antibakterijska aktivnost avarola avarona i fitola sekundarnih metabolita prirodnog porekla

UNIVERZITET U NOVOM SADU

PRIRODNO MATEMATIKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola,

sekundarnih metabolita prirodnog porekla

- Master rad -

Mentor: dr Maja Karaman, docent Student: Tnde Kartali, 242m/12

Komentor: dr Boris Pejin, nauni saradnik

Novi Sad, 2013.

Eksperimentalni deo ovog master rada

uraen je u

Mikrobiolokoj laboratoriji

Departmana za biologiju i ekologiju

Prirodno-matematikog fakulteta

Univerziteta u Novom Sadu.

Zahvaljujem se

mentoru dr Maji Karaman, docentu na Departmanu za biologiju i ekologiju

Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu,

na ukazanom poverenju, ljubaznosti, predloenoj temi i korisnim savetima;

komentoru dr Borisu Pejinu, naunom saradniku Odseka za nauke o ivim sistemima

Instituta za multidisciplinarna istraivanja (IMSI) Univerziteta u Beogradu,

na predloenoj temi i iskrenoj podrci i pomoi u svim fazama izrade ovog rada;

lanovima Komisije, red. prof. dr Milanu Matavulju i doc. dr Petru Kneeviu, sa

Departmana za biologiju i ekologiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u

Novom Sadu, na posveenom vremenu i krajnjoj dobronamernosti;

red. prof. dr Duanu Sladiu (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu) i

naunom saradniku dr Ireni Novakovi (Centar za hemiju, IHTM, Univerzitet u

Beogradu), na iskazanoj dobroj volji i kolegijalnosti oko uzoraka avarola i avarona;

svojoj Porodici, prijateljima i kolegama, na punom razumevanju, veri u mene i ljubavi

koje su mi pruili.

U Novom Sadu, Tnde Kartali, master kandidat

31. oktobra 2013. godine (E-mail: [email protected])

Sadaj

Lista ilustracija u tekstu .......................................................................................................... i

Lista ilustracija u prilogu ....................................................................................................... ii

Lista tabela ............................................................................................................................. iii

Lista grafika ........................................................................................................................... iv

1. Uvod .................................................................................................................................. 1

2. Cilj rada ............................................................................................................................ 3

3. Opti deo ........................................................................................................................... 4

3.1. Patogeni mikroorganizmi............................................................................................ 9

3.1.1. Escherichia coli ............................................................................................................ 9

3.1.2. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................... 10

3.1.3. Bacillus cereus ............................................................................................................ 10

3.1.4. Clostridium sporogenes .............................................................................................. 11

3.1.5. Sarcina lutea ............................................................................................................... 11

3.1.6. Staphylococcus aureus ................................................................................................ 12

3.1.7. Streptococcus agalactiae ............................................................................................ 13

3.1.8. Enterococcus faecalis ................................................................................................. 13

3.2. Sekundarni metaboliti prirodnog porekla ................................................................. 14

3.2.1. Avarol i avaron ........................................................................................................... 14

3.2.2. Fitol ............................................................................................................................. 18

4 Materijal i metode .......................................................................................................... 21

4.1. Bioloki materijal ...................................................................................................... 21

4.1.1. Suner Dysidea avara ................................................................................................. 21

4.1.1. Test kulture mikroorganizama .................................................................................... 21

4.2.Ispitivane supstance ................................................................................................... 21

4.3. Bakterijske suspenzije i standardizacija inokuluma ................................................. 22

4.4. Minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna (MBC) koncentracija ....... 23

4.5. Procena vrednosti MIC i MBC ................................................................................. 23

4.6. Osetljivost kultura na standardne antibiotike ........................................................... 26

4.7. Priprema serije razreenja gentamicina i ampicilina ................................................ 26

4.8. Odreivanje osetljivosti bakterija na antibiotike ...................................................... 27

5. Rezultati i diskusija ....................................................................................................... 29

5.1. Avarol i avaron ......................................................................................................... 29

5.2. Fitol ........................................................................................................................... 32

6. Zakljuak ........................................................................................................................ 38

7. Literatura ....................................................................................................................... 39

8. Prilog ............................................................................................................................... 47

Izvod ....................................................................................................................................... 52

Abstract .................................................................................................................................. 53

i

Lista ilustracija u tekstu

Slika 1. Strukturne hemijske formule avarola i avarona. 15

Slika 2. Suner Dysidea avara (Schmidt, 1862). 16

Slika 3. Izgled sferularnih elija sunera Dysidea avara pod transmisionim elektronskim

mikroskopom.

17

Slika 4. Mahovina Rhodobryum ontariense.

19

Slika 5. Strukturna hemijska formula fitola. 19

Slika 6. Mikrotitar ploa sa inokulisanin hranljivim bujonom (Meller Hinton), tretiranih

serijom dvostrukih razblaenja avarona (12.50-0.02 g/ml).

50

ii

Lista ilustracija u prilogu

Slika 1. Brojnost kolonija soja Pseudomonas aeruginosa pri razliitim koncentracijama fitola

dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 47

Slika 2. Brojnost kolonija soja Bacillus cereus pri razliitim koncentracijama fitola dobijenih u

postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 47

Slika 3. Brojnost kolonija sojeva a) Bacillus cereus i b) Sarcina lutea pri razliitim

koncentracijama avarona dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 48

Slika 4. Brojnost kolonija soja Staphylococcus aureus pri razliitim koncentracijama avarola


Slika 5. Brojnost kolonija soja Enterococcus faecalis pri razliitim koncentracijama avarola


Slika 6. Zone inhibicije rasta nastale delovanjem razliitih antibiotika na bakterijsku kulturu

Staphylococcus aureus 5485: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.

Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklin; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina. 50


Staphylococcus aureus 5485: 10. Imipenem; 11. Tobramicin; 12. Ertapenem. 50


Escherichia coli: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5. Ceftriakson; 6.

Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10. Imipenem; 11.

Tobramicin; 12.Ertapenem.

51


Clostridium sporogenes: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.

Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10. Impenem;

11. Tobramicin; 12. Ertapenem. 51

iii

Lista tabela

Tabela 1. Finalne koncentracije avarola, avarona i fitola u mikrotitar ploama. 26

Tabela 2. Finalne koncentracije referentnih antibiotika u mikrotitar ploama. 27

Tabela 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne

koncentracije (MBC) ispitivanih supstanci. 36

Tabela 4. Osetljivost test mikroorganizama prema konvencionalnim antibioticima. 37

iv

Lista grafika

Grafik 1. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) avarola (MIC AOL), avarona

(MIC AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na

testirane Gram-pozitivne bakterije. 31

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona

(MBC AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na

testirane Gram-pozitivne bakterije. 32

Grafik 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) fitola (MIC FIT) i referentnih antibiotika

gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na testirane bakterije. 34

Grafik 4. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) fitola (MBC FIT) i referentnih

antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane bakterije. 35

Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola, sekundarnih metabolita prirodnog porekla

1

1. Uvod

Neracionalna primena antibiotika omoguava nastanak i irenje rezistentnih patogenih

mikroorganizama i kao takva predstavlja ozbiljan problem poslednjih decenija. Zbog ovog

fenomena znaajna panja posveena je pronalaenju novih terapeutika irokog antimikrobnog

dejstva (Jawetz et al., 1998).

Pod sekundarnim metabolizmom uglavnom se podrazumeva sinzteza molekula male

molekulske mase kao to su terpeni, alkaloidi i fenoli. Za razliku od primarnih metabolita koji su

obino ukljueni u vitalne procese poput rasta i razvoja, sekundarni metaboliti (= prirodni

proizvodi) omoguavaju preivljavanje u nepovoljnim uslovima sredine i/ili odbranu organizma

(Petrovi et al., 2007). Ova grupa jedinjenja iz biljaka i evolutivno jednostavnijih organizama

ukljuujui sunere u ii je interesovanja naune javnosti kako kod nas, tako i u svetu.

Poslednjih decenija marinski organizmi postali su jedan od glavnih predmeta istraivanja

u oblasti hemije prirodnih proizvoda, medicinske hemije i farmakologije. U prvom redu,

marinski beskimenjaci i njima pridrueni mikroorganizmi predstavljaju bogat izvor novih

prirodnih organskih jedinjenja koja se razlikuju od sekundarnih metabolita terestrinih vrsta. Po

pravilu, marinski metaboliti odlikuju se visokim farmakolokim potencijalom. Prirodni proizvodi

avarol (sesviterpenoidni hidrohinon) i avaron (odgovarajui hinon) izolovani su iz mediteranskog

sunera Dysidea avara (Schmidt, 1862) (Minale et al., 1974; De Rosa et al., 1976). Radi se o

izrazito bioaktivnim supstancama koje pokazuju antimikrobni potecijal (Seibert et al., 1985;

Gai, 1988; Cozzolino et al., 1990; Pejin et al., 2008; Boi et al., 2010), antiviralnu i

antitumorsku aktivnost (Sladi i Gai, 2006), kao i antiinflamatorni efekat (Ferrndiz et al.,

1993).

Fitol, aciklini nezasieni diterpen, uglavnom se nalazi u biljakama, kao komponenta

hlorofila (Mili, 1997). Ulazi i u sastav etarskih ulja, tj. biljnih produkata bogatih terpenima koji

nastaju u lezdanim dlaicama, kanalima ili sekretornim organima (Novakovi, 2010). I etarska


2

ulja sama za sebe i njihovi pojedinani hemijski konstituenti intenzivno se izuavaju kao mogui

antibakterijski i antifungalni agensi. U stvari, data istraivanja od posebnog su znaaja za

pronalaenje i razvoj novih antimikrobika visoko efikasnih prema rezistentnim patogenim

mikroorganizmima (Inoue et al., 2005).


3

2. Cilj rada

Cilj ovog rada bio je in vitro 'skrining' antibakterijske aktivnosti tri sekundarna metabolita

(avarol, avaron i fitol) na sedam referentnih bakterijskih kultura (ATCC American Type

Culture Collection):

dva Gram-negativna soja (Escherichia coli ATCC 11229 i Pseudomonas aeruginosa ATCC

9027) i

pet Gram-pozitivnih sojeva (Bacillus cereus ATCC 11778, Sarcina lutea ATCC 9341,

Clostridium sporogenes ATCC 19404

, Enterococcus faecalis ATCC 19433

i Staphylococcus

aureus ATCC 25923

),

kao i na

dva humana patoloka izolata poreklom iz vaginalnog brisa (bakterijski sojevi

Staphylococcus aureus 5485 i Streptococcus agalactiae 5492).


4

3. Opti deo

Antibiotici su magini lekovi XX veka koji zavreuju posebnu panju naune javnosti

irom sveta. Zapravo, njihova iroka upotreba u medicini, veterini i poljoprivredi, kao i pojava

sve vee rezistencije bakterija, prua prostor za savremene naune studije i otvorenu diskusiju

(Beovi, 2006).

Ova grupa jedinjenja obino predstavlja produkte sekundarnog metabolizma

mikroorganizama koji nepovoljno deluju na razvoj ili razmnoavanje drugih mikroorganizama.

Prema hemijskoj grai, dele se na:

Tetracikline (doksiciklin, oksitetraciklin)

-laktamske antibiotike (penicilini, cefalosporini)

Makrolide (eritromicin, azitromicin, klaritromicin)

Linkozamide (linkomicin i klindamicin)

Aminoglikozide (streptomicin, amikacin, gentamicin, rifampicin, neomicin)

Glikopeptide (vankomicin i teikoplanin)

U uem smislu, antibiotici predstavljaju sekundarne metabolite mikroorganizama

razliite hemijske strukture koji mogu imati baktericidni (ubijaju bakterije) ili bakteriostatski

efekat (inhibiraju rast bakterija). Nema nikakve sumnje da su otkrie i razvoj antibiotika kao

lekova od revolucionarnog znaaja za medicinsku hemiju, kao i mikrobiologiju. Naime,

antibiotska era traje oko 60 godina, a zapoela je 1929. godine pronalaskom penicilina od strane

Aleksandra Fleminga, kotskog naunika. Od tada, pa sve do danas, otkriveno je preko 9000

antibiotika (Petrovi et al., 2007). Idealni antibiotik pokazuje selektivnu toksinost tj. deluje

iskljuivo na patogeni mikroorganizam, a ne i na domaina. Prema mehanizmu delovanja, mogu

se svrstati u etiri grupe (Jawetz et al., 1998; Mihajilov-Krstev, 2009):


5

1. inhibicija sinteze elijskog zida: obuhvata antibiotike koji deluju na neki stadijum sinteze,

nakupljanja ili unakrsnog vezivanja peptidoglikana, to dovodi do inhibicije rasta, a u veini

sluajeva i do smrti bakterija. To su laktami (penicilini, cefalosporini, monobaktami i

karbopenemi) i glikopeptidi;

2. inhibicija funkcije elijske membrane: obuhvata antibiotike koji deluju na elijsku

membranu; usled njihovog nakupljanja u eliji, naruava se funkcionalni integritet

membrane, te makromolekuli i joni 'bee' u vanelijski prostor, to vodi ka njenom

oteenju. U ovu grupu spadaju polimiksini, nistatin i gramicidin;

3. inhibicija sinteza proteina (inhibicija translacije i transkripcije genetskog materijala):

obuhvata antibiotike koji se vezuju za ribozomske subjedinice, spreavajui tako stvaranje

inicijalnog kompleksa ili vezivanje aminoacil-tRNK za ribozom. Radi se o streptomicinima,

tetraciklinu, hloramfenikolu, eritromicinu, linkomicinu i aminoglikozidima;

4. inhibicija sinteze nukleinskih kiselina: obuhvata antibiotike koji deluju na nukleinske

kiseline; svrstane u dve glavne klase - DNK inhibitori i RNK inhibitori:

inhibitori sinteze DNK: ovi antibiotici inhibiraju sintezu i replikaciju DNK vezujui se za

A subjedinicu DNK-giraze, ime direktno blokiraju aktivnost naznaenog enzima

neohodnog za proces replikacije. Predstavnici su kvinoloni i fluorokvinoloni;

inhibitori sinteze RNK: ovi antibiotici vrsto se vezuju za DNK zavisnu RNK-polimerazu

i tako inhibiraju sintezu RNK. Predstavnik je rifampicin.

Generalno, moe se rei da mehanizmi delovanja ove grupe jedinjenja nisu potpunosti

razjanjeni.

Antibiotike nazivaju 'panacejima' medicine XX veka; esto se, meutim, 'napamet'

uzimaju, tj. ne vodi se rauna o prirodi same infekcije. Na bazi svojih istraivanja, Fleming je jo


6

1945. godine ukazao da neodgovarajua upotreba penicilina moe dovesti do selekcije

rezistentnih 'mutantnih formi' bakterije Staphylococcus aureus sa veom infektivnou od

'osnovnih' sojeva. Nakon samo godinu dana, upravo zbog njegove neracionalne primene,

pokazalo se da je Fleming bio u pravu. tavie, trebalo je da proe jo svega par godina, pa da

vie od 50 % datog soja ne pokae osetljivost na penicilin. Naalost, svedoci smo identinog

trenda. Sa razvojem antibiotika poveava im se upotreba, a pojednostavljuje tehnologija

proizvodnje. Shodno tome, iz godine u godinu raste broj bakterija koji pokazuju znaajnu

rezistenciju prema komercijalno dostupnim antibioticima. Da stvar bude gora, pojedini

rezistentni sojevi, poznati po stopi mortaliteta hospitalizovanih bolesnika, 'ire' se van zidova

medicinskih ustanova, to bi trebalo da bude alarmirajui podatak za najiru javnost (Alanis,

2005).

Bakterijska rezistencija moe biti rezultat modifikacije antibiotika, elijskog zida ili

enzima tj. 'ciljnih meta' na koje deluju ovi lekovi deluju. Pojedine bakterije same su po sebi

otporne su na razliite agense (tzv. prirodna ili uroena rezistencija), to podrazumeva prirodnu

karakteristiku koju druge bakterije nemaju, a zbog koje odreeni antibiotik ne moe normalno da

deluje. Kod ostalih bakterija data otpornost je steena. Steena rezistencija sa bakterija na

bakterije prenosi se onom brzinom kojom sojevi uspevaju da razviju otpornost na relevantne

antibiotike. Jedan vid steene rezistencije je fenotipska rezistencija: na primer, L forma bakterija

(na inhibitore sinteze elijskog zida) i rezistencija bakterija u formi endospora (na inhibitore

sinteze proteina); ova rezistencija ne prenosi se na sledeu generaciju. Drugi vid steene

rezistencije, genotipska rezistencija, podrazumeva promenu genetskog materijala: geni koji

obezbeuju rezistenciju (nastali mutacijom) mogu biti smeteni ili na hromozomu ili

ekstrahromozomalno (na plazmidima ili transpozomima) i ire se horizontalnim transferom

(ekstrahromozomske rezistencije veoma se lako prenose na iste ili razliite vrste bakterija).

Pojedine bakterije 'brane' se formiranjem biofilma. Naime, poznato je da su biofilmovi kljuni

faktori virulentnosti mnogih oboljenja, ukljuujui infekcije implantata i urinarnog trakta, kao i

cistinu fibrozu. Faktori koji doprinose ovoj vrsti rezistencije najee su redukcija metabolizma

i brzine rasta, zatita pomou polimernih supstanci (lue se u okviru biofilma) i specifini

mehanizmi na bazi izmenjene fiziologije (Beovi, 2006; Petrovi et al., 2007). Krajnji rezultat

ovih fenomena jeste rezistentencija na antibiotike; u mnogim sluajevima radi se o


7

multirezistenciji, to u mnogome oteava leenje i efikasan izbor antibiotika. Prvi sluaj

antimikrobne rezistencije zabeleen je kasnih 40-ih godina prolog veka, tj. ubrzo po pojavi

sulfonamida i penicilina. Naime, sojevi S. aureus postali su otporni na date antibiotike

rekordnom brzinom. Zabeleen porast broja hospitalizovanih bolesnika sa problemom

bakterijske rezistencije u narednih 25 godina upotrebe ovih lekova ukazao je na dramatinu

situaciju u budunosti. Tada je konstatovano da su posebno ugroeni bolesnici smeteni na

intenzivnoj nezi, sa hroninim tegobama, kojima je prepisana terapija na bazi steroida i sa

oslabljenim imunim sistemom.

Spisak rezistentnih bakterija je impresivan: soj S. aureus rezistentan na sulfonamid i

penicilin ('40-te godine); -laktam produkujui soj Haemophylus influenza ('70-te godine);

meticilin-rezistentan soj S. aureus (MRSA) i multirezistentan soj Mycobacterium tuberculosis

('80-te godine); nekoliko rezistentnih sojeva enterinih i neenterinih Gram-negativnih bakterija

kao to su Shigella sp., Salmonella sp., Vibrio cholera, E. coli, Klebsiella pneumonia,

Acinetobacter baumanii i P. aeruginosa ('80-'90-te godine); sojevi Streptococcus iz grupe A

rezistentni na makrolide, soj S. pneumoniae rezistentnan na razliite klase antibiotika ukljuujui

peniciline i sojevi MRSA i Enterococcus rezistentni na vankomicin (aktuelan period).

Karbapanemi i monobaktami

Pored penicilina i cefalosporina, karbapanemi i monobaktami spadaju u -laktamske

antibiotike. Nastali su iz potrebe da se rei problem sa laktamazama koje proizvode

Gram-negativni bakterije rezistentne na peniciline.

Mehanizam njihovog delovanja isti je kao i kod penicilina: naime, svi -laktamski

antibiotici spreavaju sintezu peptidoglikana bakterijskog elijskog zida. Ovi antibiotici veoma

su stabilni i u prisustvu -laktamaza i u prisustvu penicilinaza i cefalosporinaza. Po vezivanju za

bakteriju, data jedinjenja inhibiraju transpeptidacioni enzim koji unakrsno povezuje peptidne

lance privrene na osnovnu strukturu peptidoglikana. Finalni baktericidni dogaaj, inaktivacija

inhibitora autolitikih enzima u elijskom zidu, dovodi do lize bakterije.


8

Imipenem, intravenozni -laktamski antibiotik, na tritu se pojavio '80-ih godina. Potie

iz jedinjenja tienamicina, prirodnog proizvoda bakterije Streptomyces cattleya. Ima veoma irok

spektar antimikrobne aktivnosti, deluje protiv mnogih aerobnih i anaerobnih Gram-pozitivnih i

Gram-negativnih organizama. Meutim, mnoge meticilin rezistentne stafilokoke (MRSA) manje

su osetljive, a Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus spp. za vreme terapije mogu razviti

rezistenciju (Jawetz et al., 1998).

Aminoglikozidi

Aminoglikozidi predstavljaju grupu antibiotika sa sloenom hemijskom strukturom i

meusobno slinim antimikrobnim dejstvom, farmakokinetikim karakteristikma i toksinou.

Glavni predstavnici su im gentamicin, streptomicin, amikacin, tobramicin, netilmicin i

neomicin. Streptomicin, prvootkriveni lek iz ove grupe (1943. godina), ujedno je bio i prvi

antibiotik koji je mogao da lei tuberkulozu. Premda se isti sve manje upotrebljava u medicini,

ima svoje 'naslednike' (Jawetz et al., 1998). Tobramicin produkuje soj Streptomyces tenebrarius,

a upotrebljava se u leenju razliitih bakterijskih infekcija, preteno uzrokovanih

Gram-pozitivnim bakterijama; posebno je efektivan protiv sojeva Pseudomonas. Ovaj antibiotik

vezuje se za 30S i 50S bakterijski hromozom, spreavajui tako formiranje 70S kompleksa, to

inhibira translaciju, usled ega bakterije umiru (Jawetz et al., 1998).

Na osnovu izloenog moe se zakljuiti da je potreba za novim antibioticima vie nego

opravdana i nuna (Alanis, 2005).


9

3.1. Patogeni mikroorganizmi

U odnosu na ukupan broj do sada opisanih mikroorganizama, relativno malo je onih koji

su uzronici oboljenja ljudi i ivotinja (Mihajilov-Krstev, 2009). Po definiciji, mikroorganizam

je patogen ako moe da uzrokuje oboljenje, a takva njegova sposobnost naziva se patogenost

(Petrovi et al., 2007). U irem smislu, pod patogenou mikroorganizma smatra se njegova

sposobnost da prodire u organizam domaina, da se u njemu odrava, razmnoava i izaziva

bolest. S druge strane, u uem smislu, patogenost predstavlja sposobnost infektivnog agensa da

izaziva oboljenje (Jawetz et al., 1998).

3.1.1. Escherichia coli

Spada a u familiju Enterobacteriaceae. Radi se o sojevima koji su fakultativni anaerobi;

Gram-negativni; asporegeni; sa peritrihalnim flagelama; pravih tapia duine, 2 6 m, ive

pojedinano ili u parovima; dobro rastu na svim jednostavnim podlogama.

Kolonije su im najee srednje veliine, okrugle, ispupene, glatke, sjajne, providne i

bezbojne; pojedini sojevi odlikuju se mukoidnim kolonijama. Na endo- i eozin-

metilenskoplavom agaru imaju metalni sjaj.

Dobro rastu na 37 C. Katalaza pozitivne i oksidaza negativne. Poseduju veliku

fermentativnu sposobnost. Razlau znaajan broj eera, uz produkciju kiseline i gasa. Veina

sojeva fermentie laktozu. Ne hidroliu ureu, ne produkuju vodonik-sulfid i ne obavljaju

likvefakciju elatina. IMViC-formula ovih bakterija je + + - -.

Escherichia coli prilino je otporni soj. Mesecima moe opstati u vodi i zemlji, kao i na

raznim predmetima. Tolerantna je na temperature znatno ispod 0 C, dok je temperatura od 60

C ubija nakon 15-20 min. Veoma je osetljiva na hlor i hlorna jedinjenja. Produkuje vie

toksinih materija ukljuujui endotoksin, enterotoksin i hemolizine.

E.coli javlja se u normalnoj mikroflori crevnog trakta toplokrvnih ivotinja. Kod ljudi

naseljava crevni trakt gde sintetie vitamine (B12) i antibiotike (kolicin); uestvuje i u

transformaciji ugljenih hidrata i proteina. Pri padu imunog sistema moe da izazove crevne

poremeaje (enteritis). Osim toga, glavni je uzronik infekcija urinarnog trakta, septikemije i


10

meningitisa; poznato je da izaziva i pneumonije (u organizam domaina dospeva aspiracijom

orofaringealnog sekreta) (Jawetz et al., 1998; Petrovi et al., 2007; Mihajilov-Krstev, 2011).

3.1.2. Pseudomonas aeruginosa

Spada u familiju Pseudomonadaceae. Radi se o pokretnim aerobnim Gram-negativnim

sojevima; tapii; dimenzija 0.6 2 m; mogu biti pojedinani, u parovima ili u obliku lanca;

nemaju kapsule, ali poseduju fimbrije i pile.

Striktni su aerobi i rastu na velikom broju hranljivih podloga. Formiraju glatke i okrugle

kolonije fluoroscentno zelene boje. esto produkuju nefluorescentni plaviasti pigment

piocijanin koji difunduje u agar, kao i fruorescentni pigment pioverdin koji agaru daje zelenkastu

boju. Kulture im miriu na cvet lipe.

Dobro rastu u temperaturnom opsegu od 37 C do 42 C. Katalaza i oksidaza pozitivne.

Ne fermentiu ugljene hidrate, ali mnogi sojevi razlau glukozu, uz stvaranje kiseline. Usvajaju

citrat, redukuju nitrate, ne hidroliu ureu.

Lue endotoksine, egzotoksine, enzime i druge bioloki aktivne materije koje poveavaju

njihovu toksinost; za elije domaina privruju se uz pomo pila (fimbrija).

Soj Pseudomonas aeruginosa esto ulazi u sastav normalne flore creva i koe oveka.

iroko je rasprostranjen u prirodi, a obino je prisutan i u bolnicama. Kod zdravih osoba moe da

formira kolonije (saprofit), dok kod pojedinaca sa oslabljenim imunitetom izaziva oboljenja

(Jawetz et al., 1998).

3.1.3. Bacillus cereus

Spada u familiju Bacillaceae. Re je o pokretnim Gram-pozitivnim fakultativnim

aerobima; sporogeni sojevi; tapii; dimenzija 1 3-4 m; rasporeeni su u dugake lance.

Dobro rastu na svim jednostavnim podlogama; optimalna temperatura je izmeu 20C i

40 C. Kolonije su im bele, krupne i glatke sa testerastim ivicama.


11

Veina predstavnika je pokretna; pojedini sojevi stvaraju kapsulu. Formiraju endospore

bacilarnog tipa (sporuliu samo aerobno) smetene centralno ili subterminalno; date endospore

ne deformiu telo bacila, a otporne su prema toploti. Katalaza pozitivne.

Bacillus cereus rasprostranjen je u zemljitu. Premda nije humani patogen, moe da

kontaminira hranu (spore su mu jako otporne na kuvanje) i izazove trovanje. Dato trovanje ima

dva razliita oblika, emetini i dijarealni, i obino se dovodi u vezu sa jelima na bazi mesa i

itarica. Soj B. cereus stvara toksine odgovorne za oboljenja koja bi se pre mogla okarakterisati

kao intoksikacija nego toksikoinfekcija (Jawetz et al., 1998).

3.1.4. Clostridium sporogenes

Spada u familiju Clostridiaceae. Radi se o Gram-pozitivnim anaerobima; sporogeni;

pokretni (peritrihe); bacili.

Formiraju krupne uzdignute kolonije glatkih ivica. Na krvnom agaru uoava se zona

hemolize.

Katalaza negativne. Fermentiu brojne eere, mnogi predstavnici razgrauju proteine.

Veoma su otporni na visoke temperature: u toku 10-15 min preivljavaju kuvanje na 80

C.

iroko su rasprostranjeni u zemljitu, vodi i raspadnom materijalu biljnog i ivotinjskog

porekla (Jawetz et al., 1998).

3.1.5. Sarcina lutea

Spada u familiju Micrococcaceae. Re je o aerobnim Gram-pozitivnim nepokretnim

kokama koje obrazuju sitne i glatke ute kolonije.

Katalaza negativne. Ne fermentiu ugljene hidrate, podnose visoke koncentracije soli.

ive slobodno u prirodi i mogu se nai u zemljitu, praini, vodi i vazduhu; uesnici su

normalne flore koe sisara, a kolonizuju sluzokou usta i gornjih disajnih puteva (Jawetz et al.,

1998).


12

3.1.6. Staphylococcus aureus

Spada u familiju Staphylococcaceae. Radi se o aerobnim Gram-pozitivnim nepokretnim

sojevima loptastog oblika udruenim u nepravilne grozdaste skupine.

Brzo rastu na veini bakteriolokih hranljivih podloga u aerobnim i mikroaerofilnim

uslovima pri temperaturi od 37 C. Na vrstom hranljivom agaru kolonije su im okrugle, glatke,

ispupene i sjajne, od sive do tamno zlatno-ute boje.

Katalaza pozitivne i koagulaza pozitivne. Sporo fermentuju mnoge ugljene hidrate,

produkujui mlenu kiselinu bez gasa.

Soj Staphylococcus aureus otporan je na isuivanje i toplotu. Veina sojeva osetljiva je

na izlaganje temperaturi od 60 C po isteku 1 h, a neki mogu izdrati due vremena i na 80 C.

Tolerantni su prema visokim koncentracijama natrijum-hlorida i eera.

Soj S. aureus produkuje i oslobaa mnoge enzime i toksine; isti sintetie i intracelularne

i ekstracelularne metabolite. Enterotoksini (A-E, H, G i I) nalaze se u pokvarenim namirnicama;

nastaju vrlo brzo i otporni su na toplotu (ne denaturiu se na temperaturi od 100 C ni nakon

vie od 30 min); spadaju u superantigene.

S. aureus esto naseljava kou i sluzokou (pogotovo sluzokou nosa), pre svega kod

obolelih osoba. Bolesti koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne (nastaju prodorom

bakterije u organizam), intoksikacijske (bakterija ne prodire u organizam ve izluuje toksine

koji su odgovorni za nastale poremeaje; na primer, konzumiranje pokvarenih namirnica) ili

predstavljati njihovu kombinaciju.

Meticilin-rezistentni S.aureus posebni je soj ove bakterije nastao zbog uestale i

nekritike primene antibiotika. Soj MRSA izaziva infekcije kod hospitalizovanih bolesnika

oslabljenog imuniteta. Na ovu bakteriju deluje svega par antibiotika, tako da se strogo mora

voditi rauna o njihovoj upotrebi. MRSA pozitivni pacijenti trebalo bi da se izoluju i na taj nain

spree dalje irenje ove bakterije unutar bolnice (Jawetz et al., 1998; Mihajilov-Krestev, 2009).


13

3.1.7. Streptococcus agalactiae

Spada u familiju Streptococcaceae koja obuhvata aerobne Gram-pozitivne nepokretne

koke kraih ili duih lanaca.

Soj Streptococcus agalactiae pripada grupi B streptokoka. Predstavnik je normalne flore

genitalnog trakta ena i znaajan je uzronik neonatalne sepse i meningitisa. Tipino je -

hemolitian i stvara zone hemolize koje su malo vee od prenika kolonija. S. agalactiae

hidrolizuje natrijum hipurat i daje pozitivan CAMP test (Jawetz et al., 1998).

3.1.8. Enterococcus faecalis

Spada u familiju Enterococcaceae koja obuhvata fakultativno anaerobne Gram-pozitivne

nepokretne koke; soj Enterococcus faecalis pripada grupi D streptokoka.

Katalaza negativne. Fermentiu glukozu bez produkcije gasa. Rastu u temperaturnom

opsegu od 10 C do 45 C; obino su nehemolitine ili stvaraju zonu -hemolize; daju pozitivan

PYR test.

Rastu u prisustvu ui i 6.5 % natrijum-hlorida; hidrolizuju eskulin. Izrazito su rezistentne

na penicillin G. Preivljavaju temperaturu od 60 C preko 30 min.

Normalno nastanjuju enski genitalni trakt i crevni trakt ljudi i toplokrvnih ivotinja. Uzrokuju

urinarne infekcije, upalu une kese i endokarditis (Jawetz et al., 1998).


14

3.2. Sekundarni metaboliti prirodnog porekla

3.2.1. Avarol i avaron

U poslednjih est decenija iz morskih sunera izolovan je vei broj jedinjenja neobinih

hemijskih struktura koja nisu naena kod terestrinih organizama, meu kojima se istiu steroli

sa vrlo raznovrstnim bonim nizovima i seskviterpeniodni hidrohinoni i hinoni drimanskog i

preureenog drimanskog tipa (Sladi i Gai, 2006).

Filum Porifera (lat. porus pora, fini orvor; ferre nositi) odnosno Spongia (= suneri)

predstavlja najprimitivniju grupu ivotinja. Ime filuma u vezi je sa injenicom da je telo ovih

acelomatnih oblika ivotinja perforirano velikim brojem finih otvora pora, kroz koje

neprekidno tee voda (Radovi i Petrov, 2003). Suneri su preteno marinske sesilne ivotinje:

naime, samo mali broj vrsta ivi u slatkim vodama (Kruni, 1992). Radi se o sesilnim

beskimenjacima koji ive privreni za stene, ljuture raznih ivotinja ili neke druge objekte u

vodi, pojedinano ili u kolonijama. Karakteristini su za iste vode bez estica koje bi mogle da

zatrpaju ili zapue njihove pore; stoga se smatraju dobrim biomonitorima u morskom ekosistemu

(Radovi i Petrov, 2003). Fosilni ostaci pokazuju da su se svi tipovi sunera javili u toku

kambrijskog perioda, uz mogui izuzetak klase Calcarea (Bergquist, 1978). Veoma su

rasprostranjeni; zapravo, procenjuje se da ima oko 8000 vrsta svrstanih u etiri klase (Calcarea,

Hexactinellida, Sclerospongiae i Demospongiae); osnovne kriterijume u klasifikaciji sunera

ine hemijski sastav i struktura skeleta (Thakur i Mller, 2004). Njihova uspena evolutivna

istorija sunera u velikoj meri posledica je hemijske odbrane od predatora i konkurentskih

sesilnih organizama, kao to su korali (Radovi i Petrov, 2003).

Sesviterpenoidni hidrohinon avarol (do 1.5 % teine suve materije sunera, odnosno 2.7

g na kg svee materije; Slika 1) i odgovarajui hinon avaron (u manjoj koliini; Slika 1)

izolovani su iz mediteranskog sunera Dysidea avara (Schmidt, 1862) (Slika 2) (Minale et al.,

1974; De Rosa et al., 1976; Mller et al., 1986).


15

Avarol Avaron

Slika 1. Strukturne hemijske formule avarola i avarona. (Pejin, 2011).

Suner D.avara Schmidt pripada klasi Demonspongiae, redu Dictyoceratida i familiji

Dysideidae (Slika 2). Predstavnici ove vrste su ruiaste do ljubiaste boje; masivni ali meki;

povrina skeleta je gruba na dodir; pinakocite su veih dimenzija i meusobno su udanjene;

imaju leukonski tip grae. D. avara mediteranska je vrsta, a moe se nai i na razliitim

lokalitetima du obale zapadne Evrope. Dimenzije su im oko 25 x 15 x 5 cm. Povrina im je

obloena pinakocitima, veliine oko 4 mm sa razmacima od 2 5 mm. Ovakva graa daje im

mreast izgled. Prenik oskuluma na vrhu tela sunera iznosi 1 3 mm. Nemaju spikule. Polno

se razmnoavaju. Najee rastu na izolovanim mestima i bez makroskopskih simbionata

(Carballo et al., 1994).

Bioloka aktivnost avarola i avarona prouava se u paru jer je usled lakoe redoks

konverzije mogue prisustvo oba oblika. Utvreno je da ova jedinjenja pokazuju umerenu ali

selektivnu antibakterijsku (na Gram-pozitivne bakterije), antifungalnu, antiviralnu, citotoksinu i

antileukemijsku aktivnost in vitro i in vivo (Sladi i Gai, 2006). Avarol i avaron bili su

predmet opsenih studija zbog sposobnosti da efikasno inhibiraju replikaciju HIV virusa u in

vitro uslovima (Sarin et al., 1987). Meutim kod pacijenata obolelih od AIDS-a izostali su

rezultati koji bi upuivali na njihovu upotrebu u klinikoj praksi. U tzv. SAR studijama (od engl.

Structure-Activity Relationship studies) zapaeno je da nijedan od semisintetikih derivata


16

avarola i avarona nije pokazao veu anti-HIV aktivnost od poetnih jedinjenja tj. navedenih

sekundarnih metabolita (De Giulio et al., 1991). Meutim, veina njih pokazala je selektivnu

inhibiciju multiplikacije polio virusa (takoe RNK virusi), to prua mogunost za dalja

istraivanja. Kada je o ovoj grupi jedinjenja re, smatra se da je za inhibiciju aktivnosti HIV1

reverzne transkriptaze neophodno prisustvo hidroksilne grupe u orto poloaju prema karbonilnoj

grupi na hinonskom prstenu (Loya i Hizi, 1990).

Ovaj hidrohinonski/hinonski par poseduje i antiinflamatornu aktivnost; pretpostavlja se

da interferira sa arahidonskom kiselinom (Ferrndiz et al., 1994). Novija istraivanja ukazala su

na znaaj avarola, avarona i/ili njihovih derivata za psorijazu (De Rosa et al., 2008) i

Alchajmerovu bolest (Pejin et al., 2008; Pejin, 2011; Pejin, 2012e). Nijedan od ova dva

sekundarna metabolita vrste D. avara nije neurotoksian (Sladi i Gai, 2006).

Izvor:

http://www.natuurlijkmooi.net/adriatische_zee/sponzen

/dysidea_avara.htm

Izvor:

http://doris.ffessm.fr/fiche2.asp?fiche_

numero=790

Slika 2. Suner Dysidea avara (Schmidt, 1862).


17

Opte je poznato da suneri ive u obligatnoj simbiozi sa razliitim vrstama algi, gljiva,

briozoa i bakterija (Bergquist, 1978). Mller i saradnici (1986) utvrdili su, meutim, tano mesto

sinteze avarola i time ukazali da se radi o sekundarnom mebolitu datog sunera.

Pomou transmisione elektronske mikroskopije pokazali su da se u citoplazmatinim

vezikulama sferularnih elija nalaze granule koje upravo predstavljaju parakristalizovani avarol

(Slika 3). Naime, tenom hromatografijom utveno je da je avarol supstanca koja se nalazi u

sferularnim elijama; kvantitativnim metodama dolo se do podataka da 106 sferularnih elija

sadri 3.2 g avarola. Pored toga, avarol nije detektovan ni kod jednog bakterijskog soja

izolovanog iz vrste D. avara. Najverovatnije je da ovo jedinjenje ima funkciju u regulaciji

bakterijske flore u ekstracelularnom prostoru sunera, budui da poseduje antibakterijsku i

antifungalnu aktivnost. injenica da se pokazalo citotoksinim u in vitro skriningu mogla bi da

objasni podatak zbog ega je intracelularni avarol funkcionalno inaktiviran i smeten u posebnim

vakuolama.

Slika 3. Izgled sferularnih elija sunera Dysidea avara pod transmisionim elektronskim

mikroskopom. (Mller et al., 1986)

p parakristalizovani avarol

n nukleus

- oslobaanje parakristalnih materija


18

3.2.2. Fitol

Odreeni sastojci etarskih ulja razliitog biljnog porekla privukli su veliku panju kao

potencijalni antimikrobni agensi. Premda se ova ulja tradicionalno upotrebljavaju, njihov

antimikrobni potencijal i mehanizmi delovanja jo uvek nisu sasvim razjanjeni (Inoue et al.,

2005; Nikoli et al., 2013).

Etarska ulja predstavljaju kompleksne prirodne smee lako isparljivih produkata

sekundarnog metabolizma biljaka karakteristinog mirisa i ukusa. Ova prirodna organska

jedinjenja iz aromatinih delova biljaka obino se izoluju destilacijom pomou vodene pare

(Kovaevi, 2004), dok im se identifikacija zasniva na instrumentalnim metodama, gasnoj

hromatografiji i gasnoj hromatografiji-masenoj spektrometriji.

Mogu se nai u razliitim delovima biljaka (korenu, rizomu, stablu, semenu, listovima,

cvetovima i plodovima) u koliini koja zavisi od same vrste; u najveem procentu obino su

zastupljeni u listu i cvetu. U pojedinim etarskim uljima identifikovano je i preko 200

komponenti, dok neke sadre praktino samo jedno jedinjenje. Po pravilu, u slobodnom su

obliku i nalaze se u lezdama, lezdanim ljuspama i dlakama, kao i u sekretornim elijama

(Mihajilov-Krstev, 2009).

Preliminarna analize etarskog ulja mahovine Rhodobryum ontariense (Kindb.) (Slika 4)

ukazala je na prisustvo diterpenskog alkohola fitola (Slika 5) kao glavnog sastojaka (Pejin et al.,

2011). Ova biljna vrsta pripada klasi Bryopsida, redu Bryales i familiji Bryaceae. iroko je

rasprostranjena i najee raste na suvim, toplim i krenjakim zemljitima; poto je ujedno i

retka vrsta, moe se rei da joj je areal veliki ali ratrkan (Pejin, 2011).


19

Slika 4. Mahovina Rhodobryum ontariense. Na kineskom jeziku Hui Xin Cao .

Izvor: Pejin et al., 2011.

Kao biljni lek iz tradicionalne medicine, mahovine iz roda Rhodobryum prvenstveno se

sakupljaju i koriste u Junanu (provincija jugozapadne Kine) za srane i neuroloke probleme

(Pejin, 2011). Pored isparljivih komponenti, za vrstu R. ontariense utvreno je prisustvo ugljenih

hidrata (Pejin et al., 2012a,b), masnih kiselina (Pejin et al., 2012c), minerala (Pejin et al., 2013) i

tekih metala (Pejin et al., 2012d).

Prema hemijskoj strukturi, fitol (molekulska formula C20H40O), se ubraja u acikline

nezasiene diterpenske alkohole (Petrovi et al., 2005).

Aktivni je sastojak patenata koji sniavaju nivo triglicerida i/ili holesterola (Olofsson et

al., 2009); smatra se i da povoljno utie na odravanje normalnog nivoa holesterola kod zdravih

osoba. Pored toga, odlikuje se antiradikalskom aktivnou u in vitro uslovima (Santos et al.,

2013).

Slika 5. Strukturna hemijska formula fitola.

(Izvor: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phytol_Formulae.png)


20

Malo je podataka u literaturi za antimikrobnu aktivnost fitola. Rajab i saradnici (1998)

ukazali su na vrednost minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) od 2 g/ml spram soja

Mycobacterium tuberculosis za (E)-fitol, (Z)-fitol i komercijalno dostupnu smeu (E) i (Z)-fitola

u odnosu 2:1, respektivno. Derivati (E)-fitol acetata, smea (2S,3S)- i (2R,3R)-izomera (E)-fitol

epoksida i (3R,S,7R,11R)-fitanska kiselina pokazali su bolju antimikrobnu aktivnost sa

vrednostima za MIC od 8 g/ml, 16 g/ml i >128 g/ml, respektivno. Zapaeno je da je

aktivnost (E)-fitola i (Z)-fitola bila uporediva sa aktivnou etambutola, leka u klinikoj upotrebi.

Pored toga, vredno je pomena da se novi estar (E)-fitol-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosapentaenoat

prirodnog porekla odlikuje antibakterijskom aktivnou prema soju Staphylococcus aureus (zona

inhibicije >4 mm), Staphylococcus epidermidis (zona inhibicije >2 mm), Salmonella

typhimurium (zona inhibicije >2 mm) i Proteus vulgaris (primetna zona inhibicije) (Findlay i

Patil, 1984).


21

4 Materijal i metode

4.1. Bioloki materijal

4.1.1. Suner Dysidea avara

Suner Dysidea avara sakupljen je u Bokokotorskom zalivu (Crna Gora), ronjenjem na

dubini od 5 m do 15 m. Vauer primerak date vrste uva se u Institutu za biologiju mora u

Kotoru.

4.1.1. Test kulture mikroorganizama

Od referentnih bakterijskih kultura (ATCC American Type Culture Collection) koriene su

dve Gram-negativne (Escherichia coli ATCC 11229

i Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

) i pet

Gram-pozitivnih (Bacillus cereus ATCC 11778

, Sarcina lutea ATCC 9341

, Clostridium sporogenes

ATCC 19404

, Enterococcus faecalis ATCC 19433

i Staphylococcus aureus ATCC 25923

) iz kolekcije

kultura Mikrobioloke laboratorije Departmana za biologiju i ekologiju Prirodno-matematikog

fakulteta Univerziteta u Novom Sadu. Od izolata, koriena su dva humana patoloka bakterijska

soja poreklom iz vaginalnog brisa (Staphylococcus aureus 5485 i Streptococcus agalactiae

5492), poreklom iz Medicinske laboratorije BIOTEST, Novi Sad.

4.2. Ispitivane supstance

Avarol je izolovan iz morskog sunera D. avara, dok je avaron dobijen oksidacijom

avarola pomou Ag2O u etanolu (Minale et al., 1974; De Rosa et al., 1976). Po 1 mg obe

supstance (u kristalnom obliku) rastvoren je u 1 ml 97 % etanola, kako bi se dobila poetna

koncentracija (1 mg/ml).

Diterpenski alkohol fitol nabavljen je u tenom stanju od komercijalnog proizvoaa

(Sigma-Aldrich, Nemaka).


22

4.3. Bakterijske suspenzije i standardizacija inokuluma

Skrining antibakterijske aktivnosti uraen je po standardnoj Kirbi-Bauer-ovoj

proceduri. Priprema bakterijskih suspenzije uraena je na 0.5 po McFarland-u. Prethodno su

bakterijske stock kulture osveene presejavanjem referentnih sojeva na hranljive podloge

Meller Hinton agara u Perti ploama.

Iz sveih bakterijskih kultura (18-24), inkubiranih na 37 C preko noi, uzet je deo

bakterijske kolonije pomou prethodno sterilisane bakterioloke eze. Izrasla bakterijska kultura

zatim je suspendovana u epruvetama sa 0.9 % NaCl (fiziolokim rastvorom). Homogeni rastvor

suspenzije dobijen je upotrebom vorteksa (IKA, Nemaka). Suspenzija je napravljena po

McFarland standardu 0.5; aproksimativna brojnost bakterija procenjuje se iz njene gustine (CFU

- 1.5 108/ml) (Norell i Messley, 1997). Gustina suspenzije odreena je kolorimetrijski

uporeujui svee napravljenu bakterijsku suspenziju i McFarland 0.5 standard koji odgovara

zamuenju nastalom u reakciji izmeu 99.5 ml 0.1 M rastvora H2SO4 i 5ml rastvora 0.2 M

barijum-hlorida dihidrata (BaCl2 2H2O). U ovom sluaju zamuenje je podeavano

fotoelektrinim fotometrom pri emu je korien crveni filter (KOLORIMETER MA 9504

Metrix). Ovako dobijena bakterijska suspenzija omoguava semikonfluentan rast

mikroorganizama na hranljivoj podlozi. elije rastu u formi kontinuiranog tepiha u Petri ploi.

Fotoelektrina fotometrija spada u najprimenjenije optike apsorpcione tehnike. Ova

metoda slui za kvantitativno odreivanje i zasniva se na merenju intenziteta proputene

svetlosti, odnosno apsorbancije (A) ili transmisije (T), uz prethodno eksperimentalno definisanu

funkcionalnu vezu ovih veliina od koncentracije (Krsti i Marjanovi, 1998).

Potom je po 100 l pripremljene bakterijske suspenzije sterilnom automatskom pipetom

preneeno u epruvete sa 9.9 ml dvostruko koncentrovanog Meller Hinton bujona, prethodno

sterilisanog u autoklavu (121 C, 20 min). Na ovaj nain dobijen je odnos od 1:100, koji

odgovara finalnoj gustini bakterijske suspenzije od 2 106 CFU/ml.


23

4.4. Minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna (MBC) koncentracija

Za odreivanje minimalne inhibitorne (MIC) i minimalne baktericidne (MBC)

koncentracije antimikrobnog agensa uraen je antimikrobni skrining pomou mikro-dilucione

metode, koja podrazumeva meanje serije dvostrukih razblaenja testiranih uzoraka sa podlogom

koja je prethodno inokulisana test organizmom (Berghe i Vlietinck, 1991).

Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) predstavlja najniu koncentraciju ispitivane

supstance pri kojoj dolazi do inhibicije vidljivog rasta testiranih sojeva mikroorganizama

(oitavanjem suspenzije koja nema zamuenja u hranljivom bujonu Meller Hinton). Minimalna

baktericidna koncentracija (MBC) predstavlja koncentraciju agensa koja ubija vie od 99.9 %

elija poetnog inokuluma ispitivanog mikroorganizma (dobija se po zasejavanju radnih proba

na nove ploe hranljivog agara, a na osnovu broja izraslih kolonija nakon subkultivacije od

vrednosti MIC pa nanie) (Clinical Laboratory Standards CLSI, 2005).

4.5. Procena vrednosti MIC i MBC

Procena vrednosti MIC i MBC utvrena je u sterilnim polipropilenskim mikrotitar

ploama sa 96 bunaria zapremine od 350 l (Spektar, aak, Srbija) u dva ponavljanja, za

svaki bakterijski soj.

U svaki prvi vel (bunari) doda se po 90 l dH2O dok se u ostale, osim poslednjeg, doda

po 50 l. Potom se u prvi vel doda po 10 l ispitivane supstance poetne koncentracije 1mg/ml

(osnovni rastvor), a zatim su pravi serija dvostrukih razblaenja, tako to se sterilnom

automatskom pipetom iz prethodnog vela uzima po 50 l prvog razblaenja i prenosi se u sledei

vel u nizu, sve do desetog vela, odakle se izbaci koliina od 50 l kako bi zapremina bila jednaka

u svim bunariima. U svaki vel zatim se dodaje po 50 l MHB inokulisanog prethodno

pripremljenom standardnom suspenzijom testirane kulture (Slika 6). Na ovaj nain u prvom velu

dobija se finalna koncentracija od 12.5 l/ml, dok se u drugom velu u nizu zbog dvostrukog

razblaenja podloge, koncentracija ispitivane supstance dvostruko smanjuje to u finalnoj

koncentraciji iznosi 6.25 l/ml i tako redom, sve do desetog vela, gde se nalazi najnia

koncentracija ispitivane supstance, koja je iznosila 0.02 l/ml (Tabela 1).


24

Pored radnih proba, u kojima su testirana antibakterijska dejstva ispitivanih supstanci, raene su i

tri kontrole: kontrola rasta test organizma, kontrola ispitivane supstance i kontrola rastvaraa

(kontrola etanola).

1. Kontrola rasta test organizma: sadri 50 l MHB inokulisanog sa odgovarajuim test

organizmom i 50 l dH2O, sa ciljem kontrole rasta i vitalnosti bakterijskog soja. Ne

sadri ispitivanu supstancu.

2. Kontrola ispitivane supstance: sadri 50 l MHB bez bakterijske kulture, 40 l dH2O i

10l ispitivane supstance iz osnovnog rastvora. Predstavlja kontrolu uticaja supstance

(antibakterijskog agensa) na podlogu i ne sadri bakterije.

3. Kontrola rastvaraa: sadri 50 l MHB inokulisanog sa odgovarajuim test

organizmom, 45 l dH2O i 5 l 97 % etanola. Predstavlja kontrolu uticaja rastvaraa na

rast test organizama.

U svim velovima, radne probe ili kontrolne probe, ukupna zapremina smee u

bunariima iznosila je 100 l. Mikrotitar ploe zatim su poklopljene inkubirane u termostatu na

37 C u trajanju od 24 h.


25

Slika 6. Mikrotitar ploa sa inokulisanin hranljivim bujonom (Meller

Hinton), tretiranih serijom duplih razblaenja avarona (12.50-0.02 g/ml).

Nakon isteka inkubacije od 24 h oitani su rezultati. MIC vrednost utvruje se vizuelno

uporeivanjem sa kontrolom rasta test organizma i predstavlja prvu koncentraciju ispitivane

supstance u bunariu pri kojoj nema zamuenja odnosno precipitacije (uoljivog rasta). Za

procenu MBC potrebno je iz komorica, u kojima je procenjeno odsustvo rasta bakterija, prebaciti

sadraj, u ovom sluaju po 100 l, na Petri ploe sa Meller Hinton agarom. Zasejane Petri ploe

zatim se odloe u termostat na 37 C tokom naredna 24 h. Nakon inkubacije prebroje se kolonije

izraslih bakterija na Petri ploama.


26

Tabela 1. Finalne koncentracije avarola, avarona i fitola u mikrotitar ploama.

Oznake radnih

koncentracija

Finalne koncentracije ispitivanih

supstanci (g/ml)

C1 12.50

C2 6.25

C3 3.12

C4 1.56

C5 0.78

C6 0.39

C7 0.19

C8 0.10

C9 0.05

C10 0.02

4.6. Osetljivost kultura na standardne antibiotike

U cilju odreivanja osetljivosti kultura na standardne antibiotike i poreenja vrednosti

ispitivanih supstanci za MIC i MBC sa odgovarajuim vrednostima komercijalnih tj. standardnih

antibiotika gentamicina i ampicilina, naknadno su testirane kulture standardnom Kirby-Bauer-

ovom metodom u Petri ploama, kao i mikro/dilucionom metodom, za svaki bakterijski soj u dva

ponavljanja.

4.7. Priprema serije razreenja gentamicina i ampicilina

Serije dvostrukih razblaenja standardnih antibiotika napravljena su u opsegu koncentracija

od 20 - 0.16 g/ml i 128 - 1 g/ml za gentamicin i ampicilin, respektivno (za oba antibiotika,

ukupno po 8 koncentracija) (Tabela 2).

Za pripremu odgovarajuih koncentracija antibiotika koriene su sterilne mikrokivete

('ependorfice') od 1 ml u kojima je, pri sterilnim uslovima, dodato po 500 l sterilne dH2O. Kod

oba antibiotika u prvoj ependorfici zapremina sterilne dH2O iznosila je 900 l da bi pri

dodavanju 100 l odgovarajueg antibiotika iz osnovnog rastvora (njegova koncentracija bila je


27

256 mg/ml i 40 mg/ml za ampicilin i gentamicin, respektivno) dobili eljenu poetnu

koncentraciju u odnosu 1:10. Pomou serije dvostrukih razblaenja napravljene su ostale finalne

radne koncentracije standardnih antibiotika. Iz ependorfice sa odgovarajuim koncentracijama

antibiotika zatim je preneena potrebna zaprremina radne probe od 100 l i implicirana u velove

mikrotitar ploa sa po 100 l MHB inokulisanim test bakterijama. Prva radna koncentracija kod

gentamicina bila je 20 g/ml, a kod ampicilina 128 g/ml.

Tabela 2. Finalne koncentracije referentnih antibiotika u mikrotitar ploama.

Radne koncentracije

antibiotika

Gentamicin (g/ml) Ampicilin (g/ml)

C1 20 128

C2 10 64

C3 5 32

C4 2.50 16

C5 1.25 8

C6 0.62 4

C7 0.31 2

C8 0.16 1

4.8. Odreivanje osetljivosti bakterija na antibiotike

Zbog odreivanja osetljivosti bakterija na standardne antibiotike primenjena je disk-

difuziona Kirby-Bauer-ova metoda, koja se bazira na primeni diskova sa odreenim

koncentracijama antibiotika (najee 10-40 g) na agarizovanoj hranljivoj podlozi Meller

Hinton prethodno zasejanoj sa odreenom test bakterijom.

Nakon inkubacije u termostatu (37 C, 24 h), izmeri se prenik zone inhibicije

(oitavanjem zone oko diska sa postavljenim antibiotikom); isti se smatra merom inhibitorne

aktivnosti antibiotika tj. osetljivosti bakterije na odreeni antibiotik.

Prilikom odreivanja osetljivosti bakterija standardnom disk-difuzionom metodom, u

veini sluajeva koriste se diskovi sa antibiotikom odreene koncentracije, koje variraju u


28

zavisnosti od antibiotika. U ovom radu upotrebljeni su standardni diskovi (Torlak, Beograd), kao

i diskovi sa imipenemom (APP Pharmaceuticals, LLC) i tobramicinom (Akorn - Strides, LLC).

Upotreba diskova sa antibiotikom, uz standardizaciju uslova izvoenja testa, omoguuje

da se proceni da li je mikroorganizam osetljiv ili rezistentan na odgovarajui antibiotik

poreenjem veliina inhibitorne zone sa referentnim vrednostima u specifikaciji proizvoaa

(Jawetz et al., 1998).

Prethodno pripremljene i sterilisane Petri ploe sa Meller Hinton agarom inokulisane su

ispitivanim bakterijskim sojevima, a zatim je uraena inokulacija sa po 200 l pripremljenih

suspenzija test mikroorganizama (bakterijska suspenzija turbiditeta 0.5 McFarland-a koja sadri

1.5 106 CFU/ml) i razmazano je sterilnim staklenim tapiem. Po postavljenju diskova sa

antibioticima, Petri ploe odloene su u inkubator na 37 C, u trajanju od 18-24 h. Nakon isteka

vremena inkubacije rezultati su oitavani merenjem prenika zone inhibicije rasta bakterija i

izraeni su u mm.


29

5. Rezultati i diskusija

U ovom master radu uraen je in vitro 'skrining' antibakterijske aktivnosti tri odabrana

terpena koja se javljaju u prirodi (avarol, avaron i fitol) na devet bakterijskih sojeva (dva

Gram-negativna i sedam Gram-pozitivnih) razliitog porekla. Naime, datim 'skriningom'

obuhvaeno je sedam referentnih bakterijskih kultura (ATCC), kao i dva humana patoloka

izolata.

Sve tri ispitivane supstance pokazale su se aktivnim prema Gram-pozitivnim bakterijama,

ali u razliitoj meri (Tabela 3).

5.1. Avarol i avaron

Moe se uoiti da su avarol i avaron pokazali visoku antibakterijsku aktivnost na

Gram-pozitivne bakterije inhibirajui rast bakterija (u zavisnosti od karakteristika samih kultura)

ve pri koncentracijama od 0.78 g/ml (B. cereus i S. lutea) preko koncentracije 1.56 g/ml

(Cl. sporogenes, E. faecalis, S. aureus) do 12.5 g/ml za humane patoloke kulture koje su,

inae, pokazale najveu rezistenciju prema njima (Tabela 3), kao i prema standardnim

antibioticima (Tabela 4). Posebno je znaajno uoiti da su sve MIC vrednosti koncentracija

prema atestiranim kulturama analiziranih Gram-pozitivnih bakterija bile za dva do etiri puta

nie od vrednosti dobijenih za referentne antibiotike (ampicilin i gentamicin), to upuuje na

eventualnu mogunost njihove primene kao antibiotika u budunosti. Pri tome, sve testirane

Gram-pozitivne bakterije bile su osetljivije na ampicilin (u poreenju sa gentamicinom), sem u

sluaju humanog izolata S. aureus koji je ispoljio multirezistenciju i u standardnom antibiogram

testu (Tabela 4).

Takoe je primeeno da su testirane Gram-negativne bakterije E. coli i P. aeruginosa bile

neosetljive na uticaj ispitivanih supstanci, to je u skladu sa rezultatima prethodnih istraivaa.

Naime, antibakterijska aktivnost avarola i avarona bila je predmet dosadanjih istraivanja koja


30

su ukazala na njihovu umerenu, ali selektivnu aktivnost prema Gram-pozitivnim bakterijama

(Gai, 1988; Cozzolino et al., 1990; Pejin et al., 2008; Boi et al., 2010). Isto se potvrdilo i u

eksperimentu obuhvaenim ovim radom.

Prema Boi i saradnicima (2010), u sluaju soja S. aureus vrednost MIC za avarol iznosi

12.50 g/ml, a za avaron 6.25 g/ml. Pejin i saradnici (2008) istakli su da avarol i avaron

inhibitorno deluju na B. subtilis i M. luteus (25 g/ml i 10 g/ml & 10 g/ml i 1 g/ml,

respektivno). U ranijoj studiji na temu antimikrobne aktivnosti ovog redoks para (Seibert et al,

1985), izmeu ostalog, dolo se do zakljuka da je najvea antibakterijska aktivnost uoena

prema sojevima Streptococcus pneumoniae i Erysipelothrix rhusiopathiae (MIC 0.781 mg/l), kao

i to da je avaron bio aktivniji od avarola prema testiranim Gram-pozitivnim sojevima.

Generalno, avarol i avaron pokazali su veu antibakterijsku aktivnost od fitola: vrednosti za

MIC u opsegu su im od 0.78 g/ml do 3.12 g/ml, a za MBC od 3.12 g/ml do 12.50 g/ml.

Trebalo bi istai da su date vrednosti u sluaju referentnih bakterijskih kultura praktino

identine, to se moe objasniti lakoom konverzije avarona u avarol. S druge strane, uoljiva je

razlika u delovanju ovih marinskih prirodnih proizvoda na referentne i patoloke bakterijske

sojeve. Naime, rast S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492 inhibiran je tek pri koncentraciji od

12.50 g/ml, dok su relevantne MBC vrednosti iznad 12.50 g/ml, tj. najvee radne

koncentracije (Grafik 1 i Grafik 2). Naime, bakterijski sojevi iz patolokog materijala

vaginalnog brisa pokazali su se rezistentnijim od referentnih elijskih kultura, tj. manje

osetljivim na supstance sa antibiotskom aktivnou. Konkretno, u ovom master radu soj

S. aureus 5485 pokazao se rezistentnim prema svim testiranim antibioticima (Tabela 4).

Vrednosti avarola i avarona za MIC ukazuju da bi njihovi derivati mogli inspirisati razvoj novih

bioaktivnih agenasa na rezistentne sojeve ukljuujui S. aureus 5485, ukoliko bi imali vei

terapeutski indeks tj. bolju antibakterijsku aktivnost od datog redoks para.


31

Grafik 1. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) avarola (MIC AOL), avarona (MIC AON) i

referentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na testirane Gram-pozitivne

bakterije.

0.5

1

2

4

8

16

32

64

128

MIC AOL

MIC AON

MIC GEN

MIC AMP


32

5.2. Fitol

U poreenju sa sekundarnim metabolitima sunera D. avara (avaronom i avarolom), fitol

se pokazao manje efikasnim i spram standardnih bakterijskih kultura i spram klinikih izolata

(Tabela 3). Najvea inhibitorna aktivnost uoena je na sojeve E. faecalis i S. aureus (MIC 1.56

g/ml), a najmanja na sojeve S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492 (MIC 12.50 g/ml) (Grafik 3).

Kada je o odgovarajuim vrednostima za MBC re, one su ili 12.50 g/ml (sojevi B. cereus, S.

aureus, E. coli i P. aeruginosa) ili iznad date vrednosti (sojevi S. lutea, S. sporogenes,

E. faecalis, S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492), to ukazuje na podatak da maksimalna radna

koncentacija (12.50 g/ml) prema naznaenim bakterijama nije imala baktericidnu aktivnost

(Grafik 4).

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona (MBC

AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane

Gram-pozitivne bakterije.

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona (MBC

AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane

Gram-pozitivne bakterije.

1

2

4

8

16

32

64

128

MBC AOL

MBC AON

MBC GEN

MBC AMP

1

2

4

8

16

32

64

128

MBC AOL

MBC AON

MBC GEN

MBC AMP


33

Za razliku od pomenutih seskviterpena, diterpen fitol bio je aktivan prema

Gram-negativnim bakterijama: dok su mu vrednosti MBC jednake za oba soja (12.50 g/ml),

odgovarajue vrednosti za MIC identine (12.50 g/ml i 6.25 g/ml, respektivno).

U Japanu Inoue i saradnici (2005) ispitivali su aktivnost odreenih diterpena

(geranilgeraniola, terpenona i fitola) na rast soja S. aureus. Utvrdili su da fitol pokazuje

bakteriostatsku aktivnost u opsegu od 1.25 g/ml do 40 g/ml, a baktericidnu aktivnost od 10 do

80 g/ml. U ovom radu utvreno je da se njegova minimalna inhibitorna vrednost na rast soja

S. aureus ispoljava pri koncentraciji od 1.56 g/ml, dok mu odgovarajua vrednost za MBC

iznosi 12.50 g/ml.

Veliki broj studija ukazuje da razliiti bakterijski sojevi uzrokuju infektivni endokarditis

(IE), zapaljenski proces na sranim zaliscima i drugim strukturama srca izazvan infektivnim

agensima. Meu najee uzronike IE ubraja se soj S. aureus (Yeaman i Bayer, 2000). Izmeu

ostalog, konstatovano je da ovaj zapaljenski proces mogu izazvati i sojevi B. cereus (Steen et al.,

1992), Clostridium sp. (Koch i Estrella, 1999), E. faecalis (Dahl et al., 2013), E. coli (Lauridsen

et al., 2011) i P. aeruginosa (Dawson et al., 2011). Uzimajui u obzir upotrebu mahovine

R. ontariense u etno medicini moe se pretpostaviti da je fitol jedan od njenih kardioprotektivnih

hemijskih konstituenata, delom i zbog svoje umerene antibakterijske aktivnosti.

U nedavnom skriningu antimikrobne aktivnosti dimetil-sulfoksidnog ekstrakta biljne

vrste R. ontariense (osam bakterijskih sojeva; modifikovana mikrodiluciona tehnika) naeno je

da se vrednosti za MIC i MBC kreu u opsegu od 1 mg/ml do 3 mg/ml (Pejin et al., 2012). Dalja

ispitivanja odnosila su se na aj od pomenute mahovine tj. liofilizovani vodeni ekstrakt; dobijene

vrednosti za MIC (0.62 - 6.00 mg/ml) i MBC (2.50 - 8.00 mg/ml) vie su od odreenih za njen

dimetil-sulfoksidni ekstrakt (Pejin et al., 2013). Fitol je, meutim, pokazao znatno veu

antibakterijsku aktivnost od oba ekstrakta, to je podatak koji ne iznenauje, s obzirom da se

iste supstance, po pravilu, odlikuju potentnijom biolokom aktivnou od ekstrakata i / ili

njihovih frakcija.


34

Grafik 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) fitola (MIC FIT) i r

eferentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) n

a testirane bakterije.

1

2

4

8

16

32

64

128

MIC FIT

MIC GEN

MIC AMP


35

Grafik 4. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) fitola (MBC FIT) i referentnih

antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane bakterije.

1

2

4

8

16

32

64

128

MBC FIT

MBC GEN

MBC AMP


36

Tabela 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne koncentracije (MBC) ispitivanih supstanci

Test organizmi

Ispitivane supstance Referentna vrednost antibiotika

Avarol Avaron Fitol Gentamicin Ampicilin

MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml)

B.cereus ATCC11778

0.78 3.12 0.78 3.12 6.25 12.50 2.50 10 2 4

S.luteaATCC9341 0.78 6.25 0.78 6.25 6.25 12.50 2.50 20 2 2

Cl.sporogenesATCC19404 1.56 12.50 1.56 12.50 3.12 12.50 2.50 20 64 128

E.faecalisATCC19433 1.56 6.25 3.12 12.50 1.56 12.50 5 20 16 128

S.aureusATCC25923 1.56 12.50 1.56 6.25 1.56 12.50 2.50 10 8 128

S.aureus 5485 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 20 20 ND ND

S.agalactiae 5492 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 20 20 32 128

E.coliATCC11229 ND ND ND ND 12.50 12.50 2.50 10 64 128

P.aeruginosaATCC 9027

ND ND ND ND 6.25 12.50 NT NT NT NT

Legenda: ND: ne deluje; NT: nije testiran; : vie od.


37

Tabela 4. Osetljivost test mikroorganizama prema konvencionalnim antibioticima.

Testirani bakterijski

sojevi

Ispitivani antibiotici

Cef.

(30 g)

Kan.

(30 g)

Met.

(10 g)

Azit.

(15 g)

Ceft.

(30 g)

Cefta.

(30 g)

Tet.

(30 g)

Cefa.

(30 g)

N.K

(30 g)

Imip.

(10 g)

Tob.

(10 g)

B.cereusATCC11778

R S S NT R R S I S S S

S.luteaATCC9341

R R R R R R R R R S R

Cl.sporogenesATCC19404

R R R NT R R R R R S S

E.faecalisATCC19433

R I R S R R S R R S S

S.aureusATCC25923

S S S NT S R S S R S S

S.aureus 5485 R R R R R R R R R R R

S.agalactiae 5492 I R R R R R R R R S R

E.coliATCC11229

S I R R S I R R R S S

Legenda: Cef.-Cefotaksim ( 23 S; 18-22 I; 17 R); Kan.-Kanamicin ( 26 S; 23-25 I; 22 R); Met.-Meticilin ( 21S; 20-17 I; 16 R); Azit.-Azitromicin ( 19; 18-15 I; 14);

Ceft.-Ceftriakson ( 16 S; 13-15 I; 12 R); Cefta.-Ceftazidim ( 19 S; 18-17 I; 16 R); Tet.-Tetraciklin ( 26S; 23-25 I; 22 R); Cefa.-Cefahlor ( 20 S; 19-15 I; 14 R); N.K.-

Nalidiksinska kiselina ( 26 S; 25-23 I; 22 R); Imip.-Imipenem ( 20 S; 19-17 I; 16 R); Tob.-Tobramicin ( 15 S; 13-14 I; 12 R).

NT nije testirano.


38

6. Zakljuak

Avarol i avaron glavni su sekundarni metaboliti sunera D. avara (Minale et al., 1974;

De Rosa et al., 1976). Njihova raznolika bioaktivnost (Gai, 1988; Sladi i Gai, 2006; Pejin

et al., 2008), niska toksinost na mieve (20 % smrtnosti pri dozi od 1g / kg)

(De Pasquale et al., 1991) i odsustvo sporednih efekata kod ljudi pri dozi od 3 mg/kg (Mller

et al., 1987) ini ih dobrim kandidatima za razvoj novih terapeutskih agenasa. Datu tvrdnju

podupiru i podaci da ova jedinjenja nisu ni direktni mutageni ni promutageni ve ih, naprotiv,

karakterie antimutagena aktivnost (Kurelec et al., 1985), kao i penetracija kroz krvno-

modanu barijeru (Mller et al., 1986).

Rezultati proistekli iz ovog rada ukazuju na njihov znaajan antibakterijski potencijal, u

prvom redu na soj B. cereus, koji je vei od pozitivnih kontrola, antibiotika gentamicina i

ampicilina. Identine vrednosti ovih jedinjenja za MIC i MBC prema datoj bakteriji verovatno

potiu od lake konverzije avarona u avarol. Dalja istraivanja mogla bi da obuhvate

semisinteze novih derivata avarola i avarona i testiranje njihove antibakterijske aktivnosti kako

bi se pomou SAR studija dolo do vanih zakljuaka o odnosu izmeu hemijske strukture i

odreene bioaktivnosti. Takoe, in vitro antibakterijski skrining ovih marinskih prirodnih

proizvoda mogao bi se proiriti (na do sada neobuhvaene sojeve), a bilo bi koristno testirati ih

i u in vivo uslovima.

Fitol se smatra najrasprostranjenijim aciklinim izoprenoidnim jedinjenjem u prirodi

(Daines et al., 2003), a novija istraivanja istiu njegov medicinski potencijal i znaaj (Santos

et al., 2013). Eksperimentalni podaci do kojih se dolo u ovom radu predstavljaju doprinos

izuavanjima ne samo njegove antimikrobne aktivnosti, ve i kardioprotektivnog efekta.

Naime, fitol je pokazao relevantnu antibakterijsku aktivnost na sojeve koji mogu biti ukljueni

u patologiju infektivnog miokarditisa, na prvom mestu prema bakterijama S. aureus i E.

faecalis. Izmeu ostalog, dalja istraivanja trebalo bi usmeriti ka ispitivanju mehanizma

njegovog dejstva na pomenute sojeve i antibakterijskom skriningu u in vivo uslovima.


39

7. Literatura

Alanis, J.A. (2005). Resistance to antibiotics: are we in the post antibiotic era? Archieves of

Medical Research, 36: 697705.

Beovi, B. (2006). The issue of antimicrobial resistance in human medicine. International

Journal of Food Microbiology, 112: 280287.

Berghe, A.D. & Vlietnick, A.J. (1991). Screening methods for antimicrobial and antiviral

agents from higher plants. Methods in Plant Biochemistry, 6: 4769.

Bergquist, P.R. (1978). Sponges. University of California Press.

Boi, T., Novakovi, I., Gai, M.J., Jurani, Z., Stanojkovi, T., Tufegdi, S., Kljaji, Z. &

Sladi, D. (2010). Synthesis and biological activity of derivatives of the marine quinone

avarone. European Journal of Medicinal Chemistry, 45: 923929.

Carballo, J.L., Snchez-Moyano, J.E. & Garca-Gmez, J.C. (1994). Esponjas del Estrecho de

Gibraltar. I. Esponjas crneas. Graellsia, 50: 3556.

Cozzolino, B., De Giulio, A., De Rosa, S., Strazzullo, G., Gai, M.J., Sladi, D. & Zlatovi,

M. (1990). Biological activities of avarol derivatives, 1. amino derivatives. Journal of Natural

Products, 53: 699702.

Dahl, A., Rasmussen, R.V., Bundgaard, H., Hassager, C., Bruun, L.E., Lauridsen, T.K., Moser,

C., Sogaard, P., Arpi, M. & Bruun, N.E. (2013). Enterococcus faecalis infective endocarditis: a

pilot study of the relationship between duration of gentamicin treatment and outcome.

Circulation, 127: 18101817.


40

Daines, A.M., Payne, R.J., Humphries, M.E. & Abell, A.D. (2003). The synthesis of naturally

occurring vitamin K and vitamin K analogues. Current Organic Chemistry, 7: 16251634.

Dawson, N.L., Brumble, L.M., Pritt, B.S., Yao, J.D., Echols, J.D. & Alvarez, S. (2011). Left-

sided Pseudomonas aeruginosa endocarditis in patients without injection drug use. Medicine

(Baltimore), 90: 250255.

De Giulio, A., De Rosa, S., Strazzullo, G., Diliberto, L., Obino, P., Marongiu, M.E., Pani, A. &

La Colla, P. (1991). Synthesis and evaluation of cytostatic and antiviral activities of 3' and 4'-

avarone derivatives. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2: 223227.

De Pasquale, R., Circosta, C., Occhiuto, S., De Rosa, S. & De Stefano, S. (1991).

Pharmacological studies on terpenoids from marine sponges: analgesic and muscle relaxant

effects. Phytotherapy Research, 5: 4953.

De Rosa, S., Minale, L., Riccio, R. & Sodano, G. (1976). The absolute configuration of avarol,

a rearranged sesquiterpenoid hydroquinone from a marine sponge. Journal of the Chemical

Society, Perkin Transactions 1, 1: 14081414.

De Rosa, S., Pejin, B. & Tommonaro, G. (2008). Anti-inflammatory marine natural products

with antipsoriatic effects, 4th

International Conference on Oxidative Stress in Skin Medicine

and Biology, Andros, Greece, September 11-14, Book of Abstracts, p. 53.

Ferrndiz, M.L., Sanz, M.J., Bustos, G., Pay, M., Alcaraz, M.J. & De Rosa S. (1994). Avarol

and avarone, two new anti-inflammatory agents of marine origin. European Journal of

Pharmacology, 253: 7582.

Findlay, J.A. & Patil, A.D. (1984). Antibacterial constituents of the diatom Navicula delognei.

Journal of Natural Products, 47: 815818.


41

Gai, M.J. (1988). Biologically active compounds from marine sponges: an approach to

chemical and biochemical characterization of the avarol/avarone redox couple. Journal of the

Serbian Chemical Society, 53: 229249.

Inoue, Y., Hada, T., Shiraiski, A., Hirose, K., Hamashima, H. & Kobayashi, S. (2005).

Biphasic effects of geranylgeraniol, teprenone and phytol on the growth of Staphylococcus

aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49: 17701774.

Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A. (1998). Medicinska mikrobioloija. Savremena

administracija, Beograd.

Kovaevi, N. (2004). Osnovi farmakognozije. Srpska kolska knjiga, Beograd.

Koch, F. & Estrella, C. (1999). Features of infectious endocarditis by Clostridium sp. in the

elderly population of a general hospital. Anaerobe, 5: 381383.

Krsti, B. & Marjanovi, N. (1988). Instrumentalne metode u biolokim istraivanjima.

Univerzitet u Novom Sadu.

Kruni, M. (1992). Zoologija invertebrata. Univerzitet u Beogradu.

Kurelec, B., Zahn, R.K., Gasic, M.J., Britvic, S., Lucic, D. & Mller, W.E.G. (1985).

Antimutagenic activity of the novel anti-leukemic agents, avarone and avarol. Mutation

Research, 144: 6366.

Lauridsen, T.K., Arpi, M., Fritz-Hansen, T., Frimodt-Moller, N. & Bruun, N.E. (2011).

Infectious endocarditis caused by Escherichia coli. Scandinavian Journal of Infectious

Diseases, 43: 545546.


42

Loya, S. & Hizi, A. (1990). The inhibition of human immunodeficiency virus type 1 reverse

transcriptase by avarol and avarone derivatives. FEBS Letters, 269: 131134.

MihajilovKrstev, T. (2009). Doktorska disertacija. Hemijski sastav i antimikrobna aktivnost

etarskih ulja biljnih vrsta roda Satureja L. Prirodno-matematiki fakultet. Univerzitet u

Novom Sadu.

Mili, B.Lj. (1997). Terpeni. Tehnoloki fakultet. Univerzitet u Novom Sadu.

Minale, L., Riccio, R. & Sodano, G. (1974). Avarol, a novel sesquiterpenoid hydroquinone

with a rearranged drimane skeleton from the sponge Dysidea avara. Tetrahedron Letters, 15:

34013404.

Mller, W.E.G., Diehl-Seifert, B., Sobel, C., Bechtold, A., Kljajic, Z. & Dorn, A. (1986).

Sponge secondary metabolties: biochemical and ultrastructural localization of the antimitotic

agent avarol in Dysidea avara. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 34: 16871690.

Mller, W.E.G., Maidhof, A., Zahn R.K., Schrder, H.C, Gai, M.J., ... & Seibert, G. (1985).

Potent antileukemic activity of the novel cytostatic agent avarone and its analogues in vitro and

in vivo. Cancer Research, 45: 48224826.

Mller, W.E.G., Sarin, A., Kuchino, Y., Dorn, A., Hess, G., Meyer zum Bschenfelde, K-H.,

Rottmann, M. & Schrder, H.C.M. (1987). Avarol, a novel anti-HIV compound,

which modulates posttranscriptional control systems. In: W. Vettermann and M. Schauzu

(Eds.), AIDS. Bonn: Bundesministeriums fr Forschung und Technologie, p. 354378.

Nikoli, M., Markovi, T., Mojovi, M., Pejin, B., Savi, A., Peri ,T., Markovi, D.,

Stevi, T. & Sokovi, M. (2013). Chemical composition and biological activity of Gaultheria

procumbens L. essential oil. Industrial Crops and Products 49: 561567.


43

Norell, S.A. & Messley K.E. (1997). Microbiology laboratory manual. Principles and

applications. Prentice Hall, New Jersey.

Novakovi, A. (2010). Master rad. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja vrsta Carum carvi L.,

Coriandrum sativum L. i Pimpinella anisum L. (Apiaceae Juss.). Prirodno-matematiki

fakultet. Univerzitet u Novom Sadu.

Olofsson, P., Hultqvist, M. & Holmdahl, R. (2011). Phytol as a cholesterol lowering

agent. United States Patent Application Publication, Appl. No. 12/921,169.

Pejin, B. (2011). Doktorska disertacija. Hemijski sastav i medicinski potencijal odabranih vrsta

liajeva, briofita i sunera. Hemijski fakultet. Univerzitet u Beogradu.

Pejin, B. (2012e). Thio-avarol derivatives and Alzheimer's disease, Serbia Italia Status and

Perspectives of the Scientific and Technological Bilateral Cooperation, Belgrade, Serbia, June

25-26, AIS3 Proceedings, p. 131134.

Pejin B., Belic, D., Vuckovic, G., Kien-Thai, Y. & Stanimirovic, B. (2013). Mineral content of

a moss tea hypertension. Italian Journal of Food Science, 25: 235237.

Pejin, B., Bianco, A., Newmaster, S., Sabovljevic, M., Vujisic, Lj., Tesevic, V., Vajs, V. & De

Rosa, S. (2012c). Fatty acids of Rhodobryum ontariense (Bryaceae). Natural Product

Research, 26: 696702.

Pejin, B., Glamoclija, J., Ciric, A., Kien-Thai, Y. & Sokovic, M. (2013). The moss

Rhodobryum ontariense tea, a good source of natural antifungals against Candida albicans.

Revista de Chimie 64: 552554.

Pejin, B., Iodice, C., Tommonaro, G. & De Rosa, S. (2008). Synthesis and biological activities

of thio-avarol derivates. Journal of Natural Products, 7: 18501853.


44

Pejin, B., Iodice, C., Tommonaro, G., Sabovljevic, M., Bianco, A., Tesevic, V., Vajs, V. & De

Rosa, S. (2012a). Sugar composition of the moss Rhodobryum ontariense (Kindb.) Kindb.

Natural Product Research, 26: 209215.

Pejin, B., Kien-Thai, Y., Stanimirovic, B., Vuckovic, G., Belic, D. & Sabovljevic, M. (2012d).

Heavy metal content of a medicinal moss tea for hypertension. Natural Product Research, 26:

22392242.

Pejin, B., Sabovljevi, A., Sokovi, M., Glamolija, J., iri, A., Vujii, M. & Sabovljevi,

M. (2012). Antimicrobial activity of Rhodobryum ontariense. Hemijska industrija (Chemical

Industry), 66: 381384.

Pejin, B., Sabovljevic, M., Tesevic, V. & Vajs., V. (2012b). Further study on

fructooligosaccharides of Rhodobryum ontariense. Cryptogamie Bryologie, 33: 191196.

Pejin, B., Vujisic, Lj., Sabovljevic, M., Tesevic, V. & Vajs.,V. (2011). Preliminary data on

essential oil composition of the moss Rhodobryum ontariense (Kindb.) Kindb. Cryptogamie

Bryologie, 32: 113117.

Petrovi, O., Kneevi, P. & Simeunovi, J. (2007). Mikrobiologija (skripta za studente

biologije). Prirodno-matematiki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Petrovi, S.D., Mijin, D.. & Stojanovi, N.D. (2005). Hemija prirodnih organskih jedinjenja.

Tehnoloko-metalurki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Rajab, M.S., Cantrell, C.L., Franzblau, S.G. & Fischer, N.H. (1998). Antimycobacterial

activity of (E)-phytol and derivatives: a preliminary structure-activity study. Planta Medica,

64: 24.


45

Radovi, I. & Petrov, B. (2003). Raznovrsnost ivota. Struktura i funkcija. Bioloki fakultet,

Univerzitet u Beogradu.

Santos, C.C.M.P., Salvadori, M.S., Mota, V.M, Costa, L.M., de Almeida, A.A.C., de Oliviera,

G.A.L., ... & de Almeida, R.N. (2013). Antinociceptive and antioxidant activities of phytol in

antibakterijska aktivnost avarola avarona i fitola sekundarnih metabolita prirodnog porekla

Documents