Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo 557–565 (2013)

Prospective Evaluation of B-type Natriuretic Peptide

Concentrations and the Risk of Type 2 Diabetes in Women

Brendan M. Everett,1,2* Nancy R. Cook,1 Daniel I. Chasman,1 Maria C. Magnone,3 Maria Bobadilla,3

Nader Rifai,4 Paul M Ridker,1,2 and Aruna D. Pradhan1,5

Avaliação Prospectiva das Concentrações de Peptídeos Natriuréti-

cos do tipo B e o Risco de Diabetes Tipo 2 nas Mulheres

Brendan M. Everett1,2,*, Nancy R. Cook1, Daniel I. Chasman1, Maria C. Magnone3, Maria Bobadilla3,

Nader Rifai4, Paul M Ridker1,2 and Aruna D. Pradhan1,5

1 Division of Preventive Medicine,

2 Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical

School, Boston, MA;

3 F. Hoffman-La Roche, Pharma, Metabolic and Vascular Diseases, Basel, Switzerland;

4 Division of Laboratory Medicine, Department of Pathology, Children's Hospital, Boston, MA;

5 Division of Cardiovascular Medicine, VA Boston Medical Center, Boston, MA.

* Envie correspondência para esse autor para: Brendan M. Everett, Division of Preventive Medicine, Brigham and Women's Hospital,

900 Commonwealth Ave., Boston, MA 02115. Fax 617-232-3541; e-mail: beverett@partners.org.

Abstrato

FUNDAMENTOS: Dados animais sugerem

que os peptídeos natriuréticos desempenham

um importante papel no metabolismo da

energia, contudo estudos prospectivos que

avaliam uma relação entre esses peptídeos e

diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) nos huma-

nos são poucos e os resultados são conflitan-

tes.

MÉTODOS: Nós usamos uma abordagem

prospectiva de grupos de casos (n = 491

T2DM casos, n = 561 subgrupo de referên-

cia) dentro do Estudo da Saúde das Mulhe-

res para avaliar as concentrações da porção

N terminal de peptídeos natriuréticos tipo

pro B (NT-proBNP) e o risco de T2DM in-

cidente. Nós também testamos associações

entre 4 variantes comuns nos genes A e B

dos peptídeos natriuréticos (NPPA e NPPB)

e concentrações de NT-proBNP (n = 458) e

T2DM incidente (n = 1372 casos entre 22

607 mulheres).

RESULTADOS: Os indivíduos dos casos

tiveram um índice de massa corpórea média

mais alto (29.4 vs 25.0 kg/m2, P < 0.001) e

concentrações de NT-proBNP mais baixas

(faixa interquartil) [46.8 ng/L (26.1–83.2)

contra 66.7 ng/L (39.3–124.7), P < 0.001].

Em riscos proporcionais os modelos se ajus-

tam para fatores de risco estabelecidos para

diabetes, mulheres no quartil mais alto da

concentração NT-proBNP (≥117.4 ng/L)

tiveram uma redução de 49% no risco de

T2DM [coeficiente de risco (HR) 0.51,

0.30–0.86, P = 0.01] relativo àqueles no

quartil mais baixo. Duas das 4 variantes tes-

tadas no NPPA e NPPB (rs632793,

rs198389) estavam associadas com elevadas

concentrações de NT-proBNP e risco redu-

zido de T2DM. Por exemplo, cada cópia do

alelo menor do rs632793 estava associada

com elevado NT-proBNP [β (SE) = 0.201

(0.063), P < 0.01] e risco reduzido de T2DM

(HR 0.91, 0.84–0.989, P = 0.026).

CONCLUSÕES: Concentrações de NT-

proBNP que estão altas, mas ainda dentro do

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intervalo de referência, estão associadas com

risco reduzido de diabetes incidente nas mu-

lheres e apoiam um papel favorável para os

peptídeos natriuréticos na prevenção do

T2DM.

Os papéis dos peptídeos natriuréticos em

promover a vasodilatação e a natriurese são

bem conhecidos (1, 2), e testes tanto para a

forma ativa do peptídeo natriurético do tipo

B (BNP)6 quanto para o fragmento amino-

terminal inativo do peptídeo (NT-proBNP)

ganharam larga aceitação como ferramentas

para o diagnóstico da insuficiência cardíaca

no cenário do tratamento agudo (3, 4). Pep-

tídeos natriuréticos do tipo B também de-

sempenham um importante papel na regula-

ção da lipólise nos adipócitos (5, 6), e vários

estudos epidemiológicos cruzados têm rela-

tado associações inversas entre concentra-

ções de BNP e índice de massa corpórea

(BMI), concentrações de glicose, medidas

de resistência à insulina, e o número de

componentes da síndrome metabólica (7–9).

Entretanto, estudos prospectivos da relação

entre concentrações de BNP e diabetes mel-

litus do tipo 2 incidente (T2DM) são escas-

sos e inconsistentes (10–12). Para melhor

entender os possíveis efeitos metabólicos do

sistema dos peptídeos natriuréticos, nós pri-

meiro medimos as concentrações de linha de

base do NT-proBNP e vários outros marca-

dores plasmáticos do metabolismo e da in-

flamação em mulheres saudáveis de meia

idade e mais velhas registradas no Estudo da

Saúde das Mulheres (WHS) (13). Nós então

examinamos as correlações entre esses bio-

marcadores e as concentrações de NT-

proBNP e testamos para evidência da asso-

ciação entre concentrações de NT-proBNP e

T2DM incidente num estudo prospectivo de

grupos de casos de mulheres do WHS. Nós

também conduzimos uma série de análises

para determinar se variantes genéticas co-

muns previamente relatadas se associam

com concentrações de NT-proBNP e T2DM

demonstrou evidência semelhante de associ-

ação em nosso grupo de mulheres.

Materiais e Métodos

PARTICIPANTES DO ESTUDO

Participantes do estudo foram registradas no

WHS, ensaio clínico randomizado fatorial 2

x 2 duplo cego placebo controlado da aspiri-

na e da vitamina E na prevenção da doença

cardiovascular e do câncer entre 39 876 pro-

fissionais femininas da saúde com idade de

45 anos e mais velhas (13). A inscrição co-

meçou em 1992, participantes estavam livres

de doença cardiovascular no início do estu-

do, e um total de 28 345 mulheres forneceu

uma amostra sanguínea no início do estudo.

Entre essas, 19 871 (70.1%) estavam em

jejum na hora da coleta da amostra. Essas

amostras foram centrifugadas e armazenadas

em nitrogênio líquido até análise laboratori-

al. A porção randomizada do estudo foi

completada em Março de 2004, e mulheres

foram convidadas a participar de acompa-

nhamento de observação contínuo. Partici-

pantes têm sido acompanhadas continua-

mente para doença cardiovascular incidente

e T2DM. Três diferentes subgrupos de par-

ticipantes do WHS foram identificados para

análises do NT-proBNP e T2DM incidente,

variação genética comum e concentrações

de NT-proBNP, e variação genética comum

e T2DM incidente são componentes desse

estudo.

ASSOCIAÇÃO PROSPECTIVA DO

NT-proBNP E DO T2DM

Para a análise prospectiva das concentrações

de NT-proBNP e T2DM incidente, todos os

indivíduos foram selecionados dentre mu-

lheres sem diabetes diagnosticada no início

do estudo [ausência de auto relato de T2DM

e hemoglobina A1c (Hb A1c) <6.5%] e com

amostras adequadas de sangue em jejum no

início do estudo. Nós criamos um estudo de

grupos de casos primeiro selecionando uma

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amostra aleatória de casos de T2DM inci-

dente (n = 491) dentre todo o grupo do

WHS. Casos foram definidos como partici-

pantes não diabéticas do WHS que fornece-

ram amostras de sangue no início do estudo

e subsequentemente desenvolveram T2DM

recentemente diagnosticado. Um subgrupo

selecionado aleatoriamente de mulheres com

amostras disponíveis de sangue foi então

escolhido como um grupo de risco de refe-

rência (n = 561). A técnica de amostragem

excluiu mulheres com T2DM no início do

estudo, contudo mulheres que desenvolve-

ram T2DM durante o acompanhamento fo-

ram escolhidas para inclusão no subgrupo de

referência. Por acaso, 50 dessas mulheres

foram selecionadas para o subgrupo de refe-

rência, de modo que o grupo caso-coorte

incluía 491 casos de T2DM incidente e 511

não casos. A seleção do subgrupo de refe-

rência foi estratificada por raça/etnia (branco

contra não branco) assim como idade (ca-

madas de 5 anos ) para combinar aproxima-

damente a distribuição entre os casos de

T2DM (incluídos nesse estudo) assim como

um grupo separado de casos de doença car-

diovascular incidente (não incluídos nesse

estudo).

VARIANTES COMUNS NO NPPA-

NPPB E NAS CONCENTRAÇÕES

DE NT-proBNP

Para validar associações anteriormente rela-

tadas entre as variantes genéticas comuns

nos genes precursores dos peptídeos natriu-

réticos A (NPPA)7 e nos genes precursores

dos peptídeos natriuréticos B (NPPB) e no

NT-proBNP, nós usamos dados de mulheres

selecionadas para o subgrupo de referência

que também tiveram genotipagem realizada

como parte do mais amplo Estudo da Saúde

do Genoma das Mulheres, que é um subgru-

po das mulheres inscritas no WHS. O Estu-

do da Saúde do Genoma das Mulheres inclui

>25 000 mulheres com dados disponíveis de

genotipagem. O estudo é descrito em detalhe

em outra parte (14). Das 561 mulheres sele-

cionadas para inclusão no subgrupo de refe-

rência para esse estudo, 458 eram de des-

cendência Européia e tinham tanto informa-

ção de genotipagem quanto concentrações

de NT-proBNP disponívies.

VARIANTES COMUNS NO NPPA-

NPPB E NA T2DM INCIDENTE

Para testar se a variação comum no NPPA e

NPPB estava associada com T2DM inci-

dente no WHS e no Estudo da Saúde do

Genoma das Mulheres, nós identificamos

todas as mulheres de descendência Européia

com informação de genotipagem que tinham

Hb A1c <6.5% e não tinham um diagnóstico

clínico de T2DM no início do estudo. No

total, havia 22 607 mulheres nesse grupo

com 1372 casos de T2DM incidente.

VERIFICAÇÃO DE T2DM

T2DM incidente foi identificado de uma

maneira idêntica para todas as participantes

do WHS e nesse estudo. Possíveis casos de

T2DM incidente foram inicialmente identi-

ficados por auto relato em questionários

anuais que perguntavam se e quando a parti-

cipante tinha sido diagnosticada com T2DM

desde o início do estudo. Casos auto relata-

dos foram então confirmados por entrevistas

por telefone administradas por médicos

usando os critérios diagnósticos da Associa-

ção Americana de Diabetes (15) ou um

questionário suplementar auto administrado.

Num estudo de validação, a confirmação

baseada tanto na entrevista quanto no ques-

tionário suplementar produziu valores predi-

tivos positivos >90% em comparação com a

revisão dos prontuários (16). Em particular,

o valor preditivo positivo do questionário

suplementar era de 99% (95% CI 97%–

100%). Em geral, em 95% de todos os even-

tos auto relatados de T2DM, informação

suficiente para confirmação ou desconfirma-

ção do endpoint foi obtido, e apenas casos

confirmados foram usados nessa análise. Já

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557–565 (2013)

que a prevalência do T2DM não diagnosti-

cado entre adultos Americanos de meia ida-

de é tão alta, e visto que essa análise foi cri-

ada para investigar o papel do NT-proBNP

como um determinante de doença futura,

nós limitamos nossa amostra a indivíduos

com uma linha de base Hb A1c <6.5%.

ANÁLISE LABORATORIAL

Plasma NT-proBNP foi medido usando-se

um teste de imunoensaio de eletroquimio-

luminescência fornecido pela Roche Diag-

nostics. O teste possui variabilidade dia-a-

dia em concentrações de 175, 434, e 6781

ng/L de 3.2%, 2.4%, e 2.2%, respectivamen-

te. Além do NT-proBNP, amostras plasmá-

ticas foram medidas para insulina, leptina,

resistina, interleucina-6, ácidos graxos li-

vres, colesterol LDL oxidado, creatinina, Hb

A1c, colesterol total, colesterol LDL, coleste-

rol HDL, triglicerídeos, proteína C reativa

de alta sensibilidade (hsCRP), e molécula de

adesão intercelular solúvel 1 num laborató-

rio central certificado pelo Instituto Nacio-

nal do Coração, Pulmão, e Sangue/CDC e

Programa de Prevenção da Padronização dos

Lipídios. Detalhes dos testes usados e medi-

das da variação do dia-a-dia estão disponí-

veis sob pedido.

Amostras de DNA foram genotipadas dentro

da tecnologia Infinium II da Illumina (painel

humano HAP300) como anteriormente des-

crito (14). Todas as amostras eram obrigadas

a ter genotipagem bem sucedida usando o

software BeadStudio v. 3.3 (Illumina) para

pelo menos 98% dos polimorfismos de nu-

cleotídeo único (SNPs). SNPs com taxas de

chamadas <90% e amostras com percenta-

gem de genótipos ausentes >2% ou que se

desviaram de equilíbrio Hardy-Weinberg

foram removidos da análise. Nós identifica-

mos 4 polimorfismos de nucleotídeo único

(rs198358, rs5068, rs632793, e rs198389)

que tinham estado associados com concen-

trações de NT-proBNP, concentrações de

peptídeos natriuréticos atriais, ou aspectos

da síndrome metabólica e/ou T2DM na lite-

ratura (10, 17–20). rs198358 foi diretamente

genotipado com 99.25% de sucesso. A dose

estimada de alelos no rs5068, rs632793, e

rs198389 foi imputada usando o programa

MACH 1.0.16.

(http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/ma

ch/index.html) e dados do HapMap (21–23).

Pontuações da qualidade da imputação vari-

aram de 0.962 (rs632793) até 0.998

(rs5068).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Associação prospectiva do NT-proBNP e

do T2DM.

Dados para esse componente do estudo fo-

ram analisados como um estudo de grupos

de casos usando-se ponderação apropriada

das observações (24, 25). Visto que a amos-

tragem foi estratificada por raça/etnia e ida-

de, nós usamos ponderação específica. (26).

Características da população em geral foram

estimadas usando-se ponderações iguais ao

inverso das probabilidades de inclusão na

amostra do subgrupo usando a abordagem

da ponderação de Horvitz–Thompson no

Proc SurveyMeans no SAS 9.2 (24, 27).

Frequências brutas e valores médios [faixa

interquartil (IQR)] das características bio-

químicas e clínicas do início do estudo fo-

ram comparadas usando-se χ2

e testes de

soma de classificação Wilcoxon. Frequên-

cias populacionais estimadas das variávies

categóricas foram comparadas usando-se o

teste Rao–Scott χ2 no Proc SurveyFreq no

SAS 9.2. Médias populacionais estimadas

para variáveis contínuas nos casos e subgru-

po foram comparadas usando-se regressão

linear ponderada no Proc SurveyReg no

SAS 9.2. Associações entre NT-proBNP e

outros marcadores metabólicos séricos, in-

cluindo Hb A1c, creatinina, taxa de filtração

glomerular estimada (eGFR), insulina, greli-

na e adiponectina foram computados no

subgrupo usando-se coeficientes de correla-

ção Spearman.

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

Concentrações de NT-proBNP foram dividi-

das em quartis crescentes baseados na distri-

buição no subgrupo de referência de mulhe-

res não diabéticas. Modelos de risco propor-

cionais Cox ajustados para o tamanho da

amostra ponderada (28) foram usados para

calcular coeficientes de risco ajustados

(HRs) e 95% CIs para T2DM incidente de

acordo com o quartil crescente do NT-

proBNP, com o quartil mais baixo escolhido

como a categoria de referência. Testes para

tendência através dos quartis do NT-proBNP

foram calculados usando-se um grupo variá-

vel indicador para o valor médio de cada

quartil do NT-proBNP. Nós também avali-

amos a associação entre NT-proBNP e dia-

betes incidente modelados por incremento

1SD na escala logarítmica transformada.

Mulheres sem informação completa para

todas as covariáveis incluídas nos modelos

multivariáveis foram excluídas daquelas

análises. Um número máximo de 27 mulhe-

res foi excluída da análise primária por cau-

sa da falta de informação de covariáveis.

Visto que os resultados da análise primária

descritos acima sugeriram a possibilidade de

um efeito limite, nós conduzimos uma análi-

se exploratória na qual nós analisamos vá-

rias concentrações de NT-proBNP como

possíveis pontos de corte dicotômicos para

associação com T2DM. A análise primária

sugeriu que o percentil de 75% (117.4 ng/L)

seria um possível ponto de corte; nós então

selecionamos o valor do NT-proBNP cor-

respondente aos percentis de 50%, 55%,

60%, 65%, 70%, 80%, 85%, e 90% da dis-

tribuição do NT-proBNP no subgrupo de

referência. O risco de T2DM para mulheres

com valores em ou acima de cada limite foi

comparado com um grupo de referência

composto de mulheres com valores NT-

proBNP < percentil de 50% usando-se mo-

delos de risco proporcionais Cox como des-

crito para a análise primária. Nós também

realizamos análises de sensibilidade que

censuraram mulheres quando elas desenvol-

veram doença cardiovascular (n = 14) ou

insuficiência cardíaca congestiva (n = 8) ou

antes de desenvolver diabetes ou no fim do

acompanhamento. Todas as análises foram

realizadas usando-se SAS 9.1 ou 9.2 para

Unix.

Variantes comuns nas concentrações de

NPPA-NPPB e de NT-proBNP.

Modelos de regressão linear ajustados por

idade, BMI, pressão arterial sistólica, e crité-

rios de seleção de indivíduos (T2DM preva-

lente, T2DM incidente, doença cardiovascu-

lar incidente, tanto a doença cardiovascular

incidente quanto o T2DM, ou subgrupo)

foram usados para testar a evidência de as-

sociação entre rs198358, rs5068, rs632793,

e rs198389 e concentrações de NT-proBNP

logarítmicas transformadas naturais no sub-

grupo de referência. Cada SNP foi testado

para evidência de associação com BMI,

pressão arterial sistólica, e concentração de

insulina em jejum. Evidência para desvio de

um modo aditivo de herança foi avaliada

incluindo-se um prazo para testar a não line-

aridade no modelo de regressão linear.

Variantes comuns no NPPA-NPPB e na

T2DM Incidente.

Modelos de risco proporcionais Cox foram

construídos para testar a evidência de asso-

ciação entre rs198358, rs5068, rs632793, e

rs198389 e T2DM incidente. Modelos foram

ajustados por idade, BMI, (BMI)2, uso da

terapia hormonal, histórico familiar de dia-

betes, exercício pelo menos uma vez por

semana, e consumo de álcool pelo menos 1

drink por dia. Cada SNP foi testado para

evidência de associação com BMI, uso da

terepia hormonal, histórico familiar de dia-

betes, exercício e consumo de álcool. Evi-

dência para desvio de um modo aditivo de

herança foi avaliada incluindo-se um prazo

para testar a não linearidade no modelo de

regressão de riscos proporcionais.

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

Resultados

ASSOCIAÇÃO PROSPECTIVA DO

NT-proBNP E DO T2DM

Características do início do estudo das mu-

lheres que subsequentemente desenvolveram

T2DM e as mulheres selecionadas para in-

clusão no subgrupo de referência, tanto nas

análises brutas quanto após reponderar a

amostragem a partir da população maior do

WHS, são mostradas na Tabela 1. Como

previsto, tanto na análise bruta quanto na

reponderada, mulheres que desenvolveram

T2DM tinham BMI e pressão arterial mais

altos, eram mais prováveis de ter histórico

familiar de diabetes, consumiam álcool e se

exercitavam menos frequentemente, e ti-

nham insulina de jejum e concentrações de

hsCRP mais altas (cada P < 0.0001). Tanto

na análise bruta quanto na reponderada, as

concentrações de NT-proBNP eram mais

baixas entre as mulheres que subsequente-

mente desenvolveram T2DM (cada P <

0.001). A duração média (IQR) do acompa-

nhamento para todas as mulheres incluídas

na amostra dos casos dos grupos foi de 13.4

(7.7–11.6) anos.

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Tabela 1. Comparações das características de início de estudo dos casos de T2DM e o subgrupo aleatório, na amostra e reponderado para o grupo total do WHSa

Características de início de estudo

Bruto Reponderado para População

Casos de Diabetes

Subgrupo de Referência

P Casos de Diabetes Subgrupo de Referência

P

n 491 561 1228 19 277

Idade, anos 53.3 (49.0–59.8) 56.7 (50.9–64.2) <0.0001 53.6 (49.3–59.7) 53.5 (49.2–59.3) 0.53

Raça branca 450 (92) 516 (92) 0.37 1134 (92.4) 18468 (95.8)

BMI, kg/m2 29.4 (25.8–33.9) 25.6 (23.0–28.3) <0.0001 9.6 (26.0–33.9) 25.6 (22.9–28.3) <0.0001

Pressão arterial, mmHg 135 (125–145) 125 (115–135) <0.0001 135 (125–145) 125 (115–135) <0.0001

Fumo corrente 63 (12.9) 56 (10.0) 0.18 159 (12.9) 1999 (10.4) 0.29

Histórico familiar de diabetes 208 (42.4) 158 (28.2) <0.0001 520 (42.3) 5178 (26.9) <0.0001

Consumo de álcool ≥1 drink por dia 27 (5.5) 45 (8.0) 0.06 361 (29.4) 7749 (40.2) 0.0001

Exercício ≥1 vez por semana 159 (32.4) 259 (46.2) <0.0001 399 (32.5) 8991 (46.6) <0.0001

Uso da terapia hormonal 209 (42.7) 242 (43.3) 0.6 533 (43.5) 8379 (43.6) 0.8

Uso randomizado de aspirina 248 (50.5) 275 (49.0) 0.66 617 (50.2) 9312 (48.3) 0.41

eGFR, mL · min−1 · (1.73 m2)−1 112.5 (92.4–141.7) 92.6 (7584–110.6) <0.0001 112.7 (92.6–141.7) 96.1 (80.5–115.7) <0.0001

Hb A1c, % 5.3 (5.1–5.5) 5.0 (4.9–5.2) <0.0001 5.3 (5.1–5.5) 5.0 (4.8–5.2) <0.0001

Insulina de jejum, μIU/mL 12.5 (8.4–18.9) 6.8 (4.4–10.7) <0.0001 12.5 (8.4–18.8) 6.9 (4.3–10.7) <0.0001

hsCRP, mg/L 4.0 (2.2–7.0) 2.2 (0.9–4.6) <0.0001 4.1 (2.3–7.0) 2.1 (0.9–4.5) <0.0001

NT-proBNP, ng/L 46.8 (26.1–83.2) 65.2 (37.8–117.4) <0.0001 46.9 (26.4–83.1) 58.7 (35.2–103.5) <0.0001

ln(NT-proBNP) 3.9 (3.3–4.4) 4.2 (3.7–4.8) <0.0001 3.9 (3.3–4.4) 4.1 (3.6–4.6) <0.001

a Dados são médio (IQR) ou n (%).

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557–565 (2013)

Correlações entre concentrações de início de

estudo do NT-proBNP e biomarcadores in-

flamatórios, lipídicos, metabólicos e antro-

pométricos de início de estudo no subgrupo

de referência são mostradas na Tabela 2. Na

análise não ajustada, idade (0.37), insulina

(−0.25) e leptina (−0.18) parecem estar pelo

menos tão intimamente correlacinadas com

as concentrações de NT-proBNP quanto os

outros correlatos conhecidos, incluindo BMI

(−0.17), pressão arterial (0.06), e eGFR

(−0.20). Após ajuste por idade, e por idade e

BMI, correlações entre NT-proBNP e insu-

lina persistiram (−0.25 e −0.18, respectiva-

mente). Nem Hb A1c e nem qualquer um dos

biomarcadores inflamatórios mostrou qual-

quer correlação importante com NT-

proBNP.

Tabela 2. Correlações Spearman entre NT-proBNP e outros biomarcadores metabólicos no subgrupo de referência, uma subamostra representativa do WHS.

Característica ou Biomarcador Não ajustado

Ajustado por Idade

Ajustado por Idade e BMI

ρ P ρ P ρ P

Idade, anos 0.371 <0.0001

BMI, kg/m2 −0.165 <0.0001 −0.185 <0.0001

Pressão arterial sistólica, mmHg 0.059 0.17 −0.044 0.3 0.025 0.57

Biomarcadores metabólicos

Insulina, μIU/mL −0.245 <0.0001 −0.248 <0.0001 −0.180 <0.0001

Hb A1c, % −0.039 0.36 −0.106 0.01 −0.069 0.1

Grelina, pg/mL 0.051 0.23 0.051 0.23 −0.015 0.72

Leptina, ng/mL −0.177 <0.0001 −0.178 <0.0001 −0.070 0.1

Resistina, ng/mL −0.033 0.43 −0.073 0.08 −0.051 0.23

Creatinina, mg/dL −0.014 0.74 −0.054 0.2 −0.052 0.22

eGFR, mL · min−1 · (1.73 m2)−1 −0.195 <0.0001 −0.048 0.26 0.07 0.1

Biomarcadores lipídicos

Colesterol total, mg/dL −0.130 0.002 −0.209 <0.0001 −0.196 <0.0001

Colesterol LDL, mg/dL −0.151 0.0004 −0.228 <0.0001 −0.202 <0.0001

Colesterol LDL Oxidado −0.027 0.52 −0.087 0.04 −0.054 0.21

Colesterol HDL, mg/dL 0.143 0.0007 0.132 0.002 0.07 0.1

Triglicerídeos, mg/dL −0.110 0.009 −0.148 0.0005 −0.098 0.02

Ácidos graxos livres mEq/L 0.031 0.46 −0.048 0.26 −0.022 0.61

Biomarcadores inflamatórios

hsCRP, mg/L 0.016 0.7 −0.026 0.54 0.05 0.24

IL-6, pg/mL 0.076 0.07 −0.009 0.83 0.047 0.27

Molécula de adesão intracelular solúvel 1, ng/mL

0.006 0.89 −0.090 0.03 −0.061 0.15

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

O risco de T2DM incidente de acordo com

os quartis crescentes das concentrações de

NT-proBNP é mostrado na Tabela 3. Em

modelos ajustados por idade e raça, concen-

trações crescentes de NT-proBNP estavam

associadas com um reduzido risco de T2DM

incidente para quartis 2–4 comparados com

quartil 1. Após ajuste por BMI, as reduções

observadas no risco de T2DM foram atenu-

adas nos quartis 2–4, contudo permaneceram

estatisticamente significativas para a catego-

ria mais alta em comparação com a mais

baixa do NT-proBNP (HR 0.54, 95% CI

0.33–0.89, P = 0.015). Essa relação persistiu

após ajuste para eGFR, uso da terapia hor-

monal, histórico familiar de diabetes, ativi-

dade física, e consumo de álcool (HR 0.51,

95% CI 0.30–0.86, P = 0.011) e foi atenuada

por ajuste adicional para as concentrações de

insulina do início do estudo (HR 0.58, 95%

CI 0.35–0.97, P = 0.039). Nós observamos

uma redução de 20% no risco de T2DM

incidente por aumento unitário 1SD nas

concentrações de NT-proBNP logarítmicas

transformadas em modelos plenamente ajus-

tados (Tabela 3, Modelo 4; HR 0.80, 95%

CI 0.67–0.96, P = 0.016). Essa estimativa de

ponto não mudou substancialmente quando

Hb A1c foi adicionada ao modelo (HR 0.80,

95% CI 0.65–0.99, P = 0.044). Nenhuma

mudança significativa nas estimativas de

risco foi notada após ajuste adicional para

hsCRP ou após a substituição das medidas

alternativas de adiposidade (circunferência

da cintura, circunferência do quadril, ou

coeficiente cintura/quadril) para BMI em

modelos ajustados (dados não mostrados ).

Os resultados da análise categórica sugeri-

ram a possibilidade de um efeito limite, no

qual apenas mulheres com as mais altas

concentrações de NT-proBNP estavam com

reduzido risco de T2DM. Numa análise

exploratória, nós examinamos o risco de

T2DM incidente para mulheres com concen-

trações de NT-proBNP com ou acima dos

percentils de 55% até 90%, usando mulheres

com concentrações de NT-proBNP < per-

centil de 50% (<65.2 ng/L) como o grupo

de referência (Fig. 1). Como pode ser visto,

a associação com T2DM incidente é estatis-

ticamente significativa para pontos de corte

do NT-proBNP do percentil de 75% e mais

alta. Por exemplo, mulheres com concentra-

Tabela 3. Risco de diabetes incidente de acordo com a concentração de início de estudo do NT-proBNP.a

Modelo Quartil 1 Quartil 2 Quartil 3 Quartil 4 tendência

P Por 1 unidade SD

b

Faixa NT-proBNP, ng/L <37.4 37.4 to <64.2 64.2 to <117.0 ≥117.4

Modelo 1 1 0.56 (0.40–0.78) 0.61 (0.43–0.85) 0.40 (0.27–0.60) <0.001 0.68 (0.58–0.79)

valor P 0.0006 0.004 <0.0001 <0.001

Modelo 2 1 0.84 (0.56–1.26) 0.93 (0.61–1.42) 0.54 (0.33–0.89) 0.047 0.79 (0.67–0.94)

valor P 0.4 0.75 0.015 0.007

Modelo 3 1 0.88 (0.58–1.34) 0.97 (0.62–1.51) 0.51 (0.30–0.86) 0.041 0.78 (0.65–0.93)

valor P 0.56 0.89 0.011 0.006

Modelo 4 1 0.96 (0.63–1.47) 0.99 (0.63–1.56) 0.58 (0.35–0.97) 0.1 0.80 (0.67–0.96)

valor P 0.86 0.97 0.039 0.016

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

ções de NT-proBNP ≥ percentil de 75%

(117.4 ng/L) estavam em risco 47% menor

de T2DM (HR 0.53, 95% CI 0.33–0.86, P =

0.009) do que aqueleas com concentrações

de NT-proBNP abaixo da média após ajuste

para todos os confundidores exceto insulina.

Ajuste adicional para insulina não alterou

substancialmente os resultados (HR 0.58,

95% CI 0.36–0.93, P = 0.024).

Fig. 1. Risco relativo ajustado de T2DM

incidente calculado para uma faixa de possí-

veis pontos de corte para NT-proBNP.

Possíveis pontos de corte foram escolhidos

baseados na distribuição das concentrações

de NT-proBNP no subgrupo de referência.

O risco de diabetes incidente é calculado

para mulheres com concentrações de NT-

proBNP no ou acima do valor indicado

comparado com mulheres com concentra-

ções de NT-proBNP < percentil de 50%

(65.2 ng/L). HRs e 95% dos CIs são ajusta-

dos por idade, raça, BMI (kg/m2), eGFR,

uso da terapia hormonal, histórico familiar

de diabetes, exercício pelo menos uma vez

por semana, e consumo de álcool de 1 drink

ou mais por dia. Ajuste adicional para con-

centrações de insulina de início de estudo

não alterou os resultados substancialmente

(dados não mostrados).

* Adjusted relative risk of incident type 2

diabetes = risco relativo ajustado de diabetes

tipo 2 incidente

* NT-proBNP threshold percentile (ng/L) =

percentil do limite do NT-proBNP (ng/L)

* 50th

= 50%

Nós não observamos qualquer evidência de

interação estatística entre as concentrações

de NT-proBNP acima ou abaixo desse limite

e da categoria do WHO do BMI (<25, 25 to

<30, 30+ kg/m2), histórico familiar de diabe-

tes, pressão arterial sistólica, ou idade acima

ou abaixo de 53 anos (a média no estudo

populacional). Numa análise de sensibilida-

de, nós construímos modelos de risco pro-

porcionais separados que censuraram as

mulheres quando elas desenvolveram ou

doença cardiovascular incidente ou insufici-

ência cardíaca congestiva. Nossos resultados

permaneceram inalterados.

VARIANTES COMUNS NAS

CONCENTRAÇÕES DE NPPA-

NPPB E DE NT-proBNP

Os resultados para o teste de associação en-

tre SNPs rs198358, rs5068, rs632793, e

rs198389 são mostrados na Tabela 4. Como

pode ser visto, nós observamos evidência

estatisticamente significativa de associação

entre concentrações de NT-proBNP de iní-

cio de estudo logarítmicas transformadas e

rs632792 e rs198389. Cada cópia do alelo

menor em cada SNP aumentou as concen-

trações de NT-proBNP logarítmicas trans-

formadas em 0.2012 e 0.1860 unidades SD,

respectivamente. Nenhuma evidência esta-

tisticamente significativa de desvio de um

modo aditivo de herança foi detectada para

qualquer um dos SNPs. Embora nenhum dos

SNPs estivesse significativamente relacio-

nado com pressão arterial, nós não detecta-

mos uma associação estatisticamente signi-

ficativa entre BMI e rs632792 [β (SE) por

1 kg/m2 de aumento no BMI = −0.69682

(0.33556), P = 0.038] e rs198389 [−0.66137

(0.32973), P = 0.046]. Incluindo um prazo

de interação entre cada SNP e BMI em mo-

delos de regressão linear das concentrações

de NT-proBNP logarítmicas transformadas

que não melhorou o ajuste do modelo.

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

a Para cada um dos SNPs, o menor valor P foi visto quando um modo aditivo (em vez do dominante) de herança foi suposto.

b Associação por alelo com 1SD de mudança em concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas, ajustadas por ida-

de, BMI, e pressão arterial sistólica. A concentração média (SD) de NT-proBNP logarítmica transformada no subgrupo de re-

ferência é 4.254 (0.821).

c Nas participantes de descendência Européia com informação de genotipagem disponível e concentrações de NT-proBNP.

rs198358 foi diretamente genotipado; informação de genotipagem para os SNPs restantes foi imputada.

d Teste de associação usou genótipos diretamente medidos. Os resultados não diferiram quando genótipos ausentes no

rs198358 (n = 1, or 0.22%) foram substituídos com a dose estimada de genótipo imputada.

Tabela 4. Associação de variantes comuns na região NPPA-NPPB com concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas.a

SNP Cromossomo Posição Alelo Me-nor/Maior

Frequência do alelo menorc Pontuação da

Qualidade

Associaçãob

β (SE) P

rs198358d 1 11826663 C/T 0.236 N/A

0.0829 (0.0680)

0.228

rs5068 1 11828561 G/A 0.059 0.998 −0.0035 (0.1255)

0.978

rs632793 1 11833264 G/A 0.409 0.962 0.2012

(0.0631) 0.0015

rs198389 1 11841858 G/A 0.427 0.987 0.1860

(0.0620) 0.0029

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

VARIANTES COMUNS NO NPPA-

NPPB E NO T2DM INCIDENTE

Quando cada um dos 4 SNPs foi testado

para evidência de associação com o T2DM

incidente em modelos Cox ajustados (n =

22607 com 1372 casos de T2DM inciden-

te), nós observamos evidência de associação

tanto para rs632793 quanto para rs198389.

O coeficiente de risco por alelo para T2DM

foi 0.91 (95% CI 0.84–0.989; P = 0.026)

para rs632793 e 0.92 (95% CI 0.85–0.995;

P = 0.036) para rs198389. O efeito dos

SNPs ou no rs632793 ou no rs198389 so-

bre o risco de T2DM é consistente com a

direção de seu efeito sobre as concentrações

de NT-proBNP. Entretanto, nós não obser-

vamos associação estatisticamente significa-

tiva nem para o rs198358 (por alelo HR

0.94, 95% CI 0.86–1.03, P = 0.18) e nem

para o rs5068 (por alelo HR 0.98, 95% CI

0.83–1.16, P = 0.84). Nenhuma evidência

estatisticamente significativa de desvio de

um modo aditivo de herança foi detectada

para qualquer um dos SNPs, e nenhuma as-

sociação significativa com BMI, histórico

familiar de diabetes, exercício, uso da tera-

pia hormonal, ou consumo de álcool foram

notados.

Discussão

Nessas análises prospectivas, nós relatamos

uma associação estatisticamente robusta

entre concentrações de NT-proBNP e o risco

de diabetes incidente numa população de

mulheres inicialmente saudáveis com risco

comum para T2DM. Nós observamos uma

redução de quase 50% no risco de diabetes

tipo 2 entre mulheres com concentrações de

NT-proBNP >117 ng/L (o percentil de

75%), uma concentração que está tanto bem

dentro do intervalo de referência quanto é

rotineiramente observada na prática clínica.

Esse risco reduzido não pode ser atribuído à

insuficiência cardíaca congestiva interveni-

ente ou doença cardíaca coronária que ocor-

re durante o acompanhamento. Além disso,

enquanto nós observávamos as esperadas

associações entre as concentrações de NT-

proBNP e idade e BMI, nós também obser-

vamos uma relação inversa entre NT-

proBNP e insulina de jejum que persistiu

após o ajuste por idade e BMI. Nós também

confirmamos associações anteriormente

relatadas entre variação comum no gene

NPPA-NPPB e nas concentrações de NT-

proBNP, e uma associação entre 2 SNPs no

NPPA-NPPB e no T2DM incidente em mu-

lheres inicialmente saudáveis. A direção

desses efeitos era consistente com os dados

que nós relatamos aqui para a associação

entre plasma NT-proBNP e o risco de

T2DM incidente.

Esses dados, tomados juntos, dão apoio à

hipótese de que peptídeos natriuréticos estão

causalmente envolvidos no desenvolvimento

da resistência à insulina e no diabetes clíni-

co. A magnitude da redução dos riscos ob-

servada é consistente com aquilo observado

por Pfister et al. (10) no grupo EPIC-

Norfolk, que relatou uma redução de 21%

no risco ajustado de T2DM incidente por

aumento de 1 unidade SD nas concentra-

ções de NT-proBNP logarítmicas transfor-

madas (HR 0.79, 95% CI 0.64–0.97, P =

0.02). Naquele mesmo relatório (10), Pfister

et al. realizaram uma análise de randomiza-

ção Mendeliana que apoia um papel causal

para peptídeos natriuréticos no desenvolvi-

mento do T2DM. Nossas observações apoi-

am aquela conclusão, e sugerem que altera-

ções nas concentrações de NT-proBNP pre-

cedem o diagnóstico clínico de diabetes em

muitos anos. Outros estudos prospectivos

relataram resultados semelhantes, com um

estudo relatando associações significativas

entre concentrações de peptídeos natriuréti-

cos do tipo B, concentrações de NT-

proBNP, e concentrações de peptídeos na-

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

triuréticos atriais mid regionais e T2DM

incidente (11) e outro relatando uma associ-

ação significativa para peptídeo natriurético

atrial mid regional contudo não NT-proBNP

(12). Estudos cruzados também relataram

associações inversas entre peptídeos natriu-

réticos e características da síndrome metabó-

lica (7–9).

Nosso estudo prospectivo se soma a esse

trabalho anteriormente publicado por inti-

mamente examinar as relações entre NT-

proBNP e hormônios com importantes fun-

ções metabólicas, incluindo insulina, leptina,

e grelina. Nós observamos uma modesta

correlação inversa entre concentrações de

NT-proBNP e de insulina de jejum que era

independente do BMI e parecia ser mais

forte do que sua correlação com a pressão

arterial, um determinante tradicionalmente

aceito das concentrações de peptídeos na-

triuréticos. Em nosso estudo, a relação entre

NT-proBNP e T2DM incidente é indepen-

dente tanto do BMI quanto das concentra-

ções de insulina de jejum, apoiando a hipó-

tese de que alterações nas concentrações de

NT-proBNP contribuem para o risco de

T2DM via um diferente mecanismo biológi-

co ou com diferente tempo do que as altera-

ções na sensibilidade da insulina ou obesi-

dade.

Nós também fomos capazes de replicar os

resultados de vários estudos genéticos que

relataram associações significativas entre

variação comum no gene NPPA-NPPB e nas

concentrações de NT-proBNP, pressão arte-

rial, e T2DM prevalente (17–20). Nossos

resultados são amplamente consistentes com

aqueles achados anteriormente publicados,

visto que 3 dos 4 SNPs anteriormente rela-

tados se associam com concentrações de

NT-proBNP eles também estavam associa-

dos com as concentrações de NT-proBNP

em nosso grupo. O quarto, rs5068, mostrou

uma associção menos consistente com as

concentrações de BNP (19, 20). Nós tam-

bém replicamos associações cruzadas ante-

riormente publicadas entre variação no

NPPA-NPPB e no T2DM prevalente (17,

18). Em nossa análise prospectiva de 1372

casos de T2DM incidente, nós observamos

uma associação estatisticamente significati-

va entre dois SNPs intimamente ligados

[rs632793 e rs198389, r2 = 0.874 e D′ =1.00

nas participantes de descendência Européia

incluídas em 1000 Genomas (29)] no gene

NPPA-NPPB e no T2DM.

Uma possível ligação causal entre peptídeos

natriuréticos e T2DM é apoiada por evidên-

cia de modelos experimentais de camundon-

gos de expressão alterada de peptídeos na-

triuréticos. Em recente trabalho de Miyashi-

ta et al. (30), camundongos transgênicos que

expressaram BNP a níveis >100 vezes o

normal eram mais magros, eram resistentes

aos efeitos de uma dieta rica em gordura

sobre o ganho de peso e resistência à insuli-

na, e tinham gordura corpórea total mais

baixa e elevado consumo de oxigênio. Esses

efeitos foram mediados por elevada biogê-

nese mitocondrial através de uma via de

sinalização cGMP ativada por peptídeos

natriuréticos. Além disso, receptores de pep-

tídeos natriuréticos estão expressos nas célu-

las β pancreáticas e modulam secreção de

insulina estimulada pela glicose (31, 32).

Embora nosso estudo seja prospectivo, a

possibilidade de causalidade reversa não

pode ser excluída. Em particular, nós obser-

vamos uma modesta correlação inversa entre

concentrações de NT-proBNP e concentra-

ções de insulina de jejum no início do estu-

do, e evidência fisiológica de resistência à

insulina pode preceder os sinais clínicos de

T2DM de 3–6 anos (33). Entretanto, o tem-

po médio para o diabetes clínico em nosso

grupo foi de 8.2 anos, e a associação entre

NT-proBNP e T2DM incidente era inde-

pendente das concentrações de insulina, su-

gerindo que os 2 hormônios podem marcar

diferentes processos patofisiológicos no ca-

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

minho para o T2DM. Nós também observa-

mos uma correlação inversa entre BMI e

concentrações de NT-proBNP, como os ou-

tros observaram (9). Nossos dados prospec-

tivos levantam a possibilidade de que a rela-

ção entre concentrações de peptídeos natriu-

réticos e o metabolismo alterado não é com-

pletamente mediada pela obesidade, embora

vias biológicas sobrepostas sejam difíceis de

excluir. Finalmente, nós não observamos

atenuação da relação entre NT-proBNP e

T2DM após ajuste para inflamação subclíni-

ca, que é um importante marcador de riscos

para T2DM, sugerindo que os peptídeos

natriuréticos agem para alterar o risco de

T2DM por um mecanismo alternativo (34).

Em conclusão, nós observamos uma redução

de >40% no risco de diabetes tipo 2 inciden-

te entre mulheres inicialmente saudáveis

com concentraçõs de NT-proBNP >117

ng/L. Essa associção era independente de

outros tradicionais fatores de risco para dia-

betes, incluindo BMI, função hepática, idade

e concentrações de insulina de jejum. Nós

também replicamos relatórios publicados de

associações entre variação comum nos genes

NPPA-NPPB e tanto nas concentrações de

NT-proBNP quanto no risco de T2DM. Es-

ses dados prospectivos oferecem forte apoio

para a hipótese de que o sistema de peptí-

deos natriuréticos desempenha um importan-

te papel no metabolismo do ácido graxo e da

glicose e no desenvolvimento do diabetes

tipo 2.

Notas de Rodapé 6 Abreviações não padronizadas:

BNP,

Peptídeo natriurético do tipo B;

NT-proBNP,

amino-terminal pro-BNP;

BMI,

Índice de massa corpórea;

T2DM,

Diabetes mellitus tipo 2;

WHS,

Estudo da Saúde das Mulheres;

Hb A1c,

hemoglobina A1c;

hsCRP,

Proteína C reativa de alta sensibi-

lidade;

SNP,

Polimorfismo de nucleotídeo

único;

IQR,

Faixa interquartil;

eGFR,

Taxa de filtração glomerular es-

timada;

HR,

Coeficiente de risco.

7 Genes humanos:

NPPA,

Peptídeo natriurético A;

NPPB,

Peptídeo natriurético B.

Contribuições dos Autores: Todos os

autores confirmaram que eles contribuí-

ram para o conteúdo intellectual desse

paper e satisfizeram os 3 seguintes re-

quisitos: (a) contribuições significativas

para a concepção e design, aquisição

de dados, ou análise e interpretação dos

dados; (b) rascunhando ou revisando o

artigo para conteúdo intelectual; e (c)

aprovação final do artigo publicado.

Revelações dos Autores ou Potencias

Conflitos de Interesse: Na submissão

do manuscrito, todos os autores comple-

taram o formulário de revelações dos

autores. Revelações e/ou potenciais con-

fltos de interesse:

Emprego ou Liderança: D.I. Chasman,

Brigham & Women's Hospital; M.C.

Magnone, F. Hoffman-La Roche; M.

Bobadilla, F. Hoffman-La Roche; N. Ri-

fai, Clinical Chemistry, AACC.

Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo

557–565 (2013)

Consultor ou Papel Consultivo: Nada a

declarar.

Posse dos Valores: Nada a declarar.

Honorários: Nada a declarar.

Fundo de Pesquisas: Esse estudo foi

apoiado por doações HL-043851, HL-

080467, e HL-099355 do Instituto Na-

cional do Sangue, Pulmão e Coração e

CA-047988 do Instituto Nacional do

Câncer, a Fundação Donald W. Rey-

nolds (Las Vegas, NV), a Fundação Le-

ducq (Paris, França), e a Fundação Doris

Duke Charitable (New York, NY). Ge-

notipagem foi fornecida por Amgen

(Cambridge, MA). B.M. Everett (PI), a

doação de investigador iniciado da Ro-

che Diagnostics (medição das concentra-

ções de NT-proBNP ), Doação do De-

senvolvimento Cientista da Associação

Cardíaca Americana (0835304N), e

Prêmio de Descoberta do Brigham e do

Conselho de Liderança Cardiovascular

do Hospital das Mulheres; D.I. Chas-

man, NIH; M.C. Magnone, F. Hoffman-

La Roche; M. Bobadilla, F. Hoffman-La

Roche; P.M Ridker, doação de investi-

gador iniciado da Roche Pharma (apoio

para a construção do estudo dos grupos

de casos).

Testemunho Hábil: Nada a declarar.

Papel do Patrocinador: As organiza-

ções patrocinadoras não desempenharam

papel algum no design do estudo, esco-

lha dos pacientes inscritos, revisão e in-

terpretação dos dados, ou preparação ou

aprovação do manuscrito.

Recebido para publicação em 1º de

Agosto de 2012.

Aceito para publicação em 27 de No-

vembro de 2012.

© 2013 The American Association for

Clinical Chemistry

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