bahan dan metode - ipb repositoryrepository.ipb.ac.id/jspui/bitstream/123456789/744/11/bab iv... ·...
TRANSCRIPT
20
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Unggas dan Veteriner;
Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan - Instirut Pertanian
Bogor, serta. di Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor. Penelitian dilaksanakan
mulai bulan Iuli 2002 sampai Maret 2004.
Materi PeDelitian
Hewan Perrobaaa
Pada penelitian ini dipergunakan ayam pedaging berumur 1 hari sebanyak
300 ekor yang akan dipelihara selama 7 minggu. Ayam dibagi menjadi 15
kelompok yaitu
a. Kontrol (tanpa probiotik dan antibiotik) dibagi 3 kelompok. yaitu tanpa
infeksi Salmonella (lA), diinfeksi S. enteritidis (18) dan infeksi S.
typhimurlum (IC).
h. Kelompok antibiotik (tanpa probiotik dan diberi antibiotik) dibagi 3
kelompok yaitu tanpa infeksi Salmtmella (2A), diinfeksi S. enteritidis
(2B) dan infeksi S. typhimurium (2C).
c. Kelompok. probiotik Bacillus apiorius dan flInpa antibiotik dibogi 3
kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (3A), diinfeksi S. enteritidis
(3B) dan infeksi S. typhimurlum (3C).
d. Kelompok probiotik B. coagulans dan tanpa antibiotik dibagi 3
kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (4A), diinfeksi S. enteritidis
(4B) dan infeksi S. typhimurium (4C).
e. Kelompok probiotik campuran Bacillus sp. (BM) dan tanpa antibiotik
dibagi 3 kelompok yaitu tanpa infeksi Salmonella (5A). diinfeksi S.
enteritidis (5B) dan infeksi S typhimurium (5C).
21
Bakteri Salmonella
Balten Salmonella yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah S.
enteritidis dan S. typhimurium yang berasal dari ayam. Isolat bakteri Salmonella
diperoleh dari Balai Penelitian Veteriner. Bakteri ditumbuhkan pa.da media
selektif Salmonella Shigella (SS) agar. Untuk identifikasi dilakukan pewamaan
Gram dan uji biokimia (Krieg and Holt. 1984 ; Sneath el al., 1986; Williams et
al., 1980).
Probiotik daD aotibiotik
Probiotik yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah :
a. Mengandung isolat B. apiarius 109 CFU/ml
b. Mengandung isolat 8. caagulans 10' CFU/ml
c. Mengandung campuran 6 spesies Bacillus sp. 109 CFUImI
Probiotik diperoleh dari Dr. I Putu Kompiang. APU, Balai Penelitian
Temak Ciawi Bagor. Probiotik berbentuk cairan dan diberikan setiap hari dengan
dosis 2 milliter air minum. Probiotik diberikan pada ayam secara peroral yang
dicampur dengan air minum. Antibiotik yang dipergunakan dalam penelitian ini
adalah zinc bacitrasin. Antibiotik diberikan dengan dicampur dengan pakan 0,1
glkg pakan. Pakan yang digunakan adalah pakan bmiler komersial.
Mctode Peneiitian
Karakterisasi BaciUlIS
Isolat probiotik (bakteri Bacl1/us apiarius dan B. coagulans)
dikarakterisasi. Bakteri ditumbuhkan pada media nutrient agar (NA), media cair
(nutrient brothINB) dan diamati sifat-sifat koloni dan perturnbuhan.
Kurva Pertumbuban
Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah total bakteri (Bacillus
apiarius dan B. coagulans) adalah metode penghitungan cawan atau disebut
Total Plate Count (TPC) (MatuTin dan James, 1998). Kultur mumi ditumbuhkan
dalam media nutrien broth (NS) selama 24 jam pada suhu 3'fC, kemudian
22
disentrifugasi 500g selama 25 menit uotuk mendapatkan pelet. Pelet dirnasukan
ke dalam 2 ml NB dan dihomogenkan. Untuk menghitung konsentrasi bakteri.
diambil 1 ml isolat dan dicampurkan ke dalam 9 ml NaCI fisioiogis 0,96%,
kemudian dihomogenkan. Selanjutnya dilakukan pengenceran secara seri 10.2,
10'3, dan seterusnya sampai to-10, Masing-masing pengenceran dipupuk ke
dalam media nubi.en agar dan diinkubasikan selama 24 jam pada subu 3'fC.
Koloni yang tumbuh dihitung dan diketahui jumlah awat bakteri.
Untuk pengamatan kurva pertumbuhan isolat yang telah diketahui
jumlahnya diinkubasi pada 37"C. Pemupukan dilakukan padajam ke 2, 4, 8, \2,
16, 20, 24, 28, 32, 36, dan 40.
Uji Dambat Pertumbuhan Salmonellil secara in vitro
Vji hambat pertumbuhan bakteri Salmonella """"" in vitro dengan bakteri
probiotik (B. apiarius, B. coaguJans) dilakukan menurut metode Miyamoto et ai.
(2000) yang dimodifilcasi. Vji hambat pertumbuhan bakteri Salmonella dilakukan
dengan menanam SoJmonel/a enteritidis dan Salmonella typhimurium masing
masing dalam media Mueller Hinton agar secara merata. Kemudian pada cawan
petri yang telah diinokulasi Salmonella tersebut diinokusasikan kertas cakram
yang berisi probiotik yang diuji yaitu isolat B. opiarius dan B. coagulans.
Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 31' C. Zona hambatan
pertumbuban yang terben\Uk diamati.
PemberiaD probiotik
Dalam penelitian ini digunakan I'8Ilcangan acak lengkap. Ayam dibagi
menjadi 15 kelompok, masing-masing terdiri dari 20 ekor seperti tercantum
diatas.
Dosis probiotik B. apiarius, B. coagulans dan probiotik BM adalah 2ml/
liter air minum. Probiotik diberikan setiap hari mulai umur 1 hari sampai umur 6
minggu. Kandidat Probiotik mengandung masing-masing B. apiarius 109 colony
forming unit (CFU)/ml dan B. coaguJans 109 CFU/ml da.., BM mengandung 109
CFU/ml bakteri penyusunnya. Antibiotik pemacu pertumbuhan (growth promoter)
yang dipergunakan adalah zinc bacitrasin yang dicampurkan ke dalam pakan
23
dengan dosis 0.1 gram/kg pakan. Pakan dan air minum diberikan secara ad
libitum.
InfeksiSabnoneUa
Biakan bakteri Salmonella (s. enteritidis dan S. typhimurium) diambil
koloni 1 loop dan ditanam pads media kaldu brain heart infusion (BHl) dan
diinkubasikan pada suhu 37' C selama 18-24 jam (Alisantosa et ai., 2000;
Desmidt ., al., 1997). Kemudian disentrifus (500g, 10 menil) sehingga terbentuk
pelet. Untuk memperoleh dosis inokulum, pelet diencerkan dengan Jarutao NaCI
fisiologis steril dan .kekeruhannya disamakan dengan standar McFarland no. 1
yang setara dengan 109 Colony fonning unit (CFU)/ml (Miyamoto, el al., 1998).
Pad, saat berumur 3 minggu 'yam diinfeksi dengan Salnwnella (S.
enteritidis dan S. typhimurium). Infeksi dilakukan peroral dengan dosis 10'
CFU/ml (Alisantosa., aI., 2000; Desmidt., aI., 1997).
Pengamatao Performan
Peubah perfonnan yang diamati adalah berat badan, pertamhahan berat
badan, konsumsi kumulatif dan nilaifeed conversion rate (FeR).
Berat bad .. daD pertambauD bera. badaD
Setiap minggu ayam percobaan ditimbang uotuk mengetahui berat badan
dan kenaikan berat badannya.
KODsumsi kumulatif dan Feed conversion rate (FeR)
Untuk mengetahui jumlah pakan yang dikonsumsi dan efisiensi
penggunaan pakan pada ayam percobaan maka dilakukan penimbangan pakan
yang diberikan. Setiap hari pakan yang diberikan (pagi dan sore) ditimbang,
kemudian pakan yang tersisa juga ditimbang, sehingga dapat diketahui jumlah
pakan yang dikonsumsi oleh ayam. Selanjutnya dilakukan penghitungan FeR.
24
Status Kesehatan
Untuk mengetahui status kesehatan hewan percobaan maka dilakukan
pemeriksaan gambaran darah yang meliputi jumlah eritrosit, lekosit, kadar
hemoglobin dan hematokrit (Packed cell vo/umeIPCV) serta kemampuan
fagositosis dan clearance sel heterofil (polimorfonuklearlPMN).
PemeriksaaD Gambaraa Dara"
Pemeriksaan gambaran darah pada ayam percobaan dilakukan uotuk
mengetahui status kesebatan ayam tersebut. Untuk pemeriksaan gambaran darah,
darah diambil dari vena brachialis selanjutnya dilakukan pemeriksaan :
Jam"" Eritrosit daD Lekosit
Jumlah eritrosit dan lekosit dihitung menurut metode hemositometer.
Darah dihisap det1gan aspilator pada pipet eritrosit abIU lekosit Kemudian
dengan pipet yang sarna dihisap tarutan Rees dan Ecker dan dikocok. Campuran
tersebut kemudian dimasukkan kedalam kamar hitung Neubauer dan jumlah
eritrosit dan lekosit dihitung.
Nilai He .... tokrit
Nilai hematokrit diukur dengan metode mikro hematokrit. Darah
dimasukkan ke dahun pipa kapiler. Kemudian disentrifus selama 15 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Nilai hematokrit dibaca dengan menggunakan
microhematocrit reader.
Kadar Hemoglobin (Hb)
Nilai hemoglobin diukur dengan metode Sianmedtemoglobin.
Uji Fagositosis set beterofil (PMN)
Uji fagositosis dilakukan uotuk mengetahui aktivitas dan kapasitas
fagositosis oteh sel !ekosit polimorfonuklear (PMNlhcterofil). Uji fagositosis
dilakukan pada saat ayam berumur 6 minggu pada kelompok lA, 2A, 3A, 4A dan
5A. Sampel darah diambil dan vena brachiaJis. Ke dalam tabung reaksi diisi 5
25
mllanltan ®ficoll faque dingin, kernudian secara perlahan-Iahan ke dalam tabuog
tersebut diisi 5 ml darah ayam dari setiap kelompok sehingga terbentuk 2 lapisan
(Andreasen dan Latimer, 1989). Campuran disentrifus (l500g, 15 meDit),
kemudian supematan dibuang. Endapan yang terdiri atas eritrosit dan PMN
ditambahkan larotan NH4CI 0,87% (pH 7,2) dingin sambil dikocok kuat hingga
terjadi hemolisa sempuma. Suspensi disentrifus dan dicuci beberapa kali hingga
endapan PMN terbebas dari eritrosit. Endapan PMN disuspensikan dalam larutan
RPM!.
Uji viabilitas sel PMN menggunakan larutan tripan blue 0.4% dalam
larutan NaC) 0,81% dan 0,06% Na2HPO. sterH dan penghitungan lekosit
menggunakan hemositometer.
Penentuan jumlah sel bakteri untuk uji fagositosis dilakukan secara
spektrofotometer (/.. 620 om, transmisi 10%). Suspensi bakteri dica.mpur dengan
suspensi PMN dengan perbandingan 1000 : 1 (Wibawan dan Laemmler, 1994).
Kemudlan campuran diinkubasikan selama 30 menit pada subu 37' C.
Untuk mengetahui aktivitas dan kapasitas fagositosis campuran PMN dan
bakteri dibuat preparat ulas dan diwamai dengan Giemsa. Aktivitas fagositosis
adalah jumlah sci PMN yang menelan bakteri per 100 PMN. Kapasitas
fagositosis adalah jumlah bakteri yang ditelan oleh sci PMN per 50 PMN yang
menunjukkan aktivitas fagositosis (Wibawan dan Laemmler, 1994).
Uji Kemampuan clearance sel PMN
Kemampuan clearance sel PMN dihitung menurut metode (Anderson et
al., 1984). Campuran suspensi bakteri Salmonella dan sel PMN yang telah
diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 3-tC. Kemudian disentrifus (500g)
selama 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supematan.
Untuk mengetahui jumlah CFU bakteri Salmonella yang tidak dimakan
oleh PMN. supematan ditumbuhkan pada media SS agar. diinkubasi selama 24
jam pada suhu 3 -tc. Sedangkan pelet yang mengandung sel PMN yang mernakan
bakreri Salmonella disuspensikan kembali dan diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 3~C.
26
Setelah inkubasi kembali selarna 30 menit pada suspensi tersebut
ditambahkan aquades yang mengandung 0,01 % gelatin dan dikocok
menggunakan vortex selama 60 detik. Selanjutnya ditumbuhkan pada media SS
selama 24 jam agar dan CFU dihitung. Persentase yang bakteri Salmonella yang
dimakan dan mati dihitung rnenurut rumus Anderson el 01., 1984.
Persentase Salmonella yang dimakan PMN pada 30 menit dihitung dengan
rumus:
No : Jumlah CFU awal
N, : Jumlah CFU dalam supematan pada 30 menit
Persentase Salmonella yang mati oleh PMN pada 60 menit dihitung
deilgan nunus : r-:-:---cc:-------,
N2 -Nl xlOO N,
N, : Jumlah CFU dalam supernatan peda 30 menit
N, : Jumlah CFU peda pele! pada 60 menit
Reisolasi da. pengbitungaD jumlab SabnoneJJo. pada sekum
Untuk pemeriksaan reisolasi Salmonella, sampel yang diambil adalah
organ sekum. Organ sekum diambil dari setiap hewan percobaan. lsi organ
sekum ditimbang 1 gram, kemudian diencerkan dengan akuades steril secara
,bertingkat dan ditanam pada media SS agar (Lafont et a1., 1983; Miyamoto et al.,
1998; Seo et a1., 2000). Koloni yang tumbuh dihitung, sehlngga diketahui jumlah
CFU/gram. Selanjutnya dilakukan identifikasi.
27
Pemeriksaan Pases mati
Pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik dilakukan pada organ sistem
pencemaan yaitu usus dan hati; dan organ sistem pertahanan yaitu bursa Fabricius
yang merupakan organ limfoid primer dan sekal tonsil yang merupakan organ
Iimfoid selrunder. Serta dilakukan pemeriksaan morfometrik pada usus dan bursa
Fabricius.
Pemeriksaao makroskopik (patologi aDatomiIP A)
Pada I, 2, 3 dan 4 minggu pasco infeksi (pi) 4 ekor ayam dari setiap
kelompok dinekropsi. Pada saat nekropsi dilakukan pemeriksaan terhadap
perubahan patologi _i (pAimakroskopik) yang terjadi pada organ terutama
organ pencemaan (usus dan bati) dan organ pertahanan (bursa Fabricius dan sekol
tonsil). Pengan>a1an menggunakan sknr berdasarkan perkembangan lesie.
Pembuatan preparat histopatologi
Untok pemcriksaan mikroskopik (histopatologilHP) sampel organ
pencemaan dan pertahanan difiksasi dalam larutan buffer normal formalin (BNF)
100/., didehidrasi dengan a!kobol berbagai konsentras~ clearing dengan xylol dan
diembedded dalam parafin, Kemudian dipotong dengan ketebalan 5 ~m dan
sediaan diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE), Pengamatan menggunakan
skor berdasarkan perkembangan lesio mikroskopik.
Pemerlksaa. orgaa sistem peaceraaaa daD perla ......
Organ pencernaan yang diamati terutarna adalah usus dan hati. sedangkan
organ pertahanan yang diamati ada1ah bursa Fabricius dan sekal tonsil.
Pemeriksaan yang dilakukan pada organ-organ tersebut adalah sebagai ,berlkut :
28
Organ Pencernaan
Organ usus
Berat relatif usus
Organ usus ditimbang untuk mengetahui herat relatif organ tersebut
Berat relatif dihitung dengan mernbagi berat organ dengan berat badan.
Laas permukaan usus (per villi)
Penghitungan luas pennukaan usus dilakukan pada yeyunum dan ileum.
Penghitungan luas pennukaan per villi usus dilakukan dengan membual preparaI
histopatologi u,::us dan diwamai dengan hematoksilin dan eosin (HE).
Penghitungan luas pennukaan per villi dihitung menggunakan mikroskop
(Olympus) dengan pembesaran objektif 4 leali dan video mikromder (Video
measuring gauge IV - 560, FOR A company limited) poda 10 Iapong pandang
pada setiap preparat histopatologi. Kemudian dihitung luas pennukaan villi
dengan penghitungan menurut metode Iji et aI. (2001):
Luas pennukaan per villi = (c + bl (b xa)
a = tinggi villi
b = lebar apikal vi IIi
c = lebar basal villi
Kerapatan villi usus
Kerapatan villi dihitung pada yeyunum dan ileum. Kerapatan villi dihitung
dengan menghitung jumlah villi pada I mm panjang usus dengan menggunakan
mikroskop (Olympus) dengan pembesaran objektif 4 leali dan viden mikrometer
(Video measuring gauge IV - 560, FOR A .company limited). Jumlah villi
dihitung pada 10 lapang pandang pada setiap preparat histopatologi.
Pengamatan makroskopik usus
Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomifPA) dilakukan dengan
memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :
o = tidak: ada perubahan
I = pembendunganlhiperemi pembuluh darah
2 = enteritis kataralis
3 = enteritis hemorhagika
4 = nekrotik
Lesio mikroskopik usus
29
Usus dibagi menjadi 4 bagian yaitu duodemnn. yeyunum, ileum dan
sekum. Penilaian dilakukan pada 10 Japang pandang pada setiap preparat.
Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarlam derajat
perubahan yaitu :
o ~ tidak ada perubahan
I ~ perubendunganlhiperemi pembuluh darah
2 = edema
3 ~ pendarahan
4 ~ infiltrasi sel radang
5 = deskuamasi epitel
Jumlah set radaDg pada usus
Sel radang yang dihitung adalah makrofag, heterofil (PMN), limfosit dan
sel plasma. Sel radang dihitung pada bagian lamina propia mukesa pada
duodenum, yeyunum dan ileum dengan pembesaran objektif 100 kali pada 10
lapang pandang pada setiap preparat Kemudian dirata-ratakan.
Orgao bati
Berat relatif bati
Organ hati ditimbang uotuk mengetahui berat relatif organ tersebut. Berat
relatif dihitung dengan membagi berat organ dengan berat badan.
Pengamatan makroskopik bati
Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomiIPA) dilakukan dengan
memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :
o = tidak ada perubahan
1 = pembendungan dan wama belang
2 = bengkak dan pucat
3 = rapuh
4 = pendarahan
5 = nekrotik
Lesio mikroskopik uti
30
PenHaian dilakukan pada lO lapang pandang pada setiap prepanat.
Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarkan derajat
perubahan yaitu :
0= tidak ada perubahan
1 = pembendunganlhiperemi pembuluh darah
2 = degenerasi hepatosit
3 = infiltrasi sel radang
4 = nekrotik bepatosit
Hiperemilpembendungan dibeti penilaian yaitu riDpD (+) apabila
kurang dari 30 % dari pembuluh darah yang mengalami hiperemi daIam 1 lapang
pandang, sedaog (++) bila 30 - 50 %, parah (+++) bila <50 -70% dan .. agot
parah (++++) bila diatas 70% dalam satu iapang pandang.
Derajal untuk degenerasi sel bali dengan katagori: riaga. (+) bilaleljadi
degenerasi individual dalam satu lapang panclang; sedaog (++) leljadi fokus
degenerasi; parall (+++) leljadi mu\tifokus degenerasi dan saogat parah
(++++) bila teljadi degenerasi yang bersifut difus.
31
Organ pertahanao
Organ sistem pertahanan yang diperiksa dalam penelitian ioi adalah bursa
Fabricius dan sekal tonsil.
Bursa Fabricius
Berat relataf bursa Fabricius
Organ bursa Fabricius ditimbang untuk mengetahui herat relatif organ
tersebut. Berat relatif dihitung dengan membagi herat organ dengan berat badan.
Pengamataa makroskopik bursa Fabricius
Penilaian lesio makroskopik (patologi anatomiIPA) dilakukan dengan
memberikan skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :
o ~ tidak ada perubahan
1 = membesar dan edema
2 ~ pendarahan
3 ~nekrotik
Lesio mikroskopik bursa Fabricius
Perubahan mikroskopik yang diamati adaIab persentase edema, persentase
deplesi, jumlah makrofag dan jumlah sellimfoid yang mengalami nekrose.
_ deplesi adalab rataan jnmlah folikel limfoid yang mengalami
deplesi pada 10 plika dibagi dengan rataan jum lab folikel Iimfoid pada 10 plika
pada setiap preparal histopatologi.
Persentase edema adalah jumlah plika yang mengalami edema dibagi
jumlab plika yang terdapat pada bursa Fabricius.
Jumlah sel limfoid yang mengaiami nekro~ dan jumlah makrofag pada
folikel limfoid dihitung pada setiap folikel limfoid pada 10 plika pada setiap
preparat histopatologi. Sel limfoid yang mengalami nekrose adalah sel Iimfoid
yang mempunyai ioti piknotik (karyopiknotik) atau reksis (karyoreksis).
32
Pengamatan morfometrik folikellimfoid bursa Fabricius
Pengamatan morfometrik folikel limfoid bursa Fabricius adalah ukuran
panjang dan lcbar folikel limfoid. Pengukuran dilakukan pada setiap folikel
Iimfoid yang terdapat pada 10 plika pada setiap preparat dengan menggonakan
mikroskop (Olympus) dengan pembesaran objektif 4 kali dan video mikrometer
(Video measuring gauge IV - 560, FOR A company limited).
Sekal toDsil
Pengamata. makrookopik sekaI toasil
Penilaian lesio makroskopik (Patologi anatomiIPA) dilakukan dengan
memberikao skoring berdasarkan derajat perubahan yaitu :
o = tidak ada perubahan
1 =beagkak
2 = pendsrahan
3 = nekrotik
Lesio mikroskopik sekal tODsH
Penilaian dilakukan pada 10 lapang pandang pada setiap preparat.
Penilaian lesio dilakukan dengan memberikan skoring berdasarkan derajat
perubahan yaitu :
o = tidak ada perubahan
1 = pembendunganlhiperemi pembuluh darah
2 = edema
3 = pendarahan
4 = infiltrasi sel radang
5 = deskuamasi epilel
Jumlah germinal alire, pada sekat tonsil
Jumlah germinal center (Ge) yang terdapat pada sekal tonsil dihitung
pada 10 lapang pandang dengan pembesaran objektif 10 kali pada setiap preparat
histopatologi.
33
Analisis Data
Data kuantitatif yang diperoJeh dalam penelitian ini diuji dengan analisa
sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji multiple Duncan uotuk mengetahui
perbedaan antar perlakuan (Steel dan Torrie, 1991). Data non parametrik yang
diperoleh dalam penelitian ini dianalisa dengan uji Friedman. Data seianjutnya
dianalisis menggunakan software SAS release 8,2