Технология рекомбинантнойДНК

Рекомбинантная ДНК

— искусственно созданная последовательность ДНКпутем объединения нескольких последовательностейДНК

• Части рекомбинантной ДНК могут быть полученыисскуственным путем или клонированы изорганизмов

• Рекомбинантную ДНК получают с использованиемживых клеток

Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК

Ключевые этапы клонирования ДНК

Создание рекомбинантной ДНК

Трансформация

Ключевые этапы клонирования ДНК

Амплификация

Выделение рекомбинантной ДНК

Необходимые элементы

• Клонируемая ДНК (чужеродная ДНК)

• Вектор (молекула переносчик ДНК)

• Способ объединения вектора и клонируемой ДНК

• Клетка-хозяин (host cell)

• Способ переноса ДНК в клетку-хозяин(трансформация)

• Способ отбора клеток, успешно прошедших трансформацию (селекция, скрининг)

Создание рекомбинантной ДНКс использование рестрикции

Рестрикция

Лигирование

«Липкие» и «тупые» концы рестриктаз

ПЦР для клонирования в вектор

Вектор

— молекула ДНК, обеспечивающая перенос клонирующей ДНК в клетку-хозяин и последующую репликацию

• Плазмиды

• Вирусы (бактериофаги)

• Искусственные хромосомы

Плазмиды

11

— несущественные двуцепочечные молекулы ДНК, реплицирующиеся в клетке независимо от основной хромосомной ДНК

• Характерны, как правило, для одноклеточных (бактерии, дрожжи и тд)

• Как правило, кольцевые молекулы ДНК (встречаются линейные)

• Размер от 2 kb до 200 kb

• В клетке могут присутствовать разные типы плазмид

• Эписомы – плазмиды, способные встраиваться в хромосому бактерии

Плазмиды

12

Минимальный состав плазмиды:

• Ориджин репликации

• Селективный маркёр

• Полилинкер

• Однокопийные• Мультикопийные

Плазмидный вектор pUC19

• ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку)• полининкер• AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину)• lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция)

Бактериофаги (фаги)- вирусы, поражающие клетки бактерий

• Могут существовать вне клетки бактерии

• Для репликации должны инфицировать клетку бактерии

• ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечнойформе, линейная или кольцевая

Геном фага λ

• Линейная dsDNA 48,5 kb. Внутри клетки замыкается в кольцо.

• Фаг заражает бактерию E. coli. Может реплицироваться независимо или встаиваться в геном клетки.

• Несущественный фрагмент 23 kb нужен только для встраивания в геном клетки-хозяина.

Искусственные хромосомы

• Позволяют клонировать большие фрагменты ДНК

• Низкое количество копий на клетку

• BAC (bacterial artificial chromosome)

• PAC (P1 artificial chromosome)

• YAC (yeast artificial chromosome)

YAC• Емкость до 2 Mb

• 3 необходимых элемента:– CEN – центромера

– TEL – теломеры

– ARS (autonomous replication sequence) – ориджин репликации

Бактериальная плазмида

YAC

Клетка-хозяин

• Бактерии (напр., Escherichia coli)

Клетка-хозяин

• Бактерии (напр., Escherichia coli)

• Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)

Клетка-хозяин

• Бактерии (напр., Escherichia coli)

• Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)

• Растительные клетки

Клетка-хозяин

• Бактерии (напр., Escherichia coli)

• Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)

• Растительные клетки

• Животные клетки

HeLa CHO

и тд. и тп...

Трансформация

• Перенос чужеродной ДНК внутрь клетки-хозяина

• В каждую клетку попадает, как правило, одна молекула рекомбинантной ДНК

• Большое количество способов, адаптированных для разных типов клеток

Электропорация- один из наиболее эффективных методов трансформации

одноклеточных организмов

24

Пример эксперимента по клонированию

Селекция

• Позитивная (прямая) – выживает лишь искомый тип клеток, несущий определенный ген– устойчивость к антибиотикам и другим токсичным агентам

– способность расти на среде без какого-либо питательного вещества

• Негативная – избирательная гибель клеток, несущих определенный ген

• Визуальная

• Тотальный скрининг – индивидуально тестируются все клеточные клоны

Плазмидный вектор pUC19

• ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку)• полининкер• AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину)• lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция)

Позитивная + визуальная селекция

Бело-голубая селекция

28

В питательную среду добавляют: антибиотик, X-gal, IPTG

X-gal

Тотальный скрининг

Применение клонирования ДНК

• Изоляция и амплификация интересующего фрагмента ДНК

• Создание библиотек ДНК

• Секвенирование ДНК

• Изменение последовательности ДНК (мутирование)

• Синтез белков

Библиотеки ДНК

- большое число молекул векторной ДНК со встроенными фрагментами чужеродной (анализируемой) ДНК

33

BAC libraries

Скрининг фаговых библиотек

Для поиска и клонирования интересующих генов

Получение ssDNA(для секвенирования, мутагенеза)

Вектор М13Плазмида + фаг

= Фагмида

Мутагенез

Мутагенез для:• изучения функций генов• получения генов и белков с измененными свойствами

Синтез белков

• Экспрессионное клонирование – клонированиес целью экспрессии генов и синтеза белков

• Гетерологичная экспрессия – экспрессия генов одного организма в клетках другого

• Рекомбинантные белки – белки, полученные в ходе гетерологичной экспресии

Гетерологичная экспрессия:• конститутивная – постоянный синтез белка• индуцибильная – синтез белка при определенных условиях

Синтез белков

Индуцибильная экспрессия

Fusion protein vectors

• При клонировании получаются химерныегены => при экспрессии синтезируются химерные белки

• К белкам добавляются различные форагменты для:

– облегчения очистки

– обеспечения направленного транспорта

– облегчения визуализации белка

Фаговый дисплей (phage display)

А – получение библиотек в фаговых частицахВ – скрининг библиотеки при помощи специфичных антител

(рекомбинантные белки экспрессируются на поверхность фага)

Применение гетерологичнойэкспресии

• Синтез белковых лекарств – инсулин

• Получение организмов с новыми свойствами – ГМО

• Лечение генетических заболеваний

Системы гетерологичной экспрессии

• Бактериальные

• Дрожжевые

• Растительные

• Культуры клеток насекомых

• Культуры клеток млекопитающих и человека

• Трансгенные растения и животные

Модификации белковВажна не только аминокислотная последовательность белков, но и

посттрансляционные модификации

Экспрессия в молоке трансгенных животных

Экспрессия в молоке трансгенных животных

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ