cap 1. - neuroimagen microscópica

INTRODUCCIÓN

La neuroimagen microscópica consiste en la observa-ción del tejido nervioso a través de sistemas ópticos oelectrónicos que permiten obtener imágenes a gran au-mento para el estudio de su microestructura y organiza-ción. Con este fin se emplean microscopios de campoclaro, de fluorescencia, confocal y multifotón, que em-plean luz para la obtención de imágenes y que permitenuna aproximación a la estructura tisular y celular del sis-tema nervioso. El microscopio electrónico resuelve losproblemas de resolución que origina el uso de luz y utili-za radiación electrónica para obtener grandes magnifi-caciones y resolución a nivel molecular para desvelar laorganización subcelular. Estos sistemas de microscopianecesitan un procesamiento previo del tejido, y se apo-yan en el empleo de técnicas de tinción y marcaje selecti-vo de las muestras a estudiar, que permiten diferenciarlos distintos componentes del tejido nervioso y estudiarsu distribución, sus características morfológicas y bioquí-micas, sus interacciones sinápticas y su fisiología.

En las últimas décadas, el desarrollo de marcadoresfluorescentes compatibles con la fisiología celular, hapermitido la observación del tejido vivo, tanto in vivo1

como in vitro,2 empleando sistemas de microscopia defluorescencia, particularmente el microscopio confocaly multifotón. Esta aproximación permite visualizar la di-námica de muchos procesos biológicos como la res-puesta fisiológica celular en tiempo real, la migración

neuronal o la sinaptogénesis durante el desarrollo cere-bral, y de esta forma obtener una información muchomás completa acerca del funcionamiento del sistemanervioso. En este capítulo se sintetizan los fundamentosde los distintos sistemas de microscopia, sus capacida-des y limitaciones, y se describen también las princi-pales técnicas empleadas en neurobiología para iden-tificar selectivamente los diferentes componentes delsistema nervioso y estudiar su estructura, organización,y fisiología.

PREPARACIÓN DEL TEJIDO PARA MICROSCOPIA

El estudio microscópico del tejido nervioso implica unapreparación de las muestras que incluye los pasos descri-tos a continuación.

FIJACIÓNProcedimiento que impide que se produzcan fenóme-nos de degeneración post mortem, y permite, a su vez, quela estructura del tejido se mantenga de forma muy simi-lar a como es en vivo. La fijación se consigue con la in-mersión o perfusión del tejido con aldehídos como elformaldehído, paraformaldehído y glutaraldehído, queestablecen puentes moleculares entre las proteínas es-tructurales y solubles del tejido, insolubilizándolas e in-activando las enzimas que darían lugar a la autólisis celu-lar, con lo que se preserva la estructura del tejido. Seemplean distintos fijadores en función de las técnicasque se quiera emplear en el tejido, de modo que una fija-ción suave preservará gran parte de la actividad enzimá-tica (v. «Técnicas histoquímicas»), mientras que una fi-jación normal (4% paraformaldehído) puede inactivaralgunas enzimas pero conserva la mayoría de la antigeni-

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NEUROIMAGENMICROSCÓPICA

J. I. Arellano Cabornero

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1 In vivo: término latino que se emplea en biología para describir los experi-mentos u observaciones realizados en un animal vivo.2 In vitro: término latino que se utiliza para describir los experimentos u ob-servaciones realizados en tejido biológico que ha sido aislado del organismoy mantenido vivo en un sustrato adecuado.

cidad del tejido (v. más adelante «Inmunohistoquími-ca»), y una fijación fuerte (2% glutaraldehído) general-mente inactiva enzimas y antígenos, pero genera una ex-celente preservación estructural, necesaria para losestudios de microscopia electrónica.

SECCIONADOEl tejido fijado es seccionado para su procesamiento yobservación al microscopio. Las secciones suelen tenerun grosor entre 4 �m y 100 �m, en función del tipo deestudio que vaya a realizarse. La obtención de seccionesfinas (por debajo de 30 �m) requiere dar firmeza al teji-do mediante su inclusión en medios como parafina o ce-loidina. También se emplea la congelación del tejidopara preservar sus propiedades biológicas a la vez que fa-cilita la obtención de secciones finas. Las secciones grue-sas, de 100 a 400 �m, se utilizan cuando es necesariomantener cierta integridad en las estructuras a analizar,específicamente de las neuronas o conexiones locales,como en el caso de las tinciones de Golgi, inyecciones in-tracelulares o cuando se realizan cultivos de tejido. Lassecciones se realizan con la ayuda de microtomos o vibra-tomos, aparatos de precisión que permiten obtener cor-tes finos de un grosor homogéneo. En el caso de tejidocongelado, se emplea un criostato, que es un microtomoque se encuentra dentro de una cámara que mantieneuna temperatura de –20 ºC para evitar la descongelacióndel tejido.

MONTAJELas secciones se montan en láminas de vidrio denomina-das portaobjetos, cubiertas de albúmina o gelatina quepermiten que las secciones queden adheridas a su super-ficie, y son teñidas según las diferentes técnicas que sedescriben en el apartado «Aplicaciones del microscopiode luz transmitida». En algunos casos la tinción se realizapreviamente a su montaje en el portaobjetos.

Finalmente, las secciones son cubiertas con un me-dio de montaje transparente con un índice de refracciónsimilar al del vidrio que presenta propiedades ópticasadecuadas para la observación microscópica (fig. 1-1).Este medio de montaje suele ser hidrófobo, lo que impli-ca la deshidratación progresiva del tejido antes de in-cluirlo en el medio de montaje. En el caso de emplearmarcadores fluorescentes, es necesario un medio demontaje hidrófilo (medios especiales, glicerol diluido)dado que la deshidratación elimina la fluorescencia. Porúltimo, la preparación se cubre con una lámina muy fina(17 �m) de vidrio denominada cubreobjetos, que protegela muestra y permite obtener una superficie lisa y homo-génea que evita las distorsiones ópticas (fig. 1-1).

PROCESADO PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICAEl procesado del tejido para su visualización al microsco-pio electrónico presenta particularidades dadas sus espe-

ciales características. Así, la fijación suele realizarse conuna mezcla de paraformaldehído y glutaraldehído, queproduce una excelente fijación de las proteínas y los áci-dos nucleicos. Además se emplea tetróxido de osmio,que permite una buena fijación de los lípidos, con lo que en conjunto se obtiene una óptima preservación ul-traestructural. La observación al microscopio electróni-co de transmisión requiere el empleo de secciones ultra-finas (v. más adelante «Microscopia electrónica»), por loque es necesario incluir el tejido en resinas (epoxi, acri-lato, glicol-metacrilato, etc.) que permiten obtener sec-ciones de grosor homogéneo en torno a los 50 nm, em-pleando para ello un microtomo específico denominadoultramicrotomo y cuchillas especiales con filo de diamante.Las secciones obtenidas se montan en rejillas metálicas(fig. 1-1) que se introducen en el portamuestras del mi-croscopio electrónico.

4 PRIMERA PARTE: TÉCNICAS

3 mm

1 mm

2 mm

B Rejilla de ojal Rejilla de ojalcon membrana

C D Rejilla de malla

Seccionesultrafinasseriadas

Membranatransparente

Microscopia óptica

Microscopia electrónica de transmisión

Portaobjetos

Cubreobjetos

Medio de montaje

TejidoA

Fig. 1-1. Montaje de muestras para microscopia óptica y elec-trónica. Microscopia óptica (A) sobre un portaobjetos de vidrio secoloca la muestra, se baña con un medio de montaje y se cubrecon un cubreobjetos de vidrio. El medio de montaje presenta uníndice de refracción similar al del vidrio y solidifica al secarse, per-mitiendo la conservación indefinida de la muestra. Microscopia elec-trónica de transmisión (B-D): dimensiones de una rejilla de ojal (B);rejilla de ojal cubierta con una membrana transparente sobre laque se montan las secciones ultrafinas, en este caso una serie decortes consecutivos para poder seguir estructuras en secciones su-cesivas (C); rejilla de malla sobre la que se han montado dos seccio-nes: esta rejilla permite mayor estabilidad del tejido bajo el haz deelectrones, pero limita el estudio del tejido a las ventanas que for-ma la malla (D).

MICROSCOPIO DE LUZ TRANSMITIDA

También se denomina microscopio de campo claro, y empleados sistemas de lentes, el objetivo y el ocular (microsco-pio compuesto) para magnificar la imagen formada porla luz visible al atravesar el objeto de estudio. Consta delos siguientes elementos:

1. Una fuente de luz blanca, normalmente una lámparahalógena de wolframio para iluminar el objeto de es-tudio.

2. Un condensador que cuenta con un sistema de lentesy un diafragma, que permite concentrar la luz de for-ma homogénea sobre la muestra. El condensador esfundamental para optimizar las características ópti-cas del microscopio.

3. El objetivo capta la luz que atraviesa la muestra y gene-ra una imagen aumentada del objeto observado (ima-gen intermedia). El objetivo es la pieza fundamentaldel microscopio, y sus características van a determi-nar las principales propiedades del sistema óptico.

4. El ocular, que aumenta la imagen intermedia creadapor el objetivo y genera una imagen virtual que pue-de ser captada por el observador.

En la figura 1-2 se representa de modo esquemáticoel funcionamiento de un microscopio.

Las características principales de un microscopio sedescriben en los siguientes puntos.

MAGNIFICACIÓNAumento que permite obtener, y se calcula multiplican-do la magnificación de cada uno de sus componentes,ocular y objetivo. Un microscopio típico presenta unosoculares con una magnificación 10-15� y un revólver con4-5 objetivos con distintas magnificaciones entre 4� y100�. Así, empleando un ocular 15� y un objetivo 100�se obtendrá una magnificación total de 1.500�, es decir,una neurona de 10 �m (1 �m = 10-6 m) de diámetro seráobservada como si tuviera 1.500 · 10 = 15.000 �m = 15 mmde diámetro. Existen objetivos de hasta 250�, por lo quese pueden obtener magnificaciones superiores cercanasa 4.000� (250 · 15 = 3.750�); sin embargo, la informa-ción útil que puede obtenerse está limitada por la resolu-ción del microscopio.

RESOLUCIÓNMedida del nivel de detalle que permite discriminar elmicroscopio. Se define como la capacidad para resolvercomo distintos dos puntos muy próximos, sin que se con-fundan en un único punto, y se evalúa como la distanciamínima a la que pueden estar dichos puntos. La resolu-ción del microscopio depende de la longitud de onda dela luz empleada y de la apertura numérica del objetivo y

del condensador, relacionadas a través de la ecuación deAbbe:

donde � = longitud de onda de la luz,AN = apertura numérica de las lentes del objeti-

vo (ANobj) y del condensador (ANcond).

En condiciones de óptima alineación de las lentes seconsidera que ANobj = ANcond, y la fórmula se simplifica:

d = � / (2 · ANobj) [1-2]

d = � / (ANobj + ANcond) [1-1]

Neuroimagen microscópica 5©

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Ocular

Objetivo

Imagenintermedia

Ojo

Muestra

Imagenvirtual

Magnificación ~ 12x

Condensador

Diafragma

Fig. 1-2. Microscopio óptico. Esquema del funcionamiento delmicroscopio óptico de luz transmitida: la luz (rayos amarillos) pro-ducida por una fuente de iluminación (no representada) atraviesaun condensador que concentra los rayos sobre la muestra, garanti-zando una iluminación homogénea. La luz que atraviesa la mues-tra (rayos verdes y rojos) es captada por el objetivo, que crea unaimagen intermedia aumentada de dicho objeto. Esta imagen inter-media es, a su vez, magnificada por el ocular, que crea una imagenvirtual aún más aumentada, que puede ser percibida por el obser-vador. En este caso se produce una magnificación 12x.

Nótese que la resolución se calcula a través de la dis-tancia d, pero ambas están relacionadas de forma inver-sa: una alta resolución implica una d pequeña y vicever-sa. La resolución depende por tanto de las característicasdel objetivo, y no del ocular, que simplemente aumentala imagen formada por el objetivo. La apertura numéri-ca (AN) de una lente, se define por la fórmula:

donde � = índice de refracción del medio situado en-tre la lente y el objeto observado (tabla 1-1),

� = mitad de la apertura angular de la lente,que es el ángulo máximo que forma la luzque entra en el objetivo procedente de unpunto de la muestra (fig. 1-3).

Para un objetivo convencional la AN máxima en lapráctica es 0,95, ya que el índice de refracción (�) del airees 1, y la máxima apertura angular técnicamente posible es144º, con lo que � = 72º y seno � = 0,95. Puesto que la lon-gitud de onda media de la luz blanca empleada en un microscopio es de 550 nm (1 nm = 10-9 m), al sustituir en la fórmula se obtendrá una resolución d = 0,55/(2 · 0,95) = = 0,29 �m. Para poder aumentar la resolución es necesa-rio incrementar la AN del objetivo, lo que se consigue através de objetivos con máxima apertura angular, diseña-dos para emplear un medio de inmersión líquido (aceitede inmersión) entre la muestra y el objetivo. Este mediode inmersión presenta un elevado índice de refracción (� = 1,515) similar al del medio de montaje y el vidriodonde va montada la muestra, que permite obtener unaAN máxima de 1,4, con lo que la resolución máxima deun microscopio es d = 550/(2 · 1,4) = 0,2 �m (tabla 1-2).

La resolución y la magnificación están relacionadas,ya que para observar con comodidad los detalles quepermite resolver el microscopio, es necesario emplearun aumento suficiente. Para poder observar sin esfuerzouna resolución de 0,2 � es necesario emplear una mag-nificación de 1.000-1.400�. Como ya se ha comentadoanteriormente, se pueden obtener mayores magnifica-ciones, pero no se obtendrá un incremento de la resolu-ción, por lo que se produce el denominado aumento va-cío: se ve la misma imagen más aumentada, sin obtenermás discriminación de los detalles. Como regla general,el máximo aumento útil de un microscopio es 500-1.000veces la AN.

La resolución tal como se ha definido, se refiere a laresolución horizontal en el plano X-Y de la muestra. Laresolución axial, en el eje óptico o eje Z, queda definidapor la profundidad de campo.

PROFUNDIDAD DE CAMPOSe trata de una medida de la resolución axial del micros-copio, y representa el espesor de tejido que se puede ob-servar en foco con un determinado objetivo. Para resolvercomo distintos dos puntos muy próximos situados en eleje axial, es necesario que la profundidad de campo sea

AN = � · seno � [1-3]


η = 1,0 (aire)Apertura angular = 29°μ = 14,5°AN = 0,25

Objetivo 40 × Objetivo 100 ×

η = 1,0 (aire)Apertura angular = 82°μ = 41°AN = 0,65

η = 1,515 (aceite de inmersión)Apertura angular = 136°μ = 68°AN = 1,4

μ

μ

μ

Objetivo 10 ×

Fig. 1-3. Factores que determi-nan la apertura numérica. Se re-presenta el portaobjetos con la mues-tra y el cono de luz que partiendo deun punto de la muestra puede sercaptado por el objetivo. El ánguloque forma este cono es la aperturaangular, y la mitad de este ángulo secorresponde con μ. Se muestran losvalores de η y μ de distintos objeti-vos, variables según la distancia focaly el medio de inmersión empleado. Elobjetivo 100x tiene una distancia fo-cal pequeña y emplea aceite de in-mersión, lo que permite maximizar laapertura numérica (AN).

Tabla 1-1. Índices de refracción de distintos medios

MATERIAL ÍNDICE DE REFRACCIÓN

Vacío 1

Aire 1,0003

Agua 1,333

Glicerol 1,473

Vidrio 1,52

Aceite de inmersión 1,52

pequeña, por lo que una profundidad de campo reduci-da implica alta resolución axial y viceversa.

Existen distintas fórmulas para calcular la profundi-dad de campo, dado que hay distintos criterios para defi-nir lo que se encuentra en foco; aquí se muestra una delas más utilizadas:

La profundidad de campo aumenta al emplear obje-tivos de inmersión, y disminuye en relación cuadráticacon la AN del objetivo (tabla 1-2). La máxima resoluciónaxial (mínima profundidad de campo) se obtendrá conun objetivo de inmersión de máxima AN (AN = 1,4) yserá de 0,43 �m (tabla 1-2), que implica que se puede ob-servar en foco 0,21 �m por encima y por debajo del pla-no enfocado. La resolución axial es siempre menor quela resolución horizontal, por propiedades inherentes alsistema óptico.

ABERRACIONES ÓPTICASComo se puede observar, las principales característicasópticas de un microscopio vienen dadas por las caracte-rísticas del objetivo, que a su vez es el principal responsa-ble de las posibles distorsiones ópticas del sistema. Estasdistorsiones son principalmente la aberración esférica, lacurvatura de campo y la aberración cromática. La aberra-ción esférica y la curvatura de campo aparecen al em-plear lentes convexas, y se manifiestan como una pérdidade foco y definición en la periferia de la imagen.

Los objetivos actuales corrigen estas aberraciones me-diante la sustitución de algunas lentes por pares de lentesque en conjunto compensan este efecto. La mayoría delos objetivos presentan una corrección aceptable de laaberración esférica, y aquellos que corrigen la curvaturade campo son denominados planares o plan (tabla 1-2).La aberración cromática se debe a la refracción diferen-cial de las distintas longitudes de onda (colores) quecomponen la luz al pasar por una lente o sistemas de len-tes. Esta aberración puede estar corregida para dos longi-tudes de onda en el rojo y el azul (objetivos acromáticos,tabla 1-2), para tres (objetivos de fluorita, v. tabla 1-2) o

para 4 o 5 longitudes de onda (objetivos apocromáticos,tabla 1-2).

TÉCNICAS ÓPTICAS DE CONTRASTE

En general, el tejido nervioso es prácticamente trans-parente, de forma que su observación al microscopio óptico no revela los detalles de su composición u orga-nización. Para obtener contraste se recurre normalmen-te al empleo de tinciones (v. más adelante «Aplicacionesdel microscopio de luz transmitida»), o a modificacio-nes del microscopio que permiten aumentar el contraste.Estas modificaciones se producen normalmente en la ilu-minación de la muestra y se utilizan para la observaciónde tejido vivo, para observar estructuras particulares quepresentan características ópticas específicas y en algunoscasos para realzar el contraste en tejido teñido. Entre es-tas modificaciones del microscopio óptico, destacan:

MICROSCOPIA DE CAMPO OSCUROSe emplea para estudiar secciones no teñidas y tejidocon marcaje de partículas pequeñas o fibras nerviosasmuy finas que presentan escaso contraste con microsco-pia de campo claro o que se encuentran en el límite deresolución. Se basa en el empleo de un condensador es-pecial que presenta un disco opaco en el centro del hazde luz, de forma que la luz que ilumina la muestra pro-viene de la periferia del condensador e incide de formaoblicua sobre la muestra. Este sistema impide que llegueluz transmitida al objetivo y éste solo puede captar la luzque ha sido reflejada, difractada o refractada por lamuestra. El resultado es un fondo oscuro donde desta-can los elementos a analizar como elementos luminosos.En general se emplea para estudiar las partículas en elmarcaje autorradiográfico (v. seguidamente «Aplicacio-nes del microscopio de luz transmitida) o para aumentarel contraste del marcaje de plexos axonales formadospor fibras de diámetro reducido.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASESLa transparencia del tejido biológico es debida a que noproduce cambios de color (cambios en la longitud de

dz = � · � /AN2 [1-4]


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Tabla 1-2. Características ópticas típicas de los tres tipos principales de objetivos

PLANACROMÁTICOS PLANFLUORITA PLANAPOCROMÁTICOS

Aumento AN d (μm) dz (μm) AN d (μm) dz (μm) AN d (μm) dz (μm)

4x 0,10 2,75 55 0,13 2,12 32,54 0,20 1,375 13,75

10x 0,25 1,10 8,80 0,30 0,92 6,11 0,45 0,61 2,72

20x 0,40 0,69 3,44 0,50 0,55 2,20 0,75 0,37 0,98

40x 0,65 0,42 1,30 0,75 0,37 0,98 0,95 0,29 0,61

60x 0,75 0,37 0,98 0,85 0,32 0,76 0,95 0,29 0,61

100x 1,25 0,22 0,53 1,30 0,21 0,49 1,40 0,20 0,43

onda) ni en la intensidad (amplitud de onda) de la luzincidente. Sin embargo, los distintos componentes deltejido presentan diferentes índices de refracción, queproducen desfases en la luz que lo atraviesa (diferenciasen la fase de las ondas). Estas diferencias de fase no pue-den ser percibidas por el ojo humano, de modo que elmicroscopio de contraste de fases intercala en la vía ópti-ca un sistema que permite modificar estas diferencias defase, para convertirlas en fenómenos de interferenciaque alteran la intensidad de la luz de forma diferente enfunción de las diferencias en la refracción del tejido. Así,la imagen formada presenta zonas claras y oscuras quereflejan la composición del tejido, en función de las dife-rencias en la refracción que producen los distintos ele-mentos que constituyen el tejido.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE POR INTERFERENCIADIFERENCIAL O TÉCNICA DE NOMARSKILa microscopia de contraste por interferencia diferencial(DIC) se emplea para la visualización de estructuras no te-ñidas, y para realzar el contraste en tejido teñido, dandoun aspecto tridimensional a la imagen. Se basa en interca-lar un filtro polarizador y un sistema de prismas en el con-densador, que dividen cada rayo de luz incidente en dosrayos paralelos muy próximos entre sí, cuyos planos de vi-bración forman un ángulo de 90º, de modo que no inter-fieren entre sí. Cuando estos rayos segregados atraviesanel tejido pueden atravesar regiones con diferente grosor oíndice de refracción que se traducen en un cambio de fasediferente para ambos. Estos rayos son recogidos por el ob-jetivo, y un nuevo prisma y otro filtro polarizador refun-den ambos rayos en uno único, que representa la interac-ción de la fase de los dos rayos, y se traduce en cambios enla intensidad o longitud de onda (color). La imagen resul-tante presenta un patrón de color o de zonas claras y oscu-ras que refleja la estructura de la muestra con un aspectotridimensional, lo que aumenta el contraste y facilita la in-terpretación de la imagen obtenida. Esta técnica es muyutilizada incluso en muestras teñidas, ya que realza el con-traste y mejora la calidad de la imagen (v. fig. 1-8 C-E).

Además de estas técnicas, existen otras como el em-pleo de luz polarizada, la iluminación de Rheinberg, o latécnica de Hoffman para modular el contraste. Estas téc-nicas se basan en principios similares a los descritos, real-zando el contraste y transformando diferencias de faseen diferencias de color, en muestras de tejido con pococontraste.

APLICACIONES DEL MICROSCOPIO DE LUZ TRANSMITIDA

La microscopia de luz transmitida ha sido y continúasiendo la herramienta más utilizada en el estudio de laestructura y microanatomía del sistema nervioso. Ade-

más de los sistemas de contraste óptico descritos, se handesarrollado múltiples técnicas para contrastar el tejidoy obtener información biológica relevante. Estas técnicasincluyen la histoquímica, el método de Golgi, el marcajecon trazadores, la inmunocitoquímica, la autorradiogra-fía y la hibridación in situ.

TÉCNICAS HISTOQUÍMICASEmplean colorantes químicos que tienen una afinidadselectiva por determinadas sustancias o componentesdel tejido nervioso y que producen una tinción diferen-cial del tejido. Entre estas tinciones se pueden destacarlas basadas en la acidofilia o basofilia de los colorantes.Así, un colorante básico (con carga neta positiva) tendráafinidad (acidofilia) por grupos ácidos (carga neta nega-tiva) presentes en algunas moléculas, como los ácidosnucleicos. Existen diferentes colorantes acidófilos comoel azul de metileno, la pironina G, la toluidina o la tioni-na. Esta última se emplea en la tinción de Nissl, que tiñeintensamente los núcleos celulares (ricos en ácidos nu-cleicos), así como la sustancia de Nissl que se correspondecon el retículo endoplásmico rugoso (rico en ARN).Además puede teñir la membrana celular y segmentosproximales de dendritas de neuronas (fig. 1-4A). Estatécnica permite diferenciar por su morfología los distin-tos tipos celulares (neuronas y neuroglía) y establecer di-ferencias regionales en cuanto a su distribución, densi-dad, laminación o tamaño (figs. 1-4A, C, D; 1-5A). Portanto es muy útil para el diagnóstico de patologías quealteran la citoarquitectura o la distribución y densidadcelular como las displasias, heterotopías, algunos tiposde epilepsia, la enfermedad de Alzheimer, etc. (fig. 1-4D).

Los colorantes basófilos son sustancias ácidas comola fucsina ácida, el azul de anilina, la eosina y el naranjaG, que tienen afinidad por grupos básicos en el tejido,como filamentos citoplasmáticos, componentes de mem-brana en su cara interna y fibras extracelulares. Una téc-nica ampliamente utilizada es la tinción con hematoxili-na-eosina, que emplea dos colorantes, la hematoxilinaque se comporta como un colorante acidófilo, y la eosi-na, que es basófilo. En conjunto permiten obtener imá-genes donde las sustancias ácidas se tiñen de azul, y lassustancias básicas se tiñen de rosa, permitiendo un ma-yor grado de contraste (fig. 1-4B).

Otras tinciones marcan determinadas sustancias o estructuras presentes en el tejido, como por ejemplo latécnica del ácido periódico-Schiff (PAS) para marcarglúcidos y macromoléculas ricas en glúcidos; la técnicade Feulgen para marcar ácidos nucleicos; la técnica deTimm para detectar la presencia de cinc (las fibras mus-gosas del hipocampo son ricas en cinc); la tinción deGallyas o el luxol fast blue para mielina (fig. 1-5B), quepermiten colorear específicamente las vainas de mielinade los axones; el uso de orceína y fucsina para marcarelementos del citoesqueleto, etc.


La histoquímica también se emplea para localizar en-zimas en el tejido, mediante la introducción de un sus-trato para la reacción enzimática acoplado a un cromó-geno3 que precipita en el lugar de la reacción. Así, en la técnica de la NADPH(nicotinamido-adenín-dinucleó-tido reducido)-diaforasa, se añade al tejido un sustratoartificial (nitroblue tetrazolium, NBT) y NADPH comocofactor, de forma que la enzima diaforasa reduce el

NBT, que adquiere color azul y precipita en el lugar dela reacción. Esta enzima participa también en la síntesisde óxido nítrico, por lo que esta técnica es útil para mar-car neuronas nitrérgicas (fig. 1-5C). La citocromo oxida-sa es una enzima presente en las mitocondrias, que inter-viene en la respiración celular, por lo que su abundanciase asocia con actividad metabólica. Para evidenciar supresencia, se añade al tejido citocromo C como sustratoy DAB (3’3-diaminobenzidina tetrahidrocloruro) comocromógeno. La reacción enzimática produce la oxida-ción del DAB que adquiere color marrón y precipita enel lugar de la reacción (fig. 1-5D; v. fig. 1-7C, D).


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Subículo

Giro dentado

Hilus

C

B

VS

End

Neuronas

Nucleolo

Núcleo

Glía

núcleo

neuronas

VS

Glía

Neuronas

End

Nucleolo

Núcleo

A

Fig. 1-4. Tinciones histoquímicas. A) Tinción histoquímica de Nissl (tionina; acidófila) en una sección de 50 μm ilustrando la tinción en neuro-nas, células gliales y células endoteliales (end) de los capilares sanguíneos (cap) de la corteza cerebral humana. Se observa el marcaje tenue delnúcleo neuronal, y el nucléolo intensamente marcado. B) Sección de 8 μm de grosor (inclusión en parafina) con tinción de hematoxilina-eosinamostrando un marcaje similar a A, pero incluyendo los componentes intercelulares (neuropilo). C) Sección de 50 μm del hipocampo humano continción de Nissl mostrando la citoarquitectura y distribución de los campos neuronales. D) Sección de 50 μm de un hipocampo humano con tin-ción de Nissl, procedente de un paciente epiléptico; se observa un patrón de esclerosis de hipocampo, con extensa muerte neuronal (asteriscos),y gliosis generalizada (fondo oscuro). Barras de calibración: 15 μm en A y B; 800 μm en C; 500 μm en D.

3 Cromógeno: sustancia que presenta la propiedad de adquirir coloraciónbajo determinadas condiciones químicas. Normalmente los cromógenosadquieren coloración al sufrir reacciones de oxidación-reducción.

MÉTODO DE GOLGISe basa en la adición al tejido de dicromato potásico y nitrato de plata, que reaccionan formando un densoprecipitado marrón oscuro que impregna completa-mente algunas células del sistema nervioso (fig. 1-6A).Esta técnica requiere el empleo de secciones gruesas, de100-400 �m, que preservan gran parte del árbol dendríti-co y axonal de las neuronas para poder estudiar su mor-fología. Con este método se tiene acceso a la morfologíacompleta de las neuronas y células gliales, y asimismo elmarcaje de los axones de las neuronas permite obtenerinformación acerca de la conectividad de las distintas re-giones cerebrales.

El método de Golgi contribuyó de forma fundamen-tal al desarrollo de la neurociencia a partir de su descu-brimiento a finales del siglo XIX, al permitir visualizarpor primera vez la estructura neuronal completa, quellevó a la confirmación de la teoría neuronal y del princi-

pio de la polarización dinámica, además de ofrecer in-formación esencial acerca de la estructura del sistemanervioso, sus componentes, organización, desarrollo yconectividad. Sin embargo, la impregnación de Golgipresenta dos importantes limitaciones: es un métodopoco consistente, lo que dificulta la realización de estu-dios sistemáticos, y por otra parte, no permite seleccio-nar el tipo de células a estudiar. Por estos motivos estásiendo sustituida por la inyección intracelular para la vi-sualización de neuronas completas, que se realiza conayuda del microscopio de fluorescencia.

TRAZADORES AXONALESEsta técnica se basa en depositar en el tejido un marca-dor o una sustancia marcada que es incorporada por lasneuronas y transportada por el axón, permitiendo obser-var el trazado y destino de las conexiones entre distintasregiones. Este transporte puede ser anterógrado, desde


B

D

A

2

3

4

5

6

1

SB

C

Fig. 1-5. Tinciones histoquímicas. A) Sección de 100 μm de la neocorteza humana con tinción de Nissl, ilustrando las capas corticales (1-6) y la sustancia blanca (SB). B) Sección adyacente a A procesada con histoquímica de Gallyas para teñir la mielina; se observa la disposición de unabaja densidad de axones mielínicos en capas superficiales (1-3), y la formación de fascículos corticófugos en capas profundas (4-6). C) Sección de100 μm de corteza cerebral humana teñida mediante histoquímica enzimática de la NADPH (nicotinamido-adenín-dinucleótido reducido)-diafo-rasa; se pueden diferenciar 2 neuronas nitrérgicas (v. texto) intensamente teñidas. D) Sección tangencial de 100 μm de la corteza visual primaria(área 17) de mono Rhesus con deprivación monocular; se ha realizado histoquímica enzimática para la citocromo oxidasa (v. texto), y se puedeobservar un patrón en bandas, que revela las columnas de dominancia ocular en el área 17; las zonas oscuras se corresponden con intensa acti-vidad de la enzima (columnas de dominancia del ojo sano), mientras las zonas claras se corresponden con baja actividad enzimática (columnas dedominancia del ojo deprivado). Barras de calibración: 700 μm en A y B; 25 μm en C; 400 μm en D. (Imágenes B, C y D cortesía de Javier DeFelipe,Instituto Cajal, CSIC, Madrid.)

el soma a los terminales axónicos, o retrógrado, desdelos terminales al soma. El trazador puede ser un aminoá-cido marcado radiactivamente (v. más adelante «Auto-rradiografía»), o distintas moléculas como la peroxidasade rábano (v. seguidamente «Inmunohistoquímica») quees un trazador retrógrado, dextranos o la PHA-L, una lec-tina que se revela por inmunohistoquímica. Estos traza-dores se emplean in vivo, inyectados en una región cere-bral, y tras un período de transporte, se sacrifica al animalde experimentación y se revela el marcaje (fig. 1-6B).Existen también trazadores que funcionan en tejido fija-do, como el DiI y DiA, que son fluorescentes y lipofílicos,

por lo que son incorporados a las membranas neurona-les y difunden por las dendritas y axones. Estos métodosno son practicables en humanos, por lo que se ha realiza-do un extenso mapeo de las conexiones de otros prima-tes como el macaco, que sirven para conocer la conecti-vidad cerebral y establecer circuitos para comprender elcerebro humano (1).

INMUNOHISTOQUÍMICASe basa en el empleo de anticuerpos dirigidos contra sus-tancias presentes en el sistema nervioso. Estos anticuer-pos son generados en animales de laboratorio, mediante


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CA

B

Fig. 1-6. Golgi, trazadores y autorradiografía. A) Impregnación de Golgi: neurona piramidal de la corteza cerebral de ratón; la impregnaciónrellena la neurona completamente y permite observar en detalle la morfología celular. Detalle de una dendrita (recuadro) donde se pueden apre-ciar las espinas dendríticas que la recubren, cada una de las cuales recibe una entrada sináptica excitadora. B) Trazadores: sección del rombencé-falo de anfibio (Xenopus laevis), mostrando una neurona marcada retrógradamente por la proyección axonal del tálamo. La inyección del traza-dor (dextrano) se realizó en el tálamo. (Imagen cortesía de Alberto Muñoz Céspedes, Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense,Madrid.) C) Autorradiografía: imagen de una sección de 20 μm teñida con Nissl (v. «Técnicas histoquímicas») del giro dentado de mono Rhesusal que se inyectó timidina tritiada. Se observan grupos con alta densidad de granos marcados (puntas de flecha), correspondientes a células ge-neradas durante el período de incubación con el nucleótido radiactivo. Barra de calibración: 20 μm en A; 40 μm en B; 10 μm en C.

la inyección de la sustancia de interés (antígeno)4 proce-dente de una especie diferente. El animal reconocecomo extraña esta sustancia, y genera anticuerpos que sepueden obtener mediante la extracción de suero del ani-mal. La incubación de tejido nervioso con estos anticuer-pos permite que se unan al antígeno contra el que estándirigidos. El posterior marcaje de estos anticuerpos consustancias cromógenas permite su localización al micros-copio óptico.

Una vez demostrada la especificidad de los anticuer-pos, estos son normalmente comercializados, de formaque existe un catálogo muy variado de anticuerpos diri-gidos contra múltiples sustancias de interés como enzi-mas, neurotransmisores, transportadores, receptores deneurotransmisores y sus subunidades, proteínas demembrana, componentes del citoesqueleto, marcadoresneuronales, astrocíticos, microgliales, etc. El marcaje seobtiene a través de diferentes protocolos de inmunohis-toquímica perfectamente estandarizados, que permiten

obtener resultados consistentes y reproducibles. En la fi-gura 1-7 se muestra en detalle uno de estos métodos.

La inmunohistoquímica es una herramienta muy va-liosa para el estudio de la neuroquímica del sistema ner-vioso, al permitir obtener información acerca de la dis-tribución y abundancia relativa de múltiples sustanciasde relevancia biológica en el cerebro. Esta técnica per-mite realizar mapas neuroquímicos que pueden ser co-rrelacionados con la citoarquitectura y la conectividad,además de indicar los patrones laminares de expresión,y la localización subcelular del marcaje (fig. 1-8A-D).Además, determinadas sustancias como algunos neuro-péptidos, las proteínas fijadoras de calcio, las catecolami-nas, etc., están presentes en todos los compartimentosneuronales (soma, dendritas y axón) lo que permite vi-sualizar la morfología neuronal y establecer correlacio-nes entre la morfología y la química neuronal.

AUTORRADIOGRAFÍASe basa en suministrar al tejido vivo (in vivo o in vitro)precursores (ácidos nucleicos o aminoácidos) de macro-moléculas (ADN o proteínas, respectivamente) marca-das radiactivamente, de modo que son incorporados por


Precipitadomarrón

Incubaciónanticuerpoprimario

Incubaciónanticuerposecundario

Incubacióncon DAB yH2O2

H2O2 + DAB

Otros antígenosAntígeno buscado

lavado lavado lavado

2H2O2 O2

2H2ODAB

DAB

A B C D

Conejoα-antígeno

Cabraα-conejo

peroxidasa

Fig. 1-7. Técnica de marcaje inmunocitoquímico basado en la reacción de la peroxidasa. A) Las secciones de tejido fijado se incuban conun anticuerpo (primario) generado en un animal (p. ej., conejo), y dirigido contra la sustancia (antígeno) cuya localización queremos conocer. B) Se añade un anticuerpo secundario (generado en otra especie, p. ej., cabra) dirigido contra las proteínas de la especie donde hemos generadoel anticuerpo primario (conejo), por lo que se unirá al anticuerpo primario; a este anticuerpo secundario se ha unido peroxidasa de rábano (HRP),una enzima que oxida el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada, H2O2), convirtiéndolo en H2O y liberando oxígeno. C) A continuación, se aña-de al tejido DAB y H2O2. El DAB es una sustancia que al oxidarse precipita y adquiere color marrón, por lo que en los lugares donde se encuentrala HRP, el H2O2 se reduce y libera O2 que oxida el DAB, el cual se deposita como un precipitado marrón que indica la presencia del antígeno bajoel microscopio óptico (D).

4 Antígeno: molécula que es capaz de desencadenar la producción de anti-cuerpos. En el contexto de la inmunohistoquímica, define la molécula contrala que generamos anticuerpos para poder detectar su presencia en el tejido.

aquellas células que realizan síntesis de dichas macromo-léculas. Posteriormente, las secciones del tejido se cu-bren con emulsión fotográfica y son expuestas en oscuri-dad durante un período de tiempo suficiente (variosmeses) para que la desintegración radiactiva de los isóto-pos irradie la emulsión fotográfica. Al revelar esta emul-sión se obtiene una imagen en mosaico de puntos quecorresponde a los lugares del tejido donde se ha incor-porado el isótopo, y por tanto donde hay síntesis de pro-teínas o ácidos nucleicos. El marcaje de puntos puedeser visualizado al microscopio óptico y además, normal-

mente se tiñe el tejido con técnicas histoquímicas (Nissl)para visualizar las células. Esta técnica ha sido amplia-mente utilizada para detectar y cuantificar la neurogéne-sis (síntesis de ácidos nucleicos) durante el desarrollo yen el adulto (2) (fig. 1-6C).

HIBRIDACIÓN IN SITUEsta técnica permite detectar la expresión de un gen através del marcaje del ARN mensajero generado; pararealizar esta técnica es necesario conocer la secuencia denucleótidos del ARN mensajero, y crear una sonda com-


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A B

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* *E F

C

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*

*

***

D

Fig. 1-8. Inmunohistoquímica e hibridación in situ para microscopia óptica de luz transmitida. A-F) Secciones de 50 μm del hipocampohumano procesadas con inmunohistoquímica y reveladas con la técnica de la peroxidasa (v. fig 1-6). A) Inmunohistoquímica contra GFAP, unaproteína específica de astrocitos, que nos permite estudiar su morfología y distribución. B). Marcaje inmunocitoquímico contra un marcador demicroglía (LN3) en un caso control. C). Imagen obtenida empleando el método de Nomarski (DIC) de contraste óptico, para realzar el marcaje in-munocitoquímico con un marcador específico de neuronas (NeuN) ; se diferencian neuronas grandes correspondientes a células piramidales yneuronas pequeñas, probablemente interneuronas (D). Marcaje inmunocitoquímico del transportador de GABA tipo 1 (GAT-1), presente en ter-minales axonales que contienen GABA; el marcaje es punteado y se corresponde con los terminales axónicos inhibidores; se aprecian zonas sinmarcaje (asteriscos) que se corresponden con cuerpos celulares, rodeados de terminales axonales marcados que probablemente establecen si-napsis inhibidoras (GABAérgicas) con los cuerpos neuronales; las estructuras tubulares (puntas de flecha) representan terminales axonales querodean el segmento proximal del axón de las neuronas piramidales, con el cual establecen sinapsis inhibidoras. E-F) Hibridación in situ. Combina-ción de técnicas inmunocitoquímicas y de hibridación in situ en una sección de 30 μm de embrión de ratón de 12,5 días, empleando microscopiade Nomarski; la sección incluye el primordio del ojo, donde se observa el epitelio pigmentado (ep) en color marrón. La copa óptica (co) está mar-cada en azul en su parte dorsal (sonda de ARN conjugada con digoxigenina y revelada con inmunohistoquímica), como resultado de una hibrida-ción in situ para detectar la expresión del gen Ephrinb2, mientras el nervio óptico aparece teñido de rojo como resultado de una inmunohistoquí-mica para detectar la proteína Pax2 (F). Hibridación in situ realizada in toto, es decir, en el embrión completo de 10 días de gestación; la relativatransparencia de sus tejidos permite observar el marcaje antes de un análisis detallado en secciones; el patrón de marcaje azul corresponde a laexpresión del gen BMP7 en focos discretos, y en segmentos a nivel de la médula (puntas de flecha). Barra de calibración: 15 μm en A-B; 30 μmen C; 8 μm en D; 125 μm en E; 450 μm en F. (Imágenes E y F cortesía de Julián Morcillo y Paola Bovolenta, Instituto Cajal, CSIC, Madrid.)

plementaria de 50-200 pares de bases que puede ser deADN o ARN. Estas sondas están marcadas, de forma queal introducirlas en el tejido se unen al ARN mensajeropresente en la célula, y permiten localizar su presencia.El marcaje de las sondas se puede realizar mediante laincorporación de isótopos radiactivos en los nucleótidos(autorradiografía) o mediante la unión de moléculasfluorescentes o enzimas peroxidasa de rábano (HRP)que pueden ser reveladas por histoquímica enzimática,aunque, con mayor frecuencia, se marcan con la uniónde digoxigenina a determinados nucleótidos, una molé-cula que puede ser revelada por inmunohistoquímica(fig. 1-8).

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia es un microscopio ópti-co que presenta algunas modificaciones para observar lafluorescencia emitida por el tejido. La fluorescencia esuna propiedad que presentan algunas moléculas deno-minadas fluorescentes o fluoróforos, que al ser iluminadaspor una radiación luminosa de una determinada longi-tud de onda, son excitadas y liberan energía a través de laemisión de luz de una longitud de onda mayor. El micros-copio de fluorescencia está adaptado para el uso de fluo-róforos como marcadores, que ofrecen algunas ventajassobre los marcadores tradicionales para luz transmitida.

Los microscopios de fluorescencia presentan unafuente de luz (una lámpara de mercurio o xenón), capazde emitir luz de gran intensidad en un amplio espectro delongitudes de onda, desde el ultravioleta (254 nm) hastael rojo (650 nm), para producir la excitación de los fluo-róforos. Asimismo, presentan una importante diferenciarespecto a los microscopios de campo claro, ya que la ilu-minación de la muestra se produce a través del objetivo(epiiluminación), que actúa por tanto como condensa-dor y como objetivo.

En el microscopio de fluorescencia (figs. 1-9 y 1-10),el haz de luz producido por la lámpara es concentradopor un condensador y atraviesa un filtro que seleccionael rango de longitud de onda adecuado para excitar elfluoróforo que se esté empleando. La luz filtrada incidesobre un reflector cromático, que es un espejo de tipo di-croico, el cual presenta la propiedad de reflejar la luz debaja longitud de onda (incidente) pero que puede seratravesado por luz de mayor longitud de onda (emitida).La luz incidente es, por tanto, reflejada por el reflectorcromático y enfocada por el objetivo sobre la muestra detejido. Los fluoróforos presentes en el campo iluminadodel tejido son excitados por esta luz incidente y en res-puesta emiten luz de mayor longitud de onda que es re-cogida por el objetivo y que será capaz de atravesar el es-pejo dicroico. Esta fluorescencia emitida pasa despuéspor un filtro barrera, que permite el paso de longitudes

de onda correspondientes a la emisión del fluoróforoempleado, bloqueando otras posibles emisiones del teji-do (v. fig. 1-9). Esta emisión final puede ser visualizada através del ocular.

A diferencia del microscopio óptico de transmisión,donde normalmente la intensidad de luz es alta, en el mi-croscopio de fluorescencia la intensidad de la fluorescen-cia emitida puede ser muy baja, cuando existen pocasmoléculas de fluoróforo presentes en el tejido, o al obser-var tejido vivo que no puede ser iluminado con luz inci-dente de alta intensidad. Por ello, se emplea el objetivosimultáneamente como condensador y como objetivo, yaque permite optimizar la iluminación de la muestra y ma-ximizar la captación de luz. En efecto, la intensidad de laluz captada por transmisión es: It � AN2/M2 (M, magnifi-cación) mientras en un sistema de iluminación a travésdel objetivo (reflexión) es: Ir � AN4/M2. Esto implica quela epiiluminación supone una importante mejora de laeficacia en la captación de luz emitida cuando se em-


Filtro deentrada

Filtro barrera

Espejo dicroico

Objetivo = condensador

Tejido

Lámparade mercurio

Fluoróforo(Alexa 495, 520)

Ocular

λ = 495 nm

λ = 520 nm

Fig. 1-9. Esquema de los componentes y la vía óptica de unmicroscopio de fluorescencia. Se representa el caso particu-lar del empleo de Alexa 488 como fluoróforo; este marcador pre-senta una longitud de onda de excitación y emisión en torno a los 495 nm (azul) y 519 nm (verde) respectivamente; se representancon líneas discontinuas las emisiones no específicas del fluoróforo(autofluorescencia del tejido, contaminación de otros fluoróforos)que son filtradas por el filtro barrera específico; se representa tam-bién una emisión de longitud de onda menor a la del fluoróforo(reflexión de luz incidente en el sistema óptico y el tejido) que noatraviesa el espejo dicrómico y es reflejada por éste; finalmente, laluz que atraviesa el filtro de barrera es captada por el ocular y pue-de ser visualizada por el observador.

plean objetivos con una alta apertura numérica, indepen-dientemente de su magnificación. Así, un objetivo de 40�con una AN de 1 permitirá captar casi 6 veces más intensi-dad de luz que otro objetivo 40� con una AN de 0,65. Portanto, la microscopia de fluorescencia requiere el em-pleo de objetivos que presentan una apertura angularalta y utilizan medios de inmersión que maximizan laAN, que por una parte optimizan la captación de luz, ypor otra, contribuyen a maximizar la resolución de laimagen.

La resolución horizontal del microscopio de fluores-cencia viene dada por la fórmula de Rayleigh:

La resolución axial viene dada por la fórmula:

En ambos casos estos valores varían en función de lalongitud de onda de excitación y emisión, pero si secomparan estas fórmulas con las del microscopio de luztransmitida, se verá que la resolución es teóricamente in-ferior en el microscopio de fluorescencia. Sin embargo,esta pérdida de resolución se ve ampliamente compensa-da por el incremento en la detectabilidad de la señal, yaque en condiciones óptimas es posible detectar la pre-sencia de una única molécula de fluoróforo. Además,como se verá más adelante, el desarrollo de sondas fluo-rescentes con múltiples aplicaciones en neurobiologíaaporta muchas ventajas al empleo de este tipo de micros-copia.

MICROSCOPIA CONFOCAL

La microscopia confocal se basa en el empleo de un mi-croscopio de fluorescencia modificado que permite laobtención de imágenes confocales, que son imágenes de

dz = 2· � · � / NA2 [1-6]

d = 0,61 · � / NA [1-5]


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A

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B C D

TH NOS TH+NOS

Fig. 1-10. Microscopia de fluorescencia. A) Imagen de fluorescencia de una sección de 100 μm de la médula espinal de anfibio (Xenopus lae-vis), mostrando la proyección reticuloespinal y neuronas reticulares que la originan (recuadro); se ha inyectado un trazador retrógrado (dextrano)unido a fluoresceína en la médula espinal. B-D) Imágenes de combinación inmunohistoquímica con fluorescencia de anticuerpos anti-NOS (óxi-do nítrico sintasa) marcada con un fluoróforo con emisión verde (B), y anti-TH (tiroxina hidroxilasa) con emisión roja (C); la NOS marca neuronasque producen óxido nítrico, mientras marca neuronas catecolaminérgicas; en D se muestra la suma (B + C), donde se puede observar una célulaque expresa ambos marcadores (en amarillo, resultado de la suma del verde y el rojo), y otras neuronas con expresión de cada uno de los marca-dores. Barra de calibración: 100 μm en A; 25 μm en B-D. (Imagen A cortesía de Alberto Muñoz Céspedes, Facultad de Ciencias Biológicas, Uni-versidad Complutense, Madrid.)

un espesor reducido del tejido que no presentan ele-mentos fuera de foco.

El microscopio confocal (fig. 1-11) utiliza normalmen-te un láser como fuente de iluminación, que se desplazapor la muestra, realizando un barrido punto a punto deltejido. Para dirigir la trayectoria del láser en este barri-do, se intercala en la vía óptica un sistema de deflectores(espejos) que giran en ángulos opuestos, cuyo movi-miento está controlado digitalmente. El láser es enfoca-do a través del objetivo para focalizar la luz sobre unpunto del tejido, minimizando la llegada de luz a las zo-nas adyacentes, tanto en el plano horizontal (X-Y) comoen el eje axial (Z). Los fluoróforos presentes en el puntoiluminado son excitados por la luz incidente y respon-den emitiendo luz fluorescente de menor longitud de

onda, que es captada por el objetivo del microscopio,para posteriormente atravesar un condensador que fo-caliza la luz emitida sobre un receptor (un fotomultipli-cador, un fotodiodo o un CCD). Entre el condensador yel receptor se sitúa una apertura (pinhole) de diámetromuy reducido que sólo permite la entrada de luz prove-niente del punto iluminado, eliminando la emisión pro-ducida por las regiones adyacentes (figs. 1-11; 1-12A).Finalmente, un ordenador integra la señal recogida encada punto para generar la imagen final.

Los láseres empleados en el microscopio confocalpresentan espectros de emisión amplios. Un láser co-mún en microscopia confocal como es el combinado deAr/Kr, emite en un rango de longitudes de onda conmáximos en 488, 568 y 647 nm, correspondientes al azul,amarillo y rojo respectivamente, por lo que permite elempleo de diversos fluoróforos. El sistema de filtrado delas longitudes de onda incidente y emitida se realizacomo en el microscopio de fluorescencia, a través de fil-tros y espejos dicroicos específicos según los fluoróforosempleados (fig. 1-11). Por lo que respecta a la luz emiti-da por el fluoróforo, las distintas longitudes de onda sonseparadas por espejos dicroicos, por lo que cada longi-tud de onda es registrada en un fotodetector (fig. 1-11).En los sistemas más modernos, los filtros y espejos dicroi-cos están siendo sustituidos por filtros dinámicos queemplean difracción optoacústica para separar las distin-tas longitudes de onda. Estos filtros resultan más eficacesy pueden ser programados por el usuario para seleccio-nar diferentes longitudes de onda en función de las ne-cesidades de cada estudio, logrando discriminar hasta 4longitudes de onda (colores) de emisión.

El microscopio confocal también puede ser emplea-do para visualizar marcajes opacos (tipo Golgi), demodo que el láser es reflejado por las estructuras marca-das y esta emisión es recogida por el objetivo y sigue lamisma vía que en el caso de la fluorescencia.

La resolución horizontal del microscopio confocalviene dada por la fórmula:

Como se puede apreciar, es ligeramente superior a lade los microscopios de luz transmitida y de fluorescen-cia. La resolución axial teórica se define por la fórmula:

Esta ecuación indica que existe un incremento de un30% en la resolución axial respecto al microscopio defluorescencia, pero en conjunto, el sistema confocal pre-senta un importante aumento de la resolución tanto ho-rizontal como axial debido a la obtención de imágenes

dz = 1,4 · � · � / NA2 [1-8]

d = 0,4 · � / NA [1-7]


Filtro deentrada

Espejo dicroico

Objetivo = condensador

TejidoFluoróforo

(DAPI 359,461)

Fotodetectorazul

Apertura (pinhole)

Espejodicroico

Espejo dicroico

Filtro barrera azul

Filtrobarreraverde

Apertura(pinhole) Filtro

barrerarojo

Deflectoresde barrido

Fotodetectorrojo

Fotodetector

verde

Láserλ = 359 nm

λ = 461 nm

Fig. 1-11. Esquema de los componentes y la vía óptica de unmicroscopio confocal. Se representa el empleo de DAPI, un fluo-róforo que marca los núcleos celulares, con una longitud de ondade excitación de 360 nm (violeta-azul), y una longitud de onda deemisión de 461 nm (azul cian); se representan los deflectores quedirigen el haz de luz en el barrido de la muestra, y el sistema de es-pejos dicroicos y filtros barrera que en este caso permiten discrimi-nar tres longitudes de onda. Entre los filtros barrera y el fotodetec-tor, se sitúa la apertura o pinhole que permite obtener imágenesconfocales (v. texto y fig. 1-12); la emisión que atraviesa la apertu-ra incide sobre el fotodetector que registra la señal y la transmite aun ordenador que guarda en la memoria la información de cadapunto para generar la imagen completa. Con líneas discontinuasse muestra el camino que seguirían otras emisiones fluorescentesen el rango del verde y el rojo, en caso de emplear fluoróforos conemisión en estas longitudes de onda.

confocales que recogen la señal de un único plano defoco (fig. 1-12A) que representa un espesor reducido dela muestra. Este espesor dependerá del objetivo emplea-do y de la apertura o pinhole seleccionado, alcanzando va-lores mínimos de 0,5 �m empleando objetivos de altaAN y aperturas de reducido diámetro. La ausencia de es-tructuras fuera de foco, permite una mayor definiciónde la imagen que se traduce en una mayor resolución(fig. 1-13H, I). Estas imágenes se denominan secciones óp-ticas, y pueden ser tomadas a diferentes profundidadesdel tejido, generando una serie de secciones ópticas quepermiten la reconstrucción y análisis tridimensional deltejido estudiado (fig. 1-13).

MICROSCOPIA MULTIFOTÓN

Se basa en el esquema de funcionamiento de la micros-copia confocal, pero emplea un modo diferente de exci-tación del fluoróforo que permite obtener imágenesconfocales sin necesidad de emplear aperturas para eli-minar las estructuras fuera de foco.

En los microscopios de fluorescencia y confocal, lalongitud de onda de la luz incidente es la adecuada paraexcitar al fluoróforo; es decir, cada fotón tiene una ener-

gía asociada (que es inversamente proporcional a la lon-gitud de onda) suficiente para excitar el fluoróforo. Enla microscopia multifotón, la luz incidente tiene una lon-gitud de onda más larga que la de excitación del fluoró-foro, por lo que cada fotón tiene una menor energía y esnecesaria la coincidencia simultánea de varios fotonessobre la molécula de fluoróforo para excitarlo. El siste-ma más utilizado en la actualidad es el microscopio dedos fotones, que emplea una longitud de onda incidenteque es aproximadamente el doble de la de excitación delfluoróforo, por lo que es necesaria la coincidencia simul-tánea de dos fotones en el fluoróforo para generar su ex-citación. Existen también microscopios de tres fotones(y se ha observado el efecto con cuatro fotones), cuyofuncionamiento es esencialmente el mismo, pero la emi-sión se produce a longitudes de onda 3 veces mayor quela longitud de onda de excitación de los fluoróforos y re-quieren la coincidencia de tres fotones para la emisiónde señal. En adelante se hablará exclusivamente del mi-croscopio de dos fotones.

En este microscopio, para obtener una eficiencia deexcitación similar a la de los sistemas de excitación con unfotón, es necesario aumentar la intensidad de la luz inci-dente un millón de veces. Para ello, el microscopio de dosfotones emplea un láser especial que emite luz de longi-


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Tejido

Microscopioconfocal

Luzincidente

Espejodicroico

Apertura(pinhole)

Fotodetector

Objetivo

F

F’

F’’

A Microscopiomultifotón

Luzincidente

Tejido

Objetivo

Espejodicroico

Fotodetector

F

F’

F’’

B

Fig. 1-12. Sistemas ópticos para la obtenciónde imágenes confocales: microscopio confo-cal y de dos fotones (multifotón). A) Microsco-pio confocal: la luz incidente proveniente del láser(en gris) es reflejada por un espejo dicroico y esenfocada por el objetivo sobre un punto del tejidosituado en el plano de foco (F). Al atravesar el teji-do la luz incidente es dispersada, por lo que pue-de excitar fluoróforos situados en otros planos deltejido (F’ y F’’). La emisión fluorescente es captadapor el objetivo y enfocada sobre una apertura(pinhole) que sólo permite el paso de la luz emiti-da que proviene del plano de foco (F), eliminandolas emisiones de otros planos (F’ y F’’) y generan-do imágenes confocales. B) Microscopio multifo-tón: en este microscopio la luz incidente estácompuesta de pulsos de gran intensidad a altafrecuencia. Los puntos en la vía óptica represen-tan fotones. El objetivo enfoca la luz incidente so-bre un punto del tejido, maximizando la densidadde fotones en ese punto. La probabilidad de coin-cidencia simultánea de dos fotones sobre el fluo-róforo en las distintas regiones del tejido atrave-sado por la luz incidente (F’ y F’’) es muy reducida,excepto en el plano de foco (F), donde se da lamáxima concentración del haz incidente, por loque la emisión de fluorescencia se producirá ex-clusivamente en este plano. La obtención de imá-genes confocales se consigue de forma inherenteal sistema de iluminación.

tud de onda alta (el láser de pulsos de zafiro, con emisiónen longitudes de onda de 690 nm a 1.050 nm), en pulsosde muy corta duración, entre 100 fs (100 · 10-15 s) y 2 ps (2 · 10-12 s), a una alta frecuencia (100 MHz = 108 pulso/s).

La media de la intensidad de emisión de estos lásereses ligeramente superior a la de los láseres empleados enmicroscopia confocal, pero la emisión en pulsos haceque durante un pulso de emisión, la intensidad esté alta-mente concentrada, aportando la densidad fotónica ne-cesaria para la excitación.

El láser es regulado para emitir radiación con unalongitud de onda que es aproximadamente el doble dela de excitación del fluoróforo contenido en la muestra y es enfocado a través del objetivo sobre un punto del tejido, de forma que sólo en el punto enfocado la inten-sidad de la radiación (la densidad de fotones) es sufi-cientemente alta para que haya probabilidad de que in-cidan dos fotones simultáneamente sobre las moléculasde fluoróforo para generar la emisión de fluorescencia(fig. 1-12B). En las regiones adyacentes la intensidad esmenor, por lo que la probabilidad de coincidencia de

dos fotones es muy baja, eliminando la fluorescencia enel entorno del punto enfocado (fig. 1-12B). La emisiónde fluorescencia es recogida por un fotomultiplicador,sin necesidad de intercalar aperturas para eliminar laemisión periférica del punto muestreado, ya que el pro-pio sistema de excitación por dos fotones se encarga deevitarlo (fig. 1-12B). Al igual que en microscopia confo-cal, puede obtenerse una serie de secciones ópticas quepermiten la reconstrucción tridimensional de las estruc-turas observadas (fig. 1-13).

La resolución es similar a la de un microscopio con-focal funcionando en óptimas condiciones, aunque lasimágenes obtenidas presentan un mayor contraste y de-finición, al no presentar iluminación residual de las re-giones fuera de foco. En el microscopio de dos fotonesse ha obtenido la máxima resolución axial, con valoresde profundidad de campo de 0,33 �m, pero ha sido ne-cesario emplear objetivos especiales con apertura numé-rica de 1,45 (3). La principal ventaja de este sistema fren-te al confocal se deriva del empleo de luz incidente conalta longitud de onda y por tanto con baja energía, que


Z

suma A - F Fluorescencia

suma

0 μm 6 μm

12 μm 18 μm

24 μm 30 μm

A B

C D

E F H

G

I

J K L M N0 m 5 m 10 m 15 m 25 m

11

1 1 1

22

2 2

3 3 33

4

Fig. 1-13. Secciones confocales in vitro ein vivo. A-F) Secciones ópticas obtenidascon un microscopio confocal de una neuronade la corteza cerebral, inyectada intracelular-mente con un marcador fluorescente. Las sec-ciones se obtuvieron a intervalos de 6 μm,con un objetivo 16x. G) Esquema de la locali-zación tridimensional en el tejido de 4 seccio-nes ópticas; la imagen inferior corresponde a la suma de todas ellas. H) Imagen suma delas secciones ópticas representadas en A-F. I) Imagen de una neurona de la misma región,obtenida con un microscopio de fluorescen-cia convencional. Esta imagen presenta zonasborrosas correspondientes a la fluorescenciaoriginada en las regiones fuera de foco, au-sente en las imágenes confocales (A-F, H).Todas las imágenes han sido procesadas digi-talmente en la misma medida para aumentarel contraste y eliminar el fondo. J-N) Imáge-nes de microscopia de dos fotones de unasección de corteza cerebral de ratón en de-sarrollo (día 12 posnatal) mantenidas en con-diciones de cultivo. Las imágenes muestranuna dendrita de una célula piramidal, y fue-ron captadas en intervalos de 5-15 min. Seobserva la modificación estructural de distin-tos procesos dendríticos (espinas y filopodiosnumerados de 1-4) a lo largo del tiempo. Ba-rra de calibración: 25 μm. (Imágenes A-I cor-tesía de Ruth Benavides-Piccione e Inmacula-da Ballesteros-Yáñez, Instituto Cajal, CSIC,Madrid; Imágenes J-N cortesía de Carlos Por-tera-Cailliau, Universidad de California.)

minimiza el daño fototóxico sobre el tejido en las regio-nes no enfocadas. Por ello, es idóneo para realizar estu-dios de microscopia sobre tejido vivo, permitiendo la ob-servación repetida a lo largo del tiempo. Asimismo, esespecialmente útil en secciones gruesas de tejido, ya quelas longitudes de onda largas son capaces de una mayorpenetración al sufrir una menor absorción y dispersiónque las longitudes de onda más cortas empleadas en mi-croscopia de fluorescencia o confocal. Este sistema per-mite penetrar hasta 600 �m en el tejido, a diferencia delas 200 �m que permite el microscopio confocal.

APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

La microscopia de fluorescencia ha visto una enorme ex-pansión en las últimas décadas, gracias al desarrollo yaplicación de múltiples sustancias fluorescentes que seemplean como marcadores estructurales o como indica-dores del estado fisiológico y de la actividad metabólicatisular y celular. Se han desarrollado trazadores axonalesfluorescentes (v. fig. 1-10A) y existen fluoróforos que seunen a macromoléculas biológicas específicas como pro-teínas o ácidos nucleicos, o para localizarse en una re-gión celular particular como puede ser el citoesqueleto,las mitocondrias, el aparato de Golgi, el retículo endo-plásmico o el núcleo.

Una de las ventajas fundamentales que ofrece la mi-croscopia de fluorescencia es la posibilidad de emplearvarios fluoróforos simultáneamente, cuya emisión puedeser adecuadamente separada mediante los filtros y espe-jos dicroicos con que cuentan los sistemas de microsco-pia de fluorescencia. Así, el marcaje inmunocitoquímicopermite la combinación de anticuerpos marcados condiferentes fluoróforos. En general se pueden obtenerdobles y triples marcajes, empleando fluoróforos conemisión en longitudes de onda correspondientes al azul,el verde y el rojo, (fig. 1-14C), y mediante el empleo defiltros optoacústicos se pueden separar hasta 4 emisionesque incluyen el color amarillo. La combinación de dis-tintos anticuerpos permite estudiar las relaciones entrediferentes poblaciones neuronales (fig. 1-14C, D), y laposible segregación o colocalización del marcaje. Lasuma digital de las imágenes resultantes de cada emisiónproduce la mezcla de colores allí donde existe colocali-zación de antígenos, de forma que, por ejemplo, la colo-calización de dos sustancias marcadas con rojo y verdedará lugar al amarillo (figs. 1-15 y 1-10B-D).

La fluorescencia ha permitido también el desarro-llo de la inyección intracelular, que consiste en la inyec-ción de sustancias fluorescentes en el interior celular em-pleando una micropipeta. Esta técnica se realiza en sec-ciones gruesas de tejido (250-400 �m), para preservar unaimportante porción del árbol dendrítico y axonal de las

neuronas. Las secciones son teñidas por inmersión enun marcador fluorescente (p. ej., DAPI) que marca losnúcleos celulares. La sección se visualiza a través del mi-croscopio de fluorescencia, que permite observar los nú-cleos celulares y por tanto localizar y seleccionar aque-llos que presentan las características morfológicas de lasneuronas de interés. Las inyecciones se realizan con microelectrodos (micropipetas de vidrio con puntas dediámetro muy reducido) como los empleados en los re-gistros electrofisiológicos, cargados con una sustanciafluorescente que presenta carga eléctrica (lucifer yellow,biocitina u otras) que será empleada como marcador. A través del microscopio de fluorescencia, y con la ayudade un micromanipulador, se dirige la punta del microe-lectrodo al interior del cuerpo neuronal, y mediante lageneración de una diferencia de potencial entre el mi-croelectrodo y el baño donde se encuentra el tejido, seinyecta iontoforéticamente5 la sustancia fluorescente,que rellena la neurona completamente (fig. 1-14A). Estametodología permite seleccionar las regiones cerebralesque se desea estudiar, la localización laminar precisa y eltipo de neuronas que se van a inyectar (p. ej., células pi-ramidales,6 células granulares, interneuronas,7 etc.). Pos-teriormente se puede analizar la morfología neuronal através del microscopio de fluorescencia, u obtener unareconstrucción tridimensional a partir de secciones ópti-cas obtenidas en el microscopio confocal (v. fig. 1-13).La combinación de esta técnica con métodos inmuno-histoquímicos permite estudiar las relaciones entre dis-tintas poblaciones neuronales (fig. 1-14A-B).

El empleo de proteínas fluorescentes de origen bioló-gico como la proteína fluorescente verde (GFP, green fluo-rescent protein), en combinación con técnicas de modifica-ción genética, ha dado lugar a nuevas estrategias demarcaje celular. El gen de esta proteína fluorescente pue-de ser introducido en el núcleo de las células diana me-diante infección vírica o transfección,8 de modo que suexpresión dará lugar al marcaje fluorescente de las célu-


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5 Iontoforesis: movimiento de una sustancia cargada eléctricamente dentrode un campo eléctrico, debido a las fuerzas de atracción y repulsión eléctrica.6 Células piramidales: denominadas también pirámides, son las neuronasmás abundantes de la corteza cerebral. Utilizan glutamato como neuro-transmisor y son por tanto excitadoras. Su axón emite colaterales que con-tactan con otras neuronas locales y abandona la corteza para establecercontactos sinápticos con otras regiones corticales y subcorticales.7 Interneuronas: este término tiene diferentes acepciones en la literatura. Eneste texto define a las neuronas cuyo axón se ramifica localmente, estable-ciendo contactos sinápticos con neuronas de la misma región donde se en-cuentran, y que utilizan GABA (ácido �-aminobutírico) como neurotransmi-sor, por lo que son inhibidoras.8 Transfección: es la introducción de una secuencia de nucleótidos (normal-mente ADN) exógena en una célula eucariota de un organismo superior (enorganismos unicelulares se denomina transformación). Se emplean distin-tos métodos, entre los que destaca la electroporación, en la que se introdu-cen electrodos en el tejido y se genera una intensa diferencia de potencialque genera microporos temporales en las membranas celulares y permite laentrada iontoforética de los ácidos nucleicos.

las donde se ha incorporado. Este gen puede expresarseen todas o algunas de las células tratadas, y habitualmentese introduce en las células asociado a otro gen, de formaque las células que expresan el gen introducido aparece-rán fluorescentes por la expresión de GFP (fig. 1-14E).Otra posibilidad es generar animales transgénicos9 que

presentan expresión de GFP asociada a la expresión deun determinado gen, lo que permite identificar la pobla-ción celular que expresa un gen en particular por la pre-sencia de fluorescencia. Por mutaciones del gen de laGFP se han generado otras proteínas similares, como la BFP o YFP, que emiten fluorescencia en el rango delazul y el amarillo respectivamente, lo que permite com-binar estos marcadores para obtener información sobrela expresión de varios genes simultáneamente. Existen diversas cepas de animales transgénicos que expresanGFP como marcador de la expresión de distintos genes,lo que facilita mucho el estudio de poblaciones neurona-les seleccionadas.


A B C

D E

Fig. 1-14. Microscopia focal. A y B) Combinación de inyección intracelular de una célula piramidal de la corteza cerebral humana (verde), coninmunohistoquímica anti-TH (rojo). Suma de 18 secciones ópticas de 1,4 μm de grosor (microscopio confocal). B) Potencial contacto sinápticoentre una fibra TH positiva con la neurona piramidal. La imagen es la suma de 6 secciones ópticas de 0,5 μm de grosor (microscopio confocal). C) Triple marcaje fluorescente de neuronas inmaduras positivas para doblecontinua (verde), neuronas maduras inhibidoras (azul) y fibras de as-trocitos (rojo). Se observa que las tres poblaciones están separadas. D) Neurosis posnatal en el giro dentado del hipocampo: marcaje de célulasgeneradas recientemente (verde) y neuronas inmaduras (rojo). Se observan células generadas tanto reuronales (flechas blancas) como no neuro-nales (flecha roja). E) Marcaje fluorescente con GFP para visualizar la migración neuronal durante el desarrollo cortical del embrión de ratón. El marcaje con GFP se indujo mediante electroporación de un plásmido conteniendo el gen de la GFP 24 h antes. Barra de calibración: 80 μm en A; 3 μm en B; 15 μm en C; 8 μm en D y 30 μm en E. (Imágenes A y B cortesía de Ruth Benavides-Piccione, Instituto Cajal, Madrid; C-E Roko M.Rasin y Nenad Sestan, Universidad de Yale.)

9 Transgénico: es un organismo que contiene en todas sus células un frag-mento de ADN exógeno. Este fragmento de ADN se corresponde con uno omás genes, y ha sido introducido artificialmente con fines de investigación omejora genética. La expresión de los genes introducidos puede darse de for-ma natural en todas o algunas estructuras del organismo, o puede ser indu-cida bajo determinadas condiciones.

MICROSCOPIA DE TEJIDO VIVOComo ya se ha indicado, la observación de tejido vivopuede realizarse a través de sistemas ópticos de contrasteaplicados al microscopio óptico como el campo oscuro,el contraste de fases o la técnica de Nomarski. Sin embar-go, este tipo de técnicas dependen de la composición yestructura de las muestras y permiten obtener una infor-mación muy limitada.

En las últimas décadas, el desarrollo de la microsco-pia confocal y especialmente la microscopia multifotón,combinado con el desarrollo de marcadores fluorescen-tes que no afectan significativamente el metabolismo ce-lular, ha permitido seguir en vivo la dinámica de múlti-ples procesos biológicos.

Estudios in vitroLa microscopia de tejido vivo se basa normalmente en elempleo de cultivos celulares (células aisladas de un teji-do) o tisulares (secciones de tejido nervioso), incubadosen soluciones complejas que contienen los elementosnecesarios para su supervivencia, en condiciones de oxi-genación y temperatura controladas.

Los marcadores pueden ser liberados al medio de cul-tivo para ser captados por las células, pueden ser introdu-cidos en la célula viva a través de inyecciones intracelula-

res, o puede emplearse tejido con poblaciones celularesmarcadas con GFP. El marcaje de células completas per-mite seguir procesos de cambio estructural, como creci-miento dendrítico y axonal, remodelación de espinasdendríticas o migración celular (4). El empleo de sondasmetabólicas facilita la visualización y cuantificación dedistintos procesos metabólicos, como la concentraciónde iones en el interior celular, el pH, la concentración deespecies de oxígeno reactivo o el potencial de membrana(fig. 1-15A-D). Asimismo pueden emplearse marcadoresde endo y exocitosis, de la fluidez de las membranas, deltráfico de proteínas, de la transducción de señales y de laactividad enzimática.

La combinación de registros electrofisiológicos coninyección intracelular en cortes de tejido permite esta-blecer posibles correlaciones entre morfología y fisiolo-gía neuronal. Estas técnicas pueden ser además combi-nadas con métodos de análisis genético (extracción deARN mensajero, transcripción inversa a ADN, amplifica-ción génica y análisis de los genes expresados), de modoque se puede obtener información acerca de la morfo-logía de una neurona, su perfil electrofisiológico y su patrón de expresión génica para su completa caracteri-zación y el estudio de las correlaciones entre estos pará-metros (5).


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B 12 s C 25 s

1

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A 12 s

Intensidad de fluorescencia

-5

0

5

10

15

20

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30

35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Astr 1

Astr 2

Astr 3

30

140 A B

D

ATP

Tiempo (s)

Inte

nsid

ad (

%)

Fig. 1-15. Visualización y cuantificación de ladinámica del calcio intracelular. A-C) Imágenesde microscopia de fluorescencia de una sección de250 μm de hipocampo de rata, mantenida en con-diciones de registro electrofisiológico a lo largo deltiempo (t), para estudiar el efecto del ATP sobre laconcentración intracelular de calcio en astrocitos;los astrocitos han incorporado Fluo-3 añadido almedio, una sustancia que presenta fluorescencia(excitación a 488 nm y emisión sobre 510 nm) enpresencia de calcio. Imagen de la emisión de fluo-rescencia del tejido en t = 12 s (A). Imágenes proce-sadas con pseudocolor para evidenciar las diferen-cias en la intensidad de la emisión fluorescente,sustituyendo los valores de gris por colores deacuerdo a la escala representada en D, que presen-ta un mínimo de 30 y un máximo de 140 de una es-cala de grises de 0 (negro) a 255 (blanco) (B y C); seañade ATP al medio en t = 10 s, y se muestra unaimagen (A, B) en t = 12 s, y otra (C) en t = 25 s; se observa el aumento de la emisión de fluorescen-cia correspondiente al efecto del ATP liberado almedio, sobre los astrocitos. Los resultados de lacuantificación de la intensidad de fluorescencia seresumen en el gráfico, donde se ha indicado el mo-mento de la adición de ATP (flecha) y el momentode la captación de las imágenes B y C (líneas dis-continuas) (D). Barra de escala, 15 μm. (Imágenescortesía de Gertrudis Perea y Alfonso Araque, Insti-tuto Cajal, CSIC, Madrid.)

La posibilidad de obtener múltiples secciones ópticasde alta resolución de estructuras particulares del tejidovivo a lo largo de secuencias temporales, permite obtenermodelos tridimensionales del tejido a lo largo del tiem-po. Dado que la iluminación prolongada de las muestraspuede generar daño tisular, se realizan captaciones bre-ves a intervalos constantes de tiempo, que pueden sereditadas para generar vídeos (donde el tiempo quedacomprimido) que son muy útiles para analizar la dinámi-ca de los procesos metabólicos o de remodelación estruc-tural (6). Estas observaciones pueden prolongarse porespacio de un mes en condiciones óptimas de cultivo. Enla bibliografía se facilitan direcciones de internet dondese pueden visualizar algunos de estos vídeos.

Estudios in vivoLa baja fototoxicidad que presenta el microscopio dedos fotones, junto a su capacidad de penetración en eltejido, ha permitido la realización de estudios de micros-copia directamente en el cerebro de animales anestesia-dos, orientados normalmente al análisis de cambios es-tructurales como la dinámica de las espinas dendríticasde las neuronas corticales. En los últimos años, se ha de-sarrollado además una miniaturización del microscopiode dos fotones, que permite el registro microscópico dela corteza cerebral de animales no anestesiados y con li-bertad de movimiento (7). Para ello recurren a un mon-taje miniaturizado del sistema óptico (deflectores, obje-tivo, foco, espejos dicroicos, filtros) que se fija al cráneodel animal, y está conectado por fibra óptica al láser deexcitación y al ordenador de análisis de la emisión. Elmontaje unido al cráneo del animal es extremadamenteligero, y permite al animal moverse con libertad. La reso-lución obtenida, por el momento, no es suficiente pararealizar estudios específicos, pero el desarrollo de estetipo de técnicas puede dar lugar a una nueva microsco-pia in vivo, que evite los posibles artefactos derivados dela observación de cultivos celulares o tisulares, o la apli-cación de anestesia en observaciones similares, ofrecien-do información acerca de los cambios estructurales ymetabólicos que ocurren a escala microscópica en la cor-teza cerebral de animales de experimentación durantela realización de distintas tareas.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Como ya se ha visto, la resolución de la microscopia ópti-ca está limitada fundamentalmente por la longitud deonda de la luz visible, por lo que para generar microsco-pios con más poder de resolución es necesario emplearradiaciones con una longitud de onda mucho menor.Apoyándose en el comportamiento de onda que presen-tan los electrones en movimiento, el microscopio elec-trónico genera una radiación de electrones de muy baja

longitud de onda para obtener grandes magnificacionesy una alta resolución. Existen dos tipos principales demicroscopia electrónica: de transmisión y de barrido.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓNLa fuente de electrones del microscopio electrónico esgenerada por una diferencia de potencial entre un cáto-do y un ánodo. El cátodo presenta un filamento de wol-framio o un cristal de hexaboruro de lantano (LaB6) quees calentado a alta temperatura para facilitar la emisiónde electrones hacia el ánodo. El ánodo dispone de unaabertura de aproximadamente 0,1 �m que permite la sa-lida de los electrones que forman el haz en una columnade vacío. El microscopio cuenta con un condensador do-ble (fig. 1-16) para concentrar el haz de electrones sobrela muestra. Al incidir sobre ésta, algunos electrones laatravesarán sin interaccionar con ella, mientras otros inci-


Transmisión

Cátodo

Ánodo

Doblecondensador

Apertura delcondensador

Portamuestras

Objetivo

LenteintermediaLente de

proyección

Pantallafluorescente

Apertura delobjetivo

Barrido

Cátodo

Ánodo

Sistema decondensadores

Deflector

Detector de e-primariosreflejados

Detector de e-secundarios

Muestra

Análisis

Objetivo

A B

Fig. 1-16. Esquema de los sistemas de microscopia electróni-ca. Esquemas que muestran los componentes y la vía óptica de laradiación electrónica en el microscopio electrónico de transmisión(A) y en el de barrido (B). A) El microscopio electrónico de transmi-sión permite la visualización directa de las imágenes a través deuna ventana que permite visualizar la pantalla fluorescente dondese forma la imagen. B) En el microscopio electrónico de barrido serepresentan sólo los detectores de electrones primarios retrodis-persados y de electrones secundarios, los fundamentales para laformación de imagen en muestras biológicas.

dirán sobre los núcleos atómicos presentes en la muestray serán reflejados o desviados de su trayectoria (fig. 1-17).Tras atravesar la muestra, el haz de electrones pasa por laapertura del objetivo, un diafragma de reducido diáme-tro, que retendrá aquellos electrones desviados de modoque no contribuirán a formar la imagen. El haz de elec-trones resultante es magnificado por un objetivo paraformar una imagen intermedia, que es aumentada poruna lente intermedia y finalmente proyectada sobre unapantalla fluorescente por una lente de proyección. Estapantalla está compuesta por gránulos fluorescentes queemiten luz al recibir el impacto de los electrones, dandolugar a una imagen monocroma que reproduce la densi-dad a los electrones de las distintas regiones de la mues-tra, y por tanto su ultraestructura (v. fig. 1-16).

El microscopio electrónico emplea una radiación deelectrones que es originada por una diferencia de poten-cial que es regulable entre 60 y 150 KV. Esta diferenciade potencial produce una corriente de electrones cuyalongitud de onda en Angstroms (Å; 1 Å = 10-10 m), vienedada por la fórmula de De Broglie:

donde h = constante de Planck.m = masa del electrón.v = velocidad.

Los valores de h y m son conocidos, mientras que lavelocidad v dependerá del potencial V del campo queorigina la radiación, según la expresión e · V = ½ · m·v2,donde e es la carga eléctrica del electrón. Así, v = (2 · e · · V/m)1/2 y sustituyendo en la fórmula anterior, se ob-tiene:

De modo que para un microscopio electrónico de 60-150 KV, la longitud de onda de la radiación electrónicavariará entre 0,05 Å (60 KV) y 0,03 Å (150 KV), o 0,005 y0,003 nm respectivamente. La resolución horizontal deeste sistema viene dada por la fórmula de Rayleigh:

El índice de refracción (�) del vacío es 1 y la aperturaangular del objetivo de un microscopio electrónico esmuy pequeña, del orden de 1º, por lo que � � 0,5º y sen � � 0,008. Para un voltaje de 60-150 KV, sustituyendo enla fórmula las longitudes de onda correspondientes, seobtiene una resolución de 0,38 y 0,24 nm respectivamen-te. De acuerdo a la fórmula de De Broglie, al aumentar

el voltaje del campo eléctrico disminuye la longitud deonda de la radiación electrónica, contribuyendo a me-jorar la resolución, por lo que se podría obtener mayorresolución aumentando de forma considerable el vol-taje. Sin embargo, por limitaciones debidas a la calidadde las lentes electromagnéticas y al método de prepara-ción de las muestras, incluso con voltajes muy altos de 3 MV (1 MV = 1.000 kV), no es posible alcanzar reso-luciones significativamente inferiores a 0,1 nm. En lapráctica, la resolución máxima de los microscopios elec-trónicos estándar (de 60-150 KV) es de � 0,3 nm, lo quelimita la magnificación útil del microscopio electrónicoa 300.000-500.000 aumentos, y aunque se pueden conse-guir mayores magnificaciones (en torno a 1.000.000x),se trata de un aumento vacío.

Por lo que respecta a la profundidad de campo, esnormalmente superior al grosor de las secciones, por loque en la práctica la profundidad de campo será igual algrosor de las secciones empleadas. Este factor condicio-na asimismo la resolución, ya que una elevada profundi-dad de campo supone una pérdida de resolución. La op-timización de ambos parámetros implica el empleo desecciones ultrafinas de 40-50 nm.

Las secciones ultrafinas apenas presentan contrasteen el microscopio electrónico, dado que los elementosque constituyen las moléculas biológicas (C, H, O, N, S,P) presentan un bajo número atómico,10 y por tanto noson densos a la radiación electrónica. Para generar con-traste en el tejido se emplean sales de metales pesadoscon alto número atómico, como el osmio, el plomo y eluranio. Estas sales se unen por afinidad con determina-dos componentes celulares y aumentan la densidad a loselectrones. Con este fin se emplea el tetróxido de osmio,un fijador que reacciona con los lípidos, que estabiliza yda contraste a las membranas biológicas. Además, se em-plea acetato de uranilo, que estabiliza y tiñe los ácidosnucleicos y las proteínas, y el citrato de plomo, que au-menta el contraste de las membranas, proteínas, ácidosnucleicos y glucógeno.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDOSe basa en el registro de la interacción de los electronesal chocar sobre la superficie de una muestra, por lo queofrece información de la estructura superficial del tejidoen estudio. Emplea una fuente de electrones similar a ladescrita en el microscopio de transmisión (v. fig. 1-16),pero utiliza voltajes menores, de 1-50 KV. Cuenta conuna serie de condensadores que concentran el haz de

d = 0,61 · � /(� · sen �) [1-11]

� = 12,3 /V1/2 [1-10]

� = h/(m · v) (1) [1-9]


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10 Número atómico: número entero positivo que equivale al número totalde protones existentes en el núcleo atómico, y por tanto al número total deelectrones de un átomo en equilibrio. Un mayor número atómico indica ma-yor tamaño y masa atómica de un átomo, y en el contexto de la microscopiaelectrónica de barrido, una mayor probabilidad de interacción con los elec-trones incidentes sobre la muestra.

electrones, y con un objetivo que enfoca el haz sobre unárea muy reducida (� 10 nm de diámetro) de la muestra.Este haz es dirigido por un deflector que lo desplaza so-bre la muestra realizando un barrido. La radiación deelectrones incidentes sobre la muestra genera la retro-dispersión de algunos de los electrones incidentes (elec-trones primarios); la dispersión de electrones de lamuestra (electrones secundarios) y la emisión de foto-nes y rayos X (fig. 1-17). En la cámara donde se coloca lamuestra existen detectores que permiten diferenciar yregistrar la retrodispersión de los electrones primarios y la dispersión de los electrones secundarios, así como laemisión de fotones y rayos X (figs. 1-16 y 1-17). Los elec-trones dispersados son recogidos para formar una ima-gen en un tubo de televisión de alta resolución. La ima-gen resultante contiene principalmente informacióntopográfica sobre la superficie del tejido.

La muestra no es atravesada por el haz de electrones,por lo que el grosor de ésta no es relevante. Sin embar-go, la preparación de la muestra implica la deshidrata-ción y desecación completa del tejido, y su recubrimien-to con una fina película de carbón o metales pesadosque confieren conductividad a la superficie para la emi-sión de electrones secundarios y permite la reflexión delos electrones incidentes.

APLICACIONES DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Se tratará las aplicaciones de la microscopia electrónicade transmisión, dado que el uso de la microscopia de ba-rrido ha sido mucho más limitado y específico.

El microscopio electrónico de transmisión ha sidomuy útil en neurociencia, al ofrecer una aproximación anivel subcelular para estudiar la composición del tejidonervioso (fig. 1-18A), los compartimentos celulares y losorgánulos citoplasmáticos (fig. 1-18B), así como paraidentificar las sinapsis, diferenciar la morfología de las si-napsis excitadoras e inhibidoras (fig. 1-18C, D) y analizarsu estructura, composición, organización y distribuciónen las neuronas.

La mayoría de las técnicas descritas anteriormentepara el marcaje del tejido en microscopia óptica hansido modificadas para poder observar el marcaje en elmicroscopio electrónico de transmisión, ya que permiteun estudio mucho más detallado y preciso. Así, en el mé-todo de Golgi se produce una sustitución de la densa im-pregnación por un tenue marcaje de gránulos, a travésde una fotorreducción en presencia de oro (fig. 1-18E).En el caso de los trazadores axonales, algunos de ellospermiten su visualización directa al microscopio electró-nico, como ocurre también con el precipitado de DABobtenido en la inmunohistoquímica. Sin embargo, esteprecipitado no se encuentra limitado a la localizaciónprecisa del antígeno, sino que puede difundir o generaruna nube difusa de marcaje, por lo que para obtener in-formación precisa acerca de la localización de un antíge-no se recurre a marcar los anticuerpos primarios o se-cundarios con marcadores densos a los electrones comoferritina o más comúnmente con partículas de oro de 5-40 nm de diámetro. Esta técnica permite además la com-binación de anticuerpos, mediante el empleo de partícu-las de diferente tamaño para el marcaje de los distintosanticuerpos. La inyección celular también puede adap-tarse para la visualización ultraestructural, mediante lafotooxidación de las sustancias fluorescentes empleadaspara el marcaje, que forman un precipitado denso a loselectrones visible al microscopio electrónico.

El tejido puede ser analizado a partir de secciones ob-tenidas en regiones de interés, o puede también realizar-se microscopia electrónica de estructuras particularesidentificadas al microscopio óptico, mediante microsco-pia correlativa óptica-electrónica. Asimismo, las seccio-nes pueden ser individuales o pueden obtenerse sec-ciones seriadas (v. fig. 1-1) que son recogidas en conjuntoen la rejilla de visualización, de forma que las estructurasde interés como dendritas, espinas dendríticas o termi-nales axónicos se pueden seguir en las distintas seccio-nes para obtener información completa sobre su exten-sión, composición o relaciones sinápticas, y proceder a


Barrido

Tansmisión

e- secundario

e- primariodispersado

e- primariodispersado

e- primarioretrorreflejado

e- no dispersados

Fig. 1-17. Microscopio electrónico. Esquema de las interaccio-nes del haz de electrones sobre los átomos de la muestra. En el mi-croscopio electrónico los electrones incidentes sobre la muestrapueden interaccionar con los átomos presentes en el tejido de va-rias formas; el impacto con un núcleo atómico produce la retrodis-persión de los electrones incidentes (primarios). Si el impacto escon un electrón, el electrón incidente será dispersado, mientrasque el electrón impactado será también desplazado de su órbita(electrón secundario). Los electrones incidentes pueden ademásdesviarse de su trayectoria al pasar junto al núcleo de los átomosdel tejido, o bien pueden atravesar la muestra sin interacciones ypor tanto sin modificaciones en su trayectoria. La microscopia elec-trónica de barrido registra los electrones retrorreflejados y los electrones secundarios para formar una imagen de la superficie deltejido. La microscopia electrónica de transmisión registra los elec-trones que atraviesan la muestra sin modificaciones para formar laimagen de la estructura interna del tejido.

su reconstrucción tridimensional para realizar estudioscuantitativos de parámetros morfológicos.

Una técnica especial en microscopia de transmisiónes la criofractura, en la cual se infiltra el tejido con uncrioprotector y se congela (-160 ºC) muy rápidamente;posteriormente se fractura con el filo de una cuchilla,aplicando fuerzas de dirección e intensidad controlada,que permite la fractura del tejido por puntos de debili-dad estructural, y en particular genera la separación delas membranas biológicas. Posteriormente se cubre la su-perficie con platino, y se disuelve el tejido, obteniendouna réplica metálica cuyo grosor varía en función de lasuperficie del tejido, que se coloca sobre la rejilla de vi-sualización. De esta forma se puede observar la ultraes-tructura celular y en particular la estructura y composición

de las membranas lipídicas que limitan las estructurascelulares y la distribución de las proteínas de membrana(fig. 1-18F).

CONCLUSIÓN

Durante varios siglos, la microscopia ha sido una herra-mienta esencial para conocer la estructura y organiza-ción del sistema nervioso. Hasta mediados del siglo XX,la microscopia era principalmente una herramienta deanálisis estructural, con limitaciones en la resolución yen la disponibilidad de técnicas de marcaje del tejido. A partir de 1950, el desarrollo de la microscopia electró-nica, y posteriormente la microscopia de fluorescencia,


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Fig. 1-18. Imágenes de microscopia electrónica. A) Imagen a baja magnificación (1.000x) de la corteza cerebral de rata, donde se distinguendos neuronas piramidales (pir), caracterizadas por presentar una gruesa dendrita apical (da). B) Imagen (18.000x) de una célula cortical duranteel desarrollo del ratón (10 días posnatal). Se indica la presencia de un núcleo, mitocondrias y el retículo endoplasmático rugoso, formado por unapila de sáculos aplastados que presentan ribosomas adheridos (pequeños puntos negros). C y D) Imágenes de sinapsis excitadora (C, 45.000x) einhibidora (D, 60.000x); en ambas se observa un terminal axónico (ax) con vesículas de neurotransmisor. Se diferencian por la densidad postsi-náptica (DPS): las sinapsis excitadoras se denominan también asimétricas por poseer una DPS bien diferenciada, mientras las inhibidoras son si-métricas, con las membranas pre y postsináptica son muy similares. E) Dendrita (dend) impregnada con Golgi virado a oro (20.000x), para susti-tuir la tinción de Golgi por un marcaje de grámulos densos a los electrones. Se observan dos espinas dendríticas (sp), una de las cuales recibe unasinapsis excitadora (sin). F) Microscopia electrónica de transmisión (11.000x) de tejido procesado por criofractura para visualizar la estructura in-terna de las membranas. Se muestra una célula granular del cerebelo, parcialmente fracturada, mostrando la membrana nuclear (n), con los po-ros nucleares (pn). Se indica la presencia de mitocondrias (mit), el citoplasma (cit) y la membrana plasmática (cara externa de la capa interna[mpi], y cara externa de la capa externa [mpe]; en el cuadro se muestra a más aumento (30.000x) la membrana nuclear, con los poros nuclearesy agregados esféricos que corresponden a proteínas de membrana situadas en la bicapa lipídica. Barra de calibración: 6 μm en A; 500 nm en B;180 nm en C; 325 nm en D 375 nm en E y F. n, núcleo; nc, nucléolo; np: neuropilo. (Imagen cortesía de Luis Miguel García Segura, Instituto Ca-jal, CSIC, Madrid.)

A

pir pir

da

np

nc

n

da

B

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mit

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mitmit

C

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DPS

n

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F

dend

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mit

mit

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D E

junto al desarrollo de múltiples marcadores fluorescen-tes tanto estructurales como fisiológicos, permite visuali-zar los procesos biológicos en tiempo real, con un altogrado de resolución espacial y temporal, y acceder a laultraestructura subcelular del tejido nervioso. El empleode microscopia de dos fotones está contribuyendo a de-sarrollar el campo de la microscopia de tejido vivo, y elavance tecnológico permite ya captar imágenes de mi-croscopia de animales vivos que se mueven con libertad.

Por otra parte, el desarrollo de las técnicas de modifi-cación genética ha aportado nuevas perspectivas al mar-caje de poblaciones celulares, y en este campo la neuroi-magen tiene un futuro muy prometedor.

En este capítulo se han expuesto los principales siste-mas de microscopia, y las técnicas más utilizadas paramarcar el tejido y diferenciar estructuras. La investiga-ción continúa ensayando nuevos sistemas de microsco-pia, a partir de variaciones de los actuales, como el mi-croscopio 4Pi, o empleando nuevos conceptos como elcaso de la microscopia de fuerza atómica. Estos sistemasaún están en desarrollo, y su implantación en los labora-torios de investigación básica puede tardar todavía algu-nos años, pero con toda seguridad la neuroimagen talcomo se conoce actualmente va a sufrir una importantetransformación de la mano del desarrollo tecnológico,que va a permitir emplear nuevas formas de iluminacióncon láser y sistemas de control y análisis digital, que van aofrecer importantes mejoras en la resolución y capaci-dad de análisis del tejido nervioso.

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi gratitud a las personas que han con-tribuido a la realización de este capítulo a través de la re-visión crítica de sus contenidos y/o la generosa aporta-ción de material gráfico: a Alfonso Araque, InmaculadaBallesteros-Yáñez, Ruth Benavides-Piccione, Paola Bovo-lenta, Julián Morcillo, Javier DeFelipe Oroquieta, PilarEsteve, Luis Miguel García Segura, Javier López-Ríos, Al-berto Muñoz Céspedes, Gertrudis Perea, Carlos Portera-Cailliau, Roko Rasin y Nenad Sestan.

REFERENCIAS

1. Rosene DL, van Hoesen GW. The hippocampal formationof the primate brain. En: Jones EG, Peters A, editors. Cere-bral cortex. New York: Plenum Press; 1987. p. 345-456.

2. Eckenhoff MF, Rakic P. Nature and fate of proliferative cellsin the hippocampal dentate gyrus during the life span ofthe rhesus monkey. J Neurosci. 1988;8:2729-47.

3. Mar Blanca C, Hell SW. Axial superresolution with ultra-high aperture lenses. Optics Express. 2002;10:893.

4. Niell CM, Smith SJ. Live optical imaging of nervous systemdevelopment. Annu Rev Physiol. 2004;66:771-98.

5. Monyer H, Markram H. Interneuron Diversity series: mole-cular and genetic tools to study GABAergic interneuron di-versity and function. Trends Neurosci. 2004;27:90-7.

6. Portera Cailliau C, Yuste R. Espinas y filopodios en el cere-bro. Mente y cerebro; 2004:10-21.

7. Helmchen F, Fee MS, Tank DW, Denk W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brainimaging in freely moving animals. Neuron. 2001;31:903-12.

8. Yuste R, Lanni F, Konnerth A. Imaging neurons. A labora-tory manual. New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress; 2000.

9. Wischnitzer S. The electron microscope. En: Hayat MA, edi-tor. Principles and techniques of electron microscopy. Bio-logical applications. New York: Van Nostrand ReinholdCompany; 1973. p. 3-51.

10. Ross MH, Romrell LJ, Kaye GI. Histología, texto y atlas encolor. 3.ª ed. México: Editorial Panamericana; 1997.

11. Pawley JB. Handbook of biological confocal microscopy.2nd ed. New York: Plenum Press; 1995.

12. Mainen ZF, Maletic-Savatic M, Shi SH, Hayashi Y, MalinowR, Svoboda K. Two-photon imaging in living brain slices.Methods. 1999;18:231-9.

13. Lahue R. Methods in neurobiology. New York: PlenumPress; 1981.

14. Kharazia VN, Phend KD, Rustioni A, Weinberg RJ. EM colo-calization of AMPA and NMDA receptor subunits at synap-ses in rat cerebral cortex. Neurosci Lett. 1996;210:37-40.

15. Hayat MA. Principles and techniques of Electron micros-copy. Biological applications. Cambridge: Cambridge Uni-versity Press; 2000.

16. Cuello AC. Immunohistochemistry. New York: John Wiley &Sons; 1983.

Páginas web de interés

Microscopia

http://www.microscopyu.com/sitemap.htmlhttp://micro.magnet.fsu.edu/

Reconstrucción tridimensional de secciones ópticas de microscopia confocal y de dos fotones

http://raven.zoology.washington.edu/celldynamics/gallery/3D_stacks.html

http://www.lanelabs.com/CAREtest/antibodyVideos.asphttp://www.nephrology.iupui.edu/imaging/movies2.htm


cap 1. - neuroimagen microscópica

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