anÁlisis quÍmico de antocianinas en frutos ... - … · 3.3 efecto del ph y tiempo de...
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
ANLISIS QUMICO DE ANTOCIANINAS EN FRUTOS SILVESTRES
COLOMBIANOS
LILIANA ANDREA SANTACRUZ CIFUENTES
Cdigo 197518
Tesis de Maestra en Ciencias Qumica
Directora:
Prof. Dra. Coralia Osorio Roa
Bogot D.C., Mayo 20 de 2011
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LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS cido 2,2-azino-bis-(3-etilenbenzotiazolina-6-cido sulfnico)
APCI Ionizacin qumica a presin atmosfrica
CC Cromatografa en columna
CCC Cromatografa en contra corriente
CCD Cromatografa en capa delgada
CP Cromatografa en papel
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
EM Espectro de masas
EPR Resonancia electrnica paramagntica
ESI Ionizacin Electrospray
HPLC Cromatografa lquida de alta eficiencia
HPLC-DAD Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a un detector de
arreglo de diodos
HPLC-EM Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a espectrometra de
masas
RMN Resonancia magntica nuclear
TOF Tiempo de vuelo
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CONTENIDO
Pgina
RESUMEN
INTRODUCCIN
1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA 6
1.1 DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS 6
1.2 ANTOCIANINAS 9
1.2.1 Generalidades. 9
1.2.2 Biosntesis de las antocianinas. 11
1.2.3 Antocianinas en frutas. 16
1.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas. 19
1.2.6 Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis. 21
1.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS) 23
1.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MEDIANTE EL USO
DE ESPECTROFOTOMETRA UV-Vis 30
1.4 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR RESONANCIA
ELECTRNICA PARAMAGNTICA (EPR) 35
1.5 APLICACIN DE COLORIMETRA TRIESTMULO EN LOS EXTRACTOS DE
ANTOCIANINAS 36
2 METODOLOGA 41
2.1 MATERIAL VEGETAL 41
2.2 OBTENCIN DEL EXTRACTO ENRIQUECIDO EN ANTOCIANINAS (ERA) 41
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2.3 ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA (HPLC-DAD) 42
2.4 ANLISIS POR HPLC- MS-IT-TOF 43
2.5 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 44
2.5.1 Obtencin de los extractos para actividad antioxidante. 44
2.5.2 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo 45
TEAC-espectroscopa UV-Vis.
2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical 45
DPPH por espectroscopa UV-Vis.
2.6 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR
ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA PARAMAGNTICA (EPR). 46
2.7 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DEL COLOR DE LOS ERA 47
2.8 ANLISIS ESTADSTICO 48
3 RESULTADOS Y DISCUSIN 49
3.1 DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN ANTOCINICA DE LOS ERA 49
3.2 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ERA 59
3.2.1 Espectroscopia UV-Vis. 59
3.2.2 Espectroscopia EPR. 61
3.3 EFECTO DEL PH Y TIEMPO DE ALMACENAMIENTO SOBRE EL
COLOR DE LOS ERAS 65
4 CONCLUSIONES 78
BIBLIOGRAFIA 84
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LISTA DE TABLAS
Pagina
Tabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicales 14
Tabla 2. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas 15
Tabla 3. Identificacin y cuantificacin de las antocianinas presentes 51
Tabla 4. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Mora (Rubus megalococcus
Focke) 55
Tabla 5. Identificacin y cuantificacin de antocianinas en Uva de rbol (Myrciaria aff
cauliflora (Mart.)) 57
Tabla 6. Actividad antioxidante de los ERAS de las cuatro frutas frente a los radicales ABTS
y DPPH 60
Tabla 7. Constantes (K) de velocidad de atrapamiento de los radicales libres de los ARE de
las cuatro frutas (expresadas en unidades arbitrarias (a.u)) por los mtodos ABTS y
DPPH 65
Tabla 8. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de motiln 69
Tabla 9. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de Coral 70
Tabla 10. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de mora 71
Tabla 11. Variacin de los parmetros del color con respecto al pH y al tiempo de
almacenamiento de los extractos crudos aislados del fruto de uva de rbol 72
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LISTA DE FIGURAS
Pagina
Figura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke) 7
Figura 2. La Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) 8
Figura 3. Motiln y Coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg) 9
Figura 4. (a). Estructura bsica de las antocianidinas (b). Estructura de los monosacridos
ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas 10
Figura 5. Cambios en la estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH21 11
Figura 6. Ruta general de la biosntesis de antocianinas. 12
Figura 7. Interacciones de coopigmentacin de las antocianinas49 17
Figura 8. Espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido a distintos valores de pH 18
Figura 9. Estructuras de las resinas de (a) Toyopearl (b) Sephadex LH-2061 21
Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea continua);
no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua) 22
Figura 11. Interfase Electrospray (ESI) 24
Figura 12. Esquema de los modos de adquisicin permitidos en un instrumento QqQ 27
Figura 13. Esquema del equipo LC-MS-IT-TOF 28
Figura 14. (a) Reaccin del DPPH con el mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (b)
Esquema de reaccin entre 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y Trolox. 33
Figura 15. (a) Formacin del radical ABTS (b) reaccin del catin radical ABTS+ con
compuestos fenlicos. 34
Figura 16. Modelo de color CIELAB 38
Figura 17. Anlisis por HPLC de los ERA de a) Coral, b) Motiln. La identificacin de cada
pico corresponde con la tabla 50
Figura 18. Espectro de ESIMS (compuesto 2) de delfinidina-3-rutinsido presente en el
extracto ARE de las frutas coral y motiln 53
Figura 19. Espectro de masas del flavonol presente en la fruta motiln ( tR 23min) 53
Figura 20. Anlisis por HPLC del ERA de mora pequea. La identificacin de cada pico
corresponde con la tabla 4. 55
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Figura 21.Anlisis por HPLC del ERA de Uva de rbol. La identificacin de cada pico
corresponde con la tabla 5 57
Figura 22. Estructuras qumicas de los compuestos encontrados en las cuatro frutas. (1)
Delfinidina-3-O-glucopiranosa. (2) Delfinidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--
glucopiransido). (3) Cianidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido.
(4) Petunidina-3-O-(6-O--ramnopiranosil--glucopiransido(5) Cianidina 3-O-
-glucopiranosido 59
Figura 23. Set de espectros EPR individuales del ARE de Motiln registrados a diferentes
tiempos de reaccin en presencia de los radicales libres (a) ABTS y (b) DPPH. 62
Figura 24. Concentracin relativa de a) ABTS y b) DPPH en presencia de los extractos de las
cuatro frutas. Referencia * = solucin de radical libre sin antioxidante 64
Figura 25. Espectros UV-Vis de los ERA (1mg/10mL) de las cuatro frutas estudiadas
a pH 1.5 66
Figura 26. (a)Variacin del color en los ERAS de las frutas a diferentes valores de pH en
tiempo=0. (a) Motiln (b) Coral. (c). Uva. (d). Mora 67
Figura 27. Evaluacin del color durante el almacenamiento de los extractos ARE a pH 1.5.
(a).Motiln, (b). Coral, (c), Uva (d) Mora 73
Figura 28. Cambios en a: claridad (L*); b: el croma (C*ab) y c: el tono (hab) de los extractos
crudos con respecto al pH. 76
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A Dios por estar siempre presente en mi vida
A mi esposo por su inmenso apoyo
A mi hijo por su paciencia
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AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional de Colombia y al Posgrado en Qumica por permitirme
alcanzar este importante logro en mi carrera profesional.
A la profesora Dra. Coralia Osorio Roa por su apoyo, comprensin y orientacin,
durante la realizacin del presente trabajo.
A la profesora Alicia Lucia Morales por la colaboracin en el suministro de la fruta
mora pequea.
Al IFS (International Fundation of Science (Proyecto E/4826-1)) por la financiacin
de este trabajo.
Al Profesor Dr. Francisco Heredia y a la Profesora Dra. Lourdes Gonzlez Miret del
grupo Color y Calidad de Alimentos, del Departamento de Farmacia de la
Universidad de Sevilla (Espaa) por la valiosa colaboracin y asesora en las medidas
objetivas de color.
Al profesor Dr. Jos Gregorio Carriazo del departamento de qumica y al profesor
Dr. Ovidio Almanza del departamento de fsica, por la colaboracin en las medidas
de actividad antioxidante por EPR.
A mis compaeros del grupo de investigacin Grupo de Aditivos Naturales de Aroma
y Color (GANAC) por su apoyo, colaboracin y amistad.
A mi familia por su apoyo incondicional, y por acompaarme en esta etapa de mi
vida.
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1
RESUMEN
Colombia produce una amplia gama de frutas tropicales, de las cuales existen muy
pocos estudios qumicos. La investigacin en el campo de los pigmentos naturales
provenientes de frutas, permite establecer el potencial de ellas como alimento con
propiedades biofuncionales y el desarrollo de productos con valor agregado que
puedan ser usados como colorantes naturales. En este trabajo se realiz el anlisis
cualitativo y cuantitativo de los pigmentos antocianicos en cuatro frutas tropicales
colombianas: uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral
(Hyeronima macrocarpa Mull. Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y
motiln (Hyeronima macrocarpa Mull. Arg). Se obtuvieron los extractos
enriquecidos en antocianinas (AREs) por adsorcin selectiva sobre Amberlita XAD-7
del extracto metanlico de las frutas. Estos extractos se analizaron por cromatografa
lquida acoplada a un detector de arreglo de diodos (LC-DAD) y cromatografa
lquida acoplada a espectrometra de masas con interfase electrospray (LC/MS-ESI).
Estos anlisis junto con la coinyeccin con patrones permitieron elucidar la estructura
de la mayora de los compuestos. La cuantificacin se realiz mediante el mtodo de
estndar externo.
Los anlisis realizados en el coral y el motiln, confirmaron la presencia de la
antocianina delfinidina-3-rutinsido como compuesto mayoritario, seguido por
delfinidina-3-glucsido, cianidina-3-rutinsido y petunidina-3-rutinsido. En estas
dos frutas se identificaron las mismas antocianinas, siendo mucho mayor la
concentracin en el motiln que en el coral. En la mora pequea se confirm la
presencia de cianidina-3-glucsido como compuesto mayoritario junto con cianidina-
3-rutinsido; y en la uva de rbol se identific la antocianina cianidina-3-glucsido
como compuesto mayoritario junto con la antocianina delfinidina-3-glucsido.
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2
Posteriormente se evalu la actividad antioxidante de los extractos de las cuatro frutas
frente a los radicales libres ABTS y DPPH mediante espectroscopa UV-Vis y EPR
(Resonancia electrnica paramagntica). Con los resultados de espectroscopa UV-
Vis se determin que el extracto ms activo fue el de motiln, seguido por el de uva,
coral y mora. El uso de la tcnica de EPR permiti seguir el curso de la reaccin de
atrapamiento de los dos radicales libres por las sustancias antioxidantes presentes en
los AREs, observando una disminucin en la concentracin de radicales libres con el
tiempo y una cintica de segundo orden. Al aplicar dicho modelo cintico, se
confirm que el extracto ms activo frente a los dos radicales libres era el de motiln,
y que frente al ABTS se encontraban diferencias de actividad ms significativas que
con el DPPH. La tcnica de EPR es ms exacta porque permite la evaluacin directa
de la cantidad de radicales libres en solucin.
Finalmente, se evalu la estabilidad de los diferentes extractos frente a variaciones de
pH y durante un periodo de almacenamiento de un mes. Se confirm que el pH es un
factor que afecta significativamente el color de los AREs y con base en las medidas
de colorimetra triestimulo a diferentes pHs (1.5, 3.5, 5.5 y 7.5) se concluy que el
extracto ms estable era el de uva de rbol porque se encontraron menores
variaciones en el croma con respecto a las otras frutas.
Con estos resultados se comprob que las frutas estudiadas son una fuente
promisoria de pigmentos naturales, siendo ms interesantes el motiln y la uva de
rbol debido a su contenido de antocianinas, actividad antioxidante y estabilidad del
color de los extractos.
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3
INTRODUCCION
El consumo de frutas y verduras ha demostrado su efectividad en la prevencin de
algunas enfermedades en los seres humanos y en los animales. Las hortalizas, frutas y
sus semillas son ricas en vitaminas como C y E, -caroteno y polifenoles como
proantocianidinas y antocianinas. Estos compuestos podran proteger a los
organismos contra lesiones causadas por radicales libres1.
Entre estos compuestos, las antocianinas son pigmentos naturales que se clasifican
dentro del grupo de los flavonoides. Se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza y son responsables de los colores rojo, violeta y azul de frutas, bayas y
flores. En las plantas la principal funcin que cumplen es la de atraer seres vivos
(principalmente insectos y pjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin de
semillas2. Estos compuestos polifenlicos son solubles en agua, lo cual facilita su
incorporacin en una gran variedad de sistemas alimenticios acuosos.
Recientemente su estudio ha tomado importancia no solo debido a su actividad
antioxidante sino tambin a sus posibles beneficios para la salud humana ya que se ha
relacionado su consumo con la reduccin de la incidencia de enfermedades como el
cncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologas3. Por ejemplo algunos
artculos sugieren que las estructuras qumicas de las antocianinas tienen un impacto
significativo en su actividad biolgica, y los datos sugieren que las antocianinas
monoglicosiladas y no aciladas son los ms potentes inhibidores de la proliferacin y
crecimiento de las clulas de cncer de colon4. Estudios actuales sobre la actividad
biolgica de las antocianinas muestran que estas podran sustituir algunos frmacos
usados en el tratamiento de diferentes enfermedades. Es as como el extracto crudo de
antocianinas de Vaccinium myrtillus fu administrado por va oral e intravenosa para
reducir la fragilidad y la permeabilidad capilar de los vasos sanguneos5. Se ha
demostrado tambin que fracciones de antocianinas provenientes del vino son
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4
efectivas para atrapar especies reactivas del oxgeno (ROS), adems de inhibir la
oxidacin de lipoprotenas y la agregacin de plaquetas.
A pesar de los beneficios antes mencionados, un tema controversial es la
biodisponibilidad de las antocianinas en el ser humano, ya que metablicamente las
antocianinas parecen ser muy diferentes de otros flavonoides con cantidades de
excrecin mucho mayores en la orina en relacin con la cantidad consumida6.
Mientras que la ciencia est empezando a sealar el gran potencial y los beneficios de
los polifenoles, investigadores de la Universidad de Houston encabezados por el Dr.
Ming Hu, han expresado que se deben realizar investigaciones sobre la
biodisponibilidad y utilizacin de los antioxidantes, especialmente polifenoles, con
el fin de ayudar al xito en la implementacin de los mismos como agentes quimio-
protectores en el futuro7.
De acuerdo con los datos presentados por la OMS/FAO en el informe sobre la salud
en el mundo del 2003, la ingesta insuficiente de frutas y verduras es uno de los 10
factores de riesgo principales que contribuyen a la mortalidad atribuible.
Adicionalmente el informe plantea que la integracin de las frutas y verduras en la
dieta diaria podra ayudar a prevenir importantes enfermedades no transmisibles,
como las enfermedades cardiovasculares y algunos cnceres. El consumo de frutas y
verduras variadas es beneficioso porque garantiza un consumo suficiente de la
mayora de los micronutrientes, de fibra dietaria y de una serie de sustancias no
nutrientes esenciales; adems, el aumento del consumo de frutas y verduras puede
ayudar a desplazar los alimentos ricos en grasas saturadas, azcares o sal.
Actualmente el consumo estimado de frutas y verduras es muy variable en todo el
mundo, oscilando entre 100 g/da en los pases menos desarrollados y
aproximadamente 450 g/da en Europa Occidental8.
-
5
En Colombia la gran biodiversidad de bayas, frutos, flores y plantas est determinada
por la gran variedad de los pisos trmicos que ofrece la geografa Colombiana. Esta
ventaja competitiva que nos ofrece nuestra riqueza natural nos permite plantear el
presente trabajo con el objeto de evaluar y cuantificar la composicin antocinica de
especies silvestres colombianas promisorias para el desarrollo de productos benficos
para la salud humana como los colorantes naturales . Los frutos seleccionados fueron:
La uva de rbol (Myrciaria cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa
Mll.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln (Hyeronima
macrocarpa Mll.Arg). Adicionalmente se evalu la actividad antioxidante in vitro
de los extractos de estas frutas mediante espectroscopa UV-Vis y EPR.
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6
1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA
1.1 DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS
La fruta Mora pequea (Rubus megalococcus Focke) (Rosaceae) (Figura 1) es una
planta de vegetacin perenne, de porte arbustivo semierecto, conformada por varios
tallos espinosos que pueden crecer hasta tres metros. Las hojas tienen tres foliolos,
ovoides de 4 a 5 centmetros de largo con espinas ganchudas, las inflorescencias se
presentan en racimos terminales aunque en ocasiones se ubican en las axilas de las
hojas. La fruta es esfrica o elipsoidal de tamao variable, 1.5 a 2.5 cm, en su
dimetro ms ancho, de color verde cuando se estn formando, pasando por un color
rojo hasta morado oscuro cuando se maduran. Es originaria de las zonas altas
tropicales de Amrica principalmente en Colombia, Ecuador, Panam, Guatemala,
Honduras, Mxico y Salvador9. Hasta el momento no existen estudios qumicos de
esta especie.
Esta especie pertenece al gnero Rubus, el cual comprende unas 250 especies que se
distribuyen en todo el mundo. Las frutas de esta especie son conocidas por ser ricas
en vitaminas A, B y C, y se afirma que las races y las hojas tienen propiedades
medicinales10
. Recientes investigaciones han reportado la presencia de antocianinas
en la fresa y en la mora en proporciones de 6 mg/kg y 508 mg/kg de cianidina-3-
glucsido, respectivamente11 ,
12
y de acuerdo a las investigaciones dichas
antocianinas son responsables del color rojo de dichas frutas en un espectro visible
max=506 nm,
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7
Figura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke)
La uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora. (Mart.)D.Bery) (Myrtaceae) (Figura 2),
tambin conocida como guapur o jaboticaba, pertenece a la familia Myrtaceae al
igual que otras ms conocidas como la guayaba, la feijoa y el camu-camu. Es un
pequeo rbol de aproximadamente 2 metros de alto, ramificado, de corteza lisa que
se desprende fcilmente y que crece generalmente bajo la sombra de rboles ms
grandes. Sus frutos producen la impresin de estar pegados al tallo de 3-4 cm de
dimetro, se concentran en el tronco principal y las ramas gruesas. Son morados al
principio y negros al madurar. Se consume directamente como fruta fresca, pero
tambin se usa para preparar refrescos, mermeladas, licores y vinagres caseros, entre
otros productos. Adems, la cscara del tallo y del fruto es una eficaz medicina para
la diarrea.13
En esta especie se ha encontrado la presencia de taninos y de las
antocianinas, cianidina-3-glucsido y delfinidina-3-glucsido.14,15
Esta fruta tambin
ha mostrado actividad antioxidante ( IC50 = 35 g/mL de extracto) 16,17
En Colombia la industria de los colorantes naturales representa una oportunidad para
el mercado, dada las actuales tendencias de usar compontes naturales para el consumo
humano enmarcado en el importante papel que estos juegan en la salud humana.
http://es.wikipedia.org/wiki/Mirt%C3%A1ceahttp://es.wikipedia.org/wiki/Corteza_(%C3%A1rbol)http://es.wikipedia.org/wiki/Tallohttp://es.wikipedia.org/wiki/Moradohttp://es.wikipedia.org/wiki/Negrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Refrescohttp://es.wikipedia.org/wiki/Mermeladahttp://es.wikipedia.org/wiki/Licorhttp://es.wikipedia.org/wiki/Vinagrehttp://es.wikipedia.org/wiki/Diarrea
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8
Figura 2. La Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) 18
Las frutas coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) y motiln
(Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) (Figura 3) pertenecen al mismo
gnero Hyeronima el cual consta de 15 especies distribuidas en Amrica tropical.
Hyeronima macrocarpa es un rbol de corteza agrietada y griscea, de hojas elpticas,
densamente lepidotadas de 4-9 cm de longitud y 2.5 4 cm de ancho, pecolos entre
2-2.5 cm de longitud, inflorescencias axilares y subterminales, flores verde
amarillentas, fruto elipsoide casi esfrico, rojo a morado al madurar, de hasta 1 cm de
longitud en el coral y 2 cm en el motiln. Estas especies son promisorias para uso
alimenticio y como fuente de pigmentos y hasta el momento no hay estudios
qumicos publicados a excepcin de un trabajo realizado en motiln de Nario donde
se evalu la actividad antioxidante y la eficiencia antiradical de extracto de la pulpa
de esta fruta.19
A pesar de haber sido identificadas como pertenecientes a la misma
especie, estas frutas presentan caractersticas diferentes que ameritan un estudio
botnico profundo para definir su variedad.
-
9
Figura 3. Motiln y Coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg)
1.2 ANTOCIANINAS
1.2.1 Generalidades. Las antocianidinas (agliconas) son la estructura bsica de las
antocianinas (Figura 4a). Constan de un anillo aromtico (A) unido a un anillo
heterocclico (C) que contiene oxgeno, el cual est unido por un enlace carbono-
carbono a un tercer anillo aromtico (B). El esqueleto bsico de las antocianinas es el
2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio con diferentes sustituciones20
. Cuando las
antocianidinas estn en su forma glicosidada se conocen como antocianinas. Los
monosacridos comnmente encontrados son D-glucosa, L-ramnosa, D-arabinosa y
D-xilosa (Figura 4b) aunque tambin pueden contener oligosacridos como
gentobiosa, rutinosa y soforosa. Normalmente los monosacridos se unen con los
grupos hidroxilo de la posicin 3 de la antocianidina, mientras que los disacridos
sustituyen los hidroxilos 3 y 5 o los de la posicin 3 y 721
.
-
10
Figura 4 (a). Estructura bsica de las antocianidinas
22(b). Estructura de los
monosacridos ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas23
Se ha demostrado que las antocianinas relativamente simples son ms estables en un
medio cido que en un medio neutro o alcalino. En medio cido la forma
predominante es la del in flavilio, el cual da el color rojo; a medida que el pH se
eleva, las antocianinas se transforman en una base quinnica de color azulado (Figura
5). El color de estas molculas fue explicado por primera vez en 1939 por Pauling,
quien propuso que la estructura resonante del in flavilium era el responsable de la
intensidad de su color.
-
11
Figura 5. Cambios en la estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH21
1.2.2 Biosntesis de las antocianinas. Los compuestos fenlicos son biosintetizados
por varias rutas, entre las cuales sobresalen la del cido shikmico y la del cido
malnico. En la ruta del cido shikmico, los carbohidratos simples derivados de la
gliclisis, de la ruta de las pentosas fosfato y del ciclo de Calvin se convierten en
diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-coumrico, cafeico, ferlico,
clorognico y fenilalanina. En el paso principal de la biosntesis de flavonoides,
ordinariamente el p-coumaril-CoA, derivado de la L-fenilalanina en el metabolismo
general del fenilpropanoide entra en una reaccin de condensacin con tres
molculas de malonil-CoA para formar un intermediario chalcona (C15
). El C15
es
formado para dar el precursor de la antocianina, por ej. El flavan-3,4-diol, que es
transformado al catin flavilio antocianidina por una hidroxilacin en el C-2 seguida
por dos deshidrataciones24
(Figura 6). Finalmente, la molcula se estabiliza por
glicosilacin del O-heterociclo, luego suceden las posteriores modificaciones de la
-
12
antocianina que incluyen una hidroxilacin adicional, metilacin de los grupos
hidroxilos, posterior acilacin y glicosilacin25
.
Figura 6. Ruta general de la biosntesis de antocianinas.26
La fenilalanina amonio liasa (PAL), primera enzima en la ruta, juega un papel central
en dirigir la sntesis hacia metabolitos secundarios y por ello ha sido extensamente
estudiada. Un estudio realizado por Aoki et al27
., Demostr que la actividad PAL en
frutos de fresa maduros es mucho mayor que en frutos verdes. As, se encontr una
correlacin muy estrecha entre la actividad de PAL y la concentracin de
antocianinas, que se incrementa durante la maduracin28
.
-
13
1.2.3 Antocianinas en frutas. El estudio de las antocianinas en frutas tropicales, ha
tomado fuerza la ltima dcada no solo por la capacidad colorante29
, sino tambin por
su capacidad antioxidante30
. Es as como los extractos de distintas frutas como mora,
frambuesa y diferentes cultivos de grosella han demostrado actuar de manera eficaz
como inhibidores de radicales libres31
.
Muchas frutas son ricas en antocianinas y en la mayora de los estudios publicados se
ha realizado la identificacin y cuantificacin de estos pigmentos por HPLC-EM y
HPLC-DAD. Mazza y Miniati han publicado una extensa revisin sobre antocianinas
en frutas tropicales hasta el ao 1987 encontrando cerca de 20 compuestos
responsables del color rojo en frutas32
. Durante los ltimos aos se ha publicado la
composicin de los pigmentos de una gran variedad de plantas de diferente origen
geogrfico, de diferentes familias y con diferentes mtodos de extraccin.33,34
En un
estudio realizado por De Brito et al 35
, se realiz la identificacin y cuantificacin de
antocianinas en algunas frutas tropicales: acerola (Malphigia emarginata), jussara
(Euterpe edulis), jambolo (Cumini syzygium) y Guajiru (Chrysobalanus icaco), por
cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas, con el fin de demostrar la
presencia de antocianinas en frutas tropicales. Se encontraron las antocianinas:
cianidina, delfinidina, pelargonidina, petunidina y malvidina en cantidades
apreciables (75mg/100g y 275mg/100g peso seco). Vasco et al.Error! Bookmark
not defined., Realizaron una investigacin en algunos frutos ecuatorianos para
identificar y cuantificar los compuestos fenlicos responsables de la actividad
antioxidante en estos frutos, se estudiaron tres pertenecientes a la familia de las
Rosaceas (mora andina, fresa y ciruela capuli), otra especie de la familia Ericaceae
(mortio) y tres frutas de la familia Passifloraceae. Entre los compuestos fenlicos
encontrados, la antocianina cianidina estuvo presente en todos los frutos, la
delfinidina solo se encontr en el mortio y la pelargonidina en la fresa.
-
14
Recientemente se han publicado varios estudios dedicados a la bsqueda de nuevas
fuentes vegetales ricas en antocianinas (Tabla 1), entre las cuales se encuentran uvas,
repollo morado, aceitunas, grosellas, manzanas, fresas, ciruelas y cerezas, entre otras.
Tabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicales
Nombre
comn
Nombre Cientfico Antocianina
Uva Caimarona
Pourouma cecropiifolia
Dp-3-O--glucopiransido
Cy-3-O--glucopiransido
Cy3-O--(malonil) glucopiransido36
Acerola
Jambolao
Jussara
Guajiru
Malphigia emarginata Cy-3-ramnsido, Pn-3-ramnsido
Syzygium cumini
Dp-3-galactpiranosido,Pt-3-galactopiransido
Dp-3-(6-acetil) galactopiransido.
Euterpe edulis
Pt-3-(6-acetil) galactopiransido, Dp-3-(6-
acetil) glucsido, Pt-3-(6 succinil) ramnsido,
Pn-3-(6succinil) ramnsido
Chrysobalanus icaco
Dp-3-5, diglucsido, Cy-diglucsido, Pt-
diglucsido, Pn-diglucsido, Mv-diglucsido-3-
sambubisido, Cy-3-glucsido, Cy-3-rutinsido,
Pg-3-glucsido, Pg-3-rutinsido, Cy 3-
ramnsido.
Bacuau
Eugenia umbelliflora
Dp-3-O--glucopiransido, Cy-3-O--
glucopiransido, Pt-3-O--glucopiransido
Pg-3-O--glucopiransido, Pn-3-O--
glucopiransido, Mv-3-O--glucopiransido37
Manzana
estrella
Surinam cherry
Jaboticaba
Chrysophyllum
Cainito
Cy-3-O--glucopiransido
Cy-O--glucopiransido
Eugenia uniflora Cy-3-O--glucopiransido
Myrciaria Cauliflora
Dp-3-O--glucopiransido38
Mango
Chirimoya
zapote
Mangifera indica Cy-diglucsido, Pt.diglucsido, Pn-diglucsido
Annona cherimolia
Mill.
Cy-3-O--glucopiransido
Calocarpum zapota Pg-3-glucsido, Pg-3-rutinsido, Cy-3-
ramnsido.Error! Bookmark not
defined. corozo Bactris guineensis Cy-3-sambubisido, cy-3-glucsido, cy-3-
rutinsido, Pn-3-glucsido, Pn-3-rutinsido, Cy-
3-(6-O-malonil) glucsido.39
Mv: Malvidina, Pn: Peonidina, Cy: cianidina, Pg: pelargonidina, Dp:delfinidina
-
15
En general el contenido total de antocianinas en frutas puede estar entre 20 y 1000 mg
/100g de fruta fresca (Tabla 2). En algunos estudios la cuantificacin se realiz por
HPLC usando el mtodo de estndar externo con base en la respuesta de compuestos
patrn; pero tambin se ha utilizado el mtodo de pH diferencial,40
para la obtencin
de la concentracin de las antocianinas. Este mtodo se basa en las transformaciones
reversibles que sufren las antocianinas con los cambios de pH, manifestado por un
cambio en la absorbancia. La forma oxonium predomina a pH 1 y el hemiacetal a pH
4.5 (Figura 5). El pH diferencial es un mtodo basado en esta reaccin, y permite una
rpida y exacta medida de las antocianinas totales, incluso en la presencia de
pigmentos degradados polimerizados y de otros compuestos interferentes. Este
mtodo fue utilizado primero por Fuleki y Francis (1968),41
para medir el contenido
de antocianina en arndano.
Tabla 2. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas
Taxonomia Nombre comn Concentracin
(mg/ 100g fruta )
Estndar Referencia
Vaccinium
uliginosum L.
Arndano alpino 256 Mv-3-glu Andersen (1987)42
Rubus occidental L.
V. parvifolium
R. nigrum cv
Frambuesa negra 627 Cy-3-glu Moyer et al. (2002)43
Arandano rojo 34 Cy-3-gl
Grosella negra 411 Cy-3-glu "
Sambucus nigra
V. vinifera
Citrus sinensis
Cauco negro 200-1000 Cy-3-glu Bridle et al.(1997)44
Uva de vid 30-750 Cy-3-glu "
Naranjo dulce 200 Cy-3-glu "
Mv: malvidina, Cy: Cianidina, glu: Glucosa
La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol (),
coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke)
y motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), fue
Para la obtencin de la concentracin de antocianinas (Tabla 2), se utiliza la frmula
de pH diferencial:
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16
A= (A vis-max
A 700
)pH1
(A vis-max
A 700
)pH 4.5
En donde A vis-max
es la lectura del pico ms alto a pH 1 y pH 4.5, y A 700
, es la
lectura a 700 nm, tanto para pH 1 como pH 4.5.
As por ejemplo, Khknen et al
45., determinaron cuantitativamente los compuestos
fenlicos por HPLC, presentes en algunas especies de arndano (Vaccinium
myrtillus), arndano rojo (Vaccinium vitis-idaea) y grosellero negro (Ribes nigrum),
encontrando que el mayor contenido de antocianinas de las bayas que se consumen en
Finlandia se encuentra en los arndanos (300-600 mg/100g de peso fresco) y en el
grosellero negro (80 a 810 mg/100 g). Otras bayas oscuras, tales como crowberries
(Empetrum nigrum L.) tienen un contenido de antocianinas en el rango de 300-560
mg/100g.46
1.2.4 Antocianinas como colorantes alimenticios. Las antocianinas se han
convertido en una opcin interesante para la industria alimenticia como posibles
sustitutos de los colorantes sintticos. Adicionalmente estas sustancias poseen un
valor agregado por su capacidad antioxidante y citotxica47
.
De acuerdo con su estructura, el color de las antocianinas vara segn los grupos que
se encuentren unidos a ella como hidroxilo, metoxilo, azcares azucares acilados.
As por ejemplo el aumento nmero de hidroxilos en el anillo B de la antocianidina
causa un desplazamiento batocrmico en la longitud de onda de mxima absorcin de
las antocianinas, en el caso de la pelargonidina se observa un cambio de color desde
el naranja ( mx. 520 nm) hasta la delfinidina azul-violeta ( mx. 545 nm).48
Por
otro lado, la glicosilacin y la acilacin de los azcares tambin aumentan la
estabilidad.49
-
17
Otros factores como la concentracin, el pH, la temperatura, el oxgeno, las enzimas,
la existencia de reacciones de condensacin, la formacin de complejos con metales o
interaccin con otros componentes de los alimentos tambin afectan la estabilidad del
color.32
La copigmentacin es un fenmeno que se da por la interaccin hidrfoba
entre los ncleos aromticos de las antocianinas agrupadas (Figura 7), en donde una
de las consecuencias de este estado es la intensificacin del color, lo que mejora las
perspectivas de la utilizacin de antocianinas como colorantes naturales en
alimentos.50
Figura 7. Interacciones de coopigmentacin de las antocianinas49
Como se mencion anteriormente las antocianinas son sensibles a los cambios de pH,
el cual tiene un efecto en la estructura y la estabilidad de estas. En soluciones acuosas
a valores de pH inferiores a 2, bsicamente 100% del pigmento se encuentra en su
forma ms estable o de in oxonio o catin flavilio de color rojo intenso, a valores de
pH ms altos ocurre una prdida el protn y adicin de agua en la posicin 2, dando
lugar a un equilibrio entre la pseudobase carbinol o hemicetal y la forma chalcona, o
de cadena abierta. Tanto el hemicetal como la chalcona, son formas incoloras y
bastante inestables. A valores de pH superiores a siete se presentan las formas
quinoidales, de color prpura que se degradan rpidamente por oxidacin con el aire
(Figura 5), por lo cual, el uso prctico de estos pigmentos como colorantes naturales
-
18
se limita a alimentos cidos con pH inferior a 3.5 51, 52
. La prdida de color a medida
que el pH aumenta, puede ser evaluada registrando el espectro de absorcin del
pigmento con un espectrofotmetro. En la figura 8, en el espectro de absorcin de
cianidina-3-ramnoglucsido se observa una disminucin en el espectro a 510 nm a
medida que el pH aumenta, lo que indica que hay una prdida del color rojo,
existiendo un equilibrio entre las dos formas de la antocianina (catin flavilio y base
carbinol)53
.
Figura 8. Espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido a distintos valores
de pH54
En relacin a la extraccin de estos pigmentos, Rodrguez y Wolstrad40
, sealan que
el carcter polar de la molcula de antocianina permite su solubilidad en variados
solventes, tales como alcoholes, acetona y agua. La eleccin del mtodo de extraccin
debe maximizar la recuperacin de pigmentos con una mnima cantidad de solventes
y una degradacin o alteracin mnima del estado natural. Dentro de los mtodos ms
utilizados estn la extraccin con metanol y la extraccin con acetona y cloroformo.
Entre las posibles fuentes de antocianinas para su utilizacin como colorantes, se
encuentran las uvas, los arndanos, el repollo morado y la zanahoria negra. Las
-
19
principales antocianinas presentes en los arndanos son los glucsidos de cianidina y
peonidina51
. Algunos investigadores han estudiado la toxicidad de las antocianinas y
compuestos relacionados concluyendo que estos compuestos son inocuos para la
salud.55
Estos compuestos, se encuentran dentro de la clasificacin de colorantes
naturales aceptados sin restricciones sanitarias para su uso en la industria
alimenticia.56
1.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas. La extraccin de pigmentos
naturales, debe llevarse a cabo teniendo en cuenta los factores que pueden afectar la
integridad de los mismos; por lo cual este es un paso muy importante debido a que los
resultados obtenidos dependen en gran parte del proceso de extraccin realizado.
Las antocianinas son compuestos solubles en solventes polares y comnmente se
extraen de sus fuentes naturales usando metanol o etanol con pocas cantidades de
algunos cidos como cido clorhdrico, actico y frmico, ya que el cido mantiene el
pH cido lo que previene el desplazamiento de los equilibrios qumicos de
hidratacin y formacin de chalconas. Adicionalmente el uso de cidos dbiles
previene la degradacin de las antocianinas no aciladas las cuales presentan mayor
labilidad. Sin embargo, durante el proceso de evaporacin del solvente acidificado
puede ocurrir degradacin de las antocianinas aciladas, por la hidrlisis parcial o
total de los cidos enlazados a los azcares, especialmente en antocianinas aciladas
con cidos dicarboxilicos como el cido malnico. Por lo anterior se recomienda para
la extraccin de estos pigmentos el uso de cidos dbiles como el trifluoroactico,
tartrico o ctrico.57
Degenhardt et al58
., encontraron que la mezcla bifsica terbutil-metil-ter/n-
butanol/acetonitrilo/agua (acidificada al 1% con cido trifluoroactico) (2:2:1:5) es un
buen sistema de solventes en el proceso de extraccin de antocianinas de repollo rojo
(B. Oleracea L) y grosella negra (Ribes nigrum L).
-
20
Woo et al59
., estudiaron la extraccin de antocianinas a partir de los desechos del
proceso de elaboracin de jugo de arndanos, realizando una extraccin con alcohol y
cido, una purificacin parcial por medio de ultrafiltracin, y una concentracin
posterior con aplicacin de smosis inversa, concluyendo que es posible la obtencin
de un colorante a partir de los desechos de la industria de jugos de arndanos.
En la mayora de los casos, para la extraccin de las antocianinas se aprovecha la
afinidad que tiene este tipo de compuestos por materiales adsorbentes como la
Amberlita XAD-7. A diferencia de las resinas XAD-2 y XAD-4 formadas bajo una
matriz de estireno y divinilbenceno con diferente grado de entrecruzamiento, la
Amberlita XAD-7 tiene una estructura tipo acrilato (rea superficial 450 m2/g, radio
de poro 45 , porosidad 1.14 ml/g, tamao de partcula 0.25-0.84 mm, densidad 1.24
g/ml). Este tipo de resina posee el cdigo de regulacin del consejo de Europa, sobre
resinas de intercambio inico y adsorbentes usados en el procesamiento de alimentos,
adoptado por el Comit de Ministros el 30 de septiembre de 1997,
polivinilpirrolidona (PVP), octadecilsilano, Sephadex G-25, Sephadex LH-20,
poliamidas, resinas de intercambio inico, almina cida, entre otras.60
Luego que los
pigmentos son retenidos es necesario eliminar otros componentes que no son de
inters como azcares, cidos orgnicos, protenas y sales.
La complejidad de los extractos naturales enriquecidos en antocianinas hace
necesario realizar su fraccionamiento mediante el uso de tcnicas cromatogrficas
que permitan la obtencin de fracciones ms simples sin degradacin del material.
Para esto se han usado mltiples tcnicas como la cromatografa en papel (CP), la
cromatografa en capa delgada (CCD) en almina, la cromatografa en columna (CC)
y la cromatografa en contracorriente (CCC). El fraccionamiento de este tipo de
compuestos por CC, se puede realizar mediante el uso de resinas de exclusin por
tamao como lo demuestra un estudio realizado por Frytlog et al61
, donde se
compar el uso de las resinas Toyopearl HW-40F con Sephadex LH-20, para el
-
21
anlisis de antocianinas. As, se determin que el fraccionamiento obtenido con la
resina Toyopearl presentaba una mejor resolucin de los picos de algunas
antocianinas presentes en la muestra a evaluar. Las estructuras de las resinas
Toyopearl y Sephadex se muestran en la (Figura 9).
Figura 9. Estructuras de las resinas de (a) Toyopearl (b) Sephadex LH-2061
1.2.6 Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis. Debido a su
estructura, las antocianinas presentan mximos de absorcin tanto en la regin visible
como en la ultravioleta lo que resulta muy importante para la caracterizacin
estructural de dichos compuestos. Sus espectros de absorcin se caracterizan por
tener dos bandas separadas una en la regin visible entre 465 y 550 nm y otra ms
-
22
pequea en el UV alrededor de 275nm62
(Figura 4). Es as como se pueden identificar
las antocianinas por su absorcin en la regin visible.63
.
La glicosidacin conlleva a un desplazamiento hipsocrmico de los mximos de
absorcin en el visible. As por ejemplo, entre (max 520nm) de la pelargonidina y de
la pelargonidina-3-glucsido (505nm) , ocurre un desplazamiento de de 15/nm ;
entre cianidina (max 535nm ) y cianidina-3-glucsido (max 523nm) un de 12/nm,
entre delfinidina (max 544) y delfinidina-3-glucsido (max. 534nm) un de
10/nm62
.
Los derivados acilados no muestran diferencia con respecto a los correspondientes no
acilados en la zona del visible, sin embargo, en la regin del ultravioleta suelen
presentar un mximo adicional en el intervalo de 310-335 nm, correspondiente a la
absorcin del grupo acilo (Figura 10); la esterificacin con cido p-cumrico aumenta
la absorcin en torno a 308-313 nm y con cido cafico en 326-329 nm. Este
hombro no se presenta cuando el cido sustituyente es el cido actico64
.
Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea
continua); no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua) 65
-
23
1.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas
(LC/MS). La cromatografa lquida en fase reversa se basa en el principio de las
interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente
relativamente polar, un compuesto relativamente apolar y una fase estacionaria
apolar. Debido a que las antocianinas son compuestos polares, este tipo de columnas
se usa para el anlisis cualitativo y cuantitativo de mezclas de estos pigmentos63
.
El orden de elucin de las antocianinas en columnas de fase reversa depende del
patrn de hidroxilacin y metoxilacin de la aglicona, del grado de glicosilacin y
acil sustitucin, as como tambin de la composicin de la fase mvil. Usualmente, el
tiempo de retencin de las agliconas se da en el siguiente orden: delfinidina<
cianidina
-
24
Para la ionizacin ESI la muestra en solucin se pasa a travs de un capilar sometido
a un fuerte campo elctrico rodeado por un flujo de nitrgeno. El fuerte voltaje hace
que se formen gotas muy pequeas cargadas (spray), donde el solvente termina de
evaporarse y los compuestos cargados viajan hacia el analizador. En la Figura 11, se
muestra el esquema de una interfase electrospray (ESI)68
.
Figura 11. Interfase Electrospray (ESI) 69
El uso de ESI-MS ha crecido exponencialmente debido a que esta tcnica de
ionizacin suave puede producir iones intactos de especies grandes y complejas en
solucin, incluso de especies trmicamente lbiles, no voltiles, y especies polares.
El nico requisito previo a la ionizacin ESI es que los analitos de inters sean
solubles en algn disolvente pues la ionizacin se realiza en solucin. Para la
confirmacin estructural de los compuestos existe la espectrometra de masas en
tndem (MS/MS) que permite la formacin de fragmentos por colisin inducida
(CID). Este anlisis se puede realizar en cromatgrafos lquidos acoplados a
espectrmetros de masas con triple cuadrupolo (HPLC/QqQ). Para la adquisicin de
los espectros de masas, el primer cuadrupolo acta como filtro de masas que
selecciona el in de inters, el in se fragmenta luego por colisin con un gas inerte
en la celda de colisin y el ultimo cuadrupolo analiza los fragmentos producidos.
-
25
La adquisicin mediante un QqQ ofrece una gran versatilidad dependiendo del modo
en que opera cada uno de los dos cuadrupolos (Q1 y Q2). Cada uno de estos modos
de adquisicin presenta unas caractersticas que lo hacen idneo para un objetivo
concreto.
Los modos de adquisicin que se pueden aplicar son (Figura 12):
Barrido de todos los iones (full scan)
En este modo de adquisicin todas las molculas que se ionizan en la interfase llegan
al detector. En el QqQ, tanto la celda de colisin (q) como el segundo cuadrupolo
(Q2) no actan en el proceso de seleccin, realizndose el barrido de iones con el
primer cuadrupolo (Q1) y obteniendo un espectro de full scan.
Adquisicin de un in seleccionado (Single Ion Monitoring, SIM)
La adquisicin SIM est dirigida a la medida de un solo ion, que es seleccionado en el
primer cuadrupolo, donde la celda de colisin y el segundo cuadrupolo (Q2) no
actan en la medida. Este tipo de adquisicin deriva del uso de Q simple, y su
aplicacin en instrumentos QqQ no suele ser muy frecuente.
Barrido de iones producto (Product Ion Scan)
El barrido de iones producto se lleva a cabo seleccionando en el primer cuadrupolo
(Q1) una m/z concreta denominado in precursor, que se fragmenta con una energa
de colisin adecuada en la celda de colisin; el segundo analizador adquiere en modo
full scan de forma que se obtiene la medida de todos los fragmentos del in precursor.
A estos fragmentos se les denomina iones producto. Este modo de adquisicin es
ideal para la obtencin de la mxima informacin estructural posible del ion
precursor.
Adquisicin de la reaccin seleccionada (Selected Reaction Monitoring,SRM)
-
26
Se selecciona un in en el primer cuadrupolo (Q1) denominado in precursor; el in
precursor se fragmenta en la celda (q) de colisin en presencia de gas inerte aplicando
una energa de colisin optima; uno de los iones fragmento obtenido en q se
selecciona en el segundo cuadrupolo (Q2) etiquetndose como in producto. La
adquisicin en SRM es la ms utilizada en las aplicaciones analticas cuantitativas
mediante QqQ, ya que minimiza al mximo la presencia de otros interferentes y se
presenta como una herramienta de alta sensibilidad y selectividad.
Barrido de iones precursor (Precursor Ion Scan)
En este modo de adquisicin, el primer cuadrupolo (Q1) hace un barrido de todos los
iones que provienen de la interfase en el primer cuadrupolo, fragmentndose en la
celda de colisin a una energa concreta, de todos los fragmentos obtenidos solo se
selecciona uno por el segundo cuadrupolo (Q2). El barrido de iones precursores tiene
sentido en instrumentos de QqQ, debido a que se debe seleccionar un ion fragmento
proveniente de la celda de colisin en el segundo analizador (Q2). La aplicacin a la
que viene asociado este modo de adquisicin es a un grupo de compuestos de la
misma familia o a metabolitos provenientes de un mismo analito, pues el barrido de
iones precursores a un in producto comn esta directamente ligado a una estructura
qumica comn.
Barrido de prdidas neutras (Neutral Loss Scan)
El barrido de prdidas neutras es un modo de adquisicin muy especfico de QqQ
debido a que es necesario que dos analizadores trabajen coordinadamente. El primer
cuadrupolo (Q1) y el segundo cuadrupolo (Q2) realizan un barrido en desfase, fijando
un valor de masa que diferencia los iones barridos en Q1 y los barridos en Q2, una
vez han sido fragmentados en la celda de colisin a una energa concreta. De esta
forma, solo aquellos analitos que presenten la perdida neutra seleccionada sern
detectados. Al igual que en el barrido de iones precursores, este modo de adquisicin
-
27
es idneo para la bsqueda de analitos de la misma familia o de metabolitos que
comparten una estructura qumica comn70
.
Figura 12. Esquema de los modos de adquisicin permitidos en un instrumento
QqQ71
En el caso del acople cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF), el acoplamiento entre los
dos tipos de analizadores permite otras posibilidades diferentes a las del QqQ. Debido
a que en el QTOF siempre se obtiene el espectro de adquisicin total (full
adquisition) de todas las molculas ionizadas en la interfase mediante la medida del
analizador TOF, dependiendo de cmo acten el cuadrupolo (Q) y la celda de
colisin (q) se definirn los modos de adquisicin72
.
Otros instrumentos que tienen los analizadores de tiempo de vuelo acoplado trampa
de iones como MS-IT-TOF permiten obtener fragmentos de hasta MSn. El uso de la
trampa de iones permite que los iones sean atrapados y fragmentados para
posteriormente pasar al de tiempo de vuelo en donde se separan segn su relacin
masa carga en un tiempo determinado dentro del TOF (Figura 13)73
.
-
28
El sistema de lentes utilizados en el LCMS-IT-TOF da lugar a un nuevo mtodo
introduccin de iones denominado introduccin de in comprimido o CII, donde la
combinacin del lente "skimmer" y el lente octopolar convierte el flujo continuo de
iones en impulsos para su introduccin en la trampa (TI). Este mtodo hace que sea
posible controlar la acumulacin de iones antes de que se introduzcan en la trampa.
As, se puede aplicar el voltaje de radio frecuencia (RF) en el instante en que todos
los de la CII-iones acumulados entran a la trampa de iones. Este nuevo mtodo
permite el control de los iones antes de entrar a la trampa lo cual permite una mejora
sustancial sobre la cantidad de iones capturados en la trampa de iones, lo que aumenta
la sensibilidad.
Las partes que componen el LCMS-IT-TOF, estn dispuestos linealmente en una
construccin nica (Figura 13). Permitiendo una mayor velocidad en la obtencin de
resultados. El gas usado dentro de la trampa de iones para la fragmentacin de estos
es el argon (Ar) el cual permite que la fragmentacin se d por colisin inducida CID
lo que ha permitido obtener resultados de manera ms eficiente que otros mtodos de
fragmentacin.
Figura 13. Esquema del equipo LC-MS-IT-TOF 74
El anlisis ms rpido en la obtencin de un espectro, se ha logrado mediante la
aceleracin de los iones de los iones de la trampa hacia el TOF, utilizando una nueva
tecnologa llamada extraccin balstica de iones (BIE), que permite un alto
-
29
rendimiento en el anlisis. BIE es un mtodo de aceleracin de iones para inyectarlos
en el TOF mediante la aplicacin de un alto voltaje. Esta tcnica permite la reduccin
de la distribucin espacial de los iones que entran en la regin TOF.
La fragmentacin de iones es muy til en el anlisis estructural. El LCMS-IT-TOF
tiene un diseo nico en que conecta a una trampa de iones con un TOF y
proporciona informacin sobre la masa de un compuesto con alta precisin (masa
exacta), ya sea para un anlisis de MS o MSn. Esto hace que sea posible realizar el
anlisis estructural de un compuesto con alta fiabilidad.74
La espectrometra de masas de ionizacin electrospray (ESI-MS) y la espectrometra
de masas en tndem (MS-MS), son herramientas complementarias para realizar la
identificacin de antocianinas. Estas tcnicas acopladas, permiten conocer el peso
molecular, as como los patrones de fragmentacin. Estos anlisis permiten una
determinacin aproximada del tipo de antocianidina y de los azcares presentes.
En un estudio realizado por Giusti et al75
., se identificaron las antocianinas:
Delfinidina 3-O--glucopiransido, cianidina 3-O--glucopiransido, petunidina 3-O-
-glucopiransido, pelargonidina 3-O--glucopiransido, peonidina 3-O--
glucopiransido, y malvidina 3-O --glucopiransido presentes en un extracto vegetal
concentrado de granos de baguau (Umbelliflora Eugenia Berg), una fruta tropical de
Brasil, mediante de la tcnica ESI-MS. Se comprob la versatilidad y eficiencia del
acople ya que el extracto crudo de esta fruta presentaba una mezcla compleja de
compuestos polifenlicos.
-
30
1.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MEDIANTE EL USO DE ESPECTROFOTOMETRA UV-Vis
Existes diversos mtodos para determinar la actividad antioxidante in vitro de
antocianinas y otros polifenoles en una muestra. Su estructura particular, deficiente en
electrones hace que estos compuestos sean muy reactivos ante las especies reactivas
de oxigeno (ROS) y de nitrgeno (RONS). En general, los antioxidantes son
sustancias que se encuentran en pequeas concentraciones en comparacin con un
sustrato oxidable y que retrasan o inhiben significativamente la oxidacin de dicho
sustrato. Tambin estabilizan las ROS mediante la cesin de un H+ y las convierten
en compuestos no radicalarios76
. Es necesario utilizar varios mtodos de medida de
actividad antioxidante para obtener un valor representativo de capacidad antioxidante
de la muestra, debido a que los antioxidantes pueden ser hidropfilcos o lipoflicos, la
medicin de los antioxidantes individuales por separado no permite conocer con
certeza la capacidad antioxidante total de un fluido biolgico por los efectos
sinrgicos y cooperativos que puedan establecerse entre los antioxidantes presentes
en l77
. Esto indica que la capacidad antioxidante se debe a la accin conjunta de
antioxidantes de muy variada reactividad presentes en un extracto y de los cuales no
todos son solubles en agua (hidroflicos)78
.
Los radicales libres son los responsables de los daos causados sobre los lpidos y
protenas por medio del fenmeno de la oxidacin, el cual compromete la integridad
del ADN de los seres humanos y son ampliamente reconocidos como una de las
causas de enfermedades degenerativas como el cncer79
. Los antioxidantes son
sirven como inhibidores de los procesos neoplsicos y protegen a las clulas del
proceso corrosivo de la oxidacin80
.
Diferentes mtodos se han desarrollado para determinar la actividad antioxidante de
fluidos. Todos son mtodos de inhibicin, donde se usa una especie generadora de
-
31
radicales libres, y otra que las detecta. La actividad antioxidante de la muestra
aadida inhibe la generacin de estos radicales, usualmente con absorbancias
significativas en el visible para poder detectar la disminucin en su concentracin por
efecto del antioxidante.
En el congreso internacional realizado en Orlando (Florida, USA) en el 2004 sobre
los mtodos de determinacin la actividad antioxidante81
, se analizaron las ventajas y
desventajas de los principales mtodos usados en alimentos. Teniendo en cuenta
todas las variables, se estableci que no existe un mtodo nico y que los valores
obtenidos para una muestra dependen del procedimiento utilizado para evaluarla; por
lo cual es necesario considerar que las determinaciones de la capacidad antioxidante
realizadas in vitro nos dan slo una idea aproximada de lo que ocurre en las
situaciones complejas in vivo. Habitualmente las diferentes mediciones se expresan
en equivalentes de vitamina E, usando Trolox (un anlogo soluble de vitamina E), por
cantidad de muestra aplicada.
Existen varios mtodos colorimtricos muy usados hoy en da, entre estos se pueden
mencionar los siguientes:
El ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) que se basa en la medicin de la
fluorescencia de una molcula a la que se le somete a la accin de un generador de
radicales libres. A medida que la molcula fluorescente es atacada y daada por los
radicales va perdiendo su fluorescencia; la labor de los antioxidantes es la de proteger
la molcula, y cuanto ms capacidad antioxidante tiene un compuesto o alimento ms
se preserva la capacidad de emitir luz de la molcula en cuestin. El grado de
proteccin se mide con un medidor de fluorescencia y se cuantifica en "equivalentes
de Trolox" (TE)82
.
-
32
El mtodo del DPPH se basa en la reduccin del radical DPPH por los antioxidantes
de la muestra. El radical es estable y tiene una coloracin prpura que se pierde
progresivamente cuando se aade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes
(Figura 14a). La decoloracin del radical se determina a una de 515 nm hasta
alcanzar el equilibrio (Figura 14 b). Entre las ventajas de usar este mtodo, se tiene
que el ensayo DPPH es un mtodo rpido y sencillo y que no requiere de un
equipamiento sofisticado. La desventaja que tiene este mtodo es que slo puede
disolverse en medio orgnico y en algunos casos la interpretacin resulta complicada,
ya que algunos antioxidantes pueden causar interferencias si poseen un espectro de
absorcin similar al DPPH83
.
(a)
-
33
(b)
Figura 14 (a) Reaccin del DPPH con el mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo
(DPPH)84
(b) Esquema de reaccin entre 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y
Trolox.85
En el mtodo ABTS (cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfnico) el radical
tiene que ser generado tras una reaccin que puede ser qumica (dixido de
manganeso, persulfato potasio, ABAP, enzimtica (peroxidasa, mioglobulina) (Figura
15a), o tambin electroqumica. Con este mtodo, se puede medir la actividad de
compuestos de naturaleza tanto hidroflica como lipoflica. El cromforo ABTS
presenta un color azul/verde con mximo de absorcin a 342 nm, el cual es soluble
tanto en agua como en disolventes orgnicos y qumicamente estable. El radical
ABTS+
una vez generado por medio de enzimas o qumicamente pasa a presentar
nuevas caractersticas con mximos de absorcin a (414, 645, 734 y 815 nm), pero
se mide a una longitud de onda 734 nm. Una de las principales ventajas del uso de
este radical es que tiene la capacidad de solubilizarse en medios acuosos y en medios
-
34
orgnicos. El radical ABTS+
es mas indicado para ensayos decompuestos coloreados,
como el caso de los antocianos, por presentar absorcin mxima prxima a la regin
infrarroja ( 734nm) reduciendo posibilidades de interferencias de compuestos
coloreados que absorben en la regin del visible o compuestos resultantes de reaccin
secundaria86
(Figura 15b).
Figura 15 (a) Formacin del radical ABTS (b) reaccin del catin radical ABTS+
con compuestos fenlicos. 86
-
35
1.4 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR
RESONANCIA ELECTRNICA PARAMAGNTICA (EPR)
La EPR es una clase de espectroscopia de absorcin en la cual una radiacin de
microondas produce transicin entre niveles de energa magntica de electrones
desapareados. Usualmente, el origen de su paramagnetismo es un radical libre para
molculas orgnicas o un in de un metal de transicin, en compuestos inorgnicos.87
Los radicales libres son muy reactivos ya que tienden a captar un electrn de
molculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroqumica. Una vez que
ste ha conseguido sustraer el electrn que necesita, la molcula estable que se lo
cede se convierte a su vez en un radical libre por quedar con un electrn desapareado
inicindose as una verdadera reaccin en cadena que produce alteraciones en las
clulas y puede conducir a diversas enfermedades degenerativas.
La espectroscopa EPR mide las diferencias de energa entre los estados originados
por el desdoblamiento que se genera al poner un sistema con electrones desapareados
en un campo magntico externo (efecto Zeeman). La diferencia de energas entre dos
estados ser de la forma g B HZ, donde g es el factor de Land, B es el magnetn de
Bohr y H el campo magntico aplicado. La denominada condicin de resonancia para
obtener en el espectro un pico de resonancia es:
h v = gj B HZ
Y este campo es HZ ser el campo de resonancia. De aqu puede despejarse el factor
de Lande g. Este factor g puede llegar a ser muy til a la hora de identificar la
muestra88
.
-
36
En los radicales orgnicos el electrn desapareado se encuentra ms o menos
deslocalizado en la molcula que los contiene y sus espectros de EPR, pueden
suministrar informacin acerca de la distribucin de la densidad de espn a travs de
la estructura hiperfina (interacciones con otros ncleos cercanos)89
.
Esta tcnica ha sido usada anteriormente en la determinacin de la actividad
atrapadora de radicales de las catequinas, tambin en determinacin antioxidante de
los componentes seleccionados del t, los vinos, coacs y frutos90
.
En un estudio realizado por Rimbach et al.,91
en la Universidad de Salamanca se
investig la capacidad de las antocianinas y sus aductos derivados de acido pirvico
para atrapar el anin super oxido y el grupo hidroxilo por EPR. Se determin que los
3-glucsidos de delfinidina, cianidina, petunidina, pelargonidina y malvidina
exhibieron una potente captacin del radical superxido y en menor medida del
radical hidroxilo. As mismo que las piroantocianinas de cianidina, petunidina,
malvidina y pelargonidina mostraron una alta capacidad para captar radicales
superxido, pero no de radicales hidroxilo. Con lo anterior se demostr la capacidad
antioxidante de las antocianinas presentes en el vino por medio de la tcnica de EPR.
Una de las principales ventajas de esta tcnica a la hora de caracterizar radicales
orgnicos, es que proporciona diferente informacin en funcin de las caractersticas
de la muestra y permite la medida directa de la concentracin de radicales libres en
solucin.
1.5 APLICACIN DE COLORIMETRA TRIESTMULO EN LOS
EXTRACTOS DE ANTOCIANINAS
El color es una respuesta mental al estmulo producido en la retina por una radiacin
luminosa visible, pero la medida de este estmulo depende de las condiciones que lo
rodean. As, para lograr unificar dichas medidas se han definido unas condiciones
-
37
estndar que permiten obtener resultados comparables, como son: el observador, el
iluminante, la geometra de iluminacin-observacin y el intervalo de medida92
.
La bsqueda contina de sistemas estndar que permitan la descripcin y
comparacin precisa de colores ha llevado al desarrollo de modelos de color. El
modelo ms usado en la actualidad para caracterizar el color de extractos de
antocianinas es el CIELAB. Este modelo fue desarrollado en 1976 por la Comisin
Internationale de l clairage (CIE) (Comisin Internacional para el Estudio de la
Iluminacin), la cual estableci un sistema internacional basado en el efecto que
cualquier color puede producir sobre un observador estndar. Para ello se tuvo en
cuenta que el color es tridimensional y que bastan solo tres nmeros para definirlo.
El estmulo cromtico est compuesto por tres sensaciones bien diferenciadas, que
dan al color su carcter tridimensional: matiz o tono, luminosidad y saturacin o
pureza. El matiz o tono es la propiedad por la cual un color se identifica como rojo,
azul, etc., y est relacionado con las diferencias de absorbancia de la energa radiante
a diferentes longitudes de onda; es decir, es el atributo cualitativo del color. La
luminosidad es el atributo en virtud del cual los colores pueden considerarse
equivalentes a alguno de los miembros de la escala de grises, entre el negro y el
blanco. Es una medida relativa de la luz reflejada frente a la absorbida. La saturacin
o pureza se define como la proporcin de luz cromtica en la percepcin total, o
como el grado de diferencia entre el punto de color en cuestin y el correspondiente
al punto gris de la misma luminosidad.
Estos tres atributos, tono, luminosidad y saturacin definen cualquier color. Esta
consideracin tridimensional del color es el fundamento de la teora tricromtica. Las
leyes experimentales de la igualacin del color se resumen en un principio conocido
como generalizacin tricromtica.93
-
38
La escala en la cual se mide el color basada en estos aspectos, esta basada en la teora
de Hering en la cual los conos del ojo estn codificados para recibir seales de luz-
oscuridad, rojo-verde y amarillo-azul, segn lo cual un color no puede ser al tiempo
rojo y verde. En este modelo se representan en coordenadas rectangulares las
expresiones: claridad (L*), croma (C*ab), matiz o tono (hab) y a*b*. As se fija un eje
a cuyos extremos a y a sern colores rojo y verde respectivamente. De la misma
manera el eje b tendr extremos b y b azul y amarillo. La luminosidad se
representa a lo largo de una coordenada L que es perpendicular a las dos anteriores y
sus extremos son el blanco y el negro puro. El matiz se mide como el ngulo que va
en sentido opuesto a las manecillas del reloj, partiendo de +a. (Figura 16).
Figura 16. Modelo de color CIELAB94
El color de una muestra puede ser medido espectrofotomtricamente y ser trasladado
a las coordenadas del modelo a emplear mediante la transformacin matemtica de
las curvas de reflectancia o transmitancia en la regin del espectro electromagntico
visible entre 380 y 780 nm95
.
-
39
El color, puede ser expresado como un punto en un espacio vectorial definido por las
coordenadas angulares L*, a* y b* por sus coordenadas angulares, croma (C*ab ) y
tono (h ab), definidos por a* y b* as:
h ab = tan-1
(b/a)
C ab = (a2 + b
2)1/2
Por lo tanto un color que se encuentre ms cercano al origen de coordenadas
presentar un color apagado mientras que uno ms lejano presentar mayor vividez.
La estructura de las antocianinas es la de un hbrido de resonancia, en la que la carga
positiva se encuentra deslocalizada entre diversos tomos de la molcula, aceptndose
como posibles diversas estructuras (Figura 5). Los iones oxonio son generalmente
poco estables, pero en el caso del fenil-2-benzopirilio, los dobles enlaces conjugados
que posee le confieren estabilidad.
Las antocianinas poseen coloraciones rojizas las cuales se encuentran con ngulos de
matiz desde 0 hasta 60, las de matices cercanos o menores que 0 poseen
coloraciones violeta y las cercanas a 60 tienen coloraciones anaranjadas. Por medio
del modelo CIELAB se han caracterizado y comparado los colores de extractos y
compuestos puros de antocianinas, por ejemplo, en derivados de pelargonidina96
,
derivados de malvidina-3-glucsido,97
antocianinas en flores,98
antocianinas en
rbano y papa99
. Estos estudios demuestran que aplicar sistemas colorimtricos de
espacio uniforme es de gran utilidad en la caracterizacin de las propiedades del color
de los pigmentos.
En un trabajo realizado por Giusti, et al.,96
en donde se estudiaron pigmentos
obtenidos de extractos obtenidos a partir de fresas y rbanos en solucin metanlica
(pH 1) y a temperatura ambiente las caractersticas del color de diferentes
-
40
antocianinas, encontraron diferencias en la glicosidacin y acilacin de las
antocianinas estudiadas, las cuales tienen un efecto marcado sobre las caractersticas
espectrales y del color de estos pigmentos. En general se observ un mayor efecto
hipercrmico cuando se incrementa el nmero de unidades de azcar en el pigmento;
as por ejemplo, la pelargonidina-3-soforsido-5-glucsido present una mayor
absortividad molar () que su respectivo monoglucsido. Adems, como
consecuencia de la mayor glicosidacin tambin se observ un efecto hipsocrmico.
Tambin se evidenci un efecto, debido a la acilacin, sobre las caractersticas
espectrales y del color de las antocianinas estudiadas. Por ejemplo, se observ un
desplazamiento batocrmico y un efecto hipercrmico de los derivados acilados de
pelargonidina al compararlos con pelargonidina-3-soforsido-5-glucsido.
Por otro lado Heredia, et al.,100
estudiaron por colorimetra triestmulo las
caractersticas del color de glucsidos de cianidina, delfinidina, petunidina,
pelargonidina y malvidina, todas stas aisladas de la uva. Este estudio se realiz en el
intervalo de pH 1.5 a 7, en el que se encontraron grandes diferencias de color en
cuanto al croma. Estas diferencias se relacionaron con aspectos estructurales de los
pigmentos. En general el nmero y tipo de sustituyentes en el anillo B de la aglicona
fue el aspecto ms relevante, ya que los pigmentos con dos sustituyentes en el anillo
B se localizaron en el rea del matiz naranja, mientras que pigmentos con tres
sustituyentes estuvieron localizados en el rea de los rojo-prpura.
-
41
2 METODOLOGA
La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol
(Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg),
mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln Hyeronima macrocarpa
Mull.Arg), fue desarrollada en tres etapas: primero la obtencin del extracto crudo
enriquecido en antocianinas, seguido por la identificacin y cuantificacin de los
pigmentos tipo antocianina, luego evaluacin de la actividad antioxidante de los
extractos crudos; y finalmente el estudio de la estabilidad del color a diferentes pHs.
2.1 MATERIAL VEGETAL
Las frutas tropicales uva de rbol y coral objeto de este estudio se recolectaron en la
zona sur occidental del pas en Timbio (Cauca), el motiln en la Unin (Nario) y la
mora pequea en el Hatillo Albana (Santander) y se seleccionaron de acuerdo a los
parmetros de madurez establecidos por su color. La identificacin taxonmica de las
muestras de estos frutos silvestres se realiz en el Instituto de Ciencias Naturales de
la Universidad Nacional de Colombia de la siguiente manera: uva de rbol (Myrciaria
aff cauliflora (Mart.)D.Bery) (COL 531920), coral (Hyeronima macrocarpa
Mull.Arg) (COL 531921),, mora pequea (Rubus megalococcus Focke) (COL
531919) y motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg) (COL 531910). Aunque el
coral y el motiln se clasificaron bajo el mismo nombre son especies
morfolgicamente diferentes, que ameritan un estudio botnico profundo para poder
definir su variedad, lo cual no fue objeto de este trabajo.
2.2 OBTENCIN DEL EXTRACTO ENRIQUECIDO EN ANTOCIANINAS
(ERA)
Para la mora pequea, se tom la fruta entera (295 g), de la uva de rbol solo la
cscara (134 g), y en el motiln y el coral se us la fruta sin semilla (98 y 123 g
-
42
respectivamente). Estas partes de las frutas fueron extradas separadamente con
metanol/cido actico (19:1 v/v) (1 L) durante toda la noche a temperatura ambiente
y en la oscuridad. En cada caso, despus de que el disolvente se elimin al vaco, el
residuo se aplic sobre una columna de resina de Amberlita XAD-7 (Aldrich
Chemical Co., Milwaukee, WI) de 80 x 4 cm. La columna se lav con agua, y los
compuestos adsorbidos se eluyeron con 1 L de metanol/cido actico (19:1, v / v), de
acuerdo con el procedimiento descrito por Degenhardt et al58
.
Cada eluido se concentr al vaco y el residuo se liofiliz obtenindose un extracto
rico en antocianinas (ERA) en la mora (2,1 g), en la uva (1,8 g), en el coral (2,0 g) y
en el motiln (3,0 g). Con el fin de simplificar la composicin de los extractos (ERA)
de coral y motiln, un gramo de cada extracto se fraccion separadamente en una
columna de 45x40 cm, empacada con una resina Toyopearl HW-40F (150 g) (Tosoh
Bioscience, Japn). Las fracciones se eluyeron con metanol/agua/TFA
(1:4:0.005,v/v/v,1L) a un flujo de 1.0 mL/min. Se obtuvieron 34 fracciones para el
coral y 71 para el motiln de 10 mL cada una. Las fracciones se agruparon para el
coral de la siguiente manera: F1(1-5) F2(6-11), F3(12-16), F4(17-20), F5(21- 28),
F6(29-32), F7(33-34) y para el motiln: F1(1-7), F2(8-17), F3(18-24), F5(25-30),
F6(31-37), F7(38-45), F8 (46-51), F9(52-58), F10(59-64), F11(65-71). Se
seleccionaron las fracciones que tenan antocianinas, esto es para el motiln la
F6(324 mg) y para el coral la F3 (351 mg).
2.3 ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA (HPLC-DAD).
Se us un cromatgrafo Agilent Technologies serie 1200, detector DAD (barrido de
200 nm-700 nm), con una columna Zorbax-SB C18 5m 4.6 x 250mm (Phenomenex
USA). Como eluyente, se usaron los solventes acetonitrilo/agua/cido frmico en
-
43
diferentes proporciones, el solvente A (3:87:10, v/v/v) y el solvente B (50:40:10
v/v/v), a un flujo de 0.2 mL/min. Se utiliz el siguiente gradiente lineal: de 6 a 20%
de B por 10 minutos, 20 a 40% B por 10 minutos, 40 a 50% de B por 10 minutos, y
de 50 a 6% de B por 5 minutos. Se utiliz un loop de inyeccin de 50 L.
Los extractos en conjunto con los estndares, se analizaron con el fin de confirmar la
presencia de las antocianinas; las antocianinas: delfinidina 3-glucsido y petunidina
3-rutinsido provenientes de Transmit (Marburg, Alemania), cianidina 3-glucsido y
cianidina 3-rutinsido de Sigma (Aldrich); y la antocianina cianidina 3-rutinosido
aislada y purificada de la fruta tomate de rbol101
.
La cuantificacin de las antocianinas presentes en cada uno de los extractos se realiz
por el mtodo de estndar externo utilizando los patrones de cianidina-3-glucsido46
,
con un coeficiente de correlacin de r2 = 0.994 y delfinidina-3-rutinsido aislada y
purificada del tomate de rbol, con un coeficiente de correlacin de r2= 0.999. Se
elabor una curva de calibracin de 5 puntos (5mg/mL, 10 mg/ mL, 20 mg/ mL, 40
mg/ mL y 80 mg/ mL) inyectando por triplicado cada una de las concentraciones y
los datos obtenidos de las muestras (ARE) se interpolaron en la curva. Los resultados
se expresaron en mg de cianidina-3-glucosido y delfinidina-3-rutinosido/100 g de
muestra, respectivamente.
2.4 ANLISIS POR HPLC- MS-IT-TOF
Tanto los ERA como las fracciones obtenidas se disolvieron en metanol (1mg/mL), y
se analizaron utilizando un cromatgrafo lquido acoplado a un espectrmetro de
masas Shimadzu LCMS-IT-TOF (Kyoto, Japn). Para la separacin cromatogrfica,
se utiliz una columna Luna RP-18 5m (150 x 2,0mm d.i., Phenomenex). Como
eluyente se uso el solvente A compuesto de acetonitrilo/agua/ cido frmico 3:87:10,
-
44
v/v/v y el solvente B 50/40/10, v/v/v, a un flujo de 0,2 ml / min. Se utiliz un loop
de inyeccin de 5 L. Los solventes utilizados fueron grado LCMS, Honey Well
Burdick and Jackson (Muskeson, MI, USA)
Para el anlisis por espectrometra de masas se usaron los siguientes parmetros:
ionizacin electrospray operada en modo positivo, la temperatura del CDL 300C,
del bloque del CDL 200C, el flujo del gas (N2) 1,5 L/min., voltaje del detector de
1,8 kV, acumulacin de iones de 20 mseg y un rango de scan de m/z de 100-900 u.
La energa de colisin del gas Argn se fij en 50% para los extractos enriquecidos
en antocianinas y del 10% para las fracciones. El software LCMS Solution (Shimadzu,
Tokyo, Japn) fue usado para la recoleccin y anlisis de los datos.
2.5 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
2.5.1 Obtencin de los extractos para actividad antioxidante. La obtencin del
extractos se realiz siguiendo el procedimiento por Vasco et alError! Bookmark
not defined., con el objeto de extraer tanto los compuestos hidroflicos como
lipoflicos. Segn este procedimiento, se liofilizaron las frutas: mora pequea (fruta
entera), uva de rbol (cscara), motiln y coral (fruta sin semilla) y se pesaron 0.5
gramos de cada uno de los liofilizados; luego se extrajeron los compuestos fenlicos
por 1 hora a temperatura ambiente con 20 mL de una mezcla de metanol:agua (50:50
v/v), seguido por otra extraccin con 20mL de acetona:agua (70:30 v/v) y se
centrifug a 4000 rpm por 15 minutos. Finalmente al sobrenadante se le adicionaron
50 ml de agua destilada en un baln aforado obtenindose as cada uno de los
extractos que fueron usados en los anlisis de actividad antioxidante.
-
45
2.5.2 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo TEAC-
espectroscopa UV-Vis. El anlisis espectrofotomtrico TEAC est basado en la
habilidad del antioxidante para capturar el catin radical ABTS.+
. El ensayo se llev a
cabo de acuerdo con el mtodo desarrollado por Re, et al. 86
El catin radical ABTS. +
se produjo por la reaccin entre ABTS (7mM) en agua y persulfato de potasio (2,45
mM) en 10 ml de agua destilada, manteniendo la solucin en la oscuridad a
temperatura ambiente por 12 horas (solucin stock). Luego esta solucin se diluy en
metanol para obtener la de trabajo (0.18 mM), la cual se ajust a una absorbancia de
0.7 0.2 a 734 nm. Se prepararon soluciones patrn de Trolox (Fluka) Chemie
GmbM (Steinheim, Suiza) en etanol en concentraciones de 0.5, 1, 1.5, 2 y 2.5 mM.
Para la determinacin de la actividad antioxidante, a 1ml de la solucin de trabajo se
le adicionaron 10 L de cada muestra y se midi la absorbancia a 734 nm
exactamente a los 6 minutos. Para tal fin se utiliz un espectrofotmetro UV-Vis
Thermo Scientific evolution 300. Se uso cido ascrbico (Merck, Dam stadt
Alemania) como compuesto de referencia. Se interpolaron los datos en la curva y se
expresaron como TEAC (Trolox-equivalent antioxidante capacity). El valor TEAC se
define como el nmero de milimoles de Trolox que tienen el mismo porcentaje de
inhibicin que un gramo de fruta (peso seco).
2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical DPPH por
espectroscopa UV-Vis. El DPPH es un radical estable de color violeta, cuya
absorbancia disminuye al ser reducido por un antioxidante (AH):
DPPH+AH DPPH- H + A
La actividad antioxidante de los extractos de las frutas se cuantific midiendo el
grado de decoloracin de una disolucin metanlica de DPPH, a una longitud de
onda de 514 nm102
. El ensayo se llev a cabo utilizando 0.1 mL de extracto y 3.9 mL
de la solucin de DPPH
(0.27 mM, 108 mg/100mL MeOH). Se midieron los valores
-
46
de absorbancia a un tiempo cero y despus cada diez segundos hasta obtener el valor
inicial reducido a la mitad. La actividad antioxidante se expres como EC50 valor que
expresa la concentracin de la muestra necesaria para inhibir el 50% de los radicales
libres DPPH (EC50 = concentracin de la prueba en estado de equilibrio).
2.6 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR
ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA PARAMAGNTICA (EPR).
Se utilizaron los mismos extractos de frutas y las mismas soluciones de radicales
libres (ABTS y DPPH) que en los ensayos por espectroscopa UV-Vis. Una alcuota
de 10 L de cada muestra fue agregada a 1 ml de la solucin de ABTS de trabajo y
luego fue sometida a las medidas sucesivas de EPR de 0-30 minutos. Para el caso de
DPPH, 100 L de cada ARE fue adicionado por separado a 3,9 mL de solucin de
DPPH (11,5 mg/200 ml MeOH). Todas las mediciones se iniciaron exactamente dos
minutos despus de mezclar la solucin de radicales con las muestras, durante 30
minutos. En ambos casos, se corrieron los solventes y las muestras blanco con el fin
de asegurar que no se produjo absorcin por estas a lo largo de las mediciones de
EPR, y se verific la estabilidad de las soluciones de radicales libres sin muestra.
Los anlisis de EPR se llevaron a cabo a temperatura ambiente en un espectrmetro
Bruker ESP 300. Las mediciones de EPR se realizarn con una frecuencia de
modulacin de 100 kHz, un ancho de barrido de 100 G, la modulacin de amplitud de
0,49 G, el tiempo de scan de 41,94 s y una potencia de microondas de 20 mW. Las
intensidades de las integrales de los espectros de EPR se obtuvieron por la evaluacin
de sus integrales dobles (DIEPR). La concentracin relativa (Crel) de radicales libres
para los tiempos de reaccin individual fue calculada como:
Crel = [DIEPR/DIref
EPR]t
-
47
Donde, DIEPR y DIref
EPR presentan integrales dobles determinadas por las muestras
(antioxidante mas radical libre) y por la referencia (radical libre en metanol),
respectivamente.
Tomando en cuenta estudios previos.103
Se asumi que el modelo cintico para estas
reacciones era de orden 2. As para determinar la constante de velocidad, la expresin
(1/Ct 1/Co) se grafic versus tiempo (min) y se realiz el anlisis de regresin lineal
de acuerdo con la ecuacin:
(1/Ct) (1/Co) = Kt
Donde K es la pendiente, Co la concentracin inicial, Ct la concentracin del radical
libre a un tiempo especifico y t es el tiempo de reaccin en minutos.
2.7 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DEL COLOR DE LOS ERA
Este estudio se realiz en un espectrofotmetro UV-Vis Agilent 8453. Para estudiar el
efecto del pH sobre la estabilidad del color de las antocianinas en cada uno de los
extractos enriquecidos en antocianinas, se prepararon 100 mL de soluciones acuosas
de cada una de ellas en una concentracin tal que la absorbancia inicial medida en el
espectrofotmetro a 520 nm, fue de aproximadamente en 0.7 unidades. Luego se
midi el pH inicial de cada solucin y se ajust a un valor de 1.5 con HCl 32%;
posteriormente adicionando gotas de NaOH 10M se increment poco a poco el pH de
la solucin hasta obtener valores de 3.5, 5.5 y 7.5. En cada valor de pH se midieron
los parmetros de color (L*, a*, b*) y los valores de C*ab, hab se calcularon de
acuerdo a las ecuaciones 1, 2 y 3. Las sucesivas variaciones de pH se obtuvieron
adicionando pequeos volmenes de NaOH 10M, por lo que se considera
despreciable el cambio de volumen.
-
48
(1) C*ab = [ (a*)2 + (b*)2 ]1/2
(2) hab = arctan (b*/a*)
(3) E*ab = [ (L*)2 + (a*)
2 + (b*)
2 ]
1/2
Las correlaciones entre los parmetros del color se obtuvieron por medio del software
Statistica v. 6.0 (StatSoft, 2001); el cual es un software completo para el anlisis de
datos que permite correlacionar diferentes variables.
La estabilidad del color con respecto al tiempo de almacenamiento se determin a los
mismos valores de pH, a una temperatura ambiente de 15C. Cada una de las
soluciones preparadas anteriormente se envasaron en recipientes de vidrio de 130 ml
cada una, y posteriormente se almacenaron en la oscuridad en presencia de aire
(23%). Cada ocho das se midieron los parmetros del color, cada dato fue el
promedio del valor obtenido para cada parmetro en cada una de las dos soluciones
preparadas por muestra.
Los parmetros CIELAB (L*, a*, b*) de los extractos, se determinaron de acuerdo
con las especificaciones CIE usando el software CromaLab (Heredia et al, 200495
).
Las diferencias de color E*ab se calcularon entre el pH inicial (pH 1.5) y la muestra
despus del tratamiento (incremento de pH).
2.8 ANLISIS ESTADSTICO
Se realiz el anlisis de varianza y la prueba de comparacin de medias (Tukey P
0.05) para todas las variables r