3.2.7 Colchón de sacarosa al 20%
Se colocaron 10 ml del sobrenadante que se recuperó en tubos para ultracentrífuga de 38.5 ml Beckman
Coulter y se colocó un volumen de 5 ml de sacarosa 20% (w/v) en el fondo de cada tubo utilizando una
pipeta Pasteur de 20 cm de largo para formar dos fases. Se balancearon los tubos y se centrifugaron en el
rotor de ángulo variable SW-32 Ti a 30,000 rpm durante dos horas a 4 °C en una ultracentrífuga Beckman
modelo Optima XPN-100. Se recuperó el pellet e, inmediatamente, se resuspendió en solución
amortiguadora de suspensión.
3.2.8 Cuantificación
Los virus purificados fueron cuantificados mediante espectrofotometría UV-Vis a partir de los cuales se
obtuvieron dos valores importantes: A260 y la razón A260/280. Se realizó una dilución 1:20 de cada virus con
solución amortiguadora de suspensión y se determinó la concentración y pureza del virus mediante
mediciones de absorbancia a 260 y 280 nm con un espectrofotómetro UV-Vis modelo Nanodrop 2000. De
acuerdo al método reportado por Warburg y Christian en 1983, el pico de absorbancia a 260 nm
corresponde a la presencia de ARN en tanto el BMV como el CCMV. A su vez, conocemos el coeficiente de
extinción molar (ε = 27,013,000 M-1 cm-1) y la longitud del camino óptico a través de la solución (b = 1 cm)
(Brumfield et al., 2004). Utilizando la ley de Lambert-Beer, es posible calcular la concentración del virus en
mol/L como se describe en la ecuación (2).
21
𝑐 = 𝐴260
𝑏 (𝑐𝑚)∙ 𝜀 (𝑀−1𝑐𝑚−1) [=]
𝑚𝑜𝑙
𝐿 (2)
La ecuación (2) puede ser multiplicada por el peso molecular del virión (4.6x106 g/mol), tal que se obtiene
una segunda ecuación (3) que determina la concentración del virus en mg/ml.
𝑐 = 𝐴260
5.8 (3)
Adicionalmente, la pureza del virus está relacionada con la proporción de ácidos nucleicos y proteína
presente, por lo cual la razón A260/280 debe proporcionar un valor igual o mayor a 1.5. A partir de estas
mediciones, se prepararon alícuotas de 2 mg/ml de virus en tubos de 2 ml y se almacenaron a -80 °C.
3.3 Síntesis de VLPs-(DCD-1L)
3.3.1 Purificación de proteína de cápside
El desensamble de las proteínas de cápside del virus fue realizado mediante una diálisis de 4 mg de BMV
y 2 mg de CCMV nativo en membranas de 14 kDA (Spectrum Laboratories) contra una solución
amortiguadora de desensamble (CaCl2 500 mM, Tris-HCl pH 7.5 50 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.5
mM, pH 8) durante 24 horas a 4 °C en agitación constante (Figura 13). Se recuperó la muestra y se colocó
en tubos para centrífuga de 4 mL. Seguido de esto, se balancearon los tubos y se centrifugaron en un rotor
90Ti a 50,000 rpm, a 4 °C durante 8 horas con 30 minutos. Una vez concluida la centrifugación, se
recuperaron 10 alícuotas de 400 µL en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL evitando remover el pellet. Se
analizaron las alícuotas por espectrofotometría UV-Vis tomando lecturas de los valores de absorbancia
A280 y A280/260. La absorbancia a 280 nm permite determinar la concentración de proteína presente en la
muestra, mientras que la razón A280/260 determina la razón de proteína y ácidos nucleicos presentes. Por
ello, se seleccionaron aquellas fracciones con valores A280 ≥ 0.1 y A280/260 ≥ 1.5.
22
Figura 13. Vaso de precipitado mostrando una diálisis de virus en solución amortiguadora de desensamble.
Se mezclaron las fracciones seleccionadas y se dializaron en membranas de diálisis de 14 kDa contra
solución amortiguadora de proteínas (1M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.2, 1 mM EDTA) durante 12 horas a
4 °C. Finalmente, se recuperó la muestra y se almacenó a 4 °C para utilizarse durante las 2 semanas
posteriores a su purificación.
3.3.2 Encapsidación del péptido DCD-1L
3.3.2.1 Ensambles de prueba
Se realizaron múltiples ensambles de prueba a distintas razones de péptido y proteína de cápside con el
propósito de identificar las condiciones óptimas de encapsidación del DCD-1L. Para estos ensambles, la
masa de proteína de cápside se mantuvo constante mientras que se varió la masa de péptido.
Las mezclas se realizaron en microtubos de 1.5 ml y se aforaron a un volumen final de 150 µl con solución
amortiguadora de ensamble (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl). Estas mezclas
fueron incubadas durante 30 minutos a 4 °C y posteriormente se colocaron en tubos con membranas de
diálisis de 14 kDa durante 12 horas a 4 °C (Figura 14). Después, se cambió la diálisis a una solución de
suspensión de virus a pH 4.5 por 6 horas y se dializó nuevamente en solución de ensamble por 12 horas.
23
Finalmente, se recuperaron los ensambles y se filtraron en tubos con filtros de 100 kDa para eliminar las
proteínas y péptidos libres.
Figura 14. Proceso de microdiálisis para el ensamble de VLPs.
3.3.2.2 Ensamble final
El péptido DCD-1L fue encapsidado por la proteína de cápside (CP) del BMV en una razón de masa 1:6
(péptido:CP). El autoensamble de las partículas fue realizado mezclando la solución del péptido con la
proteína de cápside en solución amortiguadora de ensamble durante 1 hora. Después, se acidificó el
medio agregando ácido acético glacial al 10% e incubando durante 15 minutos. Se agregó ½ volumen de
solución amortiguadora de ensamble enriquecida con NaCl a la reacción y se resuspendió la solución
mediante pipeteo constante durante 5 minutos. Finalmente, se agregó un volumen de solución
amortiguadora de ensamble enriquecida con NaCl y se resuspendió nuevamente durante 5 minutos.
Seguido de esto, la muestra obtenida se centrifugó en tubos con filtros de 100 kDa para eliminar el exceso
de agentes.
24
3.3.3 Ensayo de cambio en la movilidad electroforética
Para analizar los ensambles realizados, se prepararon dos geles nativos de agarosa al 1% utilizando
solución amortiguadora de virus (10 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA) a pH 4.7 y 6, respectivamente. La
electroforesis tuvo una duración de 4.5 horas y fue llevada a cabo a 4 °C. Se cargaron 20 µl de muestra con
glicerol al 10% para incrementar su densidad. Como controles se cargó virus nativo, proteína de cápside y
el péptido. La electroforesis fue realizada a 4 °C con solución amortiguadora de virus a pH 4.7 y pH 6,
ambas con una duración de 4.5 horas. El gel fue teñido con Instant Blue de la marca Expedeon, para
observar las bandas correspondientes a cada condición.
3.3.4 Gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Con la finalidad de determinar la masa de la proteína de cápside y el péptido, así como la proporción molar
de encapsidación, se realizaron dos geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 20%. La composición de
los geles se encuentra descrita en la tabla 1.
Tabla 1. Composición del gel SDS-PAGE
Fase concentradora 6% Fase separadora 20%
Reactivo Volumen (µl) Reactivo Volumen (µl)
Poliacrilamida 30% 1000 Poliacrilamida 30% 5330
H2O 2600 H2O 500
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 1250 Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2000
SDS 10% 50 SDS 10% 80
PSA 10% 50 PSA 10% 80
TEMED 5 TEMED 8
25
Los geles se corrieron a 100 V durante 90 minutos en una cámara Mini-PROTEAN de Bio Rad. Cada carril
se cargó con las masas de proteína o péptido indicadas en la Tabla 2.
Tabla 2. Masa de los reactivos utilizados en los geles desnaturalizantes de poliacrilamida.
Gel de proteína de la cápside del BMV Gel del péptido DCD-1L
No. de carril Masa (µg) No. de carril Masa (µg)
2 0.5 2 0.5
3 1.0 3 1.0
4 1.5 4 2.0
5 2.0 5 4.0
6 2.5 6 6.0
7 3.0 7 8.0
8 6.0 8 10.0
9 8.0 9 12.0
10 (10 µl de VLPs) 10 (10 µl de VLPs)
El número de muestras utilizado para cada gel permite realizar dos calibraciones distintas: una para
determinar la cantidad de proteína presente, mientras que la segunda permite determinar la masa de
péptido presente. Para realizar esto, se realizó un análisis por densitometría utilizando el software
“ImageJ”. A través de este software, se graficó la intensidad de la banda correspondiente a cada carril y
se calculó el área bajo la curva correspondiente a la densidad de dicha banda. Finalmente, se utilizó el
26
software “OriginPro” para elaborar los gráficos lineales donde se relacionó la intensidad de banda con la
concentración de proteína y péptido utilizada, y se determinó la cantidad de proteína de cápside y de
péptido presentes en un volumen determinado de VLPs de acuerdo a los siguientes cálculos.
La relación lineal se encuentra establecida por la ecuación de la recta mostrada en la ecuación (4):
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 (4)
Donde y representa la intensidad de banda, m la pendiente de la recta, x la masa de proteína o péptido
presente, y b el intercepto. Despejando para x, es posible tomar la intensidad de banda obtenida para el
carril de las VLPs en el gel, tal que:
𝑥 = 𝑦−𝑏
𝑚=
𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎 − 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 (5)
De esta manera, se obtuvo la masa de proteína y de péptido presentes en un volumen determinado de
VLPs. A su vez, se utilizaron los pesos moleculares de la proteína de cápside (20.3 kDa) y del DCD-1L (4.8
kDa) para calcular el número de moles presentes de la proteína de cápside y el péptido:
𝑛𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃 = 𝑔𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃
𝑝. 𝑚.𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃= # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃
𝑛𝐷𝐶𝐷−1𝐿 = 𝑔𝐷𝐶𝐷−1𝐿
𝑝. 𝑚.𝐷𝐶𝐷−1𝐿= # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐷𝐶𝐷 − 1𝐿
Una vez que se obtuvieron estos valores, se calculó la relación molar entre la proteína de cápside y el
péptido como se ilustra en la ecuación (6):
1.52𝑥10−10 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐷𝐶𝐷−1𝐿
4.93𝑥10−11 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃= 3.08
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐷𝐶𝐷−1𝐿
𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃 (6)
Al tomar en cuenta que las VLPs analizadas poseen una estructura T=3 posee 180 subunidades proteicas
de 20.3 kDa, se determinó la relación molar de DCD-1L encapsidado por cada mol de VLPs ensambladas
utilizando la ecuación (7):
# 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐷𝐶𝐷−1𝐿
𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃 𝑥 180
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐵𝑀𝑉 𝐶𝑃
𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑉𝐿𝑃= #
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐷𝐶𝐷−1𝐿
𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑉𝐿𝑃 (7)
27
3.4 Funcionalización de VLPs-(DCD-1L) con antibióticos
Se tomaron nanopartículas virales ensambladas a una relación 1:6 para funcionalizar con el antibiótico
kanamicina. Las VLPs fueron estabilizadas durante 30 minutos previo a su funcionalización, utilizando:
1. PBS suplementado con 20 mM de MgCl2
2. Solución amortiguadora de ensamble
3. Tris-HCl pH 7.5 20 mM
La funcionalización fue llevada a cabo utilizando 550 equivalentes molares de 1-etil-3-(3-
dimethilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) como agentes activantes, así como
500 equivalentes molares de los antibióticos ampicilina, kanamicina y aztreonam. Los tubos fueron
incubados durante 10 - 12 horas a 4 ℃, permitiendo que los grupos carboxilo activos reaccionaran con los
grupos amino primarios de los antibióticos. Seguido a ello, se eliminó el exceso de agentes mediante
ultrafiltración en tubos con filtros de 100 kDa. Este procedimiento se repitió para cada virus con cada
antibiótico y las partículas fueron caracterizadas mediante dispersión de luz.
3.5 Caracterización
3.5.1 Determinación de tamaño por dispersión dinámica de luz (DLS)
Los ensambles obtenidos fueron analizados mediante la técnica de dispersión dinámica de luz (DLS) en un
Zetasizer Nano ZS de Malvern. Se colocaron 100 µl de cada muestra en celdas UV-Cuvette micro y se
realizaron tres series de mediciones para obtener sus diámetros hidrodinámicos.
3.5.2 Microscopía electrónica de transmisión
Se colocaron 6 µl de muestra en rejillas de cobre de 400 soporte formar/carbón 400 mesh (TedPella). Las
muestras se mantuvieron en la rejilla durante 90 segundos y, una vez transcurrido este tiempo, se retiró
el exceso de muestra con papel filtro Whatman No2. Seguido a ello, se agregaron 6 µl de acetato de uranilo
28
al 4% a las rejillas y se dejó reposar durante 90 segundos. Finalmente, se retiró el exceso de acetato de
uranilo con papel filtro y se almacenaron las rejillas en un desecador.
Las muestras fueron analizadas en el laboratorio de microscopía avanzada de CICESE con un microscopio
electrónico de transmisión marca Hitachi modelo H-7500. El análisis de las micrografías se realizó
mediante el software “Image J” del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (NIH). Con los datos
obtenidos, se graficaron las distribuciones de tamaño para cada ensamble.
Así mismo, el diámetro obtenido permite determinar el número de triangulación de las partículas al utilizar
la siguiente ecuación:
𝐷𝑖
𝐷𝑗=
√𝑇𝑖
√𝑇𝑗 (8)
Donde Di representa el diámetro de las VLPs, Dj el diámetro del BMV nativo, Ti el número de triangulación
de las VLPs, y Tj el número de triangulación del BMV.
3.5.3 ATR-FTIR
Para determinar la presencia del antibiótico en las VLPs tras su funcionalización, se realizaron análisis de
espectroscopía de infrarrojo (ATR-FTIR) para obtener las señales de absorbancia dadas por la muestra en
un rango de número de onda de 400 a 4500 cm-1. Se analizó la absorbancia obtenida en un rango de
número de onda entre los 400 y 520 cm-1 para una solución de aztreonam a una concentración de 100
µg/ml, una muestra de VLPs-(DCD-1L) sin funcionalizar y una muestra de VLPs-(DCD-1L) funcionalizadas
con aztreonam (VLPs-Azt). Se analizó esta región debido a que muestra señales representativas tanto para
el antibiótico, así como para las VLPs, lo cual permite determinar diferencias en las señales obtenidas.
29
3.6 Generación de cepas resistentes
Para generar cepas resistentes a los antibióticos propuestos en el presente proyecto, se prepararon
cultivos líquidos de Escherichia coli y Staphylococcus aureus expuestos a concentraciones crecientes de
antibiótico durante periodos de seis horas. Se comenzó realizando un cultivo líquido de las bacterias
expuestas a una concentración inicial de 0.5 µg/ml de cada antibiótico. Posteriormente, se realizó un
plaqueo en placas de LB agar y se seleccionaron las colonias resistentes al tratamiento. Estas colonias
fueron nuevamente cultivadas con una concentración superior de cada antibiótico. Las concentraciones
de antibiótico fueron elevadas en incrementos de 0.5 µg/ml hasta obtener cepas de E. coli y S. aureus
resistentes a una dosis de 16 µg/ml de ampicilina y kanamicina. Por otro lado, ambas cepas lograron
presentar una resistencia contra una dosis de 5 µg/ml de aztreonam.
Se realizaron cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus aureus expuestos a concentraciones crecientes
de antibiótico. Se comenzó realizando un cultivo líquido de las bacterias expuestas a una concentración
inicial de 0.5 µg/ml de cada antibiótico. Posteriormente, se realizó un plaqueo en placas de LB agar y se
seleccionaron las colonias resistentes al tratamiento. Estas colonias fueron nuevamente cultivadas con
una concentración superior de cada antibiótico. Las concentraciones de antibiótico fueron elevadas en
incrementos de 0.5 µg/ml hasta obtener cepas de E. coli y S. aureus resistentes a una dosis de 16 µg/ml
de ampicilina y kanamicina. Por otro lado, ambas cepas lograron presentar una resistencia contra una
dosis de 5 µg/ml de aztreonam. Este proceso se realizó a lo largo de dos meses donde se llevaron a cabo
numerosas repeticiones para obtener cultivos sólidos de bacterias donde se observe una distribución
homogénea de colonias resistentes al tratamiento.
3.7 Ensayos de susceptibilidad antimicrobiana
Los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana se hicieron con la finalidad de evaluar los efectos
bactericidas de los antibióticos ampicilina, kanamicina y aztreonam, del péptido DCD-1L y del sistema
antimicrobiano elaborado a partir de la funcionalización del BMV y CCMV. Se prepararon los inóculos
frescos de las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus a una concentración de 108 UFC/ml
determinada mediante densidad óptica (DO600 = 0.1) y se realizaron los ensayos de susceptibilidad.
30
3.7.1 Ensayo en cultivo líquido
Se realizaron inóculos, por triplicado, de 104 bacterias por mililitro en medio LB. Para cada tratamiento, se
inoculó un control de bacterias con proteína de cápside de BMV para tener una misma concentración de
proteína en estos tratamientos como en el ensayo con las VLPs funcionalizadas con aztreonam. Se
prepararon tres lotes de tubos para los distintos tratamientos (Tabla 3) y se incubaron por 18 horas a 37 ℃
en rotación constante. Posteriormente, se realizó una medición de densidad óptica a 600 nm para
determinar la viabilidad de las bacterias.
Tabla 3. Ensayo de actividad antimicrobiana de VLPs-(DCD-1L) funcionalizadas con aztreonam.
Tratamiento Bacterias/mL CP (µg) Aztreonam (µg) DCD-1L (µg) VLPs (µg)
E. coli
Control 104 10 - - -
Aztreonam 104 10 2 - -
DCD-1L 104 10 - 10 -
VLPs 104 - - - 10
S. aureus
Control 104 10 - - -
Aztreonam 104 10 2 - -
DCD-1L 104 10 - 10 -
VLPs 104 - - - 10
31
Capítulo 4. Resultados
4.1 Purificación de las partículas de BMV y CCMV
A los 14 días de infección, se recolectaron 250 gramos de hojas infectadas de Hordeum volgare (cebada)
y 150 gramos de Vigna ungiculata (frijol).
La obtención de los virus BMV y CCMV representa una parte fundamental del presente trabajo para la
elaboración del sistema antimicrobiano propuesto. En la Figura 15 se puede observar la banda azul
característica obtenida durante la purificación de ambos virus. La intensidad de esta banda es proporcional
a la concentración de virus presente.
Figura 15. Banda azul que contiene el virus después de realizar ultracentrifugación del gradiente de sacarosa.
Para BMV, se obtuvo un rendimiento total de 100 mg por 50 gramos de hojas infectadas, mientras que,
para CCMV, se obtuvo un rendimiento de 26 mg por 100 gramos de hojas. Ambos virus presentaron una
razón A260/280 dentro de un rango de 1.5 a 1.7.
32
4.2 Síntesis de VLPs-(DCD-1L)
4.2.1 Purificación de proteína de cápside
Para este proyecto, se eligieron las alícuotas con valores A280 ≥ 0.1 y A280/260 ≥ 1.5, indicando una
concentración de proteína adecuada, así como una pureza óptima.
Después de dializar las alícuotas seleccionadas en solución amortiguadora de proteínas, se realizó una
segunda cuantificación de la proteína donde se obtuvieron 3.2 mg de proteína libre de BMV. Esto nos
indica una eficiencia de purificación del 80%. Para CCMV se obtuvieron 1.42 mg de proteína libre, que
representa una eficiencia del 71%.
4.2.2 Encapsidación del DCD-1L en VLPs de BMV
4.2.2.1 Ensambles de prueba
Inicialmente, se realizaron cuatro ensambles siguiendo las relaciones de masa (péptido:CP) 1:1, 1:3, 1:4 y
1:6. La masa de proteína se mantuvo constante mientras que se varió la masa de péptido utilizado tal
como se describe en la tabla 4.
Tabla 4. Relaciones para ensamble de VLPs-(DCD-1L).
Relación Péptido:CP BMV Péptido DCD-1L (µg) CP BMV (µg)
1:1 30 30
1:3 10 30
1:4 7.5 30
1:6 5 30
33
Para la relación 1:1 (Figura 16), la migración fue similar a la del péptido. En cambio, para las relaciones 1:3,
1:4 y 1:6 la migración mostró mayor similitud a la del virus y su proteína de cápside, por lo que se deduce
que el péptido fue encapsidado exitosamente en estas tres condiciones, por lo cual se decide realizar otra
serie de ensambles de prueba.
Figura 16. Ensayo de movilidad electroforética en gel de agarosa al 1%. Se observa la migración de cada ensamble con respecto a la proteína libre de cápside, el virus nativo y el péptido DCD-1L.
Las composiciones de la segunda serie de ensambles de prueba son mostradas en la tabla 5. Se eliminó la
relación 1:1 dado que se observó que el péptido no fue encapsidado, se agregó la relación 1:12.
Tabla 5. Relaciones para ensamble de VLPs-(DCD-1L).
Relación Péptido:CP BMV Péptido DCD-1L (µg) CP BMV (µg)
1:3 15 45
1:6 11.25 45
1:9 7.5 45
1:12 5 45
34
Se analizó la distribución de tamaño por volumen de los ensambles obtenidos a partir de las relaciones
descritas en la Tabla 5. Para las relaciones 1:3, 1:6 y 1:9, se observa una distribución monodispersa,
mientras que las partículas ensambladas a una relación 1:12 presentan un índice de polidispersión elevado
(Figura 17).
Figura 17. Distribución de tamaño por volumen de los ensambles a) 1:3, b) 1:6, c) 1:9 y d) 1:12 de VLPs-(DCD-1L).
El ensamble 1:3 muestra tamaños promedio de partícula que varían entre los 21 y 25 nanómetros de
diámetro, que corresponde a un tamaño menor al esperado y, a su vez, en una posible morfología de
partícula distinta (Figura 17-a). Para el ensamble 1:6 se observan partículas cuyo diámetro promedio varía
entre los 24 y 29 nanómetros (Figura 17-b). Esta distribución se asemeja a los tamaños reportados para el
BMV nativo obtenidos mediante un análisis similar. En el caso del ensamble 1:9, se distingue un rango de
distribución más amplio que varía entre los 21 y 29 nanómetros de diámetro, lo cual demuestra un
incremento en el índice de polidispersión (Figura 17-c) donde el ancho de la distribución es mayor a los
dos casos anteriores. Finalmente, para el ensamble 1:12 se observa una amplia polidispersión (Figura 17-
d) donde el 61% de la población de partículas posee un diámetro superior a los 100 nm, que nos indica
una posible aglomeración importante de partículas.
35
Posteriormente, se tomaron 6 µl de cada ensamble y se depositaron sobre rejillas de cobre para su análisis
mediante microscopía electrónica de transmisión. Con los datos obtenidos, se graficaron las distribuciones
de tamaño para cada ensamble. Para el ensamble 1:3 (Figura 18), se observa un bajo número de partículas
ensambladas. La distribución de tamaño varía con diámetros desde 20 nm a 40 nm, con una concentración
moderadamente mayor de partículas de 30 nm de diámetro. Es posible notar que algunas de estas
partículas se encuentran rotas, mientras que las partículas ensambladas presentan una geometría
elipsoide.
Figura 18. a) Micrografía electrónica a 80 kV de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:3. b) Distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:3.
Las partículas ensambladas a una relación 1:6 muestran una distribución uniforme con un diámetro
promedio de 29.69 nm (Figura 19). Al considerar que el virus nativo posee un diámetro de 28 nm y utilizar
la ecuación (8), se determinó que las partículas poseen un número de triangulación T = 3, por lo que las
partículas obtenidas presentan una distribución y estructura similar a la del BMV nativo.
Figura 19. a) Micrografía electrónica a 80 keV de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:6. b) Distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:6.
36
Para el ensamble 1:9 se observa una distribución de partículas entre los 24 y 42 nm de diámetro (Figura
20), donde la mayor parte de la población está conformada por partículas con un diámetro de 30 a 36 nm.
Este tamaño es superior al reportado para el BMV nativo; sin embargo, estas VLPs aún conservan una
estructura T=3. Aunado a esto, se observa que las partículas ensambladas contienen poca cantidad del
péptido DCD-1L. Esto puede apreciarse en la estructura de las VLPs mostradas en la Figura 20, donde las
VLPs presentan un contorno brillante contrastado por un núcleo oscuro que es característico para las
cápsides vacías o con pocas moléculas en su interior.
Figura 20. a) Micrografía electrónica a 80 keV de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:9. b) Distribución de tamaño de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:9.
Finalmente, para las VLPs ensambladas a una relación 1:12 se observa principalmente una aglomeración
de partículas rotas o incompletas (Figura 21) por lo que posiblemente el cargo no está completamente
protegido. Debido a la baja síntesis de VLPs íntegras o completas, no se realizaron mediciones de
diámetros de partículas y no se estableció una distribución de tamaño.
Figura 21. Micrografía electrónica a 80 keV de las VLPs-(DCD-1L) ensambladas a una relación 1:12.
37
Con base en las observaciones anteriores, es posible resumir las principales conformaciones de las VLPs
de acuerdo a la relación de masa entre el péptido y la proteína de cápside del BMV (Figura 22). A partir de
ello, se seleccionó la relación 1:6 para desarrollar el resto del proyecto dado que esta presentó la mejor
distribución de partículas con la estructura deseada.
Figura 22. La variación de la relación de masa entre el péptido y la cápside promueve la formación de distintas estructuras de VLPs-(DCD-1L). Se observa que la relación 1:6 permite la formación de VLPs esféricas que logran encapsidar el péptido exitosamente.
4.2.2.2 Ensamble final
Tras sintetizar las nanopartículas con relación 1:6, se realizó un ensayo de movilidad electroforética en un
gel nativo de agarosa al 1% con solución amortiguadora de virus ajustada a pH 6. Se utilizaron como
controles tanto el BMV nativo como el péptido DCD-1L. Así mismo, se cargó un pozo con las VLPs
ensambladas. El gel permitió observar la que las VLPs migran de manera similar al virus nativo a través de
la posición de las bandas oscuras pertenecientes a cada carril (Figura 23). Por otro lado, se corroboró la
ausencia de péptido libre en el carril perteneciente al ensamble ya que no se observó una banda en la
posición indicada por el control del péptido libre.
38
Figura 23. Ensayo de movilidad electroforética en solución amortiguadora de virus a pH 6. El pozo a) corresponde al control de BMV nativo, el pozo b) a las VLPs ensambladas, y el pozo c) al péptido libre.
4.2.2.3 Estequiometría DCD-1L : Proteína de la cápside del BMV
El incremento de masa de proteína de cápside de del BMV correspondió con un incremento en la
intensidad de banda observado en cada carril (Figura 24). Esto también se observó en el segundo gel donde
se agregaron masas ascendentes del péptido DCD-1L (Figura 25).
Figura 24. Gel de BMV CP. Se observó un incremento en la intensidad de banda que corresponde con el incremento de masa de proteína de cápside en cada pozo.
39
Figura 25. Gel de DCD-1L. Se observó un incremento en la intensidad de banda que corresponde con el incremento de masa del péptido DCD-1L en cada pozo.
Con los resultados anteriores, se realizaron los gráficos donde se relacionó la masa de proteína de cápside
y péptido con la intensidad de las bandas de los geles (Figuras 26 y 27).
Figura 26. Relación lineal entre la intensidad de banda en función de la masa de la proteína de cápside del BMV. Los puntos azules representan la intensidad de las bandas para las masas conocidas de proteína de cápside del BMV. El punto rojo representa la intensidad de la banda de las VLPs.
40
Figura 27. Relación lineal entre la intensidad de banda en función de la masa del péptido DCD-1L. Los puntos azules representan la intensidad de las bandas para las masas conocidas del péptido DCD-1L. El punto rojo representa la intensidad de la banda de las VLPs.
A partir de los gráficos y las ecuaciones (4) y (5), se obtuvieron las siguientes relaciones de masa de
proteína de cápside y péptido:
9.68 µ𝑔𝐶𝑃 ∶ 7.07 µ𝑔𝐷𝐶𝐷−1𝐿
1 µ𝑔𝐶𝑃 ∶ 0.73 µ𝑔𝐷𝐶𝐷−1𝐿
Esta relación de masa corresponde a una relación de 3.08 moles de DCD-1L por cada mol de proteína de
cápside, lo cual significa que por cada mol de VLP tenemos 554.4 moles de DCD-1L.
4.3 Funcionalización de BMV y CCMV nativo
4.3.1 Caracterización por microscopía electrónica de transmisión
Se funcionalizaron las cápsides de BMV y CCMV con tres equivalencias molares distintas de antibiótico. Se
observó una distribución uniforme de partículas íntegras a lo largo de la micrografía (Figura 28-A). A su
vez se observaron aglomeraciones provocadas por la presencia de un exceso de los agentes utilizados en
41
la funcionalización de las partículas. En comparación, la funcionalización realizada con 500 equivalentes
molares de ampicilina (Figura 28-B) muestra partículas bien definidas dispersas entre sitios de
aglomeración. Para las partículas funcionalizadas con 1000 equivalentes molares de antibiótico, la
aglomeración se presentó con mayor abundancia. Los efectos sobre estas partículas pueden apreciarse de
mejor manera en la micrografía de la Figura 28-F, donde se observa que las partículas sufren
deformaciones estructurales y pierden la estructura cuasi-esférica típicamente observada para estos virus.
En cambio, para las funcionalizaciones realizadas con 100 y 500 equivalentes molares, las partículas
carecen de alteraciones estructurales.
Figura 28. Imágenes obtenidas mediante microscopia electrónica de transmisión de la funcionalización de BMV con 100, 500 y 1000 equivalentes de ampicilina por partícula viral. Se puede observar que los viriones comienzan a agregarse conforme se incrementa el número de sitios funcionalizados de la cápside viral. A), B) y C) Micrografías tomadas a 40,000 aumentos. D), E), F) Micrografías tomadas a 80,000 aumentos.
Considerando la información recabada a partir de las micrografías, se decidió funcionalizar el virus con
500 equivalentes molares con el fin de maximizar el número de moléculas adheridas por partícula mientras
se preserva la estructura del virus.
42
4.3.2 Caracterización por dispersión dinámica de luz
Para el BMV nativo se observa un gráfico conformado por un pico estrecho, lo que indica una distribución
monodispersa (Figura 29). El diámetro promedio obtenido para el BMV nativo fue de 27.49 nm, lo cual
coincide con la estructura T=3 característica de este virus.
Figura 29. Distribución de tamaño por volumen para BMV nativo.
Para la funcionalización del BMV con ampicilina (Figura 30) se observó una distribución de partícula
monodispersa donde el tamaño promedio de partícula fue de 29.12 nm. Esto indica la presencia de
partículas con un número de triangulación T=3 que corresponde a la estructura esperada del BMV. A su
vez, este tamaño indica un incremento de 2 nm en el diámetro de las partículas.
Figura 30. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con ampicilina.
43
De manera similar a la funcionalización con ampicilina, el BMV funcionalizado con kanamicina presentó
un pico alto y estrecho que indica una distribución de partícula monodispersa, donde el tamaño promedio
de partícula es de 29.53 nm con estructura T=3 (Figura 31).
Figura 31. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con kanamicina.
En el caso de la funcionalización del BMV con aztreonam (Figura 32), también se observa una distribución
de partícula monodispersa. Las partículas poseen un diámetro promedio de partícula es de 35.03 nm. Esto
representa un incremento de 8 nanómetros de diámetro a comparación de los casos anteriores donde el
incremento de tamaño fue menor a los 3 nanómetros.
Figura 32. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado con aztreonam.
44
En la Tabla 6 se resumen los tamaños obtenidos para las mediciones realizadas por dispersión de luz
dinámica para las partículas de BMV funcionalizado. Es posible apreciar que, para todas las instancias, el
tamaño promedio de las partículas funcionalizadas representa más del 90% del volumen de la muestra
utilizada. Esto contrasta con los gráficos observados en las figuras anteriores, confirmando una
distribución monodispersa en un rango de tamaños deseados con una desviación estándar menor a los 10
nm. Comparando estos resultados con el BMV nativo, se observa que la modificación de la superficie del
virus mediante la metodología utilizada produce un incremento en el tamaño de 2 a 8 nm.
Tabla 6. Distribución de tamaño por volumen para BMV funcionalizado.
Partícula Tamaño (nm) % Volumen
BMV nativo 27.49 ± 5.41 100.0
BMV-Ampicilina 29.26 ± 0.35 98.2
BMV-Kanamicina 29.52 ± 0.39 97.8
BMV-Aztreonam 34.47 ± 0.59 96.7
Para comparar los resultados obtenidos, se realizó una estimación teórica de las longitudes lineales para
cada antibiótico. Se obtuvieron modelos computacionales de la estructura de los antibióticos a través de
la base de datos del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI - National Center for
Biotechnology Information) y se determinó la distancia lineal para cada molécula utilizando el software
Avogadro. Se obtuvo que el antibiótico ampicilina poseen una distancia lineal teórica de 1.32 nm, para la
kanamicina se observa una distancia lineal de 1 nm, y para el aztreonam la distancia lineal fue de 1.26 nm.
45
4.3.3 SDS-PAGE
Para BMV como para CCMV, se reporta que la proteína de cápside posee un peso molecular de
aproximadamente 20 kDa, lo cual se corroboró al observarse bandas entre los 20 y 25 kDa (Figura 33).
Para CCMV se observa la presencia de dos bandas definidas tanto para el virus nativo, como para la
funcionalización del virus con los antibióticos ampicilina, kanamicina y ampicilina. Por otro lado, tanto para
el BMV nativo como cada instancia de funcionalización con antibióticos, se observa una sola banda a la
altura de 20 kDa. En general, para las cápsides funcionalizadas se observa una migración similar a la de su
contraparte nativa, sin embargo; hay un pequeño corrimiento de las bandas por encima y debajo del peso
molecular al que corresponde con la proteína de cápside.
Figura 33. SDS-PAGE de CCMV y BMV nativos y funcionalizados con antibióticos.
4.4 Funcionalización de VLPs con antibióticos
4.4.1 Caracterización por dispersión dinámica de luz
Se realizó la caracterización de los ensambles funcionalizados con el propósito de determinar la eficacia
de la estabilización de las VLPs de acuerdo al medio de dispersión utilizado en cada instancia (Figura 34).
46
Figura 34. Distribución de tamaño por volumen de a) Ensamble 1:6, b) Funcionalización en PBS con MgCl2 20 mM, c) Funcionalización en solución amortiguadora de ensamble y d) Funcionalización en Tris-HCl pH 7.5 20 mM.
Se observó la distribución de las VLPs ensambladas previamente con una relación 1:6 (Figura 34-a). Para
la funcionalización realizada en PBS (Figura 34-b), se observaron partículas con un tamaño de 43.83 nm
que representan un incremento de 16 nm en el diámetro de partícula. A su vez, se mostraron
aglomeraciones formadas durante el proceso de funcionalización. Al funcionalizar las VLPs utilizando
solución amortiguadora de ensamble como medio estabilizante (Figura 34-c), se observó un incremento
similar en el tamaño como en el caso anterior, donde se obtuvieron partículas de 43 nm. Por otro lado, en
la funcionalización realizada en Tris-HCl (Figura 34-d) se obtuvieron partículas de 32 nm de diámetro, lo
cual refleja un incremento 3 nm en el diámetro. Esto sugiere que la reacción no pudo ser llevada a cabo
en dicho medio de la misma manera que se observa en la funcionalización realizada en PBS y solución
amortiguadora de ensamble.
4.4.2 Caracterización por microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Las VLPs funcionalizadas fueron caracterizadas en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-
7500 utilizando un voltaje de 80 keV. A continuación, se muestran micrografías representativas para cada
instancia de funcionalización.
47
Figura 35. Micrografía de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en PBS con MgCl2 20 mM y funcionalizadas con kanamicina. Se observó una distribución compuesta principalmente por partículas bien definidas. Imagen tomada a 50,000 aumentos.
Para las VLPs estabilizadas en PBS suplementado con 20 mM de MgCl2 (Figura 35), se observó una
distribución de tamaño homogéneo de partículas bien definidas. Estas partículas tuvieron una estructura
íntegra T=3 con una variación en el diámetro de 27 a 37 nm (Figura 36), donde la población principalmente
se situó en un tamaño promedio de 30.9 nm. Se observaron algunas partículas rotas; sin embargo,
representan un porcentaje mínimo.
Figura 36. Distribución de tamaño de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en PBS suplementado con MgCl2 20 mM y funcionalizadas con kanamicina.
48
En comparación, las VLPs estabilizadas en solución amortiguadora de ensamble (Figura 37) presentan una
mayor cantidad de partículas rotas y aglomeraciones. Las partículas funcionalizadas correctamente
tuvieron un diámetro de 29 nm, similar a lo observado para la funcionalización estabilizada en PBS.
Figura 37. Imagen obtenida mediante microscopía electrónica de transmisión de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en solución amortiguadora de ensamble y funcionalizadas con kanamicina. A) Se apreciaron aglomeraciones importantes de partículas después de realizar la funcionalización. B) Mostró una cantidad importante de partículas rotas entre aquellas que permanecen íntegras.
En las VLPs estabilizadas en Tris-HCl pH 7.5 20 mM para su funcionalización se observaron principalmente
partículas rotas a lo largo de la micrografía (Figura 38), lo cual sugiere que un incremento en el pH y los
reactivos NHS y EDC pueden desestabilizar las VLPs y desensamblarlas.
Figura 38. Imagen obtenida mediante microscopía electrónica de transmisión de VLPs-(DCD-1L) estabilizadas en Tris-HCl pH 7.5 20 mM y funcionalizadas con kanamicina.
49
Es importante resaltar que, para las VLPs funcionalizadas en PBS y solución amortiguadora de ensamble,
disminuyeron de diámetro. Este fenómeno puede deberse a la preparación de la muestra para su análisis
por microscopía electrónica dado que, el acetato de uranilo acidifica el medio y compacta las VLPs debido
al fortalecimiento de las interacciones proteína-proteína. Tomando esto a consideración, así como las
observaciones realizadas en las micrografías, se determinó que el PBS suplementado con MgCl2 20 mM
funge como medio ideal para estabilizar las VLPs previo a su funcionalización con antibióticos.
4.5 Caracterización por ATR-FTIR
Se obtuvieron las señales de absorbancia para las VLPs nativas (sin funcionalizar) y para el antibiótico
aztreonam (Figura39). A pesar de algunas similitudes observadas, particularmente en 480 cm-1 y en 410
cm-1, es posible apreciar las diferencias en la señal de las VLPs posiblemente determinadas por los enlaces
peptídicos de la partícula. Esta señal fue principalmente reflejada en un pico estrecho en 460 cm-1, así
como otro ubicado en 420 cm-1. Con la información anterior, se realizaron comparaciones con la señal
obtenida para las VLPs funcionalizadas.
Figura 39. Señal de absorbancia obtenida mediante espectroscopía ATR-FTIR de VLPs nativas y aztreonam a 100 µg/ml.
Al comparar las señales de las VLPs nativas con aquellas que fueron funcionalizadas (Figura 40), las
similitudes fueron observadas inmediatamente. El pico estrecho en 460 cm-1 permaneció presente para
50
ambos casos; sin embargo, la señal se encuentra atenuada para las VLPs funcionalizadas. Este suceso se
observó nuevamente en 440 y 420 cm-1, donde dicha atenuación puede deberse a la presencia del
aztreonam en la superficie de las partículas.
Figura 40. Señal de absorbancia obtenida mediante espectroscopía ATR-FTIR de VLPs nativas y VLPs funcionalizadas con aztreonam (VLP-Azt).
Se apreció el cambio en el espectro de las VLPs nativas una vez que son funcionalizadas con el antibiótico
(Figura 41). Además de las señales atenuadas previamente mencionadas, las VLPs funcionalizadas
presentaron señales más intensas a las observadas en las VLPs nativas. Así mismo, en 460 y 470 cm-1 se
observaron coincidencias entre la señal del antibiótico y las VLPs funcionalizadas.
Figura 41. Señal de absorbancia obtenida mediante espectroscopía ATR-FTIR de aztreonam a 100 µg/ml y VLPs funcionalizadas con aztreonam (VLP-Azt).
51
4.6 Estabilidad de las VLPs
Para determinar posibles cambios estructurales de las VLPs obtenidas mediante la metodología de
ensamble descrita previamente, se realizó un segundo análisis mediante dispersión dinámica de luz. Las
partículas fueron almacenadas en PBS suplementado con Mg2+ durante un mes a 4 °C previo a la
realización del segundo análisis.
Las VLPs al momento de su síntesis tuvieron un carácter monodisperso con un tamaño promedio de 27
nm de diámetro (Figura 42-A). Un mes después de su almacenamiento, su distribución se mantuvo
similarmente monodispersa, con un ensanchamiento en la base del pico del espectro (Figura 42-B).
Figura 42. Distribución de partículas obtenida mediante análisis por dispersión dinámica de luz (DLS). A) VLPs-(DCD-1L) recién ensambladas. B) VLPs-(DCD-1L) un mes después de su síntesis y almacenadas a 4 °C.
4.6.1 Estabilidad de ensambles de CCMV VLPs
Se replicaron las condiciones de ensamble utilizadas para las BMV VLPs para realizar un ensamble de VLPs
utilizando proteína de cápside de CCMV, donde se obtuvieron partículas con un diámetro promedio de 32
nm (Figura 43-A). Transcurrido un mes de almacenamiento, se observó un ensanchamiento de la curva de
distribución (Figura 43-B). De manera similar para las BMV VLPs, no se observaron aglomeraciones
importantes y el máximo de la curva permaneció para un diámetro promedio de 31 nm.
52
Figura 43. Distribución de partículas obtenida mediante análisis por dispersión dinámica de luz (DLS). A) CCMV VLPs-(DCD-1L) recién ensambladas. B) CCMV VLPs-(DCD-1L) un mes después de su síntesis y almacenadas a 4 °C.
4.7 Selección de mutantes espontáneas resistentes a los antibióticos ampicilina,
kanamicina y aztreonam
Para E. coli, se observan tres escenarios distintos con cada tratamiento (Figura 44). En el tratamiento con
ampicilina a una concentración 16 µg/ml (Figura 44-A), se aprecia un estriado de grosor considerable que
indica la presencia de colonias abundantes. El tratamiento con kanamicina a una concentración de 16
µg/ml permitió la formación de colonias individuales bien definidas, lo cual indica que una porción
considerable de las bacterias fue capaz de resistir al tratamiento (Figura 44-B). Finalmente, las bacterias
sometidas a una dosis de 5 µg/ml de aztreonam mostraron un crecimiento mínimo (Figura 44-C). Se
observaron una serie de estriados delgados que indican la presencia de bacterias que resistieron al
tratamiento; sin embargo, la población de bacterias resistentes es menor a comparación a lo observado
en los tratamientos con ampicilina y kanamicina.
Figura 44. Cultivos de E. coli en LB agar posterior a los tratamientos con antibióticos. A) E. coli resistente a la ampicilina, B) kanamicina y C) aztreonam.
53
En el caso de S. aureus, también se observaron tres escenarios distintos con cada tratamiento (Figura 45).
En el tratamiento con ampicilina a una concentración 16 µg/ml (Figura 45-A), en el cultivo en LB agar fue
imposible observar la formación de estriados gruesos ni colonias individuales. Esto indica un crecimiento
considerable de las bacterias incluso en presencia del antibiótico. Por otro lado, el tratamiento con
kanamicina con una dosis de 16 µg/ml presentó una distribución abundante de colonias en forma de un
estriado continuo grueso (Figura 45-B), lo cual indica que las bacterias eran resistentes al tratamiento y se
reprodujeron. Finalmente, de manera similar a lo observado en E. coli, las bacterias sometidas a una dosis
de 5 µg/ml de aztreonam (Figura 45-C) mostraron un crecimiento menor a comparación de los
tratamientos realizados con los otros antibióticos. Se observan una serie de estriados separados que
indican la presencia de bacterias que resistieron al tratamiento; sin embargo, la baja población de
bacterias indica que el tratamiento tiene un efecto antimicrobiano.
Figura 45. Cultivos de S. aureus en LB agar posterior a los tratamientos con los antibióticos. A) S. aureus resistente a la ampicilina, B) kanamicina y C) aztreonam.
4.8 Ensayo de actividad antimicrobiana
El tratamiento con aztreonam recuperó su efecto antimicrobiano contra E. coli, por lo que la mortalidad
de la bacteria bajo este tratamiento fue del 100%. El efecto del péptido DCD-1L contra E. coli es
considerablemente menor con una mortalidad del 4%. Finalmente, se obtuvo una mortalidad del 23% con
las VLPs funcionalizadas con aztreonam (Figura 46-A).
Los tratamientos en S. aureus mostraron un comportamiento similar (Figura 46-B), donde se observó una
mortalidad de bacterias del 100% con el tratamiento de aztreonam. De manera similar, se obtuvo una
mortalidad del 7% con el péptido DCD-1L; sin embargo, se observó una mortalidad significativamente
54
menor con el tratamiento con VLPs funcionalizadas con aztreonam al compararlas con los resultados
observados en E. coli, ya que se obtuvo una mortalidad del 9% en S. aureus, lo cual representa una
disminución de la mortalidad del 14%.
Figura 46. Mortalidad observada en bajo tratamientos antimicrobianos para A) Escherichia coli y B) Staphylococcus aureus.
55
Capítulo 5. Discusión
5.1 Purificación de BMV y CCMV
La optimización del protocolo requirió de dos meses y medio de purificación hasta obtener un rendimiento
de 0.26 mg de CCMV por cada gramo de hoja infectada y 2 mg de BMV por gramo de hoja infectada.
Comparando estos rendimientos con aquellos previamente reportados (Escobedo, D. 2018), se obtuvo un
rendimiento cuatro veces mayor para CCMV y ocho veces mayor para el BMV. Esta mejora puede deberse
a dos cuestiones cruciales: el incremento en la concentración de virus presente en la solución de
inoculación utilizada para infectar las plantas y las modificaciones realizadas en el protocolo de
purificación de virus. Al incrementar la carga viral en la infección, se obtuvieron plantas cuyas hojas
mostraron un patrón de clorosis intenso, síntoma característico de la infección viral. Por otro lado, los
pasos adicionales del protocolo de purificación permitieron recuperar virus previamente descartado. A
partir de esto, se incrementó tanto los virus en las hojas, como virus puro, lo cual mejora el proceso de
obtención de virus.
A pesar de los incrementos en el rendimiento de virus purificado, hubo diferencias importantes en el
rendimiento de los virus del BMV y CCMV. Estas diferencias pueden atribuirse a las condiciones
climatológicas del invernadero, ya que las plantas huéspedes de cada uno de estos virus crecen a
temperaturas distintas. Considerando que los cultivos de Vigna unguiculata y Hordeum vulgare son
realizados en un mismo invernadero, es posible que las condiciones de este mismo se adecuen mejor al
cultivo de Hordeum vulgare por lo que, al momento de realizar la infección, las condiciones de crecimiento
vegetal predispongan una mayor sensibilidad a la infección viral por parte de Hordeum vulgare tal que se
obtenga una mayor carga viral de BMV que de CCMV. Es importante resaltar que el rendimiento de
purificación reportado para el BMV se encuentra dentro de 1 a 3 mg por gramo de hoja, mientras que el
del CCMV es de 0.2 a 0.4 mg por gramo de hoja (Lauffer, M. 1974), por lo que ambos rendimientos se
encuentran dentro de su margen reportado.
56
5.2 Síntesis de VLPs-(DCD-1L)
Con propiedades electrostáticas del virus del BMV y del péptido DCD-1L, se determinó que es posible
sintetizar VLPs donde el péptido estuviera encapsidado en la partícula (VLPs-[DCD-1L]). Esto toma en
cuenta que, en condiciones de pH neutro, el péptido posee una carga neta de -2 y será atraído
electrostáticamente hacia la parte N-terminal de la proteína de cápside del virus.
El análisis de los ensambles de prueba por medio de los ensayos de movilidad electroforética en gel nativo
de agarosa muestra que se requiere una mayor cantidad de proteína de cápside que de péptido para la
encapsidación (Figura 10). Esto concuerda con lo reportado por Comas-García y colaboradores (2012),
donde se observó que la eficiencia de empaquetamiento de ARN de cadena sencilla incrementa cuando la
relación péptido:proteína de cápside es igual o mayor a 1:6. Aquellos ensambles donde la razón de masa
de la proteína de cápside fue mayor a la del péptido, muestran un patrón de migración ideal que sugiere
que se ensamblaron partículas tipo virus (VLPs). Para confirmar esto, se realizaron análisis adicionales
mediante dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.
Los análisis por dispersión dinámica de luz mostraron que, para los ensambles con razones de masa entre
péptido y proteína de cápside 1:3, 1:6, y 1:9, se obtienen partículas con una distribución de tamaño
uniforme en un rango promedio de 20 a 35 nm de diámetro. Para el ensamble realizado a una razón 1:12,
la polidispersión observada sugiere que las partículas presentes no corresponden a las VLPs esperadas.
Este suceso puede atribuirse a que la cantidad de péptido a distribuir como cargo en el ensamblaje es
menor a los casos anteriores, tal que el péptido funge como reactivo limitante.
Las micrografías obtenidas para estos ensambles corroboraron lo observado mediante DLS para el
ensamble con la razón 1:12, donde se observan abundantes partículas rotas y vacías. Es posible que se
ensamblen algunas VLPs con el péptido presente; sin embargo, el resto de la proteína de cápside carece
de un cargo al cual encapsidar, por lo que estas proteínas tienden a formar otras estructuras como dímeros,
trímeros y, en algunos casos, cápsides vacías.
A su vez, el resto de las micrografías mostraron que la mejor distribución de partícula fue lograda al realizar
ensambles con una razón 1:6. Dicho resultado coincide con las observaciones realizadas mediante DLS
dado que, para esta razón, se obtuvo una distribución de tamaño de partícula estrecha que se encontraba
dentro del rango de tamaños esperado. En el caso del ensamble 1:3, el análisis por dispersión dinámica de
luz muestra partículas con diámetros menores que indican la posible presencia de partículas con
57
estructuras distintas a las deseadas, lo cual se confirma en las micrografías donde se muestran numerosas
partículas rotas. Finalmente, para el ensamble 1:9, el incremento en el índice de polidispersión observado
mediante DLS puede ser explicado por sus respectivas micrografías. En ellas se observa que las partículas
formadas se encuentran parcialmente vacías, lo cual puede jugar un papel importante en determinar el
tamaño final de las partículas. Posiblemente, a esta razón, el péptido es insuficiente para obtener
partículas completamente cargadas y se realiza una distribución parcial entre las subunidades de proteína
de cápside durante el proceso de autoensamble.
A partir de este punto, todos los ensambles subsecuentes fueron realizados utilizando una razón entre
péptido y proteína de cápside 1:6. Así mismo, se demuestra que los ensayos de movilidad electroforética
son una herramienta útil para el análisis del ensamble de partículas tipo virus, gracias a que el
autoensamble de estas partículas es dominado por las interacciones electrostáticas entre proteínas.
Inicialmente, los ensambles fueron realizados mediante la metodología estándar previamente descrita,
donde el proceso de ensamble tiene una duración mínima de 32 horas y se requieren 3 litros de soluciones
amortiguadoras para llevar a cabo las diálisis necesarias. Con el fin de optimizar dicha metodología,
durante cerca de 2 meses se realizaron múltiples “ensambles rápidos” donde se eliminó la necesidad de
realizar diálisis. Este nuevo proceso de síntesis de VLPs se hace directamente en un microtubo de 2 mL y
utiliza una dilución 1:2 de la solución donde se mantiene suspendida la proteína de cápside. Esta dilución
es crucial para permitir la atracción electrostática entre el péptido y la proteína de cápside, de tal manera
que la proteína de cápside comienza a rodear al péptido para encapsidarlo. Seguido a ello, la solución es
acidificada directamente al añadir ácido acético para fortalecer las interacciones proteína-proteína que
formarán la partícula tipo virus. Finalmente, se realiza una segunda dilución de la solución donde se está
realizando el ensamble de las VLPs con una solución amortiguadora de ensamble enriquecida con sales
para neutralizar el medio. De esta manera, el tiempo requerido para realizar un ensamble es disminuido
a un plazo máximo de 2 horas y el volumen requerido para el ensamble de 1 mg de proteína de cápside
permanece por debajo de los 10 mL de solución. Esto implica un ahorro significativo tanto de tiempo como
de material, además de simplificar su escalabilidad en caso de desearlo.
El ensayo de movilidad electroforética para el ensamble final confirma que las VLPs se ensamblaron
correctamente, ya que se observó una migración ideal, similar a la del virus nativo. A partir de esto, se
procedió a realizar los geles desnaturalizantes de poliacrilamida para determinar la estequiometría entre
la proteína de la cápside y el péptido encapsidado a través de densitometría. Esta fue realizada mediante
el análisis de la intensidad de las bandas presentes en cada uno de los geles. El uso de múltiples
58
concentraciones ascendentes tanto de péptido como de proteína de cápside permitieron determinar la
relación lineal entre la intensidad de banda y la concentración de proteína de cápside y péptido. Esta
relación permitió determinar que, por 1 µg de proteína de cápside, se encapsidan 0.73 µg de péptido DCD-
1L. Subsecuentemente se logró determinar que se encapsidaron 554.4 moléculas de DCD-1L por cápside.
Estos resultados muestran un balance cercano de cargas entre la cápside y el péptido. La proteína de
cápside presenta 9 cargas e+ que se encuentran en el N-terminal de las proteínas de cápside e interactúan
con 3 moléculas de DCD-1L que poseen 2 cargas e-. Esto implica una relación de 1620 cargas e+ en el
interior de la cápside de la VLP contra 1110 cargas e- con las que contribuyen 555 moléculas encapsidadas
del péptido DCD-1L. La carga negativa del péptido apantalla las cargas positivas del N-terminal de las
proteínas de cápside y, junto con las interacciones electrostáticas proteína-proteína, promueve el
ensamble de VLPs.
5.3 Funcionalización de virus nativo y VLPs
El método de la carbodiimida utilizado para la funcionalización de nuestras partículas virales funciona
activando los grupos carboxilo que se encuentran en la superficie de la cápside del virus. La 1-etil-3-(3-
dimethilaminopropil) carbodiimida, en conjunto con la N-hidroxisuccinimida, promueve la formación de
un enlace covalente con el grupo amino primario de los antibióticos utilizados. Sin embargo, la activación
de los grupos carboxilo también permite la formación de enlaces covalentes entre las cápsides adyacentes.
Esto significa que, conforme incremente la concentración de los agentes para la funcionalización, las
cápsides tienden a aglomerarse. Por ello, es de suma importancia determinar la equivalencia molar ideal
para maximizar la funcionalización de la cápside, mientras se evita obtener una aglomeración importante
de partículas.
Las observaciones realizadas mediante TEM y DLS muestran que el diámetro hidrodinámico del virus
incrementa una vez que es funcionalizado y, por otro lado, a bajas concentraciones de antibiótico (100
equivalentes molares) se promueve una mayor formación de enlaces covalentes entre cápsides tal que la
tasa de aglomeración entre cápsides incrementa. Por estas razones, se continuó trabajando con una
relación de 500 equivalentes molares excedentes de agentes de funcionalización, así como de antibiótico.
A pesar de que indica la presencia de los antibióticos de interés, el gel desnaturalizante de poliacrilamida
permite la observación cualitativa de la integridad de las proteínas de cápside que fueron sujetas al
59
proceso de funcionalización. La presencia de bandas bien definidas en el peso molecular esperado es un
claro indicador de ello, mientras que el barrido observado en pesos moleculares superiores al esperado
sugiere la presencia de proteínas que formaron enlaces covalentes entre sí como se había propuesto
anteriormente. Sin embargo, la cantidad de proteínas que presentan este fenómeno es mínimo por lo que
se mantuvo este método para la funcionalización de las VLPs ensambladas. Así mismo, el incremento
observado en las partículas corresponde a lo que se esperaría al adherir moléculas pequeñas como los
antibióticos, cuyas longitudes teóricas radican de 1 a 1.32 nm. Para el caso del aztreonam, el virus
funcionalizado con este antibiótico presentó un diámetro superior al esperado y probablemente está
relacionado con la presencia de ramificaciones y estructuras cíclicas en esta molécula.
La evaluación entre el uso de distintos medios estabilizantes durante la funcionalización fue realizada para
determinar los efectos a los que las VLPs podrían estar sujetos por el incremento de sales y/o el pH,
provocando un cambio en la fuerza iónica del medio. Como se mencionó anteriormente, las proteínas de
cápside del BMV se disocian en pH alcalino y es de esperarse que las VLPs estén sujetas a dicho fenómeno.
Esto se observó principalmente en la funcionalización donde las VLPs fueron suspendidas en Tris-HCl
20mM pH 7.5 donde, en vez de obtener VLPs funcionalizadas, estas se disociaron. Caso contrario, al utilizar
PBS suplementado con MgCl2 se observa que las partículas funcionalizadas preservan su estructura.
La decisión de suplementar PBS con MgCl2 es debido a que la presencia de iones divalentes de magnesio
(Mg2+) ayuda a estabilizar la cápside antes cambios en el pH (Lucas, R. 2002). Esto implica que, en presencia
de Mg2+, las VLPs pueden encontrarse disueltas en una solución a pH neutro sin sufrir transiciones
estructurales.
5.4 Espectroscopía por ATR-FTIR
Debido a que las técnicas de caracterización utilizadas únicamente permiten realizar análisis cualitativos
de las VLPs y los efectos que estas atraviesan durante su funcionalización con antibióticos, se recurrió a la
espectroscopía por ATR-FTIR con la finalidad de determinar la presencia del antibiótico de interés en las
VLPs. Gracias a la producción de señales características del espectro infrarrojo, nos es posible relacionar
la presencia de ciertos picos en las VLPs funcionalizadas y las VLPs sin funcionalizar, así como con el
antibiótico aztreonam. Particularmente, la coincidencia de picos en 460 y 470 cm-1 entre el antibiótico
aztreonam y las VLPs funcionalizadas sugieren que el antibiótico se encuentra presente en las VLPs. A su
60
vez, las VLPs funcionalizadas mostraron una señal característica para la carbodiimida, por lo que se
comprueba la formación de enlaces covalentes relacionados con la reacción química promovida por dicho
compuesto, tal que tal que las moléculas del antibiótico se adhieren a la superficie del virus. Por lo tanto,
este espectro permite apreciar la adhesión del antibiótico de interés obtenida mediante la modificación
química de la superficie de las VLPs.
Sin embargo, estos resultados son insuficientes para determinar la cantidad de antibiótico presente en las
VLPs y, consecuentemente, nos es imposible establecer una eficiencia de funcionalización para este
proceso. Debido a que la muestra de VLPs en este momento se encuentran a bajas concentraciones (< 1
mg/ml), las señales obtenidas se encuentran en un orden de magnitud que dificulta la elaboración de una
curva de calibración, para determinar la cantidad de moléculas de antibióticos unidas en la superficie de
la VLP.
La caracterización por ATR-FTIR fue realizada en un solo antibiótico debido a limitaciones con la
disponibilidad de péptido para encapsidar en VLPs. Se espera realizar una futura caracterización completa
de VLPs funcionalizadas con los antibióticos restantes. Así mismo, al incrementar la concentración de VLPs,
será posible comparar sus espectros de ATR-FTIR contra una curva de calibración para cada antibiótico y
determinar la concentración de antibiótico presente en las VLPs.
5.5 Estabilidad de las VLPs
Los cambios mínimos en la distribución de tamaño de partícula al momento de la síntesis contra las
partículas analizadas un mes después de su almacenamiento sugieren que las VLPs permanecen estables
bajo condiciones estándares de almacenamiento. Es posible que un porcentaje de la población de
partículas haya atravesado transiciones estructurales, debido al ensanchamiento de la curva de
distribución obtenida un mes después. Estos resultados podrían ser complementados mediante un análisis
por microscopía electrónica de transmisión, donde sería posible observar la morfología de las partículas y
así establecer su tiempo de vida. Mientras tanto, se sospecha que la presencia de Mg2+ en la solución
donde las VLPs se encuentran suspendidas es el factor principal que contribuye a preservar su estabilidad.
Esto concuerda con lo reportado por Lucas y colaboradores (2002), donde la estructura cristalográfica del
virus nativo del BMV muestra que el virus es estabilizado por la presencia de Mg2+ cuando se eleva el pH.
61
Así mismo, se observa un fenómeno similar para las VLPs ensambladas a partir de proteína de cápside de
CCMV. Dicho suceso era esperado debido a las similitudes estructurales entre el BMV y CCMV, ya que este
último también se estabiliza por la presencia de sales divalentes como el Mg2+.
5.6 Ensayo de actividad antimicrobiana
La recuperación del efecto antimicrobiano observado en el antibiótico aztreonam contra ambas cepas
bacterianas puede haberse suscitado por alteraciones en las condiciones de almacenamiento de los
gliceroles de estas bacterias. Es importante resaltar que, desde un inicio, el aztreonam presentó un efecto
bactericida superior al de los antibióticos ampicilina y kanamicina, por lo cual el escenario observado no
puede ser descartado. Desafortunadamente, este incidente impide realizar una comparación acertada del
efecto antimicrobiano de las VLPs contra el antibiótico y el péptido DCD-1L por separado. Sin embargo, es
posible destacar la diferencia de mortalidad entre E. coli y S. aureus al administrar las VLPs funcionalizadas.
Sin embargo, las VLPs presentan un efecto bactericida 14% superior en E. coli en comparación con lo
observado en S. aureus. Esto puede deberse a las diferencias estructurales entre estas bacterias ya que E.
coli carece de una pared celular rica en peptidoglicanos característica en las bacterias Gram-positivas
como S. aureus. Esto puede permitir un incremento en la formación de poros transmembranales en la
membrana bacteriana de E. coli lo cual resulta en una tasa de mortalidad mayor. Esto coincide con lo
reportado por Rincón y colaboradores (2014), donde observaron que algunas cepas de S. aureus
incrementan el grosor de su pared bacteriana. Este engrosamiento detiene la difusión del antibiótico a la
bacteria e inhibe su efecto antimicrobiano.
Al considerar que los resultados obtenidos proceden de un ensayo realizado bajo condiciones óptimas
para el crecimiento bacteriano, la inhibición del crecimiento observado en esta instancia es importante
dado que el agente antimicrobiano se encuentra en competencia directa con el crecimiento exponencial
característico de estos microorganismos. En un ensayo utilizando medio mínimo de crecimiento, se
esperaría un incremento en la inhibición del crecimiento bacteriano, lo que demostraría el potencial de
las nanopartículas tipo virus elaboradas en este proyecto. A su vez, la repetición de este ensayo, utilizando
VLPs funcionalizadas con otros antibióticos como ampicilina y kanamicina, permitiría comparar cambios
en el efecto antimicrobiano. Cabe resaltar que estos últimos ensayos fueron limitados por la disponibilidad
del péptido DCD-1L; sin embargo, los resultados son suficientes para establecer un precedente y exhortar
a continuar con la exploración de esta línea de investigación.
62
Capítulo 6. Conclusiones
Las modificaciones realizadas al protocolo de purificación de virus incrementaron el rendimiento
partículas virales, ocho veces más para BMV y cuatro veces mayor para CCMV, con respecto a los
rendimientos previamente obtenidos en el grupo de investigación.
Se lograron sintetizar nanopartículas tipo virus de CCMV y BMV que contienen el péptido DCD-1L en su
interior. A su vez, fue posible optimizar el protocolo de síntesis de VLPs tal que el volumen de los reactivos
utilizados fue disminuido a volúmenes menores a los 10 mL. Esto también agilizó la reacción,
disminuyendo el tiempo de síntesis de 36 horas a 3 horas lo cual establece un escenario favorable para
escalar el proceso fuera de condiciones de laboratorio.
La variación en la relación de masa entre el péptido y la proteína de cápside produce estructuras distintas,
donde incrementar la masa de proteína de cápside deja de favorecer la formación de VLPs íntegras y
produce partículas rotas.
Las VLPs obtenidas en condiciones ideales presentaron una geometría cuasi-esférica con una distribución
de tamaño de una población predominante con número de triangulación igual 3. Este valor fue
determinado mediante la medición de tamaño de partículas a través de dispersión dinámica de luz y
microscopía electrónica de transmisión, donde el tamaño promedio de las VLPs fue de 29.69 nm.
Se determinó que hay 554.4 moléculas de DCD-1L por cada VLP mediante análisis por densitometría.
Es posible funcionalizar la superficie de la cápside del virus nativo con antibióticos, así como de las VLPs
mediante el método de la carbodiimida. Se comprobó la presencia del antibiótico aztreonam mediante
espectrometría ATR-FTIR, mientras que los análisis por DLS y TEM determinaron que las partículas
mantienen su estructura y solo presentan un incremento en el diámetro menor a 10 nm.
Suspender las VLPs en una solución amortiguadora enriquecida con Mg2+ estabiliza las VLPs para su
funcionalización. Así mismo, la medición adicional por DLS sugiere que las VLPs se mantienen estables en
esta disolución a los 30 días de su almacenamiento a 4 °C. Esto aplica tanto para BMV VLPs como para
CCMV VLPs.
63
De manera resumida, se observó que el péptido DCD-1L también puede ser encapsidado en CCMV al
replicar las condiciones de síntesis de VLPs utilizadas para el BMV. Similarmente, el análisis por DLS mostró
que la población de estas nanopartículas permanece estable un mes tras su almacenamiento a 4 °C. Las
similitudes estructurales del CCMV con el BMV sugieren que, el virus nativo de CCMV también puede ser
funcionalizado con antibióticos mediante el método de la carbodiimida, por lo cual atraviesa la misma
formación de enlaces covalentes entre proteínas de cápside dada por la activación de los grupos carboxilo
de la superficie de la cápside del virus como fue observado mediante SDS-PAGE. Esto incita a explorar con
profundidad el potencial del CCMV como base para VLPs antimicrobianas y comparar su efectividad contra
las VLPs sintetizadas a través del BMV.
El ensayo de actividad antimicrobiana muestra que las VLPs funcionalizadas con el antibiótico aztreonam
poseen un efecto antimicrobiano superior sobre Escherichia coli en comparación con Staphylococcus
aureus. Futuros experimentos podrán determinar el potencial real de estas nanopartículas dado que este
es el primer trabajo de encapsidación de un péptido antimicrobiano en partículas tipo virus.
64
Literatura citada
Ali and M. J. Roossinck, Rapid and efficient purification of cowpea chlorotic mottle virus by sucrose cushion ultracentrifugation. J. Virol. Methods, 2007, 141, 84 —86
Annamalai, P., & Rao, A. L. N. 2006. Packaging of brome mosaic virus subgenomic RNA Is functionally coupled to replication-dependent transcription and translation of coat protein. Journal of Virology, 80(20), 10096–10108. https://doi.org/10.1128/JVI.01186-06
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