biotechnology 2012-06

Методы классической генетикиКартирование генов

Законы Менделя

Законы Менделя

1. Закон единообразия гибридов первого поколения (закон доминирования признаков)

2. Закон расщепления признаков (закон чистоты гамет)

3. Закон независимого наследования признаков

Типы доминирования

Хромосомная теория наследственности

Томас Хант Морган

Хромосомная теория наследственности

• Гены расположены линейно в хромосомах. Каждый ген занимает в хромосоме строго определённое место (локус).

• Группы генов, расположенных в одной хромосоме, образуют группы сцепления.

• Между гомологичными хромосомами может происходить обмен участками (кроссинговер).

• Расстояние между генами в хромосоме пропорционально частоте кроссинговера между ними.

Кроссинговер – обмен участками гомологичных

хромосом во время коньюгации в мейозе

Иллюстрация кроссинговера, Томас Хант Морган (1916)7

8

And half look like they got a mix of both parents chromosomes…

Half look like they got a set of the parents chromosomes…

If two genes are on different chromosomes…

9

If two genes are on the same chromosome…

10

If two genes are on the same chromosome…

Two Point Cross Example

• Parent #1

– BbVv• Grey with normal

wings

• Parent #2

– bbvv• Black with vestigial

wings1

Two-Point Cross

BV bv Bv bV

bv BbVv bbvv Bbvv bbVv

ExpectedResults

575 575 575 575

Actual Results

965 944 206 185

• Calculations– Parental Genotypes

• 965 (42%) +944 (41%) = 1909• 1909/2300 = 83%

– Recombinant Genotypes• 206 (9%)+185 (8%) = 391• 391/2300 = 17%

– If independent assortment was to occur, the percentages would be 25% a piece.

– Based on the data, the recombinants arose because of crossing over

Генетическое картирование

• Анализ сцепления – основа генетическогокартирования

• Измерение частоты рекомбинации междусцепленными генами (частота рекомбинациизависит от расстояния между генами)

• 1 сМ (сантиморган) = частота рекомбинации 1%

• В среднем у человека 1 Mb = 1,22 cM

cM or centimorgan

1% Recombination = 1 cM

Частота кроссоверов никогда не превышает 50%

Двойной кроссинговер

Одиночные и двойные кроссоверы

Интерференция – это подавление кроссинговера на участках, непосредственно прилегающих к точке происшедшего обмена.

18

Карта– линейная схема расположения генов, регуляторных

элементов, а также генетических маркеров в хромосоме

• Генетические – карты сцепления

• Физические – реальное положение различных последовательностей на хромосоме

– Цитогенетические

– С использованием различных маркерных последовательностей

– Полные последовательности ДНК

Маркеры генетического картирования,приводящие к изменению фенотипа

• Морфологические – гены, мутации в которых приводят к заметным морфологическим изменениям

Drosophila melanogaster

• Биохимические – гены, мутации в которых приводят к изменениям биохимических процессов

Микроорганизмы

• и т.д.

Маркеры генетического картирования,не приводящие к изменению фенотипа

• Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs)

• Single nucleotide polymorphisms (SNPs)

• Simple sequence length polymorphisms (SSLPs)

RFLP

• Restriction-fragment length polymorphism

– Cut genomic DNA from two individuals with restriction enzyme

– Run Southern blot

– Probe with different pieces of DNA

– Sequence difference creates different band pattern

GGATCC

CCTAGG

GTATCC

GATAGG

GGATCC

CCTAGG

200 400

GGATCC

CCTAGG

GCATCC

GGTAGG

GGATCC

CCTAGG

200 400*

*

200

400

600

1 2

**

2

1

SNP

• Single-nucleotide polymorphism

– One-nucleotide difference in sequence of two organisms

– Example: Between any two humans, on average one SNP every 1,000 base pairs

ATCGATTGCCATGAC

ATCGATGGCCATGAC2

1

SNP

SSLP/Microsatellites

Simple-sequence length polymorphism• Most genomes contain repeats of three or four

nucleotides• Length of repeat varies due to slippage in replication• Use PCR with primers external to the repeat region• On gel, see difference in length of amplified fragment

ATCCTACGACGACGACGATTGATGCT

12

18

1 2

2

1

ATCCTACGACGACGACGACGACGATTGATGCT

Физические карты

• Точное картирование маркеров на хромосоме

• Разрешение может варьировать (до единичных нуклеотидов)

• Недостатки генетических карт:

– ограниченная точность

– ограниченное разрешение

Типы физических карт

Рестрикционное картирование

• Составление карты сайтов узнавания рестриктазами для отдельных фрагментов генома

• Используется несколько разных рестриктаздля создания карт фрагментов

• Из фрагментов можно собирать контиги за счет перекрывания

Contigs from overlapping restriction fragments

• Cut inserts with

restriction enzyme

• Look for similar pattern

of restriction fragments

– Known as

“fingerprinting”

• Line up overlapping

fragments

• Continue until a contig

is built

Contigs

• Contigs are groups of overlapping pieces of chromosomal

DNA

– Make contiguous clones

• “Minimum tiling path”

– Contig of smallest number of inserts that covers a region of

the chromosome

genomic DNA

contig

minimumtiling path

STS - sequence-tagged site(уникальные последовательности 60-1000 п.н.)

EST - expressed sequence tags(короткие уникальные последовательности,

являются участками генов)

Позиции STS и EST детектируются ПЦР или гибридизацией

Цитогенетические карты

Карты разрыва хромосом

Генетические карты коллинеарныфизическим, расстояния могут

отличаться

35

Сравнение генетической и цитологической карт хромосом дрозофилы

Распределение частот рекомбинации вдоль

хромосом постоянно и зависит от пола

MaleFemale

Recombination hotspots

При более выском разрешении обнаруживаются «горячие точки» рекомбинации.

Гаплотип — совокупность аллелей на локусах одной хромосомы, обычно наследуемых вместе.

Генетическое картирование человека

Родословные

Генеалогический анализ –метод родословных

• Установление наследственного характера признака

• Выяснение типа передачи НБ

• Анализ пенетрантности и экспрессивности признака

• Сцепление признака с генетическими и молекулярными маркерами

• Медико-генетическое консультирование

Пробанд - больной или его родственник, с которого начинается составление родословной.

Cимволы, используемые в при составлении родословных

Аутосомно-доминантный (ахондроплазия, синдром Марфана, нейрофиброматоз, миотоническая дистрофия, хорея Гентингтона) – популяционная частота - 0,5-1,0%

• Прослеживается в родословных только по вертикали• Соотношение больных и здоровых детей 1:1• Здоровые дети от больных родителей имеют здоровое потомство• Соотношение больных мальчиков и девочек одинаково• Пациенты независимо от пола одинаково часто передают

болезнь• У гомозигот болезнь нередко летальна• Болезнь - часто результат спонтанных мутаций

Аутосомно-рецессивный (муковисцидоз, ФКУ, СМА, АГС, мукополисахаридозы) - популяционная частота - 0,25%

• Родители клинически здоровы• Соотношение больных и здоровых детей 1:3• Если больны оба супруга – дети всегда больные• Оба пола поражаются одинаково часто• Не исключено кровное родство супругов• В браке больного и носителя рождается 50% больных,больного и здорового –рождаются только здоровые

Х-сцепленные заболевания- популяционная частота 0,25%

Доминантное наследование (болезнь Ретта, витамин Dрезистентный рахит)

• Поражаются мальчики в 2 раза чаще, чем девочки

• Женщины болеют менее тяжело, передают болезнь 50% сыновьям и 50% дочерям

• Больные мужчины передают болезнь всем дочерям

Рецессивное наследование (миодистрофия Дюшенна, гемофилии, синдромы Мартина-Белла, Леш-Нихана, Хантера)

Болеют только мальчики, 2/3 случаев наследуются от матерей-носительниц, 1/3 -

спонтанных Сестры больных братьев в 50% - носители мутации Здоровые мужчины не передают заболевание

Х-сцепленные заболевания- популяционная частота 0,25%

Другие типы наследования

Y-сцепленные (нарушения сперматогенеза, рост тела,

конечностей, зубов)

• Передаются только по мужской линии

• Болеют только мальчики

Митохондриальные болезни (атрофия

зрительного нерва Лебера, кардиомиопатии, миоклоническая эпилипсия, митохондриальная миопатия, прогрессирующая офтальмоплегия)

• Болезнь передается только по материнской линии

• Болеют мальчики и девочки

• Больные мужчины не передают болезнь потомству

Для анализа сцепления необходимы информативные мейозы

А, B – неинформативныеC – информативный нерекомбинантныйD – информативный рекомбинантный

Можно сказать, произошла ли рекомбинация между признаком и маркером

Phase known – известно, какая комбинация аллелей унаследована от какого родителя

LOD score

• Статистический метод для анализа неполных родословных

• LOD = логарифм отношения вероятности, что гены сцеплены, к вероятности, что не сцеплены

• Оценивается для набора значений предполагаемых частот рекомбинации

• Предполагаемая частота рекомбинации с наибольшим значением LOD считается более вероятной

LOD = Z = Log10 probability of birth sequence with a given linkage probability of birth sequence with no linkage

θ – принятая частота рекомбинацииВероятность того, что мейоз был рекомбинантный = θВероятность того, что мейоз был нерекомбенантный = (1- θ)

• LOD > 3 считается доказательством сцепления

• LOD < -2 считается доказательством отсутствия сцепления

Спасибо за внимание