actividad bactericida de péptidos antimicrobianos
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Actividad bactericida de péptidos antimicrobianos sintetizados a partir
del transcriptoma del cnidario Hydractinia symbiolongicarpus
Sandra B. Martínez1,2, Luis Fernando Cadavid2 & Martha Vives1 1Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, Bogotá, Colombia.
2Universidad Nacional de Colombia. Instituto de genética. Laboratorio de Inmunología evolutiva e
Inmunogenética.
Abstract:
Anitimicrobial peptides (AMPs) constitute a unique and diverse group of proteins that are
part of the immune system of many organisms. Synthetic AMPs predicted from the
transcriptome of the cnidarian Hydractinia symbiolongicarpus were tested against bacteria
present in human infections (Staphylococcus aureus (ATCC25923), S. aureus (ATCC
25423),Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), Acinetobacter
baumannii, Enterobacter aerogenes and a hospital isolation strain of Pseudomonas
aeruginosa). The peptides showed activity against both gram positive and gram negative
bacteria, revealing a broad spectrum of action and relatively low minimum inhibitory
concentrations. In addition, no hemolytic effect on animal cells was observed in any case.
The alignments revealed that the peptides tested have similarity levels, although not
significant, with previously reported bacterial proteins.
Resumen:
Los péptidos anitimicrobianos (AMPs) constituyen un grupo único y diverso de proteínas
que hacen parte del sistema inmune de muchos organismos. AMPs sintéticos predichos a
partir del transcriptoma del cnidario Hydractinia symbiolongicarpus fueron probados contra
bacterias presentes en infecciones humanas (Staphylococcus aureus (ATCC25923), S. aureus
(ATCC 25423),Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853),
Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes y una cepa de Pseudomonas aeruginosa
de aislamiento hospitalario). Los péptidos mostraron actividad tanto en bacterias gram
positivas como en gram negativas, revelando un amplio espectro de acción y concentraciones
mínimas inhibitorias relativamente bajas. Además, no se observó en ningún caso efecto
hemolítico sobre células animales. Los alineamientos revelaron que los péptidos probados
tienen niveles de similitud, aunque no significativos, con proteínas bacterianas anteriormente
registradas.
Palabras clave: Hydractinia symbiolongicarpus, péptido antimibrobianos sintéticos,
ensayos antimicrobianos.
Introducción:
Hydractinia symbiolongicarpus es un cnidario perteneciente al grupo de los Hydrozoos cuyas
colonias viven asentadas sobre las conchas de los cangrejos ermitaños (Cunningham et al.,
1991). La facilidad de cultivo de Hydractinia, su ritmo de crecimiento y propiedades
biológicas lo convierten en un modelo de investigación apropiado para realizar diversos
estudios genéticos, entre los que se pueden resaltar estudios de inmunidad en invertebrados
(Zárate et al., 2019).
Las enfermedades coralinas son un problema creciente en el que se está enfocando la atención
científica debido a las tasas alarmantes de desaparición de arrecifes coralinos (Raymundo et
al., 2008). Factores como el calentamiento global, la sobrepesca, la contaminación y
acidificación del agua aumentan la predisposición a adquirir enfermedades de carácter
infeccioso, lo que ha despertado el interés sobre el sistema inmune del phylum Cnidaria
(Raymundo et al., 2008). Diversos estudios realizados en los últimos años, han revelado
mecanismos de acción del sistema inmune en cnidarios. Se han identificado función y
estructura de moléculas fundamentales en respuesta inmune y genes involucrados en la
misma (Miller et al., 2007; Palmer & Traylor-Knowles, 2012; Zárate, 2013; Rosa et al.,2010;
Vidal-Dupiol et al., 2011; Dishaw et al., 2005).
Los péptidos anitimicrobianos (AMPs) constituyen un grupo único y diverso de proteínas
que hacen parte del sistema inmune, y usualmente su extensión es menor a 100 aminoácidos
(Brogden, 2005). Su sistema de acción consiste en desestabilizar la membrana de los
patógenos, causando la muerte de la célula. Los AMPs tienen una amplia distribución dentro
de distintos grupos animales y vegetales, lo que sugiere que son una herramienta
evolutivamente antigua (Zasloff, 2002). Además, se ha demostrado que son altamente
efectivos contra diferentes agentes patógenos como bacterias, virus, hongos y protozoos
(Mitta et al., 1999; Otero-Gonzalez et al., 2010). Múltiples ensayos realizados a partir de
aislamientos de invertebrados marinos han demostrado que los AMP tienen un papel
importante en el sistema inmune de filos basales como los cnidarios (Otero-Gonzalez et al.,
2010; Mariottini & Grice, 2016) y que dentro de ese grupo se han encontrado y aislado
toxinas en la medusa común Aurelia aurita y Chlorohydra viridissima y péptidos con
actividades antimicrobianas en Hydra y en otros cnidarios como Actinia equina y Anemonia
sulcata (Bosch et al., 2009; Ovchinnikova et al., 2006; Sher et al., 2005; Barresi et al., 2015).
Estudios previos en el grupo de inmunología evolutiva de la Universidad Nacional
condujeron a la secuenciación del trascriptoma de H. symbiolongicarpus. Luego de someter
colonias de Hydractinia a un reto inmunológico, se realizó un estudio transcriptómico de su
respuesta inmune (Zárate et al., 2019; Zárate, 2013). A partir del transcriptoma resultante, se
predijeron potenciales péptidos antimicrobianos mediante análisis in silico. En dichos
análisis el proteoma predicho se sometió a herramientas bioinformáticas que filtraban las
secuencias basadas en propiedades fisicoquímicas propias de los AMPs (longitud, punto
isoeléctrico, carga neta y capacidad de agregación in vivo e in vitro) y se identificaron
posibles candidatos (Suárez, 2017). Cuatro de 156 candidatos a péptidos antimicrobianos se
sintetizaron químicamente.
En este proyecto de investigación se realizaron ensayos antimicrobianos para 4 de los
candidatos a AMPs predichos por Suárez, 2017. Dichos péptidos fueron evaluados para
detectar actividad contra bacterias. Las cepas escogidas para realizar los ensayos son especies
con una amplia distribución, conocidas por su patogenicidad y presencia frecuente en
infecciones comunes en humanos. Se determinó actividad antimicrobiana por ensayos de
difusión radial y se estableció una concentración mínima inhibitoria para cada péptido.
Adicionalmente, se evaluó la actividad hemolítica de los péptidos sobre células sanguíneas.
Marco teórico:
A. Hydractinia symbiolongicarpus:
Hydractinia symbiolongicarpus es un cnidario colonial perteneciente a la clase Hydrozoa. Su
distribución geográfica es principalmente alrededor de las costa este de Norte América. En
su hábitat natural H. symbiolongicarpus suele encontrarse sobre las conchas de gasterópodos
habitadas por cangrejos ermitaños, con quienes comparte una estrecha relación evolutiva
(Cunningham et al., 1991). Es una especie dióica y tiene un ciclo de vida con una fase sésil
predominante (Müller & Leitz, 2002) . La fertilización es externa y produce una larva plánula
móvil que las sigue señales químicas dadas por moléculas de quorum sensing de biofilms
bacterianos presentes en las conchas de los cangrejos ermitaños (Franco et al., 2019). Allí se
asienta e inicia un proceso de metamorfosis que concluye en la formación de un pólipo
primario, que será el fundador de una colonia (Müller & Leitz, 2002). El sistema de
Hydractinia se componen de una serie de canales gastrovasculares llamados estolones,
sistema compartido por toda la colonia. Los pólipos son polimórficos y en una colonia se
pueden encontrar cuatro tipos: gastrozooides, que son pólipos alimenticios, gonozooides,
pólipos encargados de la reproducción y, con menor frecuencia, dactilozoides y
tentaculozoides que son pólipos de defensa (Frank et al., 2001).
El género Hydractinia, al ser fácilmente cultivable en el laboratorio, representa un excelente
modelo de estudio. Esto sumado a su alta adaptabilidad a ambientes no naturales, su
velocidad de crecimiento y corto ciclo de vida lo hace un buen candidato para estudios en
biología del desarrollo, genética, ecología e inmunología (Frank et al., 2001).
La respuesta inmune de los cnidarios está mediada por las células epiteliales, que actúan
como barreras físicas, reconociendo moléculas exógenas e interactuando con simbiontes
(Augustin & Bosch, 2010). El creciente interés en el sistema inmunológico de estos
organismos reside en que los cnidarios comparten muchas de las familias de genes presentes
en bilatelaria (Putnam et al., 2007; Miller et al., 2005), y conserva otras que han sido perdidas
en otros modelos genéticos de artrópodos y nemátodos (Miller et al., 2005). Esto lo convierte
en un modelo perfecto para elucidar aspectos evolutivos del sistema inmune animal.
Estudios inmunológicos en Hydractinia han identificado moléculas asociadas al
reconocimiento inmune (Schwarz et al., 2007, 2008; Lopez et al., 2011) y se han encontrado
también los genes responsables de receptores de alorreconocimiento (Cadavid et al., 2004;
Nicotra et al., 2009; Rosa et al., 2010). Estudios más recientes han secuenciado y catalogado
el transcriptoma de H. symbiolongicarpus (Zárate et al., 2019).
Parte del sistema inmune en cnidarios se encarga de mediar la interacción entre el organismo
y sus simbiontes y parásitos. En este modulo efector se han encontrado moléculas como
proteínas y péptidos antimicrobianos que regulan las poblaciones de hongos y bacterias que
son patógenas para el organismo (Augustin & Bosch, 2010).
B. Péptidos antimicrobianos:
Los AMPs son moléculas que hacen parte fundamental del sistema inmune y cuentan con
una amplia distribución y diversidad dentro de grupos animales y vegetales (Zasloff, 2002).
Se ha demostrado que son altamente efectivos contra diferentes agentes patógenos como
bacterias, virus, hongos y protozoos (Mitta et al., 1999; Otero-Gonzalez et al., 2010).
A pesar de su antigüedad, los AMPs se han mantenido como un mecanismo efectivo de
defensa inmune debido a que su blanco de acción es una característica de la membrana celular
compartida entre la mayoría de agentes antimicrobianos y distintiva entre dichos organismos
y las células de organismos multicelualres como animales y plantas (Zasloff, 2002). El
mecanismo de acción consiste en la interacción entre los lípidos y la membrana, lo que altera
la estructura membranal al desplazar los lípidos que la conforman. Seguido, en algunos casos,
por la entrada del péptido a la célula e irrumpiendo con las actividades normales de la célula
(Matsuzaki, 1999 & Shai, 2002).
La estructura fundamental compartida entre distintas clases de péptidos antimicrobianos
consiste en el diseño anfipático. Esto permite a la molécula adoptar una forma en la que
grupos de aminoácidos cargados positivamente (catiónicos) e hidrofóbicos estén organizados
espacialmente en zonas discretas de la molécula, estas zonas son las que interactuarán con la
membrana de la célula blanco (Zasloff, 2002)
A pesar de la alta diversidad de péptidos antimicrobianos que los organismos son capaces de
producir, estudios más recientes se han enfocado en péptidos sintéticos obtenidos de péptidos
naturales pero con estabilidad, selectividad o actividad antimicrobiana mejorada (Chen et al.
1988; Carmona et al. 2013; Mura et al. 2016). Así mismo, se han realizado aproximaciones
in silico para predecir posibles AMPs en un transcriptoma (Suárez, 2017; Houyvet et al.,
2018)
Basados en el modelo anterior, varias características como longitud, carga y punto
isoeléctrico han sido investigadas en AMPs (Torrent et al., 2011) con el propósito de
determinar moléculas fundamentales en la respuesta inmune de invertebrados y,
eventualmente, reconocer nuevos candidatos a antibióticos para sobreponerse al creciente
problema de la resistencia antimicrobiana a antibióticos tradicionales.
Se ha sugerido que el grupo Cnidaria es una buena fuente de compuestos con importancia en
bioprospección (Rocha et al., 2011) y dentro del cual se han encontrado y aislado varios
péptidos antimicrobianos. En Hydra magnipapillata se han reportado potentes péptidos
antimicrobianos presentes en los epitelios endo y ectodermales que contrarrestan el efecto de
patógenos externos y previenen su entrada al cuerpo (Bosch et al., 2009). Además, en este
mismo grupo se identificaron péptidos que mostraban un amplio espectro de acción contra
patógenos bacterianos humanos (Augustin et al., 2009). En cnidarios marinos como Actinia
equina y Anemonia sulcata se han purificado también AMPs con actividad antifúngica
(Barresi et al., 2015) y péptidos con actividad antibacteriana en Aurelia aurita (Ovchinnikova
et al., 2006).
Diferentes proteínas con capacidad de acción antimicrobiana han sido estudiadas y se han
reconocido ciertas características compartidas entre ellas a las que se atribuyen dicha
capacidad bactericida. Teniendo en cuenta lo anterior, fue posible identificar candidatos a
péptidos antimicrobiamos a partir de estudios transcriptómicos, como el realizado
previamente en H. symbiolongicarpus después de un reto bacteriano (Zárate, 2013; Zárate et
al., 2019). En el estudio de Suárez, 2017 se obtuvo un proteoma basado en el marco de lectura
más probable, que se sometió a análisis de propiedades fisicoquímicas (longitud, punto
isoeléctrico, y carga neta) mediante herramientas como EMBOSS y PEPSTATS.
Posteriormente, al evaluar la solubilidad de las secuencias en medios acuosos, así como la
capacidad de formar agregados en membranas biológicas con alto contenido lipídico
(AGGRESCAN y TANGO) fue posible identificar candidatos de péptidos con dominios
antimicrobianos. Estos fueron los péptidos probados en el presente estudio.
Objetivo general:
- Probar los efectos bactericidas de cuatro péptidos antimicrobianos sintéticos,
predichos a partir del transcriptoma de Hydractinia symbiolongicarpus.
Objetivos específicos:
- Realizar ensayos de difusión radial con los 4 péptidos sintéticos usando 3 cepas de
bacterias gram positivas y 4 de gram negativas.
- Determinar concentración inhibitoria mínima (IC50) de los péptidos
antimicrobianos sobre cada una de las cepas utilizadas.
- Evaluar posible acción hemolítica de los péptidos antimicrobianos.
Metodología:
a. Péptidos:
Cuatro péptidos antimicrobianos predichos del transcriptoma de Hydractinia
symbiolongicarpus fueron obtenidos sintéticamente a partir de predicciones in silico
realizadas por Diego Suárez de la Universidad Nacional de Colombia (Suárez, 2017). Los
péptidos liofilizados fueron resuspendidos en agua destilada desionizada hasta alcanzar una
concentracion de 200μg/ml y mantenidos a – 4ºC hasta el momento de ser usados. En los
casos en los que la resuspensión no fue efectiva utilizando agua, se adicionó ácido acético al
30% hasta llevar el péptido a una concentracion de 200μg/ml.
b. Cultivos bacterianos:
Para investigar la actividad de los péptidos sintetizados se utilizaron cultivos bacterianos
provenientes del cepario no registrado del laboratorio de Microbiología de la profesora
Catalina Arévalo de la Universidad Nacional. Basados en su patogenicidad y frecuencia en
infecciones humanas se escogieron las siguientes cepas de referencia estándar:
Staphylococcus aureus (ATCC25923), S. aureus (ATCC 25423), Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), Acinetobacter baumannii,
Enterobacter aerogenes y adicionalmente se obtuvo una cepa de Pseudomonas aeruginosa
de aislamiento hospitalario. Las cepas escogidas para realizar los ensayos son especies con
una amplia distribución, conocidas por su patogenicidad y presencia frecuente en infecciones
humanas, lo que indica que son constantemente expuestas a antibióticos tradicionales.
c. Ensayos antimicrobianos: Difusión radial
La actividad antimicrobiana de los AMPs se medió con ensayos de difusión radial (Steinberg
& Lehrer, 1997). Primero, las células bacterianas fueron cultivadas a 37ºC por 18h en un
medio de triptona [30g/L]. Se inocularon 100μl en 50ml de medio de triptona fresco e
incubados por 2.5h adicionales. Las bacterias se centrifugaron a 2800rpm por 10min a 4ºC.
Se realizó un lavado con 10ml de buffer fosfato de sodio (pH 7.4) 10mM frío (repitiendo el
ciclo de centrifugado) y fueron resuspendidas en 5ml del mismo buffer. La solución fue
inoculada en 10ml de medio líquido con 50ml de buffer de fosfato de sodio 100mM, 5ml de
medio de triptona y 5g de agarosa previamente autoclavado y mantenido en baño a 42ºC.
Posteriormente, el agar con las bacterias inoculadas fue vertido en una caja de Petri y
solidificado. 5μl de cada péptido resuspendido y controles (agua – ampicilina [100mg/ml])
se añadieron a pozos con 3mm de diámetro.
Luego de incubar a 37ºC por 3h para permitir que los microorganismos se difundieran, 10 ml
de medio de triptona [60g/L] con 10gr de agarosa fueron añadidos. Las cajas se incubaron a
37ºC nuevamente durante toda la noche y a la mañana siguiente los halos de inhibición fueron
medidos.
- Ensayos antimicrobianos: Concentración mínima inhibitoria (CMI)
La concentración mínima inhibitoria de determinó siguiendo métodos reportados
anteriormente (Steinberg & Lehrer, 1997). Para ello se incubaron las bacterias en medio
líquido de soya triptona (TSB) hasta que las bacterias se encontraban en fase exponencial.
Este cultivo fue centrifugado y resuspendido en TSB a una densidad óptica de 0,04 a 600nm.
Se realizaron diluciones seriadas (1:2) de los cuatro péptidos a partir del stock a 200μg/ml
(100μg/ml, 50μg/ml, 25,5μg/ml, 12,25μg/ml). Posteriormente se sirvio cada una en placas de
ELISA. La solución bacteriana preparada anteriormente se inoculó a las soluciones de
péptido. Las placas se incubaron durante toda la noche y luego se midió la densidad óptica
nuevamente. El análisis de los datos del ensayo de CMI se realizaron en el programa Prime
8 que, basado en las curvas de absorbancia, establece una concentración a la cual el péptido
ha inhibido el crecimiento a la mitad usando como referencia el control sin inhibidor. A este
valor se le denomina IC50 y es reportado en M.
d. Ensayos hemolíticos
Para verificar que los péptidos no tuvieran actividad hemolítica, 3mL de sangre humana se
resuspendieron en 14 mL de Buffer PBS pH 5.7. La mezcla se centrifugó a 500g por 10 min
a 4ºC y luego de remover el sobrenadante se realizaron 4 lavados con 14mL de PBS. Luego
del lavado final se tomaron 200l de sangre del fondo del tubo y fueron añadidos a 9.8mL
de PBS. Para probar hemólisis se utilizaron las mismas diluciones de los péptidos utilizadas
en los ensayos de concentración mínima inhibitoria.
Se añadieron 50L de la solución de sangre a 100L de solución de péptido en cada una de
las concentraciones preparadas (200μg/ml,100μg/ml, 50μg/ml, 25,5μg/ml, 12,25μg/ml) y
adicionalmente se realizó un control con reactivo para purificación FTA de GE. Las muestras
se incubaron media hora a 37ºC y luego fueron centrifugadas a 2500g por 6 min. Se
removieron 75l del sobrenadante cuidadosamente y se pusieron en una placa de ELISA para
medir su absorbancia a 540nm. Se realizó un análisis estadístico ANOVA para medir
diferencias significativas entre tratamientos y concentraciones.
e. Análisis:
Para evaluar similitud de los péptidos con AMPs reportados se realizó un blast en Uniprot.
Además, se realizaron análisis estructurales con el fin de determinar posibles explicaciones
a la actividad antimicrobiana de los péptidos. Las propiedades estructurales de las secuencias
fueron examinadas con InverPep (Gómez et al., 2017) y su análisis se realizó con Heliquest
(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/), programa que permitió visualizar la distribución espacial de
los aminoácidos y la disposición que tienen los residuos de los mismos.
Resultados y discusión:
- Ensayos antimicrobianos: Difusión radial
Los resultados de los ensayos de difusión se resumen en la Tabla 1. Los péptidos 1, 3 y 4
mostraron actividad tanto en bacterias gram positivas como en gram negativas, revelando un
amplio espectro de acción. Los halos de mayor tamaño fueron los correspondientes a los
pozos 1 y 3. El péptido 2 solo mostró actividad contra A. baumannii. En las cepas escogidas
se realizó un ensayo control en el que se midió el halo para 5μl de ampicilina a 100 mg/ml,
concentración recomendada para stock y trabajo con microorganismos. En todos los casos el
efecto del péptido fue mayor al de la ampicilina. El área del halo era claro y medible para el
caso de los péptidos mientras que la ampicilina no inhibía el crecimiento bacteriano. Estos
resultados sugieren que el efecto antimicrobiano de los péptidos responde a un mecanismo
de acción mas efectivo contra el que las cepas no han desarrollado resistencia. A diferencia
de los péptidos antimicrobianos, la ampicilina afecta la síntesis de componentes
fundamentales de la pared celular. Al impedir la adecuada estructuración de la pared, la
ampicilina ocasiona la lisis de la bacteria como último término (Peechakara, et al., 2019). Por
otro lado, los péptidos actúan activamente desestabilizando la membrana celular y matando
las bacterias sin necesidad de esperar la siguiente generación (Zasloff, 2002).
- Ensayos antimicrobianos: Concentración mínima inhibitoria
La determinación de concentración mínima inhibitoria se relizó para los péptidos que
mostraron actividad antimicrobiana en el ensayo anterior. Los resultados se muestran en la
Tabla 1. La cepa de aislamiento hospitalario muestra valores particularmente bajos, así como
la cepa de Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853). Para el ensayo de crecimiento líquido se
utilizó una alta proporción péptido-bacteria (1:1) lo que podía explicar la su alta eficiencia
inhibiendo el crecimiento.
Tabla 1. Resumen resultados de ensayos antimicrobianos. Columna de EDR: ensayos de difusión radial
medido en unidades de inhibición correspondientes a mm. Columna de IC50 muestra concentraciones
inhibitorias mínimas en M. Los signos – se muestran en los casos en los que no hubo inhibición y * en
los que la información obtenida no fue confiable por falta de consistencia en las réplicas.
Bacterias gram negativas
Enterobacter
aerogenes
Acinetobacter
baumannii
Pseudomonas
aeruginosa
P.aeruginosa
Hospitalaria
EDR
[mm]
IC50
[M]
EDR
[mm]
IC50
[M]
EDR
[mm]
IC50
[M]
EDR
[mm]
IC50
[M]
AMP1 - - 15.19 39.41 7.83 4.60 6.85 7.13
AMP2 - - 9.12 58.53 - - - -
AMP3 8.29 10.66 * 9.040 6.13 - 4.98 8.19
AMP4 5.09 35.93 * 28.82 4.64 5.68 4.20 6.20
Bacterias gram positivas
Staphylococcus
aureus
ATCC25423
Staphylococcus
aureus
ATCC25923
Staphylococcus
epidermidis
EDR
[mm]
IC50
[M]
EDR
[mm]
IC50
[M]
EDR
[mm]
IC50
[M]
AMP1 * 47.67 6.89 13.93 5.65 14.78
AMP2 * 33.84 - - - -
AMP3 * 16.37 9.67 34.62 3.42 39.32
AMP4 * 13.31 4.17 9.091 2.02 7.07
- Ensayos hemolíticos
Los resultados de los ensayos hemolíticos se muestran en la Figura 1. Estadísticamente no se
encontró diferencia significativa en el efecto hemolítico entre las diluciones y ninguno de los
péptidos (p-value > 0,05). Sin embargo, la diferencia fue significativa entre FTA y todos los
péptidos en cada una de sus concentraciones. Esto sugiere que los péptidos probados no
producen lisis celular y que este efecto no cambia a medida que aumenta su concentración.
Fig 1. Resultados de ensayos hemolíticos mostrando porcentaje de hemólisis para los controles y las
diferentes concentraciones de péptido.
- Alineamientos
Los resultados de los BLAST en Uniprot obtenidos para cada uno de los péptidos se resumen
en la Tabla 2. Se encontró para el péptido 1 una similitud del 75% y un e-value de 7e-1 con
una proteína bacteriana sin caracterización proveniente de Gammaproteobacteria. Además,
el Blast mostró 11 alineamientos con valores de similitud entre 75% y 50%. Todas las
secuencias correspondían a proteínas bacterianas de diversos clados. Entre las secuencias
alineadas con el péptido 1 se encontraban proteínas no caracterizadas de Sphingobacterium
spiritivorum (ATCC33300) (92,3% - E-value de 19.5e-1), tranferasas Polaribacter
butkevichii (57,1%), una proteína de señalización para quimiotaxis en Leptospira
wolbachii (68,4%), proteína de membrana de E. coli (50%), glicosil transefrasa familia 2
Tenacibaculum sp. (68,4%), proteína con dominio PRD Lactobacillus sp. (66,7%) y ligasa
o-antígeno Natronincola peptidivorans (57,1%). En ningún caso se obtuvieron e-values
significativos.
Para el péptido 2 no se encontraron secuencias con nivel de similitud significativo.
Por otro lado, para el péptido 3 se encontraron porcentajes de identidad de 100%
correspondientes a hidrolasas de la bacteria marina del género Maribacter y proteínas con
dominio NACHT de cianobacterias del género Nostoc sp (E-value 6.1). Otros 17
alineamientos mostraron similitud con la secuencia del péptido 3, porcentajes de identidad
varían entre 76-51% y e-values 2e-1 – 8.6.
El Blast del péptido 4 mostró un porcentaje de identidad del 83.8% con una proteína sin
caracterizar de la bacteria Bernardetia litoralis, 76,9% de similitud con una proteína sin
caracterizar de bacterias de la familia Puniceicoccaceae, y 75% con una secuencia
metagenómica de muestras de fuentes hidrotermales. A pesar de los porcentajes de similitud,
los e-values no fueron significativos. En ningún caso se obtuvo similaridad con secuencias
de origen animal, ni organismos filogenéticamente cercanos al modelo Hydractinia
symbiolongicarpus.
PÉPTIDO ID BLAST E-VALUE
AMP 1 Proteína sin caracterizar
Gammaproteobacteria bacterium
7e-1
AMP 2 No se encontraron secuencias con
porcentaje significativo de
similaridad
AMP 3 Proteína sin caracterizar
Peptoniphilus harei
1.7e-1
AMP 4 Proteína sin caracterizar
Bernardetia litoralis
5
Tabla 2. Resumen de BLAST para cada péptido. Alineamientos realizados en Uniprot.
- Análisis estructurales
Los resultados del análisis estructural de los péptidos se muestran en la Figura 2. En dos
casos se puede identificar una región hidrofóbica clara a la que se podría atribuir la actividad
antimicrobiana. Sin embargo, esta region definida está ausente en uno de los péptidos con
mayor eficiencia y espectro, i. e. péptido 3.
Análisis previos a la estructura de péptidos antimicrobianos reportados indican que muchos
de los AMPs parecen tener una vía de acción específica que consiste en la permebealización
de las membranas sin que la interacción sea mediada por un receptor (Tossi et al., 2000). Para
que dicha interacción ocurra son necesarios dos requisitos funcionales: el péptido debe tener
una carga positiva que facilite su interacción con la superficie cargada negativamente del
microorganismo. Además, debe tener la capacidad de formar estructuras anfipáticas que
permitan su incorporación en la membrana (Tossi et al., 2000). Este segundo requisito, sin
embargo, representa un punto de mayor flexibilidad ya que no se restringe a una organización
secundaria específica y permite varias conformaciones estructurales distintas. Las hélices-
y láminas- representan un arreglo estructural particularmente exitoso, siendo las primeras
las más abundantes y las más ampliamente distribuídas (Matsuzaki, 1999). Los péptidos
probados comparten estas dos características y los cuatro presentan una alta tendencia a
formar hélices-.
Fig 2. Diagrama de la estructura en hélice de los péptidos. Señalados en amarillo están los residuos
hidrofóbicos; en azul los residuos básicos; en verde los residuos especiales; en rojo los residuos ácidos y
en morado y rosado los aminoácidos polares. La flecha indica el momento hidrofóbico. Los arcos rojos
señalan la fase hidrofóbica del péptido. Todos los péptidos tienen carga neta positiva.
Conclusiones:
La búsqueda y predicción de péptidos antimicrobianos nuevos a partir de herramientas
bioinformáticas representa una herramienta útil en bioprospección, basados en las
características fisicoquímicas compartidas entre ellos es posible implementar el diseño,
desarrollo y de nuevos péptidos con posible uso antibiótico.
Se esperaba que los péptidos fueran del cnidario. Sin embargo, los alineamientos mostraron
mayor similitud con péptidos bacterianos, lo que sugiere que pueden existir simbiontes
bacterianos dentro de las colonias que no son discriminados al momento de crear el
transcriptoma. Se requiere mayor estudio de estos simbiontes para elucidar su función y
acción en el momento en que se compromete el sistema inmune de la colonia de Hydractinia.
Los péptidos probados, a excepción del AMP2, mostraron un amplio espectro de acción
bactericida, actuando sobre bacterias gram negativas y gram positivas. Se observó efecto de
inhibición del crecimiento incluso en cepas resistentes a antibióticos tradicionales sin inducir
hemólisis, mostrando además un valor bajo de CMI. A futuro se puede considerar realizar
pruebas en cultivos celulares y ensayos que prueben si los péptidos aquí descritos inducen
mutagénesis en ellas, esto con el fin de determinar si tienen alto especificidad en el blanco
de acción.
Referencias:
Augustin, R., Anton-Erxleben, F., Jungnickel, S., Hemmrich, G., Spudy, B., Podschun, R.,
& Bosch, T. C. (2009). Activity of the novel peptide arminin against multiresistant human
pathogens shows the considerable potential of phylogenetically ancient organisms as drug
sources. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(12), 5245-5250.
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ANEXOS:
Fotos de los ensayos de difusión radial (de izquierda a derecha; arriba hacia abajo)
Pseudomonas aeruginosa aislamiento hospitalario, S. aureus, E. aerogenes, S. epidermidis,
P. aeruginosa y A. baumannii.