biotechnology 2012-02
TRANSCRIPT
![Page 1: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/1.jpg)
NGS
![Page 2: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/2.jpg)
Next-generation sequencing =High-throughput sequencing =
Massive parallel sequencing
2
![Page 3: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/3.jpg)
3
![Page 4: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/4.jpg)
Анализ данных
Сырые изображения
Риды
Сборка и выравнивание
Поиск вариантов
Аннотирование
4
![Page 5: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/5.jpg)
DO NOT COPY WITHOUT PERMISSION5
![Page 6: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/6.jpg)
Sanger NGS
Library preparation
Template preparation
Sequencing
6
![Page 7: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/7.jpg)
Параметры NGS секвенаторов
• Производительность
• Длина прочтения (рида)
• Количество ридов
• Точность
• Типы возможных ошибок
• Стоимость запуска
![Page 8: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/8.jpg)
Методы NGS
• Секвенирование синтезом
– Пиросеквенирование
– Полупроводниковое секвенирование
– Синтез с обратимой терминацией
– Секвенирование в реальном времени
• Секвенирование лигированием
8
![Page 9: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/9.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2000,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
9
![Page 10: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/10.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2500,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
10
![Page 11: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/11.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2500,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
11
![Page 12: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/12.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2500,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
12
![Page 13: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/13.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2500,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
13
![Page 14: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/14.jpg)
NGS technologiesПлатформа Методика
секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности
454 Life Sciences (Roche)
Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior
+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах
Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией
Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)
HiSeq 2500,MiSeq
+ Высокая производительность
Applied Biosystems (Life Technologies)
Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды
Ion Torrent (Life Technologies)
Полупроводниковое секвенирование
Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton
+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах
Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией
Нет HeliScope - Короткие риды
Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени
Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок
14
![Page 15: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/15.jpg)
15
![Page 16: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/16.jpg)
“Benchtop” sequencers
16
![Page 17: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/17.jpg)
454 (Roche)
GS FLX Titanium GS Junior
17
![Page 18: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/18.jpg)
Chemistry of DNA synthesis
![Page 19: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/19.jpg)
Пиросеквенирование
19
![Page 20: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/20.jpg)
Пиросеквенирование
20
![Page 21: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/21.jpg)
Ion Torrent(Life Technologies)
21
![Page 22: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/22.jpg)
22
![Page 23: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/23.jpg)
Полупроводниковое секвенирование
23
![Page 24: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/24.jpg)
Быстрая прямая детекция
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
Пластина сенсора
Кремниевый субстрат
Drain SourceBulk
дНТФ
К ресиверу
∆pH
∆Q
∆ V
Чувствительный слой
H+
24
![Page 25: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/25.jpg)
CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA
1 100
GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC
101 200
CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT
201 300
CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG
301 400
CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT
401 500
AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT
|||||||||||||||||||||||||
AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT
501 600
25
![Page 26: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/26.jpg)
Чипы Ion 314 и Ion 316 с проточными ячейками
pH-сенсорные чипы
26
![Page 27: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/27.jpg)
Расположение лунок на поверхности pH-сенсорных чипов
Ion 314 Ion 316 Ion 318
pH-сенсорные чипы
Вид сенсорных чипов на срезе (сканирующая электронная микроскопия) 27
![Page 28: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/28.jpg)
Scalability
2011 2012 2013
10 Mb
100 Mb
1 Gb
10 Gb
100 Gb
28
![Page 29: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/29.jpg)
Sequencing: Ionograms
Sequence: AATCTTCTG…
Key Sequence
TTT
TCAG
AA
29
![Page 30: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/30.jpg)
Illumina
HiSeq MiSeq
30
![Page 31: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/31.jpg)
Модифицированные нуклеотиды
![Page 32: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/32.jpg)
Illumina
32
![Page 33: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/33.jpg)
Bridge PCR
33
![Page 34: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/34.jpg)
Applied Biosystems(Life Technologies)
SOLiD 34
![Page 35: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/35.jpg)
Лигирование
![Page 36: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/36.jpg)
Секвенирование лигированием
36
![Page 37: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/37.jpg)
Лигирование с олигонуклеотиднымизондами
37
![Page 38: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/38.jpg)
38
![Page 39: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/39.jpg)
HeliScope™
Мономолекулярное секвенирование
PacBio RS
39
![Page 41: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/41.jpg)
Pacific Biosciences
• Большая длина прочтения• Ошибки не зависят от последовательности• Чтение модифицированных нуклеотидов
• Высокий процент ошибок• Высокая стоимость 41
![Page 42: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/42.jpg)
Phospholinked Fluorescent Nucleotides or Real-time sequencing
42
![Page 43: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/43.jpg)
Pacific BioSciences
43
![Page 44: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/44.jpg)
Oxford Nanopore
44
![Page 45: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/45.jpg)
45
![Page 46: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/46.jpg)
46
![Page 47: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/47.jpg)
Sanger & NGS
47
![Page 48: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/48.jpg)
Next Next generation sequencing
48
![Page 49: Biotechnology 2012-02](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022052412/557f45c6d8b42ac3288b4d14/html5/thumbnails/49.jpg)
Спасибо за внимание