histolojiye giriş (fazlası için )

HİSTOLOJİYE GİRİŞ

Doç.Dr.Mehmet Fatih SÖNMEZ

2

ÖĞRENİM HEDEFLERİ

• Dönem I öğrencileri bu dersin sonunda;

– Türkiyede’ki histoloji eğitiminin tarihini

– Histoloji ve Embriyolojinin ilgi alanlarını

– Doku takip yöntemlerini öğrenecektir.

3

• Ülkemizde histoloji terimi embriyoloji ile birlikte,Histoloji ve Embriyoloji adı altında kullanılmaktadır.

• Histoloji, histos (doku) ve logia (bilim) kelimelerin birleşmesiyle türemiştir.

• Dilimizdeki karşılığı Doku Bilimi’ dir.

• İlm-i Ensaç veya Fenn-i Ensaç

• Embriyoloji, embrio (cenin) ve logia kelimelerinden oluşmuştur.

• Türkçemizdeki karşılığı ise, Cenin (dölet) Bilimi’dir.

• Mebhas-ül Cenin

4

• Türkiyede çağdaş tıp eğitim-öğretimi

1827.

• 1839 yılında “Mekteb-i Tıbbiye-i Adliyye-,

Şahane” (kısaca Mekteb-i Tıbbiye)

kurulmuştur.

• Okulun ilk yıllarında histoloji bağımsız bir

ders değildir, anatomi dersi ile birlikte

anlatılmaktadır.

• 1872 yılında histoloji dersi anatomiden

ayrılarak “ilm-i Ensac-ı Hucreviyye” adıyla

bağımsız ders olarak anlatılmıştır.

5

• Histolojinin ilk öğretim üyesi Mirliva Dr.

Mehmet Saib Paşa’dır.

• 1872 de yurtdışına doktora eğitimi için

gönderilen hekimlerden Miralay

Dr.Haydar Kamil Efendi İlm-i Ensac eğitimi

için Viyana’ya gitmiştir.

• Dr.Tevfik Recep embriyoloji alanında ilk

doktora yapan öğretim üyesidir.

• 1982 yılında morfoloji, 1993 yılında

Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı olarak

ayrılmıştır.

6

• Histoloji bilimine, mikroskopik anatomi de denmektedir.

• Histoloji biliminde, bir mikroskop yardımıyla biyolojik materyal ve yapılar incelenir.

• Histoloji hücre, doku ve organ bilimi olduğuna göre, bunların yapılarının yanı sıra işlevlerini de ele alacaktır.

• Bu yüzden, histoloji sadece yapıyı tanımlamakla kalmaz, aynı zamanda biyokimya, moleküler biyoloji ve fizyoloji arasında bağlantılar kurar ve hastalık ile ilgili patogenezde önemli rol oynar.

7

• Histoloji = Doku bilimi Histomorfoloji: Doku ve hücrelerin

mikroskobik yapısını inceler. Histofizyoloji : Hücre ve dokulardaki

canlılık olaylarını araştırır. Histokimya : Doku ve hücrelerdeki

kimyasal maddelerin hücre içi yerleşimini özel boyama maddeleri ile girdiği reaksiyona bağlı olarak gösterilmesini sağlar.

Sitoloji : Hücrelerin yapısını ve işleyişini inceleyen bilim dalı.

8

IŞIK VE ELEKTRON MİKROSKOPİDE KULLANILAN ÖLÇÜ BİRİMLERİ

Mikrometre (mikron) (µm) = 0.001 mm = 10-6 m

Nanometre (nm) = 0.001 µm = 10-9 m

Agström (Ao) = 0.1 nm = 10-10 m

9

• Doku ve organların mikroskop altında

incelenebilir hale getirilmesi için yapılan tüm

işlemlere histolojik teknik veya mikroteknik

adı verilir.

• Histolojik teknikler

A- Vital inceleme

B- Ölü dokuların incelenmesi

şeklinde olmak üzere iki şekilde yapılır.

HİSTOLOJİK TEKNİKHİSTOLOJİK TEKNİK

10

• Canlı, yaşamakta olan hücre veya organizmalar üzerinde, canlıyı öldürmeksizin yapılan incelemeye vital inceleme denir.

• Histolojide kullanılan vital boyalar

Asit boyalar : Tripan mavisi

Çini mürekkebi

Lityum karmin.................Fagositik hücreler

Bazik boyalar: Metilen mavisi

Toluidin mavisi................Sinir hücreleri

Janus green .....................mitokondrion

Nötral kırmızı

Krezil viole .......................vakuol sistemi

Dahlia viole ......................Nukleus

VİTAL İNCELEMEVİTAL İNCELEME

11

• Ana gereç Mikroskop

• Materyaller, mikroskopta incelenmeden önce, aşağıda belirtildiği şekilde elde edilir:

• İğne Biyopsisi: Beyin, göz, tiroid, lenf düğümü, meme, akciğer ve plevra, böbrek, kemik ve kemik iliği, testis ve iskelet kası.

• Endoskopik Biyopsi: Solunum yolu, mide ve barsak yolu, üriner sistem yolu.

• Transvasküler Biyopsi: Kalp ve karaciğer

• Doğrudan Çıkarım Biyopsisi: Deri, ağız, larinks ve serviks uteri.

• Kürete Biyopsisi: Uterus endometriyumu.

Histolojik İnceleme Nasıl Yapılır ?

12

1.Tespit (fixation)

2.Yıkama

3.Sudan kurtarma (Dehydratation)

4.Şeffaflandırma (Clearing)

5.Gömme (Embedding)

6.Kesit alma (Sectioning)

7.Boyama (Staining)

8.Kapatma (Mounting)

• Bir doku parçasının canlıdan alınıp parafin bloklama yapılıncaya geçen işlemlerin tümüne DOKU TAKİBİ denir

PARAFİN TEKNİĞİPARAFİN TEKNİĞİ

13

• Amacı;

1-Hücre ve dokuların canlı hale en yakın biçimde muhafaza etmektir. Ancak bu tam gerçekleştirilemez.

2-Otolizi, bakteriyel bozuma ve çürümeyi önlemek.

3-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek.

4-Sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek.

5-Dokunun boyalarla ve diğer reaktiflerle boyanmasını kolaylaştırmak.

• Fiziksel; ısı, kurutma, dondurma

• Kimyasal; immersiyon, perfüzyon

TESPİT (FİKSASYON)

14

1-Ölümden ve operasyondan sonra alınan örnekler hemen

fiksatife atılmalıdır.

2-Fiksatifde kullanılan kimyasallar taze olmalı, titizlikle

tartılmalı ve karıştırılmalıdır.

3-Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.

4-Fiksatif, doku hacminin en az 10 katı, formalin için 20 katı

olmalıdır.

5-+4 0C’de fiksasyon önerilir. Düşük ısılar fiksatifin dokuya

işleyişini azaltırsa da otolizi önlediğinden doku iyi tespit

edilir.

6-İçi boş organlar tespit çözeltisi ile doldurulmalıdır. Böylece

tespit çözeltisi dokuya her iki yüzden işler ve iç yüzün

düzgün yüzey şekli korunmuş olur.

Başarılı Fiksasyon İçin Nelere Dikkat Edilmelidir?

15

7-Kaba önce fiksatif konmalı, parçalar sonra

daldırılmalıdır. Yoksa dokular kaba yapışır ve

yapışma yerinden tespit çözeltisi dokuya işlemez.

8-Yağdan ve havadan zengin dokular tespit

çözeltisinde yüzdükleri için kaset içine alınarak

tespit çözeltisine batması sağlanmalıdır.

9-Tespit çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandıran

işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı tespit

çözeltisinin dokuya işleyişini hızlandırırken aynı

zamanda otolizi de hızlandırır.

10-Kullanılan tespit çözeltisinin dokulara işleme hızı

bilinmelidir.

16

11-Tespit çözeltisi ne hipotonik ne de hipertonik

olmalıdır. Osmolaritesi canlı dokunun osmolaritesi

(300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun

olmalıdır. Tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle

yıkanmamalıdır.

12-Tespit çözeltisinin pH’sı dokunun pH’sına yakın

olmalıdır (pH=6-8). Bu nedenle tamponlanmış

formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur.

13-Fiksasyonda kullanılan kaplar dar boğazlı olmamalı,

düz hatlı olmalıdır.

14-Doku çok sertleşmemelidir. Doku aşırı derecede

sertleşirse kesit alımı zorlanır.

17

Tespit ajanları

• Sıvı Tespit Ajanları– Absolu etil alkol– Soğuk aseton– Formaldehit– Gluteraldehit– Trikloroasetik asit– Asetik asit

• Katı Tespit Ajanları– Osmiyum tetroksit – Pikrik Asit– Kromik Asit – Potasyumdikromat– Civa Klorür

18

% 10’luk formol: 25ml formol + 75 ml distile su.Bouin: suda doymuş pikrik asit…………….15 ml

Formol………………………………….…5 mlAsetik asit…………………………….…1 ml

Müller eriyiği: potasyum bikromat…………………..2,5 grSodium sülfat……………………….1 grDistile su…………………………….100 ml

Orth karışımı: 9 kısım müller eriyiği + 1 kısım formolZenker : müller eriyiği………………………………100 ml

Civa biklorür ……………………………… 5 grAseti asit…………………………………….5 ml

Helly: müller eriyiği…………………………………100 mlCiva biklorür ………………………………..5 gr

Formol………………………………………..5 mlMaximow: müller eriyiği…………………………100 ml

Civa biklorür ………………………………..5 gr Formol………………………………………10 ml

19

• Uygulanan tespit çeşidine göre yapılır.

• Su veya değişik yoğunluklarda alkol kullanılır.

• Formol, osmiyum tetraoksit ve krom tuzu

içeren tespitlerden sonra, yıkama

aşamasında su kullanılır.

• Pikrik asitle gerçekleştirilen tespitler den

sonra, % 70 – 80’lik alkol ile yıkama

yapılabilir.

Yıkama

20

• Parafine gömülecek olan dokuların,

yıkamadan sonra içerisinde hiç su

kalmaması gerekir.

• Bu amaçla, en yaygın olarak etil alkol

kullanılır. Etanol, dokulardaki suyu çeker.

• Dokular, sırayla artan derecelerde alkol

serisinden geçirilir.

Sudan Kurtarma (Dehidretasyon)

21

• Şeffaflaştırmanın temel amacı, dokuya nüfuz etmiş olan alkolün yerine, ışığı kırma endeksi daha yüksek olan bir sıvı ayıracın konmasını sağlamaktır.

• Ksilol, bu amaçla en yaygın olarak kullanılan ve nispeten daha ucuz olan bir maddedir.

• Benzen, toluen, karbon sulfit, kloroform veya propilen oksit

Şeffaflandırma (Clearing)

22

23

• Dokulardan istenilen kalınlıkta kesitlerin elde

edilebilmesi, bunlara sert bir kıvam veren

gömme maddesi içine yerleştirilmesiyle

sağlanır.

• Parafin.

• Epoksi resinler (epon, araldit, vestopal)

Gömme (Embedding)

24

• Emdirme maddesinin içine gömülerek homojen biçimde sertleşmiş olan blok kitlesi (doku ve emdirme maddesi), mikrotom adı verilen özel bir aletle kesilir

• Bunların günlük pratikte en çok kullanılanları ise, kızaklı veya rotatif (dönerli) mikrotom tipleridir.

• Ayrıca, çok pahalı olan elmas uçlu bıçaklar da kullanılmaktadır. Mikrotomlarda, (tiplerine göre) 1 – 10 mikron kalınlığında kesitler alınır.

Kesit alma

25

26

27

• Doku elemanlarının genellikle birbirine yakın ışığı

kırma indilerine sahip olmaları ve kesitlerin

parafinle infiltre olmalarından dolayı ışık

mikroskobunda incelenemezler.

• Dokuların farklı elemanlarının incelenebilmeleri

boyanmaları ile mümkündür.

• Boyama işleminde önce, lam üzerine alınmış

kesitlerdeki parafin ksilen ile uzaklaştırılır, azalan

alkol serilerinde dokular rehidrate (yeniden su ile

doyurulma) edildikten sonra boyamaya tabi tutulur.

Boyama

28

• Asidofili: Bazik yapıdaki bir doku yapısının asit bir boya ile boyanması özelliğine asidofili denir. Eozin bir asit boyadır; sitoplazmayı pembe-kırmızıya boyar (eozinofili).

• Bazofili: Asit yapıdaki bir doku yapısının bazik bir boya ile boyanması özelliğine bazofili denir, çekirdeği mavi-mor renge boyar.

• Monokromazi: Doku yapısının boyanın gerçek renginde boyanması özelliği

• Metakromazi: Bir doku yapısının kullanılan boya solusyonunun renginden farklı bir renge boyanmasına denir.

Boyanma Özellikleri

29

30

• Hematoksilen ve Eozin (H-E)

• Periodik Asit-Schiff (PAS) reaksiyonu

• Masson trikrom

• Alcian blue

• Van Gieson

• Retikülin boyası

• Azan

• Giemsa

• Toluidin blue…..vs..

Histolojide sık kullanılan boyalar

31

• HEMATOKSİLEN-EOZİN

NUKLEUS

Heterokromatin - mavi

Ökromatin - negatif

Nukleolus - mavi

SİTOPLAZMA

Ergastoplazma - mavi

Genel sitoplazma - pembe-kırmızı

Filamanalr - pembe-kırmızı

HÜCRE DIŞI YAPILAR

Kollagen lifler - pembe

Elastik lifler - pembe

Retiküler lifler - pembe

Graund substans- mavi

Kemik matriksi - pembe

Bazal membran - pembe

32

• PERİODİK ASİT-SCHİFF REAKSİYONU (PAS)

• PAS glikojen gibi doku karbonhidratlarının gösterilmesinde

kullanılan bir tekniktir.

• Örneğin sindirim ve solunum sistemlerindeki goblet hücreleri

(sol şekil), kıkırdak matriksi ve böbrek tübüllerinin epitel

hücrelerinin mikrovillus-ları (fırçamsı kenar) ve bazal

membranları (sağ şekil) PAS (+) olarak adlandırılan menekşe

renginde boyanırlar.

33

• MASSON TRİKROM

• Üç farklı boyanın kullanıldığı bu teknik ile bağ dokusunun boyanması sağlanır. Sonuçta:– Nukleus: mavi

– Bazofilik yapılar: mavi

– Sitoplazma: kırmızı

– Kas hücreleri: kırmızı

– Eritrositler: kırmızı

– Bağ dokusu: mavi veya yeşil

34

35

• GİEMSA VEYA

WRİGHT

• Bunlar kan ve kemik iliği

yaymalarının

boyanmasında sıklıkla

kullanılan yöntemlerdir.

• Nukleus: kırmızı-

menekşe

• Sitoplazma: soluk mavi

• Eritrositler: soluk pembe

boyanır.

36

• TOLUİDİN BLUE

• Bazik bir boyadır.

• Asidik doku yapılarını mavinin değişik tonlarında boyar.

• Elektron mikroskobu için hazırlanmış ve rezine gömülmüş yarı ince doku kesitlerinin boyanmasında sıklıkla kullanılır.

• Bazı doku yapılarını metakromatik olarak boyar.

37

• Alcian blue

• Asit mukopolisakkaritleri ve glikozaminoglikanları maviye boyar.

• Van Gieson: • Bağ dokusunu boyama

tekniklerinden biridir; – kollageni kırmızıya, – nukleusu maviye, – eritrosit ve sitoplazmayı

sarıya boyar. • Bir elastik boyası ile kombine

edildiğinde elastin mavi-siyaha boyanır.

• Bu boyama teknigi özellikle kan damarları ve deri için faydalıdır.

38

HİSTOLOJİ KAYNAK KİTAPLARIHİSTOLOJİ KAYNAK KİTAPLARI

•Temel Histoloji Yener Aytekin

•Histoloji ve Hücre Biyolojisi Ramazan Demir

•Histoloji I ve II Türkan Erbengi

•Genel Tıp Histolojisi Meral Tekelioğlu

•Özel Histoloji Meral Tekelioğlu

•A Textbook of Histology Bloom, Fawcett

•Basic Histology Junqueira, Carneiro,

•Human Histology Stevens, Lowe

•Histology, A Text and Atlas Ross, Romrell

•Genel histoloji, özel histoloji Mukaddes Eşrefoğlu

39