ar. g¶r. mehmet gœmœta - .genel olarak kromatografi, §eitli maddelerin...

Download Ar. G¶r. Mehmet GœMœTA - .Genel olarak kromatografi, §eitli maddelerin hareketli faz yard±m±yla,

Post on 19-Apr-2019

215 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

Ar. Gr. Mehmet GMTA

Genel olarak kromatografi, eitli maddelerin hareketli faz

yardmyla, sabit bir faz arasndan deiik hzlarla hareket

etmeleri esasna dayanr.

lk defa 1906 ylnda bir Rus botaniki Tswetttarafndan kullanlmtr.

Yapt almada yapraklardaki pigmentleriayrmay CaCO3 kolon ve petrol eteri kullanarakbaarmtr.

Bu almalardan sonra kromatografi, 1952 ve 1960 yllar arasnda hzl bir ekilde gelierek analitik teknikler arasnda nemli bir yer almtr.

Btn sv kromatografik teknikleri arasnda en

yaygn kullanlan dalma kromatografisidir. Bu

teknik sv-sv kromatografi ve sv-bal faz

kromatografisi olmak zere iki alt snfta

incelenir.

Sv-sv tekniinde durgun faz kat yzeyine

fiziksel adsorpsiyonla, bal-faz tekniinde ise

kovalent balar ile tutturulur.

ABSORBSYON ADSORBSYON

HPLC ne amala kullanlr?

HPLC uucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileenlerin ayrm iin kullanlr.

rnek olarak

la etken maddeler, aspirin, ibuprofen veya asetaminofen

Proteinler, yumurtann beyaz veya kan proteinleri

Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen)

Gdalardaki pestisit ve vitaminler

Birok doal bileen, ginseng, bitkisel ilalar, bitki ekstraktlar

Scaklk ile kararlln kaybeden bileenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler

NOT: Eer uucu bir bileik ile alacaksak (bir gaz veya petroldeki bir hidrokarbon trevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir.

Kromatografik ayrmada maddeler birbiriyle karmayan iki fazarasnda dalrlar.

Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, dierine ise durgun faz(stasyoner faz) denir.

Karmdaki her maddenin hareket hz (tR), maddenin hareketliveya mobil faza olan ilgisine gre belirlenir.

Hareketli faza daha ok ilgisi olan maddeler daha hzl hareketederler.

Kolondan kan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarakadlandrlr.

Piklerin oluturduu tabloya da kromatogram ad verilir.

Bir kromatogram neye benzer?

Zaman

min0 2 4 6 8 10 12 14

rnein enjekte edildii zaman

Her bir sinyal pik olarak adlandrlr

A

B

C

la endstrisini baz aldmzda, dozaj formlarnda bulunan aktif bileenin kalite kontrol hayati nem tamaktadr ( ) .

HPLC sistemi bu aktif bileen veya dozaj formunun ierisinde bulunan, ilacn sentezlenmesinden veya bozunmasndan kaynaklanan safszlklarn ( ) tespiti iin kullanlabilir.

Bu noktada yaplan kalite kontrol hastann gvenliini salamaktadr.

HPLC nin uygulan

1. adm: Tabletin uygun zcde znmesi

Bileenlerin ayrm kolonda gerekleir

Kolon, elik bir borudan oluan ii silika jel ile doldurulmu bir yapdan oluur.

Kolon

Sabit Faz Partiklleri

2. adm: Ayrm

znen karm kolona enjekte edilir.Kolon

Sabit Faz Partiklleri

Kolon

Sabit Faz Partiklleri

Hareketli Faz

Kolon boyunca svnn (metanol ve su karm gibi) hareket etmesi iin bir basn uygulanr

Bu sv karmna hareketli faz denir.

Hareketli faz, sabit faz boyunca ilerleyerek, enjekte edilen numuneyi tamakla grevlidir.

Farkl bileenler, kolonda farkl hzlarda ilerlerler.

Hareketli Faz

Hareketli Faz

Bunun anlam bileenlerin kolon kna farkl zamanlarda hareket etmesi demektir.

3. Adm: Bileenlerin miktarlarnn tayin edilmesi

Bileenler ayrldktan sonra, karm ierisindeki bileenlerin miktarlarnn tayini iin UV k kaynandan faydalanlr

In madde tarafndan absorblanmas, madde miktar ile orantldr diyebiliriz

rnein madde miktarn 2 katna karrsak, madde 2 kat daha fazla absorblayacak demektir.

Detector

Dedektr n younluunu lmekle grevlidir.

Ik geiindeki azalma dedektrde bir cevap oluturur ve buna da pik denir.

4. Adm: Bileenlerin nicel olarak tayini ncelikli olarak temel maddeye

ait pik grlmekte Grnty yaklatrdka kk

pikler gzkmeye balamaktadr.Businyaller safszlklara aittir.

Hasta sal asndan bu safszlklar belirlenen limitlerin altnda olmak zorundadr.

Genel olarak 5 ksmdan oluur

Pompa

Enjektr

Kolon

Dedektr

Kaydedici

Bu ksmlardan bazlar allacak bileene gre deiiklik gsterebilir

HPLC sistemine genel bak

Agilent 1200 Infinity SKSistem

Pompann grevi svnn sistemde dolamn salamaktr. Dakikada akan mL cinsinden gsterilir.

HPLC iin normal bir ak 1- 2-mL/dk aralndadr.

Maksimum 400 bar.

UHPLC pompalar ile 600 - 1500 bar.

Bir deney esnasnda, pompa deimeyen, sabit bir ak salyorsa bu sisteme isokratik sistem denir.

Fakat hareketli fazda analiz esnasnda deiimler gerekleirse allan sisteme gradient sistem ad verilir.

HPLC sisteminin paralarPompa

1260 Infinity Izokratik pompa alma prensibi

AIV: Active inlet valveOBV: Outlet ball valve

1260 Infinity oklu pompa alma prensibi

Pump head A Pump head B

From solventbottle

From solvent bottle

Inlet ValveInlet Valve

Outlet Valve

Outlet Valve

Mixing Chamber

To waste

Purgevalve

Pumpoutlet

Mixer

Damper

Seal Seal

Piston Piston

Gradient ve Isokratik Koullarn Kyaslanmas

zokratik

zc bileimi hep sabittir

Basit ayrmlar iin idealdir

Kalite kontrol departmanlarnda sklkla tercih edilir.

Gradient

Hareketli faz bileimi zamanla deiim gsterir.

Kompleks karmlarn ayrm iin idealdir.

Bilinmeyen karmlarda metodgelitirmek iin tercih edilir.

En yaygn kullanlan ekli dorusal artan gradient tir.

Neden gradiente ihtiya duyuyoruz?

Time (min)

2

0 25 50 75 0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

1,2

3

4

5

6

7

8

1

3

45

6

7

8

Herbisitlerin ZORBAX StableBond-C18 kolon kullanlarak ayrmKolon: ZORBAX SB-C18

4.6 x 150 mm, 5 m

Hareketli faz: A: H2O 0.1% TFA, pH 2

B: Asetonitril

Ak Hz: 1.0 mL/min

Scaklk: 35C

rnek: 1. Tebuthiuron

2. Prometon3. Prometryne4. Atrazine5. Bentazon6. Propazine7. Propanil8. Metolachlor

Izokratik70% su/30% Asetonitril

Not:Son pikinalkonma sresi 25 dakikadr

0 25 50 75Time (min)

0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

1,2

3

4

5

6

7

8Not:Son pikinalkonma sresi 70 dakikadr

1

2

3

45

Gradient 20 60% Asetonitrile/su

6

7

8

Enjektr:

Genellikle enjekte edilen numune hacimleri

0.1- 20-mikrolitre (L) arasndadr.

Sistemdeki yksek basnca dayankl olmaldr.

Gnmzde oto rnekleyiciler analizcilerin zaman kaybn en aza indirecek ekilde tasarlanmaktadr.

Enjektr sistemleri

Manuel enjeksiyon valfi

Oto rnekleyici sistemi

Enjektr blmesi hakknda bilinmesi gerekenler

Enjeksiyon hacmi aral: 0.1 l den 100 l ye kadar enjeksiyon yaplabilir. Farkl enjektrler kullanlarak bu miktar arttrlabilir.

Enjektr blmesi: Farkl hacimdeki vialler kullanlabilir.

Carryover (Bulama): Numunenin enjeksiyonlar arasnda bulamasn ifade eden bir terimdir. En aza indirmek iin ykamalar yaplabilir.

Numune kapasitesi: Oto rnekleyicinin plaka tipine gre deiir.

Kesinlik: Enjeksiyon hacimlerinin tekrarlanabilirliini ifade eder.

Doruluk: Kesin olarak alnan numune hacminin doru deere yaknldr.

5 100 C arasnda ayarlanabilmektedir.

Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir.

Ayrm, bileenlerin fiziksel veya kimyasal zelliklerine gre gerekleir.

Partikl boyutu kldke, uygulanan basn artar.

Kolon blmesi

Kolon, stc bloklar arasna yerleir.

Analizler iin doru kolon seimini yapmak ok nemlidir.

HPLC de kullanlan kolon tipleri

Analitik: i ap (i.d.) 1.0 - 4.6 mm; uzunluu 15 250 mm

Preparatif: i.d. > 4.6 mm; uzunluk 50 250 mm

Kapiler: i.d. 0.1 - 1.0 mm; boylar deikendir

Nano: i.d. < 0.1 mm, ya da < 100 m

Kolon balant materyalleri

Paslanmaz elik En ok tercih edilen balant ekipman trdr, yksek basnca dayankldr.

Cam (Biomolekller iin kullanlr)

PEEK polimer (Banca daha az dayankldr fakat kullanm daha pratiktir.)

Kolon

Kolonlar genellikle poroz silica partikuller iledoldurulurlar

En cok kullanlan ebatlar 5 m, 3.5 m, ve 1.8 m

Yksek basn altnda dolum yaplmaldr.

Bu yzden bir ok kii hazr kolon kullanr

Bir bileiin alkonma zaman partikl byklne, yapsna ve kimyasna gre deiiklik gsterir.

Kolon dolgumateryali

Kolon partiklleri

Kolon seimi

zc Mod

Molekl arl < 2,000

Organik

Hekzan Normal faz

MeOH /MeOH:H2O veyaACN /ACN:H2O

Ters Faz (RP)HILIC ( polar bileikler iin)

THF Jel permasyon

Sulu faz

Iyonik olmayanTers FazHILIC

IyonikTers Faz

Molekl arl> 2,000

Organik Jel permasyon

Sulu faz

Jel permasyonIon-deiim kromatografiTers Faz(Daha byk partikll kolon ile)

Ayrm ekilleri

Temelde 4 yntem kullanlr

Ters Faz

Normal Faz

Iyon deiim kromatografi

Boyut eleme kromatografi

Mevcut bileenlerin 90% ndanfazlas iin kullanlabilir.

Apolar, polar, iyonlaabilen veya iyonik bileenler iin kullanlabilir.

Kolon apolar zellik gsterirken (C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz polar zellik gsterir.

(tampon) + su ile karabilen organik zc ( metanol veyaasetonitril)

View more >